Instituto Superior de formación técnica N° 201

Procesos de laboratorio 2
Tema: Serología
Para entender las técnicas inmunoquímicas, primero debemos comprender conceptos básicos sobre inmunología.
Los animales superiores son atacados por microorganismos y partículas extrañas, pero, poseen sistemas
defensivos frente a tales patógenos; dichos mecanismos tienden a distinguir lo propio de lo extraño
La inmunidad es un conjunto de mecanismos de defensa de los animales frente a agentes externos extraños. Se
adquiere al nacer, y va madurando y consolidándose durante los primeros años de vida.
La inmunología es la ciencia biológica que estudia todos los mecanismos fisiológicos de defensa de la integridad
biológica del organismo.
Dichos mecanismos consisten esencialmente en la identificación de lo extraño y su destrucción.
La inmunología también estudia los factores inespecíficos que coadyuvan a los anteriores en sus efectos finales.
La respuesta inmune es la actuación integrada de un gran número de mecanismos heterogéneos de defensa
contra sustancias y agentes extraños.
En general, a las sustancias extrañas se las denomina como antígenos, y son ellos los que desencadenan en el
organismo una serie de eventos celulares que provocan la producción de los mecanismos de defensa.

Anticuerpos

El sistema inmunitario es capaz de activar dos clases de respuestas: una respuesta inmune innata, rápida e
inespecífica, y una respuesta inmune adaptativa, más lenta pero distinta para cada patógeno y con capacidad de
crear memoria. La respuesta inmune adaptativa, a su vez, se divide en la respuesta celular y humoral. Ésta última
se caracteriza principalmente por la producción de anticuerpos (inmunoglobulinas, Ig).

¿Qué son los anticuerpos?

Los anticuerpos son proteínas cuya función consiste en detectar cualquier elemento extraño que pueda entrar en
el organismo. Normalmente detectan partes concretas de esos elementos, por ejemplo, proteínas de la superficie
bacteriana o vírica, lo que se denomina “antígeno” (bacteriano o vírico respectivamente). Cuando los anticuerpos
se unen a estas proteínas extrañas, actúan como marcador, facilitando que sean reconocidos y eliminados por las
células del sistema inmune.
Los anticuerpos son sintetizados en los linfocitos B e inicialmente actúan como receptores en la membrana de
estas células. Cuando esta célula se activa por el reconocimiento de un antígeno, se convierte en una célula
plasmática productora de anticuerpos, que serán liberados al torrente sanguíneo, donde circularán libremente.
Las células B activadas también se pueden convertir en linfocitos B de memoria, que van a permitir una respuesta
más rápida del sistema inmune cuando entran de nuevo en contacto con este agente infeccioso.
La estructura de todos los anticuerpos es muy parecida. Por un lado disponen de una sección denominada “región
constante”, que es la que puede unirse a los receptores de las células inmunes, como los macrófagos o
los mastocitos, y por otro lado tienen también una “parte variable”, que es la que reconoce el antígeno. Esta parte
variable se denomina así pues es específica para cada antígeno, según sea la célula B que lo produzca. Este
mecanismo de variabilidad permite al sistema inmunológico generar una gran batería de anticuerpos, únicos y
específicos para un determinado antígeno, e iniciar así una respuesta adaptada según el agente patógeno.

Los anticuerpos pueden ser divididos en cinco clases: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE

Clases de anticuerpos
Los anticuerpos (inmunoglobulinas) se dividen en distintas clases según su actividad biológica, es decir su funcionalidad:
  IgM: es el primer anticuerpo que se genera durante la respuesta inmune. Puede encontrarse como receptor en los
linfocitos B y es importante en la activación de la vía del complemento.
 IgD: su función principal consiste en servir como receptor en los linfocitos B que no han sido expuestos al antígeno.
 IgA: su función es la defensa inmune en las mucosas.
 IgG: tiene un importante papel en la defensa contra patógenos que invaden el cuerpo. Son abundantes en
circulación sanguínea y son los únicos capaces de atravesar la placenta.
 IgE: juega un papel importante en la defensa contra gusanos y parásitos. Está también implicado en respuestas
alérgicas. Su función se asocia a la de los mastocitos .

Antígenos

El principio básico de cualquier técnica inmunoquímica es el de que un anticuerpo específico se unirá con un
antígeno específico para dar un complejo anticuerpo-antígeno exclusivo.
La definición clásica de antígeno es cualquier sustancia foránea que elicita una respuesta inmune cuando es
introducida dentro de tejidos de animales susceptibles y que son capaces de combinar con los anticuerpos
específicos formados.
Los antígenos son generalmente de alto peso molecular y comúnmente son proteínas o polisacáridos.
Polipéptidos, lípidos, ácidos nucleicos y otras moléculas pueden también funcionar como antígenos. La respuesta
inmune puede también ser generada contra sustancias pequeñas, llamadas haptenos
Un hapteno es una sustancia química de pequeño peso molecular que no induce por sí misma la formación de
anticuerpos pero al unirse a una proteína transportadora como la albúmina estimula una respuesta inmunitaria.
Cualquier sustancia foránea será identificada por el sistema inmune y evocará la producción de un anticuerpo
específico. Sin embargo, esta respuesta inmune específica es altamente variable y depende mucho en parte del
tamaño, estructura y composición de los antígenos.
Los antígenos que elicitan una fuerte respuesta inmune se dice que son altamente inmunogénicos.
Las partes de las regiones hipervariables del anticuerpo que contactan con el antígeno se denominan parátopos
(es el lugar específico de unión del anticuerpo al epitopo de su antígeno correspondiente) y la región de un
antígeno que puede específicamente unirse a un anticuerpo es llamado epítope. El epitopo o determinante
antigénico es la porción de una macromolécula que es reconocida por el sistema inmunitario

Interacción antígeno-anticuerpo

Los antígenos y anticuerpos interactúan por complementariedad espacial y no por uniones covalentes. Todos
estos son uniones débiles no covalentes

Anticuerpos monoclonales y policlonales

Cuando se diseña un procedimiento experimental, es importante diferenciar entre anticuerpos monoclonales y

policlonales, ya que estas diferencias son el fundamento de las ventajas y limitaciones en su uso.
Muchos de los anticuerpos usados en técnicas inmunoquímicas son producidos por inmunización repetida de un
adecuado animal, por ejemplo, conejo, cabra u oveja, con una suspensión del antígeno apropiado. El suero es
tomado en el pico de producción del anticuerpo. Concentraciones específicas de IgG de aproximadamente 1 a
10mg/ml de suero pueden ser obtenidas con este método.
Algunos usos de las propiedades de anticuerpos policlonales son:
• Los anticuerpos policlonales frecuentemente reconocen múltiples epítopes haciéndolos más tolerantes a
pequeños cambios en la naturaleza del antígeno. Son frecuentemente la opción preferida para la
detección de proteínas desnaturalizadas.
• Pueden ser generados en una variedad de especies, incluyendo conejos, cabras, ovejas, asnos, gallinas y
otros, dándole al usuario muchas opciones en el diseño experimenta.
  Los anticuerpos policlonales son a veces usados cuando la naturaleza del antígeno en una especie no
estudiada no se conoce.
• Los anticuerpos policlonales se une a múltiples epítopes y así ellos generalmente proveen una detección
más robusta.
Algunos usos y propiedades de anticuerpos monoclonales son:
• Debido a su especificidad, los anticuerpos monoclonales son excelentes como anticuerpos primarios en un
ensayo, o para detectar antígenos en un tejido y frecuentemente dan significativamente menos tinción de fondo
que los anticuerpos policlonales.
• Cuando se compara con los anticuerpos policlonales, la homogeneidad de los anticuerpos monoclonales es muy
alta. Si las condiciones experimentales se mantienen constantes, los resultados provenientes de anticuerpos
monoclonales son altamente reproducibles entre experimentos.
• La especificidad de los anticuerpos monoclonales los hacen extremadamente eficientes para la unión al
antígeno dentro de una mezcla de moléculas relacionadas, como para el caso de la purificación por afinidad.

Técnicas inmunoquímicas

Dentro de los procedimientos inmunológicos, los más útiles y prácticos son aquellos que se basan en la
especificidad de la unión Ag-Ac.
La propiedad que tienen las Igs de unirse a un Ag, la especificidad de esta unión y el hecho de que pueda ser
visualizable por los fenómenos de precipitación, aglutinación y otros mecanismos indirectos (marcaje con
fluoresceína, con radioisótopos o con enzimas) hacen que estos métodos se empleen ampliamente.
Dado que los antígenos y anticuerpos se definen por sus interacciones mutuas, uno de ellos puede utilizarse para
cuantificar al otro. Si disponemos de una solución de un anticuerpo 20 monoclonal, podemos definir su afinidad y
especificidad con considerable confiabilidad y, si está en estado puro y en su conformación nativa, conoceremos
que la concentración de anticuerpos es la misma que la de la inmunoglobulina, en mg/mL u otra unidad.
Los sueros pueden compararse de acuerdo con su contenido de anticuerpos, ya sea por la determinación de
cuantos anticuerpos se unen al antígeno en una dilución fija del suero o por la comprobación de una dilución
seriada del suero para comprobar a que nivel una cantidad estándar de antígeno es suficiente para dar un
resultado positivo de la unión. Éste es denominado título de anticuerpos.
Existen diversos métodos basados en procedimientos distintos para visualizar la unión Ag-Ac

Principales métodos analíticos basados en la unión Ag-Ac

Complejo Ag-Ac: Técnicas de inmunoprecipitación (técnica de Ouchterlony, Inmunoelectroforesis, difusión radial

Mancini, nefelometría, etc

Aglutinado : Técnicas de inmunoaglutinación. (Hemaglutinación directa e indirecta y otras técnicas con látex, etc.)

Fluorocromo: Técnicas inmunofluorimétricas

Radioisótopos: Técnicas inmunorradiológicas (Radioinmunoensayo -RIA-)

Enzimas: Técnicas inmunoenzimáticas

Así tenemos:

1. Técnicas de aglutinación. Cuando el antígeno se encuentra unido o formando parte de células, bacterias o
partículas, la reacción Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el aglutinado celular o bacteriano formado.
2. Técnicas de fluorescencia y citometría de flujo. Para la realización de estas técnicas el anticuerpo se marca con
un fluorocromo detectándose la formación del complejo Ag-Ac por la fluorescencia emitida.
3. Técnicas de radioinmunoensayo. En estas técnicas al anticuerpo se une un isótopo radiactivo siendo posible la
cuantificación del complejo Ag-Ac a través de la radiactividad emitida.
4. Cromatografía de afinidad. La especificidad de la unión Ag-Ac puede utilizarse para obtener Acs y Ags puros.
5. Inmunoprecipitación e inmunoblotting. Permite detectar la presencia y cantidad de antígenos y anticuerpos
específicos.

Técnicas de precipitación

Existen diferentes modalidades siendo las principales:

1. Técnica de precipitación propiamente dicha: El complejo Ag-Ac precipita espontáneamente o por
centrifugación cuando la proporción de Ags y Acs de la mezcla es equivalente.
2. Técnica de difusión radial de Ouchterlony. Esta técnica se realiza en placas de agar en donde se practican
pocillos, en uno de estos pozos se coloca el suero o muestras a investigar y en el resto se coloca el anticuerpo
preparado frente a la sustancia que se quiere identificar. Cuando difunden, ambos sistemas se encontrarán y se
formará en la zona de equivalencia el complejo Ag-Ac correspondiente que se hace visible en forma de una línea
de precipitación. En una preparación que contenga varios antígenos, se obtendrán múltiples líneas de
precipitado. La técnica de Ouchterlony permite identificar sustancias según la forma de unirse las líneas de
precipitación de dos o varios sistemas.
3. Técnica de inmunoelectroforesis. Esta técnica puede utilizarse en la identificación de las proteínas de mieloma
4.Técnica de difusión radial simple de Mancini. Esta técnica se basa en la difusión y se expresa al final en forma un
anillo de precipitación.
Este anillo de precipitación es fácilmente visible y las concentraciones antigénicas están en relación directa con el
área del círculo de precipitación, cuanta más alta es la concentración del antígeno, mayor es el diámetro del
anillo.

Técnicas de aglutinación

En estas técnicas se hacen visibles los complejos Ag-Ac por la aglutinación que producen los anticuerpos cuando
el Ag forma parte o se ha unido artificialmente a la superficie de glóbulos rojos, plaquetas, leucocitos, partículas
de látex, etc. Normalmente se utilizan glóbulos rojos (hemoaglutinación) o partículas de látex.
Las reacciones de aglutinación se utilizan para identificar bacterias y para tipificar los glóbulos rojos; estas
reacciones fueron observadas con leucocitos y plaquetas, e incluso con espermatozoides en cientos casos de
infertilidad masculina debida a aglutininas presentes en el esperma.
Debido a su sensibilidad y conveniencia, el uso de la prueba se ha extendido a la identificación de anticuerpos
contra antígenos solubles que de modo artificial se adhieren sobre eritrocitos, las partículas de látex o de gelatina
Pruebas similares que utilizan partículas recubiertas con antígeno pueden llevarse a cabo en placas de
microtitulación con fondo en U, donde puede observarse el patrón de sedimentación en el fondo de las cubetas;
esto proporciona un indicador más sensible que la aglutinación macroscópica.

Hemoaglutinación directa

La presencia de antígenos en la superficie de los glóbulos rojos se puede detectar por la hemoaglutinación
producida cuando se añade un antisuero con anticuerpos frente a dichos antígenos.
Esta técnica se emplea habitualmente para la identificación de los grupos sanguíneos y Rh, para lo cual a la sangre
heparinizada se le añaden los antisueros correspondientes: anti-A, anti-B o anti-AB y anti-Rh. Habrá aglutinación
cuando los glóbulos rojos posean la especificidad del antisuero añadido. De igual manera se procede con
antisueros anti-Rh para la determinación de los distintos grupos Rh.
Hemoaglutinación indirecta

Se basa en el principio de la inhibición de la hemoaglutinación. Para su realización se precisan glóbulos rojos a los
cuales se les ha unido la misma sustancia que se desea detectar o cuantificar. Si estos glóbulos rojos son puestos
en presencia de anticuerpos preparados frente a dicha sustancia se producirá su aglutinación.
Por el contrario, cuando se añade un suero problema que contiene la sustancia a cuantificar entonces los
anticuerpos se unirán a dicha sustancia y no a los glóbulos rojos. En este caso no se producirá la
hemoaglutinación.
Por tanto, aglutinación (+) indica ausencia de la sustancia a estudiar, y aglutinación (-) indica presencia de la
misma. La medida de gonadotrofina coriónica (HCG) para el diagnóstico de embarazo puede realizarse por esta
técnica.

Técnicas de inmunofluorescencia

La fluorescencia es una propiedad de ciertas moléculas que, al ser irradiadas con energía electromagnética de
longitud de onda adecuada, emiten radiación de longitud de onda característica permitiendo su cuantificación.
Una molécula que fluoresce puede ser fijada en el anticuerpo para ser detectada usando luz UV ( Fluoresceína,
Rodamina, etc)
Se necesita un microscopio de inmunofluorescencia.
La inmunofluorescencia se utiliza esencialmente en la detección de autoanticuerpos y anticuerpos contra
antígenos de superficie de células y tejidos.

Citometría de flujo

La técnica de inmunofluorescencia se suele utilizar en el estudio de poblaciones de células de sangre periférica.

Actualmente el análisis de una suspensión de células vivas marcadas con un fluorocromo se realiza mediante un
citómetro de flujo.
La suspensión celular se hace circular en forma de gotas microscópicas.
Las células pasan por un campo de detección atravesado por un potente rayo láser que produce la dispersión de
la luz y la activación de la fluorescencia. Mediante sensores específicos se analizan y cuantifican las poblaciones
en estudio en función de sus propiedades fisicoquímicas y del marcaje efectuado.

Técnica de radioinmunoensayo

El radioinmunoensayo (RIA) se basa en la competencia que se establece, para unirse a anticuerpos específicos,
entre la sustancia a cuantificar y cantidades conocidas de la misma sustancia marcada con un isótopo. Al
establecerse esta competición resulta que a mayor cantidad de sustancia a cuantificar, menor será la cantidad de
sustancia radiactiva que se une al anticuerpo y viceversa
La técnica del radioinmunoensayo posee algunos inconvenientes que derivan de la necesidad de utilizar isótopos.
Además de su peligrosidad y la obligatoriedad de disponer de instalaciones adecuadas para su utilización, existen
isótopos que tienen el inconveniente de su pronta caducidad.

Técnica de enzimoinmunoensayo.

Esta técnica, también se conoce como ensayo de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).
La identificación de los complejos Ag-Ac, se hace mediante el empleo de enzimas, bien unidas al antígeno, o bien
unidas al anticuerpo.
Esta técnica se utiliza para la medida de hormonas, antígenos de la hepatitis y otras muchas sustancias que se
encuentran a muy bajas concentraciones.
Debido a su sencillo y rápido procedimiento, los inmunoensayos ELISA son uno de los más utilizados en
investigación y diagnóstico para la identificación y/o cuantificación de analitos de naturaleza proteica como
péptidos, proteínas, anticuerpos y hormonas.
En función de la manera en que se produzcan las interacciones antígeno-anticuerpo, los ensayos ELISA pueden
clasificarse en cuatro principales categorías.

Tipos de ELISA

En base al modo en el que se den las interacciones antígeno-anticuerpo, los ELISAs se clasifican en 4 tipos: ELISA
directo, ELISA indirecto, ELISA tipo sándwich y ELISA competitivo.
Veamos cada uno de estos tipos de ELISA con más detalle:

1.- ELISA directo

El ELISA directo es el ensayo ELISA más simple y rápido de todos, donde un anticuerpo primario marcado con una
enzima se unirá directamente al antígeno de interés permitiendo la detección y/o cuantificación del mismo.
El procedimiento simplificado sería el siguiente:
1º El antígeno se inmoviliza sobre una placa
2º Se añade un anticuerpo primario marcado con una enzima que se unirá al antígeno de interés
3º Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que permitirá la detección
y/o cuantificación del antígeno de interés.

2.- ELISA indirecto

Es un ensayo parecido al ELISA directo pero en dos pasos, lo que permite amplificar la señal obtenida. En este
caso se utilizan dos anticuerpos, uno primario y otro secundario, y es este último el que irá conjugado a una
enzima.
El procedimiento simplificado sería el siguiente:
1º El antígeno se inmoviliza sobre una placa
2º Se añade un anticuerpo primario sin marcar que se une al antígeno de interés
3º Se añade un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo primario
4º Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que permitirá la detección
y/o cuantificación del antígeno de interés.

3.- ELISA tipo sándwich

En el ELISA tipo sándwich el antígeno queda inmovilizado entre dos anticuerpos, uno de captura y otro de
detección también conocidos como pares de anticuerpos, que se unirán a dos epitopos distintos de un mismo
antígeno.
El procedimiento simplificado sería el siguiente:
1º El anticuerpo de captura se inmoviliza sobre la placa
2º Se añade la muestra que contiene el antígeno de interés que se unirá al anticuerpo de captura
3º Se añade el anticuerpo de detección que se unirá al antígeno unido a su vez al anticuerpo de captura.
4º En caso de que el anticuerpo de detección vaya conjugado a una enzima, procederemos directamente con el 5º
paso. En caso contrario (que es lo más habitual en los ELISA tipo sándwich), será necesario añadir un anticuerpo
secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo de detección.
5º Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que permitirá la detección
y/o cuantificación del antígeno de interés.

4.- ELISA competitivo

El ELISA competitivo es una variante más compleja de la técnica ELISA, también conocido como ELISA de
inhibición debido al uso de un antígeno de referencia que competirá con el antígeno de la muestra por unirse al
anticuerpo primario.
Se utiliza generalmente para detectar y/o cuantificar antígenos presentes en muy bajas cantidades.

El procedimiento simplificado sería el siguiente:

1º El antígeno de referencia se inmoviliza sobre la placa.
2º Por otro lado, un exceso de anticuerpo primario sin marcar se incuba con la muestra que contiene el antígeno
de interés, dando lugar a la formación de complejos antígeno-anticuerpo
3º Se añade la mezcla antígeno-anticuerpo a la placa, donde el antígeno de referencia competirá con el antígeno
de la muestra por unirse al anticuerpo
4º Se lava la placa eliminando los complejos antígeno-anticuerpo solubles
5º Se añade a la placa un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo primario
anclado al antígeno de referencia.
6º Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que será inversamente
proporcional a la cantidad de antígeno de interés presente en la muestra