TEMA 1: Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica

1.1. Introducción a las técnicas de bioquímica clínica.

La bioquímica clínica es una especialidad de las ciencias de la salud que estudia los procesos
metabólicos y moleculares que 6enen lugar en nuestro organismo, tanto en los estados de salud
como en los de enfermedad.

A par6r de las muestras biológicas y aplicando métodos químicos y bioquímicos de laboratorio,

la bioquímica clínica determina las magnitudes bioquímicas que cons6tuyen signos clínicos de
enfermedad o la manifestación obje6va de un estado fisiológico normal.

Estas magnitudes bioquímicas son signos clínicos, valores cuan6ta6vos de la química de los
procesos metabólicos que se u6lizan para conocer el estado clínico de un paciente.

El conocimiento de estas magnitudes permite detectar alteraciones respecto de los valores

considerados normales y asociarlas con cambios fisiológicos, procesos patológicos o variaciones
inducidas por actuaciones terapéu6cas. Esto hace que las pruebas de bioquímica clínica sean
muy habituales entre los análisis clínicos al proporcionar información básica en la prevención,
diagnós6co y evolución o pronós6co de una enfermedad, así como en el seguimiento de la
respuesta a un tratamiento.

Como veremos a lo largo de este módulo, las magnitudes bioquímicas son muy diversas y se
ob6enen de diferentes muestras biológicas. Algunos ejemplos son la determinación de
colesterol o de crea6nina en sangre, la glucosa o la bilirrubina en orina, etc.

Pero antes de entrar en el estudio bioquímico aplicado a determinaciones concretas, es

conveniente conocer los principios básicos de las principales técnicas instrumentales que se usan
en el laboratorio de bioquímica clínica.

Así, en esta primera unidad trabajaremos las técnicas espectrométricas que u6lizan las
radiaciones electromagné6cas para la determinación de los parámetros bioquímicos y en la
siguiente unidad las que no u6lizan ningún 6po de radiación, como son la espectrometría de
masas, la cromatograGa y la osmometría.

1.2. Las técnicas espectrométricas.

Las radiaciones electromagné6cas son formas de energía y cuando se hacen incidir sobre una
muestra que con6ene un compuesto o molécula que se pretende analizar, ocurren diferentes
fenómenos que se pueden medir y que aportan información tanto cualita6va como cuan6ta6va
del analito que se estudia.

Las técnicas que se basan en la medición de las radiaciones electromagné6cas por sus
propiedades de interacción con la muestra reciben el nombre de técnicas espectrométricas.

En el laboratorio de bioquímica clínica, las principales radiaciones electromagné6cas que se

u6lizan en las técnicas de espectrometría son la luz visible, la ultravioleta y la infrarroja. Por esta
razón, también nos referiremos a ellas como técnicas espectrofotométricas (espectrofotometría
significa medida del espectro de la luz).

Pero antes de abordar las diversas técnicas de espectrometría, conviene tener en cuenta algunas
nociones sobre la naturaleza de las radiaciones electromagné6cas y sobre la forma en que se
produce su interacción con las sustancias que se analizan.

1.2.1. Las radiaciones electromagné4cas. Conceptos básicos.

La energía se manifiesta de
múl6ples formas, entre las que se
cuentan las radiaciones
electromagné6cas.

Las radiaciones electromagné6cas

se pueden describir como ondas y
como parJculas.

Como ondas, las radiaciones

electromagné6cas son oscilaciones
producidas por campos eléctricos y magné6cos que vibran perpendicularmente entre sí y se
propagan a través del espacio.

Como parJculas, una radiación electromagné6ca además de comportarse como una onda se
puede comportar como una parJcula de energía o fotón.

Esta concepción permi6ó explicar el fenómeno fotoeléctrico de la luz, que la teoría ondulatoria
no podía explicar.
 N Magnitudes de las ondas electromagné2cas
Como cualquier onda, una radiación electromagné6ca es una sucesión de crestas y valles, y
algunas de las magnitudes que la caracterizan son:

1. La amplitud (A): Es la desviación máxima de la onda con relación a su valor medio o

posición de equilibrio. Se expresa en unidades de longitud.
2. La longitud de onda (λ): Es la distancia que separa dos crestas sucesivas de la onda. Se
expresa en unidades de longitud, habitualmente en nanómetros.
3. La frecuencia (ν): Es el número de oscilaciones o frentes de onda que pasan por segundo.
Se expresa en s^-1 o en hercios (Hz).

La longitud de onda es inversamente proporcional a la frecuencia: a mayor longitud de onda,

menor frecuencia; y a menor longitud de onda, mayor frecuencia.

N Magnitudes de las radiaciones como

par4culas
La energía electromagné6ca de un fotón se
relaciona con la frecuencia de la onda
electromagné6ca asociada y con la longitud de
onda, mediante las expresiones siguientes:

E = h·ν ; E = h·(c/ λ)

Donde h es la constante de Planck, ν la frecuencia,

c la velocidad de la luz, y λ la longitud de onda.

De las expresiones anteriores se deduce que:

- Cuanto mayor es la frecuencia de una onda, mayor es su energía.

- Cuanto mayor es la longitud de onda, menor es su energía. Es decir, que las ondas con
mayor energía son las que 6enen menores longitudes de onda.

N El espectro electromagné2co
El conjunto de radiaciones electromagné6cas que existen en la naturaleza es muy amplio y se
conoce con el nombre de espectro electromagné6co. La longitud de onda de las radiaciones
electromagné6cas permite ordenar el espectro en regiones (microondas, ondas de radio,
radiación ultravioleta, visible, infrarroja, rayos X, rayos gamma, etc.) y conocer sus propiedades.

La región del espectro que abarca las longitudes de onda de entre 380 y 750 nm corresponde a
la luz visible (VIS), es decir, el conjunto de radiaciones que el ojo humano puede percibir. Justo
por encima y por debajo de ella se encuentran las radiaciones ultravioletas (UV) e infrarrojas (IR).
Son estos los tres 6pos de radiaciones que se u6lizan en las dis6ntas técnicas
espectrofotométricas.
1.2.2. Interacción radiación-muestra y principales técnicas
espectrométricas
Como ya hemos señalado, cuando un haz de radiación incide sobre un compuesto, se pueden
producir diferentes fenómenos. Los que 6enen mayor interés debido a su aplicación en las
técnicas de espectrometría son los siguientes:

1. Transmisión: Se produce cuando la radiación incide sobre una sustancia sin que haya
pérdida de energía ni cambios de dirección.
2. Absorción: Se produce cuando existe una pérdida de intensidad de la radiación al
atravesar la sustancia. Las moléculas o parJculas que absorben radiación ganan energía
y entran en un estado excitado.
3. Emisión: Se produce cuando moléculas o átomos en estado excitado liberan su energía
y vuelven a su estado de reposo.
4. Dispersión: Se produce cuando el haz de radiación choca parJculas en suspensión y
cambia de dirección sin variar su energía.
5. Refracción: El haz de radiación cambia de dirección al atravesar una solución debido a
la diferente naturaleza del medio de propagación.
6. Reflexión: El haz de luz incide sobre una superficie y se produce un efecto de rebote y
cambio de dirección.
7. Difracción: El haz de luz se desvía al pasar por el extremo de una superficie o al atravesar
una rendija.

La espectroscopia es el estudio de la interacción entre la radiación electromagné6ca y la materia,

lo que nos permite detectar y cuan6ficar un gran número de magnitudes bioquímicas.
La ocurrencia de un fenómeno u otro depende de diversos factores, como el estado de
agregación del medio material de la muestra, su densidad, el 6po y forma de las parJculas que
la componen, su concentración, entre otros. La medición de la intensidad de radiación que es
absorbida, transmi6da, dispersada, reflejada, etc., mediante las técnicas de espectrometría,
permite iden6ficar las sustancias.

Las diferentes técnicas de espectrometría se pueden clasificar según el 6po de interacción

radiación-muestra de la siguiente manera:

1.2.3. La instrumentación: el espectrofotómetro

De manera genérica, el espectrofotómetro es el equipo u6lizado en las técnicas de
espectrofotometría. A pesar de que su diseño puede variar ampliamente según la técnica
específica, todos presentan ciertos elementos comunes: la fuente de radiación, el
monocromador, la cubeta, el detector de radiación y el sistema de registro y lectura.

N Fuente de radiación
La fuente de radiación, también llamada fuente de luz o lámpara, es el componente que
proporciona la energía radiante de forma con6nua y estable. Dependiendo del 6po de espectro
y las longitudes de onda que emitan, se dis6nguen entre fuentes de espectro con6nuo, espectro
de líneas y luz láser.

- Fuentes de espectro con:nuo: Se u6lizan en técnicas de absorción molecular (UV, VIS e

IR) y emisión molecular por fluorescencia. Las más comunes son:
o Lámparas de filamento de tungsteno (wolframio): Usadas para longitudes de
onda del espectro visible y ultravioleta próximo. Emiten un espectro con6nuo
de energía radiante, entre 360 y 950 nm.
 o Lámparas de filamentos de haluros de tungsteno: Tienen una vida ú6l más larga
que las de filamento de tungsteno y emiten energía radiante de mayor
intensidad.
o Lámparas de hidrógeno y deuterio: Producen un espectro con6nuo en la región
ultravioleta, entre 220 y 360 nm.
o Lámparas de arco de xenón o mercurio a elevada presión: Proporcionan altas
intensidades entre 200 y 1.000 nm.

- Fuentes de espectros de líneas: Emiten radiación en forma de líneas discretas y se

u6lizan en técnicas de absorción atómica y emisión molecular por fluorescencia. Las más
comunes son:
o Lámparas de vapores de mercurio, ampliamente u6lizadas.
o Lámparas de vapor de sodio.
o Lámparas de cátodo hueco.

- Fuentes de luz láser: Los espectrofotómetros más modernos u6lizan láseres que
permiten aplicar luz completamente monocromá6ca, sin ancho de banda.

N Monocromador
La luz emi6da por la fuente pasa a través de una rendija de entrada, llega al selector de longitud
de onda y sale a través de una rendija de salida como un rayo organizado de luz paralela con la
longitud de onda deseada. Este
conjunto de elementos se llama
monocromador y se refiere al selector
de longitud de onda. Un
monocromador es un disposi6vo
óp6co que permite seleccionar y
transmi6r una radiación
monocromá6ca a par6r de la luz
generada por la fuente emisora, que
produce una amplia gama de
longitudes de onda.
Es importante tener en cuenta que la lámpara de la fuente 6ene una vida ú6l limitada y debe ser
vigilada periódicamente. Además, las fluctuaciones bruscas de tensión pueden afectar al
funcionamiento de estas lámparas.

Rendija de entrada

La rendija de entrada 6ene como función evitar la entrada de luz difusa. Estas rendijas pueden
consis6r en lentes colimadoras que recogen los rayos de luz y los enfocan de tal manera que la
luz pasa como un rayo organizado de luz paralela.

Selector de longitud de onda

El rayo organizado de luz paralela pasa al selector de longitud de onda, que modifica la longitud
de onda de la radiación según la programación.

Los selectores se caracterizan por el ancho de banda que pueden seleccionar. Cuanto más
estrecho sea este ancho de banda, más pura será la radiación que incide sobre la muestra y
más precisos serán los valores de absorbancia obtenidos.

El ancho de banda se define como el intervalo de longitudes de onda medido en la mitad de un

pico del flujo radiante detectado.

Existen dos 6pos de selectores: redes de difracción y prismas.

• Redes de difracción: Están compuestas por un vidrio o una superficie metálica con un
gran número de hendiduras paralelas, situadas a distancias iguales entre sí. Cada una de
estas hendiduras se comporta como un pequeño prisma.
Las redes de difracción logran anchos de banda menores de 0,5 nm y son los mejores
monocromadores o selectores de onda.

• Prismas: Tienen anchos de banda que oscilan entre 0,5 y 1,5 nm y se ajustan
modificando la anchura de la rejilla de salida.
Si se trabaja en la zona del espectro visible y en el ultravioleta próximo, se pueden usar
prismas de vidrio, pero si se trabaja en el ultravioleta lejano, se requieren prismas de
cuarzo, ya que el vidrio absorbe la luz ultravioleta.

Rendija de salida

La rendija de salida permite que pase la parte del abanico desplegado por la red o el prisma que
corresponde a las longitudes de onda seleccionadas, y dirige este haz hacia la cubeta.

Es importante destacar que los colorímetros 6enen el mismo principio de funcionamiento que
los espectrofotómetros, con dos diferencias esenciales:

- Un colorímetro o fotómetro trabaja exclusivamente en el espectro de luz visible,

mientras que un espectrofotómetro puede trabajar con la luz visible, ultravioleta e
infrarroja.
- El colorímetro u6liza filtros como selectores de longitud de onda. Estos filtros pueden
ser:
 o Filtros de absorción: Son vidrios de colores que absorben todas las longitudes
de onda excepto la de su color. Proporcionan anchos de banda de 50 nm.
o Filtros de interferencia: Solo permiten el paso de las ondas que están en fase
con un cristal dieléctrico que forma parte del filtro. Proporcionan anchos de
banda de 10 nm.

N Cubeta
Las cubetas son recipientes donde se coloca la muestra para su
medición. Pueden ser individuales o agrupadas, y están
disponibles en diferentes 6pos y tamaños, como cuadradas,
rectangulares o redondas. Por lo general, 6enen un ancho de 1
cm y volúmenes variables.

Se fabrican u6lizando materiales que no absorben la longitud de

onda deseada:

- Para trabajar con luz visible se u6lizan cubetas de plás6co.

- Para trabajar con luz ultravioleta se emplean cubetas de

cuarzo.

La cubeta Jpica para espectrofotómetros simples es un prisma rectangular con dos caras
transparentes y las otras dos mate para facilitar su manejo.

N Detector
El detector se basa en el efecto fotoeléctrico, donde
los fotones que inciden sobre un material liberan
electrones, generando una corriente eléctrica
proporcional a la can6dad de fotones recibidos.
Esta señal eléctrica mínima se amplifica
posteriormente.

Existen varios 6pos de detectores, entre ellos:

- Fototubos y fototubos mul6plicadores: La luz

incide en un cátodo fotosensible que libera
electrones. Estos electrones pasan a un ánodo o
varios dínodos para amplificar la corriente. Cada
fotón libera un electrón.

- Fotodiodos: El haz de luz incide sobre un diodo.

Cuando el haz 6ene suficiente energía, excita un
electrón, creando una corriente.

- Detectores de carga acoplada (CCD): Similares a

los u6lizados en fotograGa digital.
N Sistema de registro y lectura
La señal eléctrica proveniente del detector se amplifica y luego se convierte en una señal digital.
El sistema informá6co interpreta los resultados y, mediante su sonware, realiza los cálculos
necesarios u6lizando curvas de calibración para obtener datos de concentración.

N Tipos de espectrofotómetros
Existen varios 6pos de espectrofotómetros, que se pueden dis6nguir según la disposición de sus
componentes:

1. Espectrofotómetros de haz simple: Tienen los componentes básicos que se han

estudiado anteriormente.
2. Espectrofotómetros de doble haz en el 6empo: Permiten analizar simultáneamente dos
muestras: la muestra problema y el blanco. Para lograrlo, cuentan con un disposi6vo
reflectante (chopper) que hace que la radiación del monocromador siga dos direcciones
alterna6vas. Una de ellas atraviesa la cubeta del blanco y la otra, la cubeta de la muestra.
Posteriormente, ambas radiaciones se reorientan mediante espejos y llegan al mismo
detector, que mide alterna6vamente las intensidades de ambas muestras.

3. Espectrofotómetros de doble haz en el espacio: Todos los componentes están

duplicados, excepto la lámpara. Dos haces de luz pasan al mismo 6empo a través de los
componentes separados en el espacio.
Es importante destacar que estos instrumentos se u6lizan en diversas aplicaciones analí6cas y
son esenciales en la inves6gación cienJfica y en el análisis de muestras en campos como la
química, la bioquímica y la biología molecular.

1.3. Espectrometría de Absorción Molecular

La espectrometría de absorción molecular se basa en la capacidad de las moléculas para
absorber parte de la radiación que reciben. Las longitudes de onda que cada sustancia absorbe
(que no pueden atravesarla) son caracterís6cas de la molécula y, en consecuencia, se pueden
usar para iden6ficarla.

El análisis por espectrometría de absorción molecular puede ser cuan6ta6vo o cualita6vo:

• Análisis cuan6ta6vo: Se realiza con radiaciones del UV-VIS y se fundamenta en la ley de

Lambert-Beer. Es el análisis más u6lizado en los laboratorios de bioquímica y permite
obtener información sobre magnitudes bioquímicas al comparar la radiación absorbida
por una solución que con6ene una concentración desconocida de una molécula con una
que con6ene una concentración conocida de la misma molécula.
• Análisis cualita6vo: Se realiza con radiaciones del IR y en el laboratorio clínico se usa
principalmente para análisis de la composición de cálculos urinarios.

1.3.1. Absorción Molecular

Una molécula está compuesta por átomos unidos entre sí mediante diferentes orbitales de
enlace que comparten electrones. Cuando una molécula absorbe radiación electromagné6ca,
pasa de un estado inicial de reposo a un estado de mayor energía o excitado.

En este estado excitado, el aumento de energía provoca cambios en los enlaces y en el

movimiento de los electrones en los átomos, lo que altera su estructura electrónica global. Estos
cambios se conocen como transiciones.
Las transiciones que pueden ocurrir en una molécula dependen del 6po de enlaces presentes
entre sus átomos y de si la energía absorbida es suficiente para producir esas transiciones. Por
lo tanto, una molécula 6ene la capacidad de absorber radiación electromagné6ca en longitudes
de onda específicas, aquellas que poseen la energía necesaria para pasar del estado fundamental
al excitado.

Las radiaciones de mayor energía en el rango UV-VIS pueden inducir transiciones electrónicas
entre átomos. Las radiaciones infrarrojas (IR), de menor energía, solo son capaces de generar
transiciones de vibración o rotación en las moléculas, y son muy específicas de los enlaces, por
lo que se u6lizan en análisis cualita6vo.

N Transmitancia, absorbancia y espectro de absorción.

Para medir la absorción de energía radiante que caracteriza a una molécula, se u6lizan dos
términos: transmitancia y absorbancia.

El espectrofotómetro calcula la intensidad de luz absorbida dividiendo la intensidad de luz

transmi6da (It) entre la intensidad de luz incidente (I0). Este cociente se llama transmitancia (T).

T = (It / I0) T(%) = (It / I0) · 100

La transmitancia no 6ene unidades y varía entre 0 y 1 ó (0% y 100%)

• 0 ó 0%: Cuando no se transmite luz, es decir, absorción total

• 1 ó 100%: Cuando se transmite toda la luz, es decir, no hay absorción

La transmitancia disminuye exponencialmente a medida que aumenta la concentración o el

ancho de la cubeta. Conver6r la transmitancia en absorbancia establece una relación lineal y
posi6va.
La absorbancia es el logaritmo inverso o nega6vo de la transmitancia:

Cuando la transmitancia se expresa en porcentaje, los valores de absorbancia se pueden calcular

de la siguiente manera:

Los espectrofotómetros miden Gsicamente la transmitancia y realizan un cálculo matemá6co

para obtener los valores de absorbancia.

Al estudiar las absorbancias en un rango de longitudes de onda, se ob6ene el espectro de

absorción.

El espectro de absorción es el conjunto de bandas (transiciones electrónicas) que indican la

can@dad de luz absorbida por una sustancia a diferentes longitudes de onda. Es único y
caracterís@co para cada sustancia.

El espectro de absorción se puede representar gráficamente como absorbancia frente a longitud

de onda y muestra diferentes picos de mayor absorbancia en determinadas longitudes de onda.

Estas transiciones pueden ser de tres 6pos: electrónicas, vibracionales o rotacionales, y en las
moléculas, las tres ocurren, dando lugar a espectros de absorción casi con6nuos en comparación
con los espectros de absorción atómicos.
1.3.2. La Ley de Lambert-Beer
En el laboratorio clínico, la mayoría de las
determinaciones se realizan midiendo la absorbancia
de moléculas que se encuentran en disoluciones de
muy baja concentración. Beer estudió cómo se
comporta la luz al atravesar disoluciones coloreadas y,
basándose en los experimentos de Lambert, formuló la
Ley de Lambert-Beer, que permite calcular la
concentración de un analito a través de la medición de
su absorbancia.

La Ley de Lambert-Beer establece que la absorbancia de un analito es directamente

proporcional al coeficiente de absorción de la molécula, a la distancia que recorre el haz de luz
a través de la disolución y a la concentración del analito.

Matemá6camente, se expresa de la siguiente manera:

A=ε·b·c

Donde:

• A es la absorbancia (también conocida como ex6nción o densidad óp6ca) y no 6ene

unidades.
• ε es el coeficiente de ex6nción molar o coeficiente de absorción, que es constante para
un compuesto dado siempre que se mantengan condiciones como la longitud de onda,
el pH, la temperatura, los solventes, etc. Sus unidades son L/(mol · cm).
• b es la longitud que recorre la luz a través de la cubeta que con6ene la disolución,
medida en cenJmetros (cm).
• c es la concentración de la molécula absorbente en la disolución, medida en moles por
litro (mol/L).

N El coeficiente de ex2nción molar

El coeficiente de ex6nción molar depende de la composición química de la molécula, ya que la
absorción de diferentes longitudes de onda está relacionada con el 6po y el número de enlaces
presentes en la molécula.

Existen dos grupos de enlaces que determinan el coeficiente de ex6nción molar:

• Grupos cromóforos: Con6enen enlaces químicos que absorben radiación en el rango de

VIS-UV, como los radicales e6leno (>C=C<), azoico (-N=N-), carbonilo (>C=O), 6azólico
(>C=S), amino (>C=N-), nitroso (-N=O), nitro (-NO), y quinona. La formación de enlaces
conjugados favorece la absorción.
 • Grupos auxocromos: Estos enlaces químicos no absorben luz, pero causan un cambio en
la longitud de onda en la que un grupo cromóforo absorbe, como los radicales hidroxilo
(-OH) y amino (-NH2).

N Linealidad y desviaciones de la ley de Lambert-Beer

La linealidad en el análisis se refiere al intervalo de concentraciones en el cual existe una relación
lineal entre la concentración y la absorbancia, cumpliendo así la Ley de Lambert-Beer.

Si la absorbancia se encuentra fuera de los límites de linealidad, se obtendrán concentraciones

incorrectas, y en ese caso, se debe diluir la muestra para que la concentración quede dentro de
los límites lineales. Por lo tanto, es crucial controlar la concentración y, cuando supera los 0.01
M, diluir la solución.

Las desviaciones de la Ley de

Beer pueden ser causadas por
diversos factores, ya sean de
naturaleza instrumental o
química.

Desviaciones Instrumentales:

Estas desviaciones pueden ser atribuidas a:

1. Alteraciones en la luz incidente: Puede deberse a que la radiación incidente no sea

monocromá6ca. Dado que las moléculas 6enen diferentes coeficientes de absorción
según la longitud de onda, cuando se exponen a varias longitudes de onda
simultáneamente, la relación entre absorbancia y concentración se ve afectada.
2. Errores en la rendija de salida: Estos errores ocurren cuando la anchura y la posición de
la rendija de salida de la luz modifican la longitud de onda que llega a la cubeta.
3. Caracterís6cas de la cubeta: El material de fabricación de la cubeta, su grosor, su estado
de mantenimiento (limpieza, rayaduras, golpes, etc.), su construcción (si las paredes son
perfectamente paralelas o presentan alguna inclinación), entre otros, pueden generar
errores en las mediciones.
4. Problemas en el detector: Se producen cuando al detector llega luz procedente de
fuentes dis6ntas a la fuente de luz.
Desviaciones Químicas:

Para garan6zar mediciones precisas, es fundamental controlar el pH de la solución, ya que

diferentes valores de pH pueden influir en las longitudes de onda absorbidas.

Otros factores químicos que deben considerarse incluyen:

1. La absorbancia del solvente: Si esta absorbancia es significa6va en comparación con la del

soluto, puede afectar las mediciones.
2. Interferencias: La presencia de otros compuestos en la solución que también absorben a
la misma longitud de onda aplicada puede causar problemas.
3. Fenómeno de fluorescencia: Si ocurre fluorescencia en la muestra, puede alterar las
mediciones.
4. Reacciones químicas entre compuestos: Si se producen reacciones químicas entre los
compuestos presentes en la muestra y dan lugar a otros cromógenos, esto también debe
ser tenido en cuenta.

Para evitar mediciones de moléculas dis6ntas a las deseadas, los espectrofotómetros clínicos
suelen realizar mediciones en al menos dos longitudes de onda diferentes para la misma
molécula, una con alta absorbancia y otra con baja absorbancia.

Laboratorio Virtual: hxps://phet.colorado.edu/sims/html/beers-law-lab/latest/beers-law-

lab_all.html?locale=es

1.3.3. Instrumentación: Espectrofotómetro UV-VIS

En la espectrometría de absorción molecular, la instrumentación clave es el espectrofotómetro
UV-VIS. Las caracterís6cas técnicas Jpicas de un espectrofotómetro sencillo pueden incluir:

- Dos lámparas, una para UV y otra para VIS, - Red de difracción con 1,200 líneas/mm.
para un rango de 200-1,000 nm.
- Detector de fotodiodos.
- Ancho de banda espectral de 4 nm.
- Capacidad para 4 cubetas de 10 mm.
- Haz simple.

N Manejo del Espectrofotómetro UV-VIS

A con6nuación, se describe un procedimiento general para el manejo de un espectrofotómetro
UV-VIS de sobremesa. Es importante tener en cuenta que este procedimiento puede variar
ligeramente según la marca y el modelo del espectrofotómetro. El fabricante proporcionará
instrucciones específicas para cada instrumento:

1. Puesta en marcha: Encienda el disposi6vo y espere aproximadamente 20 minutos para

que alcance la temperatura de funcionamiento.
2. Selección de la longitud de onda.
3. Selección del modo de medida: Absorbancia o transmitancia.
4. Selección de la lámpara: Deuterio (UV) o Tungsteno (VIS).
5. Ajuste del 0% de transmitancia, también conocido como corrientes oscuras.
6. Selección de la curva de calibración adecuada para la muestra que se va a medir. Esta
curva incluye el blanco de reac6vos con un 100% de transmitancia.
7. Medición de la muestra problema.
1.3.4. Curvas de Calibrado:
Las desviaciones de la Ley de Beer hacen que su aplicación directa para determinar la presencia
y concentración de una molécula en una muestra mediante la medición de su absorbancia sea
prác6camente imposible. En las muestras biológicas, hay muchas moléculas en disolución
además de la que deseamos medir, y algunas de ellas pueden actuar como interferentes, ya que
absorben en la misma longitud de onda. Además, debemos considerar la absorbancia del
disolvente.

Por lo tanto, antes de realizar una medición espectrofotométrica, es necesario medir las
absorbancias que no se deben a la sustancia que queremos analizar. Estas son:

• La absorbancia debida a las corrientes oscuras o radiaciones, que no proviene de la

fuente de luz y corresponde al 0% de transmitancia.
• La absorbancia debida a la composición de la cubeta, los disolventes y otros reac6vos
u6lizados, que corresponde al 100% de la transmitancia.

La determinación de estas absorbancias se conoce como "blancos" e incluye un blanco de cubeta

y un blanco de reac6vos.

Estos blancos establecen una línea de base de absorbancias sobre la cual se puede aplicar la Ley
de Lambert-Beer. Luego, mediante la medición espectrofotométrica de la muestra, se puede
obtener la concentración de la molécula problema extrapolando este valor sobre una curva de
calibración.

La Ley de Lambert-Beer ajustada sería:

A=ε·b·c+n

Donde "n" representa la absorbancia de los blancos.

Por lo tanto, para establecer la relación entre la absorbancia de la muestra y la concentración

del analito, es necesario realizar previamente un proceso de calibración de la técnica de
medición que permita obtener una relación matemá6ca entre ambas.
N Procedimientos de calibración
El procedimiento de calibrado se puede realizar mediante dos métodos:

• Mediante un factor de calibración.

• Construyendo una curva de calibración.

N Mediante un factor de calibración

Cuando para una determinada molécula (con coeficiente de ex6nción molar e) se dispone de
una disolución patrón (de concentración conocida, cp), se puede calcular la concentración de
otra disolución de la misma sustancia usando un factor de calibración.

Puesto que "b" y "e" 6enen el mismo valor en ambos casos:

La información de la disolución patrón (Cp, Ap) es conocida, y el cociente de la concentración y la

absorbancia se conoce como factor de calibración (K).

Para obtener la concentración problema debemos tener en cuenta, como hemos explicado, el
valor de la absorbancia que se debe restar. Por lo tanto, de la expresión anterior se ob6ene:

Siendo:

• Cm, la concentración de la muestra.

• K = Cp / Ap, el factor de calibración (Cp, la concentración del patrón y Ap, la absorbancia
del patrón).
• Am, la absorbancia de la muestra.
• Ab, la absorbancia del blanco.

La representación gráfica del valor de las concentraciones en abscisas y de las absorbancias en

ordenadas permite obtener una recta cuya pendiente es justamente el factor de calibración y la
ordenada en el origen, la absorbancia del blanco de reac6vos. Una vez obtenida, se extrapola en
la recta el valor de la concentración de la muestra a par6r de la absorbancia medida con el
espectrofotómetro.
Construyendo una curva de calibración (recta a varios puntos):

La curva de calibración es la representación

gráfica de la absorbancia (ordenadas) frente a
la concentración (abscisas). El procedimiento
de construcción es similar a la recta de dos
puntos, pero en este caso, el patrón inicial se
diluye sucesivamente y se determinan los
valores de absorbancia correspondientes. Se
ob6enen así varios puntos o coordenadas (se
emplean un mínimo de 3) que permi6rán
trazar la curva de calibración. La curva de
calibración es la recta que se aproxima lo más
posible a las coordenadas obtenidas y que se
ob6ene por métodos matemá6cos de
regresión lineal. Una vez ensayadas las soluciones problema, su concentración se averigua por
interpolación de las absorbancias de las soluciones problema en la recta de calibración.

1.3.5. Mediciones a punto final, ciné4cas y enzimá4cas:

La espectrofotometría de absorción molecular en UV-VIS también es aplicable a moléculas poco
absorbentes o no absorbentes a las longitudes de onda UV-VIS u6lizando métodos indirectos.
Estos métodos consisten en hacer reaccionar las moléculas con otros compuestos para formar
derivados absorbentes. La mayoría de las magnitudes bioquímicas, analitos, no absorben luz y
es necesario usar reac6vos comerciales que, en presencia del analito, desencadenan una serie
de reacciones que dan lugar a una sustancia mensurable por el equipo instrumental.

Siendo:

• A, el analito.
• B y C, reac6vos comerciales.
• D y/o E, sustancias mensurables.

Cuando las reacciones analí6cas se diseñan para transformar el analito en una sustancia que
absorba dentro de la región visible del espectro electromagné6co (la disolución adquiere color),
se habla de métodos colorimétricos.

En ciertas reacciones, la sustancia mensurable espectrofotométricamente se consigue con la

intervención de enzimas. La enzima realiza su función ante la presencia de un sustrato adecuado.
El sustrato se une al si6o ac6vo de la enzima, y se forma un complejo enzima-sustrato. El sustrato,
por acción de la enzima, es transformado en producto y es liberado del si6o ac6vo, quedando
libre para recibir otro sustrato. La ecuación general es la siguiente:

E + S ⇌ ES ⇌ EP ⇌ E + P
Los métodos analí6cos que u6lizan enzimas entre sus reac6vos se conocen como métodos
enzimá:cos.

Teniendo en cuenta este 6po de reacciones, el cálculo de las magnitudes bioquímicas se divide
en tres grandes grupos:

1. El cálculo de la concentración en técnicas de punto final.

2. El cálculo de la concentración en técnicas ciné6cas.
3. El cálculo de la ac6vidad enzimá6ca.

N Cálculo de la concentración a punto final:

A punto final significa que la reacción entre la muestra y los reac6vos se ha producido
completamente, es decir, que en la reacción:

A+B+C→D+E

se habrá agotado A, B y/o C, y se habrá formado D y/o E.

En bioquímica, un sustrato es una molécula sobre la que actúa una enzima. Las enzimas catalizan
reacciones químicas en las que el sustrato o los sustratos toman parte. Así, en las
determinaciones con reac6vos comerciales suele haber exceso de reac6vos para asegurar que
el analito reacciona en su totalidad en las condiciones de temperatura, pH y 6empo indicadas en
los protocolos de trabajo.

En esta situación, la concentración del analito es directamente proporcional a la concentración

de alguno de los productos formados en la reacción. En las condiciones establecidas por el
protocolo de la casa comercial, se cumple la ley de Lambert-Beer y se emplea un factor de
calibración para el cálculo de la concentración o se aplican factores de conversión:

Cproblema = Cpatrón · (Aproblema / Apatrón)

Medición a punto final en reacciones colorimétricas:

La técnica colorimétrica consiste en la determinación por colorimetría de la concentración de

una sustancia o bien del producto de su reacción con un reac6vo específico. La absorbancia del
producto obtenido es proporcional a la concentración del analito en la muestra.

Analito + reac6vo → Producto coloreado

Un ejemplo de este 6po de técnica es la medida del calcio por el método de la ortocresolnaleína
complexona: en un medio alcalino, el calcio forma un complejo violeta al añadirse
ortocresolnaleína complexona a la muestra.
Medición a punto final en reacciones enzimá:cas:

De la misma manera, en los métodos enzimá6cos, la concentración del sustrato podrá

determinarse a punto final. El método consiste en acoplar una reacción enzimá6ca, de forma
que la sustancia problema es sustrato de una enzima específica. Esta enzima transforma la
sustancia problema en un producto coloreado que absorbe en el UV-visible, de forma que pueda
leerse en el espectrofotómetro. La concentración del producto coloreado obtenido es
proporcional a la concentración de la sustancia problema.

Un ejemplo de este 6po de medición se encuentra en el método de la hexoquinasa. Se trata de

un método enzimá6co para medir la concentración de glucosa a punto final.

Acción de la hexoquinasa:

Glucosa + ATP → Glucosa-6-fosfato

Glucosa-6-fosfatodeshidrogenasa:

Glucosa-6-fosfato → Gluconato-6-fosfato + NADP+ + NADPH + H+

La can6dad de NADPH (coloreado) formado es proporcional a la can6dad de glucosa. Esta

segunda reacción es la llamada reacción auxiliar. Observa que la única diferencia respecto a una
técnica calorimétrica es que en lugar de establecerse una reacción química con la sustancia
problema, se establece una reacción enzimá6ca.

N Cálculo de la concentración en técnicas ciné2cas:

En las determinaciones ciné6cas se mide la velocidad de la reacción antes de que esta concluya.
Es muy importante mantener las condiciones de la reacción descritas en los protocolos
comerciales sobre temperatura, 6empo de medida, etc., para garan6zar la fiabilidad de los
resultados.

En las determinaciones ciné6cas, la variación de la absorbancia por unidad de 6empo es

proporcional a la concentración y/o ac6vidad del analito. Esto se debe a que la presencia del
analito en la muestra va a dar lugar a la aparición o desaparición de sustancias capaces de
absorber la radiación a la longitud de onda de medida.

La ley de Lambert-Beer que se aplica en estos casos queda modificada o adaptada como:

ΔA = ε · b · Δc

Siendo ΔA, la variación de la absorbancia.

Generalmente se toma el minuto como unidad de 6empo de medida de la variación de la
absorbancia, por lo que se expresa:

ΔA/min = ε · b · Δc

Al ser ε y b dos valores constantes, se expresa su producto como un factor numérico, F, que a
menudo proporcionan las casas comerciales, de tal manera que la concentración del parámetro
viene expresada como:

C = ΔA/min · F

La reacción que da lugar a una variación de la absorbancia se desencadena al añadir los otros
reac6vos a la muestra biológica y con las condiciones de reacción controladas. A mayor
concentración del parámetro biológico, mayor será la variación de absorbancia en la unidad de
6empo.

Cuando se dispone de una disolución con concentración conocida se puede calcular la

concentración desconocida a par6r de las variaciones de absorbancia usando factores de
conversión:

Mediciones ciné:cas en reacciones enzimá:cas:

En el método enzimá6co, la enzima añadida como parte de los reac6vos al unirse al parámetro
desencadena una reacción que en este caso permite su determinación por variación de la
absorbancia por unidad de 6empo. Un ejemplo de este 6po de medición es el método de la
glucosa oxidasa.

Para la determinación de la glucosa es muy conocida la técnica de Trínder, la enzima que actúa
sobre la glucosa es la glucosa oxidasa (GOD), transformándola en agua oxigenada y ácido
glucónico:

El agua oxigenada formada se hace reaccionar con fenol y 4-aminofenazona (4-AF) para formar
un complejo que, en presencia de una segunda enzima, la peroxidasa (POD), transforma este
complejo en quinona, un producto rojo que ahora sí puede ser leído al espectrofotómetro.
Es una técnica ciné6ca y el incremento de absorbancia es directamente proporcional a la
can6dad de glucosa en la muestra.

N Cálculo de la ac2vidad enzimá2ca:

La concentración de enzimas en suero es muy baja, sin embargo, dada su elevada capacidad
catalí6ca, es posible determinar su ac6vidad y presuponer que dicha capacidad es proporcional
a su concentración. El cálculo de la ac6vidad enzimá6ca se realiza midiendo la velocidad de
reacción, es decir, midiendo la can6dad de sustrato que desaparece o la can6dad de producto
que se forma en un intervalo de 6empo. Las reacciones enzimá6cas son muy sensibles a las
condiciones de reacción, por lo que se debe controlar muy bien la temperatura, así como el pH
y las concentraciones de reac6vos.

La medición de la absorbancia puede ser a un 6empo fijo o una medición con6nua. De la misma
manera que en el cálculo de concentración de sustratos, se pueden necesitar reacciones
auxiliares.

Métodos a punto final:

Se ponen en contacto reac6vo y muestra (enzima) y se determina la absorbancia a la longitud

de onda indicada. Tras un 6empo establecido, se de6ene la reacción (desnaturalización de la
enzima) y se mide la absorbancia final. El método a punto final puede ser:

- A un punto: cuando la enzima no 6ene periodo de incubación.

- A dos puntos: cuando existe un periodo de incubación. Se realizan dos medidas: una tras
el periodo de incubación y otra al final de la reacción.

Métodos ciné:cos:

Estos métodos son mejores porque si se detectan desvíos de la linealidad se puede despreciar
alguna de las medidas y porque permiten asegurar que la condición de velocidad constante se
man6ene durante todo el 6empo del ensayo. Esto suele ocurrir con grandes concentraciones de
enzima, que agotan enseguida el sustrato, con lo que se produce una bajada en la velocidad de
reacción. Los pasos son los siguientes:

1. Se ponen en contacto los reac6vos y la muestra (enzima).

2. Se determina la absorbancia a la longitud de onda indicada.

3. Se realizan lecturas cada minuto durante 3-5 minutos para estar seguros de que se está
trabajando en la fase lineal de la curva.

La ac6vidad enzimá6ca se expresa en unidades de ac6vidad enzimá6ca (U) que es la can6dad de

enzima que cataliza la transformación de un micromol de sustrato por minuto. La concentración
catalí6ca se expresa como U/1.

En el Sistema Internacional de Unidades (SI) se u6liza el katal. Un katal es la unidad de medida

de la ac6vidad catalí6ca de una enzima que especifica la can6dad de moles de enzima que son
necesarios para transformar un mol de sustrato en un segundo. Un katal equivale a 60 · 10^6 UI.
Como se trata de una unidad muy grande se u6lizan los submúl6plos micro y nano katal.

1.3.6. Espectrometría de absorción molecular en el infrarrojo:

Esta técnica se usa para averiguar la composición química de los cálculos urinarios. Se construye
una gráfica que representa el porcentaje de transmitancia frente a la longitud de onda
(expresada en cm^-1). Dependiendo de la composición del cálculo urinario, se obtendrá un 6po
de gráfica que se compara con gráficos patrones.
1.4. Espectrometría de absorción atómica
La espectrometría de absorción atómica se basa en la capacidad de los electrones de un
elemento químico de pasar de su capa de valencia (estado basal) a orbitales de mayor energía
(estado excitado) gracias a la energía absorbida en forma de radiación electromagné6ca UV-VIS.

Estas transiciones de electrones entre orbitales atómicos son caracterís6cas de cada elemento
químico.

Las longitudes de onda que absorbe un elemento químico @enen un ancho de banda muy
estrecho y se denominan líneas espectrales.

Cada elemento químico 6ene una línea de

espectro única y, por tanto, la
espectrometría de absorción nos va a
permi6r la determinación de elementos
químicos presentes en una muestra.

En el laboratorio de bioquímica se emplea para medir la concentración en los líquidos biológicos

de metales como aluminio, arsénico, bario, cadmio, calcio, cobre, cromo, hierro, li6o, magnesio,
manganeso, mercurio, níquel, plata, pla6no, plomo, selenio y cinc, cuya presencia en
determinadas concentraciones puede resultar tóxica para el organismo.

Para conseguir la absorción atómica es necesaria la transformación de la muestra a vapor

atómico mediante el proceso de atomización.

Existen dos sistemas de atomización, por llama o por electrotermia en horno de grafito que dan
lugar a los dos métodos de espectrofotometría de absorción atómica con que se trabaja:

• Espectrometría de absorción atómica con llama.

• Espectrometría de absorción atómica con atomización electrotérmica.
1.4.1. Espectrometría de absorción atómica con llama
La atomización por llama es un método más preciso y se usa cuando las concentraciones que se
van a medir son bajas, de partes por millón (ppm).

hxps://www.youtube.com/watch?v=-CjvW1GHVGM

N Instrumentación
El espectrofotómetro de absorción atómica es similar al descrito para la espectrofotometría de
absorción molecular, puesto que dispone de monocromador, detector y sistema de registro,
además de rejilla de entrada y de salida. Pero 6enen caracterís6cas propias en cuanto a la fuente
de radiación y al tratamiento de la muestra.

Fuente de radiación

Para conseguir la longitud de onda monocromá6ca que se necesita se u6lizan las lámparas de
cátodo hueco (una lámpara de vidrio que con6ene en su interior un gas inerte, como argón o
neón, y el electrodo de trabajo).

El cátodo es del material del mismo elemento que se pretende analizar en la muestra (analito).
Los átomos del cátodo se excitan al chocar con los átomos del gas emi6endo la radiación
caracterís6ca del elemento que se analiza. Existen lámparas con varios cátodos que permiten la
medida de varios elementos atómicos a la vez.

Sistema de atomización por llama

Es el sistema encargado de producir la llama con la que se atomiza la muestra. Está cons6tuido
por un nebulizador, la cámara de premezcla y el quemador.
La muestra es aspirada por un capilar hasta el nebulizador. En el nebulizador se produce la
transformación de la muestra líquida en un aerosol por disminución del tamaño de las parJculas.
La muestra nebulizada se mezcla con los gases en la cámara de premezcla y en el quemador se
somete a la llama. Se produce, entonces, la transformación en átomos elementales, que es la
especie absorbente.

Las caracterís6cas de cada llama (forma, temperatura, velocidad de combus6ón) dependen de

la mezcla de gases que la componen. Por ejemplo, la mezcla de oxígeno con ace6leno origina
temperaturas de 3.000 ºC.

Interferencias

En absorción atómica se pueden producir tres 6pos de interferencias:

• Químicas cuando existen moléculas que impiden la atomización de los metales.

• De ionización cuando los iones emiten a la longitud de onda que se mide.
• De matriz cuando se producen aumentos de absorción debido al disolvente o a la
formación de compuestos que absorben a la longitud de onda que se mide.

Medición y calibrado

Para la medición de los metales se u6lizan calibraciones para un intervalo concreto de

concentraciones, donde se comprueba la linealidad de la curva con patrones externos. También
se puede usar el método de adiciones estándar, que consiste en preparar los patrones con el
disolvente usado para preparar la muestra.

1.4.2. Espectrometría de absorción atómica con atomización

electrotérmica
La espectrofotometría de absorción atómica con atomización electrotérmica u horno de grafito
es más sensible que la atomización con llama y se u@liza cuando los metales que se van a medir
se encuentran en muy baja concentración.

N Instrumentación
El sistema de atomización se consigue por medio del horno de grafito. Este horno está formado
por:

1. Un tubo de grafito sujeto por dos electrodos. El tubo 6ene un orificio central por donde
se introduce la muestra.
2. Un sistema de refrigeración por agua y gas.

Los electrodos dan lugar a una corriente que atomiza rápidamente la muestra.
 N Interferencias, medición y calibrado
Sirven los mismos comentarios e indicaciones que se han dado en la espectrofotometría de
absorción en llama.

1.5. Espectrometría de emisión atómica

Algunos elementos químicos, tras ser excitados aplicándoles calor, vuelven a su estado
fundamental. El sobrante de energía de pasar del estado excitado al no excitado se emite en
forma de radiación luminosa, cuya longitud de onda es caracterís@ca de cada elemento.

La intensidad luminosa producida por los átomos resulta directamente proporcional al número
de átomos excitados y, en consecuencia, a la concentración del compuesto en la muestra. Por
tanto, en la espectrometría de emisión atómica se u6liza la intensidad luminosa para determinar
la can6dad de un elemento químico presente en una muestra biológica.

Según el sistema de atomización y la temperatura a la que se produce, existen dos métodos de

espectrofotometría de emisión atómica:

• Espectrometría de emisión atómica con llama o fotometría de llama.

• Espectrometría de emisión atómica por plasma.

1.5.1. Fotometría de llama

La fotometría de llama u6liza el calor aplicado
mediante llama para producir la atomización y la
excitación atómica, y la posterior emisión de luz
cuando vuelven al estado fundamental.

La fotometría de llama se u6lizó en el laboratorio

clínico para determinar cuan6ta6vamente
elementos químicos en muestras biológicas
como el Li, Na y K pero actualmente ha sido
sus6tuida por las técnicas de electrodo
selec6vo.

N Instrumentación
El fotómetro de llama 6ene un sistema de atomización igual al del espectrofotómetro de
absorción atómica por llama, pero carece de la fuente de luz:
 N Interferencias, medición y calibrado
En fotometría de llama se u6liza el llamado estándar interno para controlar la variabilidad de la
llama. El patrón interno es una sustancia que está ausente en la muestra y emite a longitud de
onda alejada de los elementos que se van a medir, de modo que no interfiera en la detección de
estos, y se añade tanto a la muestra como a los calibradores.

El estándar interno funciona produciendo una señal de referencia frente a la cual se puede
medir la emisión de otros elementos, de modo que el fotómetro hace una comparación de
emisión de los elementos deseados y del elemento de referencia.

De esta manera, las variaciones que pueden darse en la velocidad de aspiración, atomización,
viscosidad de la solución, temperatura y estabilidad de la llama, afectan por igual al estándar
interno y al elemento que se va a medir.

Aunque la intensidad de la emisión del elemento medido y la del patrón interno pueden variar,
no sucede lo mismo con la relación entre ambos. De esta forma, el uso de estándar interno
permite de terminaciones más precisas y exactas.
1.5.2. Espectrometría de emisión atómica por plasma
Las técnicas espectroscópicas de emisión atómica emplean como sistema de atomización el
plasma.

El plasma es una mezcla gaseosa conductora de la electricidad cons@tuida por ca@ones y

electrones.

El plasma más u6lizado en los espectrómetros es el argón que alcanza temperaturas de 10.000
K. Estas alJsimas temperaturas permiten una elevada eficiencia en la atomización, haciendo
posible medir la emisión de varios átomos a la vez y determinar gran can6dad de elementos
químicos.

En bioquímica clínica esta técnica no se u6liza de forma habitual.

1.6. Espectrometría de luminiscencia

Se en@ende por luminiscencia todo fenómeno de emisión de luz que no está asociado a altas
temperaturas.

Es la llamada luz fría, en contraposición a la luz procedente de incandescencia. Según el origen

de la excitación, los fenómenos luminiscentes se clasifican en:

Ø Fotoluminiscencia. La excitación 6ene lugar por absorción de fotones. Puede ser:

o Fosforescencia.
o Fluorescencia.
Ø Quimioluminiscencia. La energía de excitación proviene de una reacción química.
Ø Bioluminiscencia. Cuando la quimioluminiscencia 6ene lugar en un ser vivo. Uno de los más
conocidos es el de la luz emi6da por las luciérnagas, que se produce por el sistema
enzimá6co luciferina/luciferasa: la oxidación de la luciferina por parte de la luciferasa da
lugar a la emisión de luz.
Ø Electroquimioluminiscencia. Se aplica una corriente eléctrica que provoca la excitación de
un material (rutenio) que al volver a su estado normal emite luz fría.

La espectrometría de luminiscencia se basa en la medición de intensidad de la luz emi6da para

determinar la concentración de la sustancia luminiscente en la muestra.
1.6.1. Fotoluminiscencia
Para que una sustancia origine emisión
fotoluminiscente es necesario que previamente
tenga lugar la absorción de radiación
electromagné6ca y un electrón pase a un nivel
energé6co superior. Este electrón al volver a su
estado fundamental emite una radiación de mayor
longitud de onda que la recibida (menor energía).

Dependiendo del 6empo que dura la emisión hablamos de:

• Fluorescencia, se emite durante un corto periodo, ronda los 10-8 segundos.

• Fosforescencia cuando se emite durante un largo periodo, incluso horas.

La fluorescencia es una técnica muy u6lizada en los inmunoanálisis mientras que la

fosforescencia se usa menos en los laboratorios clínicos.
 N Espectrometría de fluorescencia
La espectrometría de fluorescencia o fluorimetría mide la luz fluorescente emi@da por
moléculas que poseen anillos aromá@cos o dobles enlaces conjugados.

La intensidad de luz emi6da por estas moléculas es proporcional a su concentración en la

muestra y a la intensidad de la fuente de luz emisora, pero también depende de otros factores
relacionados con el instrumento de medición.

La mayor ventaja de la fluorimetría es su enorme sensibilidad debida al retardo existente entre

la excitación y la emisión de la luz fluorescente. Esto hace que sea una técnica muy u6lizada para
determinar analitos presentes en muy bajas concentraciones.

1.6.2. Quimioluminiscencia
La quimioluminiscencia se produce cuando una reacción química genera una molécula excitada
electrónicamente, la cual emite luz al volver a un estado de menor energía.

La reacción química que se produce es la oxidación de un compuesto orgánico (luminol,

isoluminol, éster de acridinio) por un oxidante (peróxido de hidrógeno, hipoclorito, oxígeno) y la
luz es emi6da por el producto formado en la reacción de oxi dación. Estas reacciones ocurren en
presencia de enzimas (fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano).

La espectrometría de quimioluminiscencia también se aplica en las técnicas de inmunoanálisis

(inmunoquimioluminiscencia) para cuan6ficar sustancias a muy baja concentración, en la
detección de trazas de sangre en el escenario de un crimen, en heces, etc.

1.7. Espectrometría de dispersión de la radiación

La espectrometría de dispersión trabaja con suspensiones. Habitualmente estas suspensiones
están formadas por agregados procedentes de reacciones anJgeno-an6cuerpo.

Cuando un haz de luz choca con una parJcula en suspensión, una parte de esa luz es dispersada,
otra absorbida, otra reflejada y otra transmi6da.
La dispersión de la luz y su intensidad dependen de varios factores:

- La longitud de onda de la radiación incidente

- El tamaño y peso molecular de la parJcula
- La distancia entre la cubeta de la muestra y el detector
- La concentración de parJculas en la muestra.

Todos estos factores se relacionan entre sí median te fórmulas matemá6cas complejas que
cons6tuyen la ley de Rayleigh. Esta teoría expone que la dispersión de la luz es:

• Directamente proporcional a la concentración de las parJculas de la muestra.

• Directamente proporcional al peso molecular de las parJculas de la muestra.
• Inversamente proporcional al cuadrado de la distancia entre el detector y la cubeta.
• Inversamente proporcional a la cuarta potencia de la longitud de onda.

Las técnicas de espectrometría de dispersión que permiten la determinación de la concentración

de parJculas en suspensión son la turbidimetría y la nefelometría. En el laboratorio clínico se
usan para determinar las proteínas plasmá6cas específicas como la albúmina, las
apolipoproteínas, las ceruloplasmina, etc.

1.7.1. Turbidimetría
La turbidimetría es la técnica de análisis cuan6ta6vo que consiste en medir la disminución de la
intensidad del haz de luz (transmitancia) que atraviesa la cubeta que con6ene la suspensión.

Es una técnica poco sensible y se u6liza cuando las concentraciones de la parJcula en suspensión
son altas.

El instrumento que se u6liza para medir la turbidez de la muestra es el espectrofotómetro de

absorción molecular VIS-UV.

La concentración de las parJculas es inversamente proporcional a la luz transmi6da y se cumple

la ley de Beer.

Sus6tuyendo el coeficiente de absorción por una constante k que depende del tamaño y la forma
de las parJculas y de la longitud de onda de la fuente de radicación, la expresión que permite el
cálculo es:

A=K·b·c
Es necesario establecer una curva de calibración para poder extrapolar las absorbancias
problema.

1.7.2. Nefelometría
La nefelometría es la técnica de análisis cuan6ta6vo de suspensiones que consiste en medir la
intensidad de luz dispersada en un ángulo determinado.
Los nefelómetros son parecidos a los fluorímetros, pero la longitud de onda que se emite es igual
que la que se mide (la dispersada). Como en los posibles modelos de dispersión la mayor parte
de la radiación se produce hacia delante, los detectores se colocan situados en ángulos entre
1Oº y 90º respecto a la cubeta.

1.8. Refractometría de líquidos

La refractometría de líquidos es una técnica de análisis cuan6ta6vo basada en el fenómeno de
refracción de la luz.

La refracción es el desvío o cambio de dirección que experimenta un haz de luz al atravesar una
solución sobre la que incide, ocasionado por la diferente naturaleza del medio de propagación
(aire-solución).

El ángulo de desvío se denomina ángulo de refracción.

La luz se propaga con una velocidad u otra según el medio de propagación y este hecho es el que
explica que tenga lugar un desvío en la dirección cuando se produce un cambio de medio en su
propagación.

La ley de Snell relaciona la variación de velocidad con el cambio de dirección mediante la

expresión matemá6ca:

Dado que la velocidad de la luz solo depende del medio de propagación, la relación Vi/Vr es
constante para dos medios. Esta constante se conoce como el índice de refracción.

El índice de refracción (n) de una solución es la relación que se establece entre la velocidad de
la luz en el vacío (e) y la velocidad de la luz a su paso por esta solución (v).
El valor del índice de refracción es directamente proporcional a la can:dad de sustancias
disueltas en una solución y varía dependiendo de diferentes caracterís6cas como la
concentración de sustancias disueltas, el 6po de disolvente, etc. Por tanto, se puede calcular la
concentración de solutos en una solución midiendo su índice de refracción.

Los refractómetros clínicos son los instrumentos que se u6lizan en la refractometría de líquidos.
Se basan en el fenómeno de la refracción de la luz para medir la concentración de sustancias
disueltas en una solución acuosa. Las determinaciones se realizan gracias a la refracción entre el
prisma, de índice de refracción elevado, y la muestra.

En el caso de muestras de baja concentración, la diferencia entre los índices de refracción de la

muestra y el prisma es elevada, y el ángulo de refracción es amplio. Cuando las muestras
presentan una concentración de solutos elevada, la diferencia entre los índices es menor y, por
lo tanto, el ángulo de refracción también es menor.

En el laboratorio de análisis clínicos el refractómetro se emplea para la medición de la

concentración de solutos tales como la albúmina en muestras sé ricas y/o plasmá6cas, y la
medida del peso específico en orina, pero en la actualidad se u6liza poco ya que sus medidas
están incluidas en otros sistemas analí6cos más sencillos, rápidos (como la 6ra reac6va) y
automa6zados (autoanalizadores que incluyen tanto el peso específico como la concentración
de albúmina).