Práctica 5 Biotec

Departamento de Química Industrial
IES Josep Maria Llompart

Mòdul: E.Biotecnológicos
CFGS Laboratorio de análisis y control de calidad
Análisis biotecnológicos
Práctica 5: Transformación bacteriana
Alumno: Rubén Guardia Arco
Curso: 2º CFGS
Profesor: Natalia Galerón Rodríguez
Fecha: 7/02/24
1. INTRODUCCIÓN
La transformación bacteriana es un método ampliamente utilizado donde se introduce ADN
extraño en una bacteria, que entonces puede amplificar o clonar el ADN. Las células que
tienen la capacidad para fácilmente tomar este ADN se denominan células competentes.
Aunque la transformación se produce naturalmente en muchos tipos de bacterias, los
científicos han encontrado maneras de inducir artificialmente y mejorar la capacidad de una
célula bacteriana.
Un plásmido es una pequeña cadena circular de ADN que puede reducir su tamaño por
superenrollamiento, por lo que puede pasar fácilmente a través de poros en la membrana de la
célula.
Un plásmido contiene algunas regiones importantes digno de mencionar. Los plásmidos

disponibles comercialmente contienen un sitio de clonación múltiple o MCS. Esta región
contiene secuencias específicas reconocidas por endonucleasas de restricción o enzimas de
restricción. Fragmentos de ADN de interés para el investigador pueden introducirse en el sitio
de clonación múltiple del plásmido y el fragmento de ADN se corta con las endonucleasas.
Los plásmidos también contienen un origen de replicación, o ORI, que proporciona

información a la celda donde debe comenzar la replicación del plásmido.
Además el origen de replicación y el sitio de clonación múltiple, la mayoría de plásmidos

incluirá un gen de resistencia a los antibióticos. Este gen confiere resistencia a los
antibióticos a todas las celdas que contienen el plásmido, permitiendo que esas células
sobrevivan en el antibiótico.
La célula competente más comúnmente utilizada en la investigación de la biología molecular

y transformación es e. coli, que también habitan el intestino inferior. Las células típicamente
se hacen competentes a través de la exposición a un ambiente rico de calcio.
Las cargas positivas de los iones de calcio neutralizan las cargas negativas de los plásmidos y
la pared celular bacteriana disipando la repulsión electrostática y debilitamiento de la pared
celular.
Al exponer las células a un aumento repentino en la temperatura o choque térmico, se crea

una diferencia de presión entre el exterior y el interior de la célula, que induce la formación
de poros, a través del cual se puede introducir DNA plasmídico superenrollado. Después de
regresar a las células a una temperatura normal, la pared celular se autocura.
Una vez que las células han tomado en el plásmido, serán capaces de crecer en placas de agar
con antibióticos.1
2. OBJETIVOS
Transformar el material genético de una bacteria mediante el método del choque

térmico y con ADN plasmídico.
3. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS
Materiales
- Botella de vidrio
- Tapón
- Guantes
- Placas de petri
- Micropipeta
- Rack de puntas
- Asa de siembra
- Mechero de alcohol
- Microtubos
Equipos
- Incubadora
- Microondas
- Vortex
- Baño María
Reactivos
- E.Coli
- CaCl2
- Buffer
- pGAL
- x-GAL
- Hielo
- Agua destilada
- Etanol
4. RIESGOS
Riesgo eléctrico derivado del uso de equipos electrónicos, revisar siempre el estado del
cableado y hacer un uso correcto.
Riesgo de corte por el uso de material de vidrio, revisar el estado del material antes de usarlo
y hacer un uso correcto del mismo.
Riesgo térmico derivado del uso de equipos a altas temperaturas como el microondas,
usar guantes térmicos.
5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Preparación placas de LB
1- Se rompió en pequeños pedazos el agar sólido LB y mediante agitación y
exprimiendo el bote de plástico.
2- Se aflojó la tapa y se calentó en el microondas
3- Se etiquetaron las placas de la siguiente manera: 2 placas X-GAL/Amp 1 placa
X-GAL y 1 placa con E.Coli
4- Se añadieron 20 mL de agar enfriado a la placa de E.Coli.
5- Se añadió la solución X-GAL al agar enfriado, se cerró y se agitó.
6- Se añadieron 5 mL en la placa XGAL/control y se añadió ampicilina al agar
restante, se cerró y se agitó.
8- Se añadieron 5 mL a las dos placas se taparon y se dejaron 20’ a temperatura
ambiente.
Preparación de las placas fuente de E.Coli
1- Se sacó una perla de E.Coli usando el asa de siembra y se llevó a la placa de petri,
se disolvió con 10 microlitros de caldo de cultivo líquido y se realizó una siembra por
estrías.
2- Se incubó a 37ºC 24h
Preparaciones previas
1- Se colocaron los microtubos en hielo y se marcaron, se dispensaron 12 microlitros
del ADN en el tubo con pGAL y 12 microlitros de buffer en el control.
2- Se cerraron los tubos y se colocaron en hielo.
Protocolo experimento de transformación

1- Se marcó 1 microtubo con DNA+ y otro con DNA-
2- Se transfirieron 250 microlitros de CaCl2 al microtubo con DNA- y se añadieron 15

colonias de E.Coli con la ayuda de un asa de siembra.
3- Se transfirieron 250 microlitros de la suspensión al tubo con DNA+ y se añadieron
10 microlitros de plásmido pGAL y 10 microlitros de buffer al DNA-
4- Se incubó en hielo 10 minutos y luego se llevaron los tubos a un baño María a 42
grados durante 90 segundos.
5- Se colocaron los tubos en hielo durante dos minutos y se transfirieron 250
microlitros de Recovery Broth a cada microtubo.
6- Se incubaron los tubos a 37ºC durante 30 minutos.
7- Se marcaron las placas de la siguiente manera: DNA+ (X-GAL/Control), DNA+
(Ampl/X-GAL/pGAL) y DNA- (Ampl/X-GAL/ control)
8- Se sacaron los tubos del agua y se transfirieron 250 microlitros de las células a las
placas, se extendieron las células y se esperaron 5 minutos.
9- Se incubaron a 37ºC durante 24h y se visualizaron en UV pasado el tiempo.
6. CÁLCULOS Y RESULTADOS
Imagen 1: placa de petri ADN-

Imagen 2: placa de petri ADN+ con crecimiento azul
Imagen 3: Placa petri ADN + con crecimiento beige
7. ANÁLISIS DE RESULTADOS
En el laboratorio inducimos una transformación bacteriana con el plásmido pGAL utilizando
la técnica de choque térmico, en la cual introdujimos el plásmido pGAL a la bacteria al
realizar un cambio brusco de temperaturas, pasando los tubos desde un baño en hielo a un
baño maría a 42°C.
Se ha demostrado que la transformación bacteriana es un proceso que ocurre cuando una
célula ingiere ADN foráneo de sus alrededores y lo incorpora a su material genético. Este
proceso puede ocurrir de forma natural o de forma artificial, utilizando algún vector como lo
son los virus o por choque térmico.
En la placa Petri con LB/-pGAL/Amp(imagen 2) aparecen colonias azules de E.coli y
presentan resistencia a la ampicilina. Las colonias azules corresponden a las células
transformadas con el vector que lleva el gen de la β-galactosidasa funcional y produce por
inducción con IPTG dicha enzima capaz de hidrolizar al X-Gal y generar color azul. Presentó
crecimiento bacteriano en el medio pero
no presentaba fluorescencia al someterse a luz UV,esto es debido a que la transformación
bacteriana ha sido efectiva debido al cambio de color de la bacteria pero no emite
fluorescencia porque el gen que produce fluorescencia está apagado. Se pudieron contar 30
colonias
La placa Petri con LB/pGAL (imagen 3) presentaba colonias beige que corresponden a las
células transformadas con el vector que lleva un gen de la β-galactosidasa no funcional por
inserción de un fragmento de DNA dentro del mismo. No presentó fluorescencia.
La placa Petri con LB/pGAL/Amp (imagen 1) no presentó ni crecimiento bacteriano ni

fluorescencia siendo esto lo esperado ya que es el la bacteria a la que no se le ha
transformado el material genético y por lo tanto no se espera un crecimiento en ella.
8. CONCLUSIONES
Se ha conseguido transformar el material genético de una bacteria mediante el método

del choque térmico y con ADN plasmídico.
9. REFERENCIAS
[1] JoVE Science Education Database. “Métodos Básicos en Biología Celular y

Molecular” recuperado el 5 de febrero de 2023 de:
https://www.jove.com/es/v/5059/bacterial-transformation-using-heat-shock-and-comp
etent-cells?language=Spanish

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Los plásmidos también contienen un origen de replicación, o ORI, que proporciona

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La célula competente más comúnmente utilizada en la investigación de la biología molecular

Al exponer las células a un aumento repentino en la temperatura o choque térmico, se crea

Transformar el material genético de una bacteria mediante el método del choque

3. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

Protocolo experimento de transformación

2- Se transfirieron 250 microlitros de CaCl2 al microtubo con DNA- y se añadieron 15

Imagen 1: placa de petri ADN-

Imagen 2: placa de petri ADN+ con crecimiento azul

Imagen 3: Placa petri ADN + con crecimiento beige

La placa Petri con LB/pGAL/Amp (imagen 1) no presentó ni crecimiento bacteriano ni

Se ha conseguido transformar el material genético de una bacteria mediante el método

[1] JoVE Science Education Database. “Métodos Básicos en Biología Celular y

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