09 Guia Practica 09 Bqca I 2024-I

Manual de “Prácticas de Bioquímica 1” UNAP - FFB
PRACTICA Nº 09
DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE.
I. GENERALIDADES
La glucosa es el hidrato de carbono más importante que se utiliza como combustible
energético para todas las células, cuando se encuentra en exceso se almacena (en el hombre)
como un polisacárido el glucógeno o se convierte en grasa para ser utilizados en el momento
oportuno. La patología clínica más común relacionada con el metabolismo de los hidratos de
carbono es la Diabetes Mellitus, síndrome caracterizado por una secreción anormal de insulina
que se refleja en una tendencia a la Hiperglicemia (asociada con glucosuria) y
secundariamente en una variedad de manifestaciones patológicas metabólicas y vasculares
(cetoacidosis, alteraciones vasculares, coma diabético).
El diagnóstico precoz y el control de los pacientes diabéticos tiene por objeto evitar la
Cetoacidosis y las complicaciones de la Hiperglicemia, mediante el tratamiento adecuado.
Los estados de estrés, cólera, ira, provocan un aumento de glucosa en sangre de 10 a 20 mg.
Los valores de glucosa en niños son bajos y en ancianos estos aumentan. La sangre arterial
posee mayor cantidad de glucosa que la sangre venosa.
Se hace necesario definir ciertos términos como:

SUERO: Es lo que queda como sobrenadante en el tubo de ensayo después del proceso de
coagulación o de centrifugación.
PLASMA: Se denomina plasma a toda la sangre en su conjunto es decir contiene agua (90%),
proteínas, Glucosa, Lípidos, Colesterol, Enzimas, anticuerpos, etc. Aparte de lo que
comúnmente llamamos suero y Fibrinógeno.
Existen varias metodologías para determinar la concentración de glucosa en sangre o en suero:

Follin-Wu (Fosfomolíbdica): 80-120 mg/dl
Somogy–Nelson (arsenomolibdica): 60–110 mg/dl
Enzimático: Trinder: Plasma: 65 -110 mg/dl
46
Wienner: Plasma: 60 -110 mg/dl Suero: 70 -110 mg/dl L.C.R.: 40-74 mg/dl
Audit. Diagnostic: Suero: 65-110 mg/dl
OBJETIVOS
➢ Explicar el procedimiento para la determinación de glucosa en la sangre mediante el
método de glucosa-oxidasa.
➢ Determinar la glucosa en la sangre mediante el método de glucosa-oxidasa.
➢ Conocer el manejo y aplicación del Espectronic para obtener la absorbancia de una
muestra.
II. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

MATERIALES
Micropipetas Graduadas Vaso de Precipitado Tubos de Ensayo
Gradilla Metálica Aguja Hipodérmica Nº 21 Algodón Ligadura
EQUIPOS
Equipo de Baño María Espectrofotómetro Centrifuga
Cocina eléctrica Balanza analítica
MATERIAL BIOLOGICO
Muestra de Sangre
REACTIVOS
Agua Destilada Alcohol
Kit de reactivos para determinar Glucosa
Fosfato Buffer pH 7.4 100mmol/L Fenol 24mmol/l
POD 500 U/L GOD 20000 U/L
4 Amino Antipirina 0.4mmol/L Estabilizadores
STANDARD
Glucosa 100 mg/dl ó 5.56mmol/L
PRECAUCIONES
El reactivo contiene 0.1 % de azida de Sodio
47
III. METODO - PROCEDIMIENTO
1. METODO DE LA GLUCOSA OXIDASA

La glucosa es oxidada enzimáticamente por la glucosa oxidasa (GOD; D-glucosa oxígeno l-
óxidorreductasa; a ácido Glucónico y agua oxigenada); el agua oxigenada en presencia de
peroxidasa (POD; donador: hidrógeno-peróxido óxidorreductasa); produce la copulación
oxidativa del fenol con la 4- amino-antipirina (4-amino fenazona (4-AF)) dando lugar a la
formación de un cromógeno rojo-cereza con absorbancia máxima a 500 nm. Es decir la
determinación enzimática de glucosa se da de acuerdo a las siguientes reacciones:
Glucosa + O2 + H2O + GOD → Ácido Glucónico + H2O2
2H2O2 + Fenol + 4-Amino-Antipirina + POD → 4-(p-benzoquinona-monoimino)-fenazona
[Rojo de Quinona] + 4H2O
2. OBTENSION DE LA MUESTRA:
a. Extraer la muestra de sangre a dos alumnos voluntarios previamente desinfectados.
b. Luego la sangre extraída se le lleva a centrifugar para lo cual se debe de en un casquete de
la centrifuga la sangre extraída y en el extremo opuesto se coloca otro tubo de ensayo
conteniendo agua en la misma cantidad que la muestra de sangre para contrapesar ambos
tubos, el centrifugado se lleva a cabo por 20 minutos a 1000 rpm.
c. Luego de este tiempo obtendremos en el tubo de la muestra un precipitado y una parte
sobrenadante este último es el suero con el que vamos a trabajar para determinar la
concentración de Glucosa en suero.
d. El suero obtenido debe de estar libre de hemólisis.
3. DETERMINACION DE LA GLUCOSA EN SUERO:
a. Preparar el siguiente sistema. Previamente es necesario recordarle que para proceder a
extraer el suero se debe de realizar con mucho cuidado usando una pipeta graduada y tratando
de que no absorba la parte de la sangre coagulada.
MUESTRA (1) ESTÁNDAR (2) BASAL (3)
REACTIVO 1ml 1ml 1ml
MUESTRA 10ul -------- ---------
STANDAR ------ 10ul --------
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b. Mezclar y después llevar a baño maría todos los tubos por espacio de 5 minutos a
temperatura de incubación (37°C).
c. Leer la densidad óptica con un espectrofotómetro a una Longitud de Onda de 500 nm, con
filtro verde, utilizando cubeta de 1 cm paso de luz.
CALCULOS
TRAMITANCIA = % de luz que pasa
ABSORBANCIA = % de luz que es absorbida A= 2 – log T
[Glucosa] mg/dl = D.O.des. X f
mg Glucosa standar
f = si mg Glucosa standar = 1g/L = 100mg/dl
D.O. Standard
=> reemplazando:
DO Muestra Desconocida
[Glucosa] mg/dl = X 100mg/dl
DO Standard
IV. RESULTADOS
V. DISCUSION
VI. CONCLUSIONES
VII. RECOMENDACIÓN
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
49
CURVA DE TOLERANCIA A LOS CARBOHIDRATOS
I. GENERALIDADES
La prueba de la tolerancia a la glucosa es un test que permite establecer la respuesta insulínica
a un estímulo fisiológico por glucosa. La rápida absorción de glucosa desencadena la
liberación de insulina preformada en las células beta del páncreas, en cantidad suficiente para
cubrir las necesidades que aumenta la captación de la glucosa por los tejidos y especialmente
por el hígado en donde se utiliza y almacena como glucógeno.
La ingesta de glucosa va seguida de un aumento transitorio en el nivel de la glicemia debido a

que la velocidad de absorción intestinal excede a la capacidad del hígado y los tejidos para su
utilización. En sujetos normales el nivel máximo de glucosa después de la absorción rara vez
pasa de 150 mg/ dl. El organismo vuelve a ajustar el nivel de la glicemia a los valores del
estado de ayuno con un período de 1 hora y media a dos horas y media de iniciada la prueba.
En condiciones anormales de utilización de glucosa, la elevación y reajuste de la glicemia se

aparta del patrón normal teniendo estas variaciones valor diagnóstico y pronóstico. A través de
la prueba, la orina de personas aparentemente sanas se presenta siempre libres de glucosa. La
desventaja de esta prueba es que incluye un factor que no guarda relación con la respuesta
insulínica, la velocidad de absorción a partir del tubo digestivo.
La finalidad del trabajo experimental es establecer la capacidad del sistema (organismo) para
manejar una dosis fija de glucosa administrada por vía oral en condiciones standard.
OBJETIVOS
➢ Elaborar una curva de tolerancia a la glucosa.
➢ Establecer las relaciones causa y efecto entre los datos de glucosa en sangre y orina a los 60
y 120 minutos
➢ Demostrar el funcionamiento del páncreas con la respuesta insulínica.
II. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS
MATERIALES
Micropipetas Graduadas Vaso de Precipitado Tubos de Ensayo
50
Gradilla Metálica Algodón

EQUIPOS
Equipo de Baño María Espectrofotómetro Centrifuga
Cocina eléctrica Balanza analítica
MATERIAL BIOLOGICO
Muestra de Sangre
REACTIVOS
Alcohol Agua Destilada Reactivos para glicemia por Folin Wu
Reactivo de trabajo de Glucosa enzimática Solución de glucosa al 25 7o
Reactivo de Benedict
III. METODO - PROCEDIMIENTO

- El paciente debe ser preparado para esta prueba, indicándole una dieta diaria que contenga
300 mg de hidratos de carbono durante los tres días anteriores de la prueba.
- En niños el período de ayuno varía; así en niños menores de cuatro meses hasta un ayuno
de 4 horas, entre cuatro y ocho meses hacen falta 6 horas de ayuno y entre 8 meses y 2 años
8 horas.
- Obtener una muestra de sangre y por micción voluntaria recoger una muestra de orina del
paciente en ayunas.
- Administrar por vía oral una solución de 25 por 100 de glucosa, de tal manera que el
paciente ingiere en total 1,75 g de glucosa por kilogramo de peso (no es necesario dar más
de 100 g en total), si se desea, puede mejorarse el sabor de la solución con jugo de limón.
- Extraer muestra de sangre a los 30, 60, 90 y 120 minutos.
- Colectar las muestras de orina a los 6 0 y 1 2 0 minutos.
- Determinar la concentración de glucosa en cada una de las muestras de sangre obtenidas
conforme al método de Folin Wu y glucosa oxidasa.
- Determinar cualitativamente la presencia de cada una de las muestras de orina con el
reactivo cualitativo de Benedict.
- En un papel milimetrado, graficar los resultados obtenidos de glicemia en cada muestra
versus tiempo.
51
- Durante la prueba el paciente debe permanecer en estado de reposo y no debe fumar ni

tomar bebidas alcohólicas.
- La Prueba de la Curva de Tolerancia puede ser modificada por el ejercicio, fiebre,
enfermedades agudas y estados pos-traumáticos.
Valores normales de referencia
Suero o plasma: 80-120 mg/dl. (Folin-Wu) o 70 -110 mg/dl (Enzimático)
• Orina: No hay.
IV. RESULTADOS
V. DISCUSION
VI. CONCLUSIONES
VII. RECOMENDACION
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE.

Se hace necesario definir ciertos términos como:

Existen varias metodologías para determinar la concentración de glucosa en sangre o en suero:

II. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

III. METODO - PROCEDIMIENTO

1. METODO DE LA GLUCOSA OXIDASA

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

CURVA DE TOLERANCIA A LOS CARBOHIDRATOS

La ingesta de glucosa va seguida de un aumento transitorio en el nivel de la glicemia debido a

En condiciones anormales de utilización de glucosa, la elevación y reajuste de la glicemia se

Gradilla Metálica Algodón

III. METODO - PROCEDIMIENTO

- Durante la prueba el paciente debe permanecer en estado de reposo y no debe fumar ni

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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