NCh1620 - 1 - 2020 (Coliformes Totales-Aguas NMP)

NORMA NCh
CHILENA 1620/1
Segunda edición
2020.10.28
Corregida y reimpresa en 2021
Agua — Determinación de bacterias coliformes

totales y Escherichia coli — Parte 1: Método de
los tubos múltiples (NMP)
Drinking water — Determination of total coliform bacteria and Escherichia coli
— Part 1: Multiple-tube fermentation technique (MPN)
USO EXCLUSIVO - MGI Laboratorio SPA (PROHIBIDO LA REPRODUCCIÓN)

Copia para uso exclusivo - MGI Laboratorio SPA - 775258888 - 15564
ICS 13.060.40; 71.060
Número de referencia
NCh1620/1:2020
21 páginas
© INN 2020
Impreso por: Patricio Guzman
NCh1620/1:2020

DOCUMENTO PROTEGIDO POR COPYRIGHT
© INN 2020
Derechos de autor:
La presente Norma Chilena se encuentra protegida por derechos de autor o copyright, por lo cual, no puede ser reproducida
o utilizada en cualquier forma o por cualquier medio, electrónico o mecánico, sin permiso escrito del INN. La publicación en
Internet se encuentra prohibida y penada por la ley.
Se deja expresa constancia que en caso de adquirir algún documento en formato impreso, éste no puede ser copiado
(fotocopia, digitalización o similares) en cualquier forma. Bajo ninguna circunstancia puede ser revendida. Asimismo, y sin
perjuicio de lo indicado en el párrafo anterior, los documentos adquiridos en formato .pdf, tiene autorizada sólo una impresión
por archivo, para uso personal del Cliente. El Cliente ha comprado una sola licencia de usuario para guardar este archivo en
su computador personal. El uso compartido de estos archivos está prohibido, sea que se materialice a través de envíos o
transferencias por correo electrónico, copia en CD, publicación en Intranet o Internet y similares.
Si tiene alguna dificultad en relación con las condiciones antes citadas, o si usted tiene alguna pregunta con respecto a los
derechos de autor, por favor contacte la siguiente dirección:
Instituto Nacional de Normalización - INN

Av. Libertador Bernardo O’Higgins 1449, Santiago Downtown Torre 7, piso 18 • Santiago de Chile
Tel. + 56 2 2445 88 00
Correo Electrónico contacto@inn.cl
Sitio Web www.inn.cl
Publicado en Chile
ii © INN 2020 - Todos los derechos reservados

NCh1620/1:2020
Contenido Página
Preámbulo ............................................................................................................................................v
1 Alcance y campo de aplicación .......................................................................................1
2 Referencias normativas ....................................................................................................1
3 Términos y definiciones ...................................................................................................1
4 Principio ..............................................................................................................................2
5 Muestras para analisis .......................................................................................................2
6 Reactivos y medios de cultivo ..........................................................................................2
6.1 Reactivos ............................................................................................................................2
6.2 Medios de cultivo ...............................................................................................................2
7 Aparatos ..............................................................................................................................3
8 Procedimiento ....................................................................................................................4

8.1 Generalidades.....................................................................................................................4
8.2 Ensayo presuntivo para coliformes totales .....................................................................5
8.3 Ensayo confirmativo para coliformes totales ..................................................................5
8.4 Ensayo confirmativo para Escherichia coli .....................................................................5
8.5 Ensayo completo ................................................................................................................6
9 Expresión de resultados....................................................................................................7
9.1 Determinación cuantitativa de coliformes totales...........................................................7
9.2 Detección, presencia/ausencia, de Escherichia coli .......................................................8
10 Aseguramiento de calidad.................................................................................................8
10.1 Control de calidad de los ensayos ...................................................................................8
10.2 Aprobación de resultados .................................................................................................9
11 Informe de resultados ......................................................................................................10
Anexos
Anexo A (normativo) Reactivos y medios de cultivo .......................................................................11
A.1 Reactivos ..........................................................................................................................11
A.1.1 Agua tamponada para dilución .......................................................................................11
A.1.2 Reactivos para tinción Gram ...........................................................................................11
A.2 Medios de cultivo .............................................................................................................12
A.2.1 Caldo lauril sulfato triptosa .............................................................................................12
A.2.2 Caldo bilis lactosa verde brillante ..................................................................................12
A.2.3 Medio EC-MUG .................................................................................................................13
A.2.4 Agar Endo Les ..................................................................................................................13
A.2.5 Agar Mac Conkey .............................................................................................................14
A.2.6 Agar nutriente inclinado ..................................................................................................15
Anexo B (normativo) Tablas para el cálculo del Número Más Probable (NMP) ............................16
© INN 2020 - Todos los derechos reservados iii

NCh1620/1:2020
Anexo C (informativo) Diagrama de Flujo del ensayo......................................................................18

Anexo D (informativo) Bibliografía ....................................................................................................20
Anexo E (informativo) Participantes en elaboración de Norma Chilena NCh1620/1 ....................21
Tablas
Tabla 1 – Volúmenes de muestra y serie de tubos inoculados .......................................................5
Tabla B. 1 – Número Más Probable (NMP) de bacterias coliformes por 100 ml, sembrando la
combinación de: 5 tubos con 10 ml, 5 tubos con 1 ml y 5 tubos con 0,1 ml ..............16

iv © INN 2020 - Todos los derechos reservados

NCh1620/1:2020
Preámbulo
El Instituto Nacional de Normalización, INN, es el organismo que tiene a su cargo el estudio y preparación
de las normas técnicas a nivel nacional. Es miembro de la INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR
STANDARDIZATION (ISO) y de la COMISION PANAMERICANA DE NORMAS TECNICAS (COPANT),
representando a Chile ante esos organismos.
Esta norma se estudió a través del Comité Técnico CL007 Calidad del agua, Subcomité SC03 Métodos
microbiológicos, para establecer la metodología de determinación de bacterias coliformes totales y
Escherichia coli mediante el método de los tubos múltiples (NMP) en agua potable y sus fuentes de
abastecimiento.
Por no existir Norma Internacional, en la elaboración de esta norma se ha tomado en consideración

la norma NCh1620/1:1984 Agua potable - Determinación de bacterias coliformes totales - Parte 1:
Método de los tubos múltiples (NMP), Standard Methods for the examination of water and wastewater,

23a Edition, 2017, Multiple-tube fermentation for members of the coliform group, Part 9221, Manual
de Métodos de ensayo para agua potable de la Superintendencia de Servicios Sanitarios, Segunda
edición, 2007 y antecedentes técnicos proporcionados por el Comité.
Los Anexos A y B forman parte de la norma.
Los Anexos C, D y E no forman parte de la norma, se insertan solo a título informativo.
Esta norma reemplazará a la norma NCh1620/1:1984 Agua potable - Determinación de bacterias

coliformes totales - Parte 1: Método de los tubos múltiples (NMP) y la deja no vigente técnicamente.
La norma NCh1620 contiene las siguientes partes bajo el título Agua - Determinación de bacterias
coliformes totales y Escherichia coli:
Parte 1: Método de los tubos múltiples (NMP).
Parte 2: Método de filtración por membrana.

Esta norma ha sido aprobada por el Consejo del Instituto Nacional de Normalización, en sesión
efectuada el 28 de octubre de 2020.
Esta norma ha sido corregida y reimpresa en 2020, corrigiéndose errores de forma en:
Subcláusulas 9.2.1 y A.1.1, y Diagrama de Anexo C.
Esta norma ha sido corregida y reimpresa en 2021, corrigiéndose errores de forma en:
Subcláusula 6.2.1.
Si bien se ha tomado todo el cuidado razonable en la preparación y revisión de los documentos

normativos producto de la presente comercialización, INN no garantiza que el contenido del documento
es actualizado o exacto o que el documento será adecuado para los fines esperados por el Cliente.
En la medida permitida por la legislación aplicable, el INN no es responsable de ningún daño directo,
indirecto, punitivo, incidental, especial, consecuencial o cualquier daño que surja o esté conectado con
el uso o el uso indebido de este documento.
© INN 2020 - Todos los derechos reservados v

NORMA CHILENA NCh1620/1:2020
Agua — Determinación de bacterias coliformes totales y Escherichia coli

— Parte 1: Método de los tubos múltiples (NMP)
1 Alcance y campo de aplicación

1.1 Esta norma establece el método para la determinacion en aguas de:
— número más probable de bacterias coliformes totales, mediante la técnica de tubos múltiples; y
— presencia o ausencia de E. coli. en muestras donde se ha encontrado bacterias coliformes totales
1.2 Esta norma se aplica a agua potable y sus fuentes de abastecimiento.

2 Referencias normativas
Los documentos siguientes son indispensables para la aplicación de esta norma. Para referencias
con fecha, sólo se aplica la edición citada. Para referencias sin fecha se aplica la última edición del
documento referenciado (incluyendo cualquier enmienda).
NCh409/1, Agua potable - Parte 1: Requisitos.
NCh409/2, Agua potable - Parte 2: Muestreo.
NCh426/2, Agua grado reactivo para análisis - Especificaciones - Parte 2: Análisis físico-químico y
microbiológico de agua potable, aguas crudas y aguas residuales.
Manual de Métodos de Ensayo para Agua Potable, publicado por la Superintendencia de Servicios
Sanitarios, última edición.
3 Términos y definiciones
Para los propósitos de esta norma, se aplican los términos y definiciones siguientes:
3.1
bacterias coliformes totales
comprende todos los bacilos Gram negativos, aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados,
que fermentan la lactosa con producción de gas en presencia de sales biliares, dentro de 48 h ± 3 h
a 35 °C ± 0,5 °C, de acuerdo al método de ensayo descrito en esta norma
3.2
Escherichia coli, (E. Coli)
bacilo Gram negativo, anaeróbico facultativo perteneciente al grupo coliforme, que forma parte de la
flora intestinal normal de los humanos y otros animales de sangre caliente y algunas de sus cepas
pueden causar enfermedad grave en humanos
© INN 2020 - Todos los derechos reservados 1

NCh1620/1:2020
3.3
técnica de tubos múltiples
técnica utilizada para estimar la concentración de bacterias presentes en el agua, mediante la inoculación
de una serie de tubos en concentraciones decimales decrecientes de la muestra, en un medio de
cultivo adecuado, los cuales se incuban en condiciones de tiempo y temperatura determinados, cuyos
resultados son obtenidos utilizando la tabla del Número Más Probable (NMP)
4 Principio
El método para la determinación de coliformes totales se basa en la capacidad que tienen estos
organismos de fermentar la lactosa con producción de gas, al ser incubados a 35 °C ± 0,5 °C durante
48 h, usando tubos múltiples para estimar el NMP de coliformes en la muestra.
Por su parte, la detección de Escherichia .coli, se basa en la capacidad de la enzima β-glucoronidasa

presente en esta bacteria, para hidrolizar un componente del medio EC-MUG a 44,5 °C dentro

de 24 h y producir fluorescencia.
5 Muestras para analisis

Las muestras que van a ser sometidas a ensayo deben cumplir con los requisitos de muestreo
definidos en la norma NCh409/2, como también con los requisitos de envases y preservantes para
la recolección, además de las condiciones de preservación y tiempos máximos de almacenamiento
de las muestras, establecidos en Manual de Métodos de Ensayo para Agua Potable, publicado por la
Superintendencia de Servicios Sanitarios.
6 Reactivos y medios de cultivo

Preferentemente utilizar reactivos y medios de cultivo disponibles comercialmente, los cuales deben
contar con un certificado de calidad emitido por fabricante. Además, sus componentes deben ser
coincidentes a lo indicado en Anexo A, dado que algunas formulaciones comerciales podrían tener
variaciones. Si esto no es posible, se pueden preparar a partir de sus componentes.
6.1 Reactivos
6.1.1 Agua grado reactivo clase 4, según NCh426/2.
6.1.2 Agua tamponada para dilución.
6.1.3 Reactivos para tinción Gram.
6.2 Medios de cultivo
Los medios de cultivo comerciales se preparan según las indicaciones del fabricante o a partir de sus
componentes según Anexo A, y son los siguientes:
6.2.1 Caldo lauril sulfato triptosa: Preparar el caldo y distribuir en volúmenes de 10 ml para caldo
concentración simple y 10 ml para caldo concentración doble, en tubos de cultivo con tubos Durham
en su interior, de tal forma que estos últimos queden cubiertos con el caldo.
2 © INN 2020 - Todos los derechos reservados

NCh1620/1:2020
6.2.2 Caldo bilis lactosa verde brillante: Preparar el caldo y distribuir un volumen entre 5 ml a 7 ml
en tubos de cultivo con tubos Durham en su interior, de tal forma que estos últimos queden cubiertos
con el caldo.
6.2.3 Medio EC-MUG: Preparar el medio y distribuir un volumen entre 5 ml a 7 ml en tubos de cultivo
conteniendo tubos Durham en su interior, de tal forma que estos últimos queden cubiertos con el
medio.
6.2.4 Agar Endo Les: Preparar y distribuir 12 ml a 15 ml en placas de Petri estériles de 100 mm de
diámetro por 15 mm de profundidad. Este medio no se esteriliza.
6.2.5 Agar Mac Conkey: Preparar, esterilizar y posteriormente distribuir 12 ml a 15 ml en placas de

Petri estériles de 100 mm de diámetro por 15 mm de profundidad
6.2.6 Agar Nutriente: Preparar y distribuir en tubos de cultivo con volúmenes de 4 ml a 5 ml. Posterior
a la esterilización, dejar enfriar los tubos inclinados a fin de obtener una superficie de agar de 6 cm a

7 cm de largo.
Los medios de cultivo que se deben esterilizar se someten al proceso de autoclavado asegurando que
la temperatura se mantenga durante el ciclo de esterilización a 121 °C por 15 min con una variación
mínima de temperatura a una presión de ≥ 15 psi (≥ 103 Kpa), debiendo ser retirados del autoclave
antes de 45 min.
Previo a su uso, se recomienda realizar la verificación de esterilidad, conservación y los ensayos de

rendimiento, según lo indicado en el Standard Methods for the Examination of Water and Wastewaters,
Parte 9020[1] o en otra norma específica.
7 Aparatos
7.1 Aguja de inoculación, ligeramente curvada en la punta.
7.2 Asa de nicrón o platino-iridio, alternativamente usar asas estériles desechables.

7.3 Autoclave, regulable a temperatura de 121 °C a 124 °C, según su uso.
7.4 Auxiliares de pipeteado, automáticos o manuales.
7.5 Balanza de precisión, con sensibilidad de 1 mg.
7.6 Baño termorregulado, a 44,5 °C ± 0,2 °C.
7.7 Cámara oscura, para observar fluorescencia.
7.8 Equipo potenciométrico para determinar pH, con una exactitud de ± 0,1 unidades de pH.
7.9 Estufa de cultivo, regulable a 35 °C ± 0,5 °C.
7.10 Estufa de esterilización, con circulación de aire caliente, regulable a 170 °C ± 10 °C.
7.11 Microscopio, provisto de objetivo de inmersión (100 x).

NCh1620/1:2020
7.12 Lámpara de luz ultravioleta de onda larga (rango 365 nm - 366 nm), conteniendo una ampolleta
de 4 ó 6 W.
7.13 Pipetas bacteriológicas, de 1 ml, 5 ml y 10 ml, con subdivisiones de 0,1 ml, estériles o pipetas
desechables estériles y certificadas.
7.14 Placas de Petri, de vidrio o plásticas estériles, de 90 mm a 100 mm de diámetro por 15 mm de

profundidad.
7.15 Portaobjetos
7.16 Recipientes para pipetas, de aluminio, acero inoxidable, vidrio pyrex u otro material no corrosivo
y resistente al calor, provistos de tapa; o envolturas de papel Kraft. No se deben usar recipientes de
cobre o de aleaciones de cobre.
7.17 Recipientes para placas de Petri, provistos de tapa; o canastillos de alambre, de acero

inoxidable tejido, o envolturas de papel Kraft. No se deben usar recipientes de cobre o de aleaciones
de cobre.
7.18 Tubos de cultivo, de 20 mm × 150 mm y de 16 mm × 150 mm.
7.19 Tubos Durham, de diámetro no inferior al 40% del diámetro del tubo de cultivo, debiendo quedar
completamente lleno y sumergido en el medio.
7.20 Otros materiales de uso habitual en laboratorio.
8 Procedimiento
8.1 Generalidades
El procedimiento de ensayo para determinar el NMP de coliformes totales mediante el método de los
tubos múltiples y la posterior detección de Escherichia coli, se divide en tres etapas que se describen
a continuación.
Este método, contempla además la realización del ensayo completo, el cual se efectúa con una
frecuencia de al menos una vez por trimestre, con la finalidad que se indica en 8.5.

NCh1620/1:2020
8.2 Ensayo presuntivo para coliformes totales
8.2.1 Inocular la muestra en tubos de cultivo con caldo lauril sulfato triptosa (ver 6.2.1), en los
volúmenes y series que se indican en Tabla 1.
Tabla 1 – Volúmenes de muestra y serie de tubos inoculados
Volumen de la muestra Agua

Concentración del caldo lauril triptosa
ml Nº de tubos inoculados
10 doble 5
1 simple 5
0,1a) simple 5
a) Diluir 1 ml de muestra en 9 ml de agua tamponada para dilución (ver 6.1.2) y otras diluciones que se requieran, e
inocular 1 ml de esta dilución.

8.2.2 Incubar los tubos a 35 °C ± 0,5 °C.
8.2.3 Examinar los tubos a las 24 h ± 2 h de incubación, y reincubar por 24 h adicionales aquellos
tubos que no presenten formación de gas dentro del tubo Durham, o sean dudosos.
8.2.4 Anotar el número total de tubos que presenten turbiedad y/o formación de gas dentro de
las 48 h ± 3 h de incubación. Esto constituye un ensayo presuntivo positivo.
8.3 Ensayo confirmativo para coliformes totales
8.3.1 Someter al ensayo confirmativo todos los tubos de caldo lauril sulfato triptosa que dieron
positivo el ensayo presuntivo a las 24 h y a las 48 h ± 3 h de incubación (ver 8.2.3 y 8.2.4). La prueba
confirmativa de los tubos positivos a las 24 h se debe realizar inmediatamente ya que las bacterias
coliformes podrían ser inhibidas por la flora bacteriana acompañante, debido a una acción antagonista
y/o a variación del pH.
8.3.2 Agitar suavemente los tubos positivos y transferir una asada de cada tubo a otro tubo de cultivo
que contenga caldo bilis lactosa verde brillante (ver 6.2.2).
8.3.3 Incubar a 35 °C ± 0,5 °C durante 48 h ± 3 h.
8.3.4 Examinar los tubos en cualquier momento de la incubación dentro de las 48 h ± 3 h y anotar el
número total de tubos que presenten formación de gas en cualquier cantidad en el tubo Durham. Esto
constituye un ensayo confirmativo positivo.
8.4 Ensayo confirmativo para Escherichia coli
8.4.1 Para determinar la presencia /ausencia de Escherichia coli, se procede a su verificación en el

medio EC-MUG (6.2.3). Para ello, traspasar una asada de todos los tubos positivos (con gas en el tubo
Durham) del ensayo presuntivo a tubos conteniendo medio EC-MUG. En caso de que existan tubos
que presenten crecimiento sin producción de gas también deben ser traspasados a medio EC-MUG.
8.4.2 Incubar en baño termorregulado a 44,5 °C ± 0,2 °C por 24 h, dentro de los 30 min desde su
inoculación.

NCh1620/1:2020
8.4.3 Transcurrido el período de incubación retirar todos los tubos del baño termorregulado.
8.4.4 Observar los tubos de EC-MUG que presenten crecimiento, bajo la lámpara de luz UV de onda
larga (365 nm -366 nm) en cámara oscura y ver si se produce fluorescencia.
8.4.5 Registrar como positivos a todos los tubos EC-MUG inoculados que presenten fluorescencia
azul brillante. Se considera un resultado positivo para Escherichia coli, aunque un solo tubo traspasado
a EC-MUG por muestra produzca fluorescencia.
8.4.6 Verificación adicional:
Verificar la presencia de Escherichia. coli en medio EC-MUG ante la situación que se presenten tubos
con crecimiento y sin producción de gas en caldo lauril sulfato triptosa. En caso de que alguno de esos
tubos registre MUG positivo, corresponderían a cepas E. coli anaerogénicas.
8.5 Ensayo completo

8.5.1 El ensayo completo se realiza para verificar la efectividad de la detección frente a la presencia
de bacterias coliformes y proveer datos de control de calidad para los análisis de los tipos de agua
incluidas en el alcance de esta norma.
8.5.2 Efectuar este ensayo a una muestra que resulte positiva para coliformes totales, con una
frecuencia de al menos una vez por trimestre. Si el trabajo rutinario del laboratorio no produce una
muestra positiva dentro de ese período, realizar esta verificación utilizando una muestra positiva
conocida.
8.5.3 De cada tubo de cultivo positivo en caldo bilis lactosa verde brillante (ver 6.2.2), sacar un
inóculo con una aguja de inoculación (ver 7.1), y sembrar sobre la superficie de una placa de agar
Endo LES (6.2.4) o agar Mac Conkey (ver 6.2.5), teniendo cuidado de no romper el agar y girando la
placa a fin de obtener un buen aislamiento de al menos 0,5 cm entre colonias.
8.5.4 Incubar las placas en posición invertida a 35 °C ± 0,5 °C durante 24 h ± 2 h.

8.5.5 Después de la incubación, verificar el desarrollo de colonias, las cuales presentan las siguientes
características:
— Agar Endo Les:
a) colonias típicas: color rosado a rojo oscuro con brillo metálico verde en la superficie;
b) colonias atípicas: color rosado, rojo, blanco o incoloras sin brillo.
— Agar Mac Conkey:
a) colonias típicas: Color rojo y a su alrededor pueden tener una zona opaca de precipitado de
bilis;
b) colonias atípicas: colonias incoloras.
8.5.6 De cada placa que presente desarrollo, repicar con un asa 1 o más colonias típicas bien
aisladas y si hay colonias atípicas, repicar 2 o más colonias que se consideren con mayor probabilidad
que sean coliformes.

NCh1620/1:2020
8.5.7 Sembrar cada una de ellas en un tubo con caldo lauril sulfato triptosa (ver 6.2.1) y en un tubo
de agar nutritivo (ver 6.2.6).
8.5.8 Incubar los tubos de caldo lauril sulfato triptosa a 35 °C ± 0,5 °C durante 24 h ± 2 h. Si no
se produce gas dentro de las 24 h ± 2 h de incubación, reincubar los tubos y volver a examinar a
las 48 h ± 3 h de incubación total.
8.5.9 Incubar los tubos de agar nutritivo a 35 °C ± 0,5 °C durante 24 h.
8.5.10 Realizar tinción de Gram a las colonias de cada tubo de agar nutritivo cuyo correspondiente
tubo de caldo lauril sulfato triptosa haya evidenciado formación de gas.
8.5.11 Tinción de Gram:
8.5.11.1 Limpiar un portaobjeto, colocar sobre ella una gota de agua destilada y una pequeña cantidad
de inóculo; esparcir sobre la lámina y fijar a la llama de un mechero.

8.5.11.2 Dejar enfriar y cubrir la lámina con gotas de solución de cristal violeta durante 1 min. Eliminar
el exceso de colorante enjuagando con agua destilada.
8.5.11.3 Agregar solución de lugol y dejar durante 1 min. Decolorar rápidamente con solución de
alcohol-acetona.
8.5.11.4 Agregar solución de fucsina o solución de safranina y dejar durante 30 s.
8.5.11.5 Lavar la lámina con agua destilada, secar y observar al microscopio utilizando el objetivo de
inmersión (100 x).
8.5.11.6 Las bacterias coliformes se presentan como bacilos Gram negativos de color rosado.
8.5.12 Interpretación: La formación de gas en el tubo de caldo lauril sulfato triptosa en 48 h ± 3 h

y la verificación de la presencia de bacilos Gram negativos no esporulados en la tinción del cultivo
proveniente del tubo de agar nutritivo, demuestran un ensayo completo positivo.
9 Expresión de resultados
9.1 Determinación cuantitativa de coliformes totales
9.1.1 Establecer un código de 3 cifras con la combinación de tubos positivos obtenidos en cada
dilución del ensayo confirmativo (ver 8.3).
9.1.2 Con el código consultar Tabla B.1 y leer directamente el Número Más Probable de bacterias
coliformes por 100 ml, en la columna correspondiente (ver Anexo B).
9.1.3 Expresar el resultado de coliformes totales como NMP por 100 ml.

NCh1620/1:2020
9.2 Detección, presencia/ausencia, de Escherichia coli
9.2.1 Expresar los resultados para la detección de Escherichia coli de acuerdo a:
Si el resultado del ensayo confirmativo (ver 8.4) es positivo para la producción de fluorescencia se
expresa como: Presencia (P) de Escherichia coli.
Si el resultado del ensayo confirmativo (ver 8.4) no presenta fluorescencia o ésta es muy débil se
expresa como: Ausencia (A) de Escherichia coli.
10 Aseguramiento de calidad
10.1 Control de calidad de los ensayos
Cada laboratorio debe definir la constitución de su set de análisis de acuerdo a su realidad y carga

de trabajo, el cual no puede estar constituido por más de 20 muestras recepcionadas dentro de un
turno de trabajo, siempre que se cumplan las condiciones de preservación y tiempos máximos de
almacenamiento de las muestras.
Para cada set de análisis ya sea de muestras de agua potable o agua de fuentes de abastecimiento,
se debe controlar la calidad analítica de los resultados sometiendo al mismo procedimiento de ensayo
que las muestras, a los controles que a continuación se indican.
10.1.1 Control de blanco reactivo
Su objetivo es verificar ausencia de contaminación en el proceso de análisis y consiste en incubar en

conjunto con las muestras, 1 tubo de agua tamponada que se utiliza para la dilución decimal de las
muestras, efectuada en la primera etapa del ensayo (ver 8.2).
10.1.2 Control de blanco de medio de cultivo
Para verificar su esterilidad, se deben controlar todos los medios de cultivo que se utilizan en las
diferentes etapas del análisis, incubando 1 tubo de cada medio, sin inocular, en conjunto con las
muestras y en las condiciones de tiempo y temperatura que utiliza cada uno de ellos. En especial, el
control del medio EC-MUG permite evitar confusión de una respuesta positiva ante una posible auto
fluorescencia del medio.
10.1.3 Control de muestra duplicada
Se realiza para controlar la precisión por cada set de análisis y consiste en analizar por duplicado una
de las muestras del set realizando en paralelo todas las etapas del ensayo que correspondan.

NCh1620/1:2020
10.1.4 Control de productividad y selectividad
Por cada set de análisis, en paralelo con las muestras, realizar cultivos con cepas de referencia para
cada microorganismo que se esté determinando, de tal forma de llevar controles positivos y negativos.
Para ello se deben utilizar cepas apropiadas de acuerdo a lo siguiente:
Coliformes totales, de las siguientes cepas recomendadas, usar una para cada control
Productividad (control +) Selectividad (control -)

Escherichia coli ATCC® 11775 o 25922 Staphilococcus aureus(b) ATCC® 6538
Enterobacter aerogenes(a) ATCC® 13048 Pseudomonas aureaginosa(b) ATCC® 27853
(a) fermenta lactosa, pero no es típicamente termotolerante.
(b) no fermentador de lactosa.
Escherichia coli, el control se debe realizar con cada una de las siguientes cepas

Productividad (control +) Selectividad (control -)
Escherichia coli MUG positivo ATCC® 25922 Enterobacter aerogenes ATCC® 13048
Klebsiella pneumoniae ATCC® 13883 o 4352
termotolerante(c)
(c) fermenta la lactosa, pero no hidroliza MUG.
NOTA ATCC® 11775,ATCC® 25922 ATCC® 13048, ATCC® 6538, ATCC® 27853, ATCC® 13048, ATCC® 13883 y
ATCC® 4352 son el nombre comercial de cepas de control de calidad suministradas por American Type Culture Collection.
Esta información se entrega a conveniencia de los usuarios de esta norma y no constituye un respaldo del INN al producto
mencionado. Se pueden usar productos equivalentes, si se demuestra mediante validación, que con ellos se obtienen los
mismos resultados.
10.2 Aprobación de resultados
Los resultados son válidos cuando se cumpla con cada uno de los controles señalados anteriormente,
con los respectivos criterios de precisión entre muestras duplicadas y resultados satisfactorios para el
control de cepas patrón. Adicionalmente, el control de blanco reactivo y control de blanco de medios de
cultivo no deben presentar ningún tipo de crecimiento bacteriano y ausencia de fluorescencia, según
corresponda a la etapa del ensayo.

NCh1620/1:2020
11 Informe de resultados
El informe de ensayos debe indicar:
a) identificación de la muestra;
b) fecha y hora de recepción de la muestra;
c) fecha y hora de muestreo;
d) método de análisis empleado;
e) el (los) resultado(s): NMP de Coliformes totales por 100 ml; y
Presencia o Ausencia de Escherichia coli
f) cualquier desviación del procedimiento especificado;
g) fecha y hora del ensayo;

h) identificación única del informe;
i) nombre y firma del responsable.

NOTA Se recomienda que el laboratorio cuente con toda la información asociada a la cadena de custodia de las muestras.

NCh1620/1:2020
Anexo A
(normativo)
Reactivos y medios de cultivo
A.1 Reactivos
A.1.1 Agua tamponada para dilución
Composición:

Solución stock de fosfato monopotásico: disolver 34,0 g de fosfato monopotásico (KH2 PO4) en 500 ml
de agua (ver 6.1.1), ajustar el pH a 7,2 ± 0,5 con solución de hidróxido de sodio (NaOH;1N) y diluir a
1 L con agua (ver 6.1.1).
Solución stock de cloruro de magnesio: disolver 38 g de cloruro de magnesio (MgCl2) en 1 L de agua

(ver 6.1.1).
Esterilizar cada solución y almacenar en refrigeración. Descartar si presentan turbidez.
Solución de trabajo: Adicionar a 1 L de agua (ver 6.1.1) 1,25 ml de solución stock de fosfato monopotásico
y 5,0 ml de solución stock de cloruro de magnesio.
Distribuir en tubos de manera tal que después de autoclavado por 15 min, se obtenga un volumen de
9 ml ± 2 ml. El pH final debe ser de 7,2 ± 0,1.
NOTA El pH puede variar con el tiempo.

Almacenar en refrigeración y descartar si presenta turbidez. Usar antes de 6 meses.

NCh1620/1:2020
A.2 Medios de cultivo
A.2.1 Caldo lauril sulfato triptosa
A.2.1.1 Composición:
Concentración Concentración
Simple Doble
Triptosa 20,0 g 40,0 g
Lactosa 5,0 g 10,0 g
Fosfato dipotásico (K2HPO4) 2,75 g 5,5 g
Fosfato monopotásico (KH2PO4) 2,75 g 5,5 g

Cloruro de sodio (NaCl) 5,0 g 10,0 g
Lauril sulfato de sodio 0,1 g 0,2 g
Agua grado reactivo 1,0 L 1,0 L
A.2.1.2 Preparación:
Disolver en 1 L de agua grado reactivo (ver 6.1.1), mezclar y calentar para total disolución. Preparar
el medio en concentración simple o doble, según tabla anterior. Distribuir en tubos de cultivo según lo
indicado en 6.2.1.
Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 min. El pH final del medio debe ser de aproximadamente
6,8 ± 2.
A.2.2 Caldo bilis lactosa verde brillante
Peptona 10,0 g
Lactosa 10,0 g
Sales biliares 20,0 g
Verde brillante 0,013 3 g
Agua grado reactivo 1,0 L
A.2.2.2 Preparación
Disolver los componentes en 1 L de agua grado reactivo (ver 6.1.1) y calentar para disolver. Distribuir
en tubos de cultivo según lo indicado en 6.2.2 y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 min. El pH
final del medio debe ser 7,2 ± 2.

NCh1620/1:2020
A.2.3 Medio EC-MUG
Peptona de caseína 20,0 g

Lactosa 5,0 g
Mezcla de sales biliares o sales biliares Nº 3 1,5 g
Cloruro de sodio, (NaCl) 5,0 g
Fosfato dipotásico (K2HPO4) 4,0 g
Fosfato monopotásico (KH2PO4) 1,5 g
4-metilumberiferil-b-D-glucuronido (MUG) 0,05 g

Rehidratar en 1 L de agua para análisis grado reactivo. Agitar para disolver, calentar para total disolución,
dispensar de acuerdo a lo indicado en 6.2.3, en tubos de ensayo que no tengan fluorescencia bajo la
luz UV a una longitud de onda de 365 nm a 366 nm, conteniendo tubos Durham en su interior.
Esterilizar en autoclave por 15 min a 121 °C. El pH final debe ser 6,9 °C ± 0,2 a 25 °C.
A.2.4 Agar Endo Les
Extracto de levadura 1,2 g

Peptona de caseína 3,7 g
Tiopeptona 3,7 g
Triptosa 7,5 g
Lactosa 9,4 g
Fosfato dipotásico (K2HPO4) 3,3 g
Fosfato monofosfato (KH2PO4) 1,0 g
Cloruro de sodio (NaCl) 3,7 g
Desoxicolato de sodio 0,1 g
Lauril sulfato de sodio 0,05 g
Sulfito de sodio (Na2 SO3) 1,6 g
Fucsina básica 0,8 g
Agar 15,0 g
Agua grado reactivo 1L
ADVERTENCIA: La fuscina ácida es un compuesto sospechoso de ser cancerígeno y mutagénico. Evitar contacto
con la piel, ingestión y exposición a membranas mucosas. Seguir las instrucciones del fabricante y de la ficha de
datos de seguridad.

NCh1620/1:2020
Rehidratar el producto de acuerdo las instrucciones del fabricante, o los componentes individuales
en 1 L de agua conteniendo 20 ml de etanol al 95%. No se debe usar etanol desnaturalizado el cual
reduce el crecimiento y el tamaño de las colonias. Llevar hasta cerca del punto de ebullición para
disolver el agar, rápidamente remover de la fuente de calor y enfriar hasta 45 °C a 50 °C. No esterilizar
en autoclave.
El pH final debiera ser 7,2 ± 0,2. El medio Endo es normal que tenga un precipitado. Distribuir
entre 5 ml a 7 ml en el fondo de una placa de Petri de vidrio de 60 mm o 4 ml a 6 ml en el fondo de una
placa de Petri de plástico y dejar solidificar. Si se utilizan placas de otro tamaño, ajustar la cantidad de
modo que la profundidad sea de 4 mm a 5 mm.
No exponer las placas vertidas a la luz directa, refrigerar en oscuridad, preferentemente en bolsas
plásticas selladas o en otros contenedores para reducir la perdida de humedad. Descartar el medio
que no se ha usado después de 2 meses o antes, si se evidencia perdida de humedad, contaminación,

deterioro del medio (oscurecimiento) o formación de brillo en la superficie.
A.2.5 Agar Mac Conkey
Peptona 17,0 g
Proteasa peptona 3,0 g
Lactosa 10,0 g
Sales biliares 1,5 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Agar 13,5 g
Rojo neutro 0,03 g
Cristal violeta 0,001 g

Disolver los ingredientes en el agua grado reactivo (ver 6.1.1), mezclar y calentar para total disolución.
Esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 min. El pH del medio debería ser 7,1 ± 0,2 después de la
esterilización.
Distribuir 15 ml de medio fundido en placas de Petri de 100 mm de diámetro por 15 de profundidad.

NCh1620/1:2020
A.2.6 Agar nutriente inclinado
Peptona 5,0 g
Extracto de carne 3,0 g
Agar 15,0 g
Disolver los ingredientes en el agua grado reactivo (ver 6.1.1), mezclar y calentar para total disolución.
Antes de la esterilización distribuir en tubos tapa rosca. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante
15 min. El pH final del medio debe ser 6,8 ± 0,2 después de la esterilización.

Inmediatamente después de la esterilización, dejar los tubos inclinados hasta que el agar solidifique
de modo de obtener una superficie inclinada de 6 cm a 7 cm de largo.

NCh1620/1:2020
Anexo B
(normativo)
Tablas para el cálculo del Número Más Probable (NMP)
combinación de: 5 tubos con 10 ml, 5 tubos con 1 ml y 5 tubos con 0,1 ml
Número de tubos positivos Número de tubos positivos Número de tubos positivos

por volumen de inóculo Número por volumen de inóculo Número por volumen de inóculo Número
más más más
10; 1; 0,1 10; 1; 0,1 10; 1; 0,1
probable probable probable

ml ml ml
000 < 1,8 302 13 451 48
001 1,8 310 11 500 23
010 1,8 311 14 501 31
011 3,6 312 17 502 43
020 3,7 320 14 503 58
021 5,5 321 17 510 33
030 5,6 322 20 511 46
100 2,0 330 17 512 63
101 4,0 331 21 513 84
102 6,0 332 24 520 49

110 4,0 340 21 521 70
111 6,1 341 24 522 94
112 8,1 350 25 523 120
120 6,1 400 13 524 150
121 8,2 401 17 530 79
130 8,3 402 21 531 110
131 10 403 25 532 140
140 11 410 17 533 170
(continúa)

NCh1620/1:2020
combinación de: 5 tubos con 10 ml, 5 tubos con 1 ml y 5 tubos con 0,1 ml (conclusión)
Número de tubos positivos Número de tubos positivos Número de tubos positivos
por volumen de inóculo Número por volumen de inóculo Número por volumen de inóculo Número
más más más
10; 1; 0,1 10; 1; 0,1 10; 1; 0,1
probable probable probable
ml ml ml
200 4,5 411 21 534 210
201 6,8 412 26 540 130
202 9,1 413 31 541 170
210 6,8 420 22 542 220
211 9,2 421 26 543 280
212 12 422 32 544 350

220 9,3 423 38 545 430
221 12 430 27 550 240
222 14 431 33 551 350
230 12 432 39 552 540
231 14 440 34 553 920
240 15 441 40 554 1 600
300 7,8 442 47 555 > 1 600
301 11 450 41

NCh1620/1:2020
Anexo C
(informativo)
Diagrama de Flujo del ensayo
Ensayo presuntivo
Inocular en tubos de fermentación con caldo Lauril sulfato triptosa. Incubar a 35 ± 0,5 °C, por 24 h ± 2 h

Producción de gas y/o Sin producción de gas o dudoso.
turbiedad. Ensayo Incubar por 24 h adicionales
positivo Total 48 ± 3 h
Producción de gas y/o Sin producción de gas y/o

turbiedad. Ensayo positivo turbiedad. Ensayo negativo.
Grupo Coliforme Ausente
Ensayo confirmativo
Transferir a caldo bilis lactosa verde brillante e incubar Transferir a medio EC-MUG e incubar en baño
durante 48 ± 3 h a 35 ± 0,5° termoregulado a 44,5 ± 0,2 °C por 24 h
Producción de gas y/o turbiedad,

Producción de gas y/o Sin producción de gas y/o observar bajo lámpara UV de No presentan desarrollo
turbiedad. Coliformes turbiedad. Ensayo negativo. onda larga (365-366 mm) bacteriano, ensayo negativo.
en obscuridad. Los tubos que
totales confirmados Coliformes totales ausente presentan fluorescencia azul E.coli ausente
brillante. Resultado positivo
para E.coli

NCh1620/1:2020
Ensayo completo
Inocular en tubos de fermentación con caldo Lauril sulfato triptosa. Incubar a 35 ± 0,5 °C, por 24 h ± 2 h
(1) (2)
Producción de gas Sin producción de gas o dudoso
Transferir a Caldo bilis lactosa verde brillante Incubar por 24 h adicionales
Incubar a 35 °C ± 0,5 °C por 48 h ± 3 h (total 48 h ± 3 h)
Producción de gas
Sin producción de gas Producción de gas Sin producción de gas
Transferir a placas Endo Les o
Mac Conkey Ensayo negativo o dudoso Ensayo negativo
Incubar a 35 °C ± 0,5 °C por Grupo Coliforme Ausente Continuar según (1) Grupo Coliforme ausente
48 h ± 3 h

Colonias típicas o atípicas Colonias negativas
Transferir a Agar nutritivo y Grupo Coliforme ausente
Caldo lauril triptosa
Incubar a 35 °C ± 0,5 °C
Agar por 18 h a 24 h y Caldo
Lauril triptosa por
24 h ± 2 h a 48 H ± 3 h
Producción de gas Sin producción de gas

Tincion Gram a colonias Ensayo negativo
en Agar nutritivo Grupo Coliforme ausente
Bacilos Gram negativos Bacilos Gram positivos Esporas o Bacilos Gram positivos
y Gram negativos
Ensayo completo Repetir procedimiento Ensayo completo negativo
positivo desde 1 Grupo Coliforme ausente

NCh1620/1:2020
Anexo D
(informativo)
Bibliografía
[1] Standard Methods for examination of water and wastewater. 23ª Edition. 2017.
[2] Manual de Métodos de ensayo para agua potable. Superintendencia de Servicios Sanitarios.
Segunda edición. Julio 2007.
[3] Instructivo: Requisitos para un Laboratorio de aguas. Superintendencia de Servicios Sanitarios.

Primera edición. Junio 1997.

[4] NCh3373:2016, Aguas residuales - Calidad analítica de los ensayos.

NCh1620/1:2020
Anexo E
(informativo)
Participantes en elaboración de Norma Chilena NCh1620/1
La Norma Chilena NCh1620/1 ha sido preparada por la División de Normas del Instituto Nacional de
Normalización y en su elaboración participaron las personas naturales y organizaciones siguientes:
AIDIS Chile Elizabeth Echeverría

Análisis Ambientales, ANAM Edith Pinto

Superintendencia de Servicios Sanitarios, SISS Christian Lillo
Instituto Nacional de Normalización, INN Cecilia Carvajal


NCh1620 - 1 - 2020 (Coliformes Totales-Aguas NMP)

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

NCh1620 - 1 - 2020 (Coliformes Totales-Aguas NMP)

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

NCh1620 - 1 - 2020 (Coliformes Totales-Aguas NMP)

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

NORMA NCh

Corregida y reimpresa en 2021

Agua — Determinación de bacterias coliformes

USO EXCLUSIVO - MGI Laboratorio SPA (PROHIBIDO LA REPRODUCCIÓN)

ICS 13.060.40; 71.060

USO EXCLUSIVO - MGI Laboratorio SPA (PROHIBIDO LA REPRODUCCIÓN)

Instituto Nacional de Normalización - INN

ii © INN 2020 - Todos los derechos reservados

Impreso por: Patricio Guzman

USO EXCLUSIVO - MGI Laboratorio SPA (PROHIBIDO LA REPRODUCCIÓN)

© INN 2020 - Todos los derechos reservados iii

Anexo C (informativo) Diagrama de Flujo del ensayo......................................................................18

USO EXCLUSIVO - MGI Laboratorio SPA (PROHIBIDO LA REPRODUCCIÓN)

iv © INN 2020 - Todos los derechos reservados

Impreso por: Patricio Guzman

Por no existir Norma Internacional, en la elaboración de esta norma se ha tomado en consideración

USO EXCLUSIVO - MGI Laboratorio SPA (PROHIBIDO LA REPRODUCCIÓN)

Los Anexos A y B forman parte de la norma.

Los Anexos C, D y E no forman parte de la norma, se insertan solo a título informativo.

Esta norma reemplazará a la norma NCh1620/1:1984 Agua potable - Determinación de bacterias

Parte 1: Método de los tubos múltiples (NMP).

Parte 2: Método de filtración por membrana.

Si bien se ha tomado todo el cuidado razonable en la preparación y revisión de los documentos

© INN 2020 - Todos los derechos reservados v

Agua — Determinación de bacterias coliformes totales y Escherichia coli

1 Alcance y campo de aplicación

— presencia o ausencia de E. coli. en muestras donde se ha encontrado bacterias coliformes totales

1.2 Esta norma se aplica a agua potable y sus fuentes de abastecimiento.

USO EXCLUSIVO - MGI Laboratorio SPA (PROHIBIDO LA REPRODUCCIÓN)

NCh409/1, Agua potable - Parte 1: Requisitos.

NCh409/2, Agua potable - Parte 2: Muestreo.

© INN 2020 - Todos los derechos reservados 1

Por su parte, la detección de Escherichia .coli, se basa en la capacidad de la enzima β-glucoronidasa

USO EXCLUSIVO - MGI Laboratorio SPA (PROHIBIDO LA REPRODUCCIÓN)

5 Muestras para analisis

6 Reactivos y medios de cultivo

6.1.1 Agua grado reactivo clase 4, según NCh426/2.

6.1.2 Agua tamponada para dilución.

6.1.3 Reactivos para tinción Gram.

6.2 Medios de cultivo

2 © INN 2020 - Todos los derechos reservados

Impreso por: Patricio Guzman

6.2.5 Agar Mac Conkey: Preparar, esterilizar y posteriormente distribuir 12 ml a 15 ml en placas de

USO EXCLUSIVO - MGI Laboratorio SPA (PROHIBIDO LA REPRODUCCIÓN)

Previo a su uso, se recomienda realizar la verificación de esterilidad, conservación y los ensayos de

7.2 Asa de nicrón o platino-iridio, alternativamente usar asas estériles desechables.

7.3 Autoclave, regulable a temperatura de 121 °C a 124 °C, según su uso.

7.4 Auxiliares de pipeteado, automáticos o manuales.

7.5 Balanza de precisión, con sensibilidad de 1 mg.

7.6 Baño termorregulado, a 44,5 °C ± 0,2 °C.

7.7 Cámara oscura, para observar fluorescencia.

7.9 Estufa de cultivo, regulable a 35 °C ± 0,5 °C.

7.11 Microscopio, provisto de objetivo de inmersión (100 x).

© INN 2020 - Todos los derechos reservados 3

7.14 Placas de Petri, de vidrio o plásticas estériles, de 90 mm a 100 mm de diámetro por 15 mm de

USO EXCLUSIVO - MGI Laboratorio SPA (PROHIBIDO LA REPRODUCCIÓN)

7.18 Tubos de cultivo, de 20 mm × 150 mm y de 16 mm × 150 mm.

7.20 Otros materiales de uso habitual en laboratorio.

4 © INN 2020 - Todos los derechos reservados