UNIVERSIDAD MILITAR NUEVA GRANADA

Práctica 4. TITULACIÓN DE AMINOÁCIDOS

Identificación:
GL-AA-F-1
Guías de Prácticas de Número de
Revisión No.:
Páginas:
Laboratorio 2
11
Fecha Emisión:
2018/01/31
Laboratorio de:
BIOQUÍMICA

Título de la Práctica de Laboratorio:

TITULACIÓN DE AMINOÁCIDOS

Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:

María Claudia Sandoval Dr. Laura Cerón Rincón, M.Sc. Comité Asesor de
Sc. Departamento de Química

Docentes Departamento de Directora Departamento de

Química Química

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contra de los derechos de autor
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Práctica 4. TITULACIÓN DE AMINOÁCIDOS

Fecha de
Descripción del Cambio Justificación del Cambio Elaboración /
Actualización
La práctica se modifica para
incluir algunos temas nuevos y
Edición del marco teórico 25/06/18
retirar otros que ya no se
consideran pertinentes
Se aumentó la concentración
Cambio concentración HCl 1/12/19
para añadir un menor volumen
Cambio en el marco teórico,
aclarando cómo es la titulación de Para aclarar algunos aspectos
11/12/19
aminoácidos con tres valores de teóricos.
pKa.
Con el fin de reforzar los
Adición de una muestra desconocida cálculos, se incluyó un 11/12/19
aminoácido desconocido
Se añadió la sección de Para mejor comprensión del
06/07/20
estandarización procedimiento se separó el texto
Se disminuyó la concentración
Cambio concentración HCl 06/07/20
para mejorar la titulación
Ese objetivo no hace parte Marzo 2024
Se modifica el tercer objetivo fundamental de la práctica de
laboratorio
Se simplifica la sección de preguntas Este apartado era muy extenso Junio 2024
previas y un poco redundante

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1. FACULTAD O UNIDAD ACADÉMICA: Facultad de Ciencias Básicas y Aplicadas

2. PROGRAMA: Ingeniería Ambiental

3. ASIGNATURA: Bioquímica

4. SEMESTRE: Cuarto

5. OBJETIVOS:

● Repasar y afianzar los conocimientos previos en la preparación de disoluciones y

unidades de concentración.
● Titular y comparar los valores de pKa experimentales de tres aminoácidos diferentes.
● Determinar la identidad de un aminoácido problema de acuerdo con los valores de
pKa obtenidos en la titulación.

6. MATERIALES, REACTIVOS, INSTRUMENTOS, SOFTWARE, HARDWARE O

EQUIPOS DEL LABORATORIO:

DESCRIPCIÓN (Material,
UNIDAD DE
reactivo, instrumento, software, CANTIDAD
MEDIDA
hardware, equipo)
Balanza analítica 1 unidad
Potenciómetro o pH-metro 4 unidad
Goteros o pipetas Pasteur 5 unidades
Beakers de 150 mL 16 unidades
Beakers de 250 mL 12 unidades
Pipetas aforadas de 5,00 mL 3 unidades
Frasco lavador con agua destilada 4 unidad
Bureta 4 unidad
agitador de vidrio 4 unidad
Lisina 0,2 M 20 mL
Alanina 0,2 M 20 mL
Cisteína 0,2 M 20 mL
Aminoácido desconocido 0,2M 20 mL
Solución de fenolftaleína 1 mL
HCl 0,5 M 50 mL
NaOH 0,1M 250 mL
Biftalato de potasio 1 g

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Estos materiales son por sesión de laboratorio (4 grupos por sesión).

7. MATERIALES, REACTIVOS, INSTRUMENTOS, SOFTWARE, HARDWARE O

EQUIPOS DEL ESTUDIANTE:

DESCRIPCIÓN (Material,
UNIDAD DE
reactivo, instrumento, software, CANTIDAD
MEDIDA
hardware, equipo)
Bata de poliéster blanca. 1 unidad
Gafas de seguridad. 1 par
Guantes de nitrilo 2 pares
Bayetilla 1 unidad
Toallas de papel Scott 10 unidades
Marcador tipo Sharpie 1 unidad
Cinta de enmascarar 1 rollo
Cuaderno de laboratorio 1 unidad

8. PRECAUCIONES CON LOS MATERIALES, REACTIVOS, INSTRUMENTOS Y

EQUIPOS A UTILIZAR:

● Antes de entrar al laboratorio lea la guía de trabajo.

● Debe tener las precauciones mencionadas en el acta de capacitación para la
realización de todas las prácticas.
● Escuche las explicaciones del profesor al inicio de la práctica y tome atenta nota sobre
los componentes del espectrofotómetro y del pH metro, sus usos y los cuidados que
se deben tener para el correcto uso de este equipo.
● Debe leer y tener consignado en su cuaderno las fichas de seguridad de cada uno de
los reactivos, y debe tener conocimiento de dónde deben desecharse los residuos de
estos.

9. MARCO TEÓRICO

DISOLUCIONES BUFFER

Las reacciones químicas de los seres vivos requieren unas condiciones de concentración de
especies químicas determinadas y precisas, es así como la relación entre los iones H + y OH-
deben permanecer en intervalos útiles para que se lleven a cabo las reacciones mediadas por
enzimas. Algunas enzimas necesitan medios ácidos (pH < 7) y otras alcalinos (pH > 7). Para
mantener estas condiciones, el medio celular cuenta con disoluciones amortiguadoras o buffer

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que evitan los cambios bruscos de pH. Para medir el pH se utiliza el pH metro, un instrumento
que permite determinar la concentración de hidrogeniones de una solución a través del paso
de corriente por una solución saturada de cloruro de potasio en un electrodo. Con la
concentración de iones H+ se puede determinar el pH de la siguiente forma:

pH= -log[H+] pOH = -log[OH-] 14 = pH+pOH

La relación entre el pH y el pKa se describe por medio de la ecuación de Henderson

Hasselbalch. Esta ecuación es una reorganización de la expresión de la constante de
ionización de un ácido débil:

[𝐴−1 ] [𝑏𝑎𝑠𝑒]
𝑝𝐻 = 𝑝𝑘𝑎 + 𝑙𝑜𝑔 𝑜 𝑝𝐻 = 𝑝𝑘𝑎 + 𝑙𝑜𝑔
[𝐻𝐴] [á𝑐𝑖𝑑𝑜]

A partir de esta expresión se pueden calcular las concentraciones de las especies ácidas y
básicas de un equilibrio ácido base. La titulación es un experimento en el cual cantidades
medidas de base se añaden a una cantidad desconocida de un ácido. La reacción se sigue
por medio de medidas con el pH metro. El punto en la titulación en el cual un ácido está
exactamente neutralizado es el punto de equivalencia.

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En la gráfica anterior se muestra la curva de titulación de la glicina. Los dos grupos ionizables,
el amino y el carboxilo se titulan con una base fuerte como lo es el NaOH, y se observan las
dos fases, una por cada disociación.

Al inicio, la especie predominante es la especie completamente protonada +H3N-CH2-COOH,

por lo que su carga neta es +1. A medida que se añade el NaOH, el grupo -COOH se
desprotona, y empieza a aparecer la segunda especie, +H3N-CH2-COO-. Cuando existen las
mismas cantidades de ambas especies, se llega a la zona media de la zona buffer, y en este
punto el pH es igual al pKa del grupo titulado, en este caso del grupo carboxilo, 2,34; debido
a que una de las especies tiene carga neta +1 y la otra 0, la carga neta en este punto sería el
promedio de las dos, +0,5.

En la gráfica puede verse que es un punto de inflexión en donde la especie completamente

protonada ha prácticamente desaparecido, la gran mayoría está como la especie que ha
perdido su primer protón y la especie completamente desprotonada está empezando a
formarse. La segunda fase corresponde a la titulación del protón del grupo amino y cuyo punto
medio corresponde al segundo pKa, que en el caso de la glicina corresponde a 9,6. En este
punto, la mitad de la glicina se encuentran como la especie H 2N-CH2-COO-, por lo que su
carga neta es -0,5. La titulación se completa cuando se llega a un pH aproximado de 13.

A partir de los datos experimentales se puede construir la misma gráfica, pH vs Moles de OH.
De esta gráfica puede obtenerse la concentración del aminoácido, al calcular el punto de
inflexión, ya sea por el método gráfico, el de la primera derivada o el de la segunda derivada.
Como puede verse en la gráfica, para llegar al punto final de la titulación, se necesitan dos
moles de OH-, es decir que el punto de inflexión corresponde a un mol del aminoácido. En el
caso de la glicina, este punto corresponde con el punto isoeléctrico de la glicina, es decir, el
punto de corte en el eje y. Teniendo este punto se pueden hallar los dos valores de pKa; el
pK1 corresponde al punto de pH que se corta en la gráfica cuando se han añadido 0,5 moles
de OH- y el pK2 será el punto de pH cuando se corta en la gráfica con 1,5 moles de OH -. A
partir de la curva de titulación también se obtiene la información acerca de la relación entre la
carga neta del aminoácido y el pH de la disolución. En el caso de la glicina, a pH 5,97, el punto
de inflexión entre las dos partes de la curva, la glicina está predominantemente en su forma
dipolar, es decir ionizada, pero sin carga eléctrica neta. El pH característico al cual la carga
eléctrica neta es cero se le conoce como punto isoeléctrico (pI). Considerando que la glicina
no tiene grupos ionizables en la cadena lateral, el pI es el promedio entre los dos valores de
pKa:

𝑝𝐾𝑎1 + 𝑝𝐾𝑎2 2,34 + 9,60

𝑝𝐼 = = = 5,97
2 2

Por encima de ese valor, la glicina tiene una carga neta de valor negativo y en un campo
eléctrico se desplazará hacia el ánodo, el electrodo positivo. Asimismo, a cualquier valor de
pH menor al pI, la glicina tendrá carga positiva y en un campo eléctrico se desplazará hacia

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el electrodo negativo (cátodo). Todos los aminoácidos que no tienen grupos ionizables en la
cadena lateral tienen curvas de titulación muy similares, pero con valores de pK a diferentes.
Por su parte, los aminoácidos que tienen grupos ionizables en su cadena lateral y que por
ende tienen un valor de pKa adicional, el pKR, resultando en una curva de titulación más
compleja, en donde se distinguen tres regiones. La región adicional estará ubicada
dependiendo del tipo de grupo ionizable, y se fusionará con la zona del grupo carboxilo o la
del grupo amino, dependiendo de su valor pK R. El punto isoeléctrico de este tipo de
aminoácidos depende de la naturaleza del grupo ionizable.

Por ejemplo, el glutamato tiene un punto isoeléctrico de 3,22, considerablemente menor que
el de la glicina, debido a que tiene dos grupos carboxilo. Por esta razón, en estos aminoácidos
el punto isoeléctrico no siempre coincide con la adición de 1 mol de OH -, y requiere la adición
de 3 moles de OH- para su titulación completa. Es necesario dibujar la estructura de cada
aminoácido y determinar cuál es su disociación en cada punto de la curva.

pH = pK2
9,67
10 Carga neta: -1,5

pH 6 pH = pKR
4,25
pH = pI Carga neta: -0,5
3,22
pH = pK1 Carga neta: 0
4 2,19
Carga neta: +0,5
0 1,0 2,0 3,0
Moles OH-

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10. PREGUNTAS PREVIAS

El docente escogerá de estas preguntas dos para la elaboración del preinforme.

● ¿Para qué sirve la ecuación de Henderson Hasselbalch y cómo está

relacionada con procesos fisiológicos relacionados con el funcionamiento de
proteínas y enzimas?
● ¿Cuáles son los grupos ionizables de un aminoácido?
● ¿Qué es un zwitterión? .¿Qué fórmula molecular del aminoácido predomina
durante el pK1, pKr y pK2?
● La alanina es un ácido diprótico que experimenta dos reacciones de
disociación. Dada la estructura parcialmente protonada de la figura, dibuje las
estructuras de las otras dos formas que predominan en disolución acuosa: la
completamente protonada y la completamente desprotonada

● En la sangre y en casi todos los tejidos los aminoácidos se encuentran como

zwitteriones. De este modo:
I. ¿Cuál es la manera más acorde de representarlos, A o B?

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11. PROCEDIMIENTO

11.1. ESTANDARIZACIÓN DE TITULANTE

Primero, debe estandarizar la solución de NaOH que va a emplear en la titulación de los

aminoácidos. Para ello debe purgar 2 veces la bureta con la solución de NaOH 0,1 M, y llenarla
hasta enrasarla en 0,00mL. Pese alrededor de 0,20 g de biftalato de potasio en un vaso de
precipitados, disuelva en aproximadamente 15 mL de agua, añada 2 gotas de fenolftaleína y
realice la titulación por triplicado. Anote los volúmenes obtenidos en su cuaderno de
laboratorio y luego calcule la concentración del NaOH.

Determine en compañía del docente la concentración del NaOH utilizado teniendo en cuenta
los siguientes datos experimentales:

Estandarización 1
Biftalato de Hidróxido Biftalato de Agua
potasio de Sodio potasio y sodio
+ +
NaOH H2 O

Masa (g)
Moles
Volumen (mL)
Molaridad (mol/L)
Solo debe completar las casillas en blanco
Debe mostrar de forma clara y precisa los cálculos realizados

Estandarización 2
Biftalato de Hidróxido Biftalato de Agua
potasio de Sodio potasio y sodio
+ +
NaOH H2 O

Masa (g)
Moles
Volumen (mL)
Molaridad (mol/L)
Solo debe completar las casillas en blanco
Debe mostrar de forma clara y precisa los cálculos realizados

Estandarización 3

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Biftalato de Hidróxido Biftalato de Agua

potasio de Sodio potasio y sodio
+ +
NaOH H2 O

Masa (g)
Moles
Volumen (mL)
Molaridad (mol/L)
Solo debe completar las casillas en blanco
Debe mostrar de forma clara y precisa los cálculos realizados

[NaOH] promedio =

11.2. TITULACIÓN DE AMINOÁCIDOS

Mida el pH inicial de cada uno de los aminoácidos asignados. Rotule un vaso de precipitados
de 50,0 mL, por cada aminoácido a titular. Purgue las pipetas aforadas, mida 5,00 mL del
aminoácido y transfiéralo al respectivo vaso de precipitados. Mida el pH inicial de cada una
de las disoluciones y añada 5 mL de HCl 0,5 M para que el pH sea de aproximadamente de
1,3. Luego, haga adiciones de 1,0 mL de NaOH 0,1M desde la bureta hasta llegar a un pH de
3,0. Ahora, haga adiciones de 0,50 mL cada vez y una vez el pH haya llegado a 8,5, vuelva a
añadir 1,00 mL entre cada medida de pH hasta que la titulación esté completa en pH 13.
Registre los valores de pH y volumen de NaOH en su cuaderno de laboratorio. Luego repita
el procedimiento con la disolución de aminoácido desconocido.

Posteriormente realice las gráficas de titulación de pH (eje y) vs. Volumen de NaOH (eje x) y
halle los valores de pKa de los aminoácidos de estudio, recopilando la información obtenida
por sus compañeros.

12. RESULTADOS ESPERADOS:

Se espera que el estudiante pueda hallar un estimado de los valores de pKa de los diferentes
aminoácidos empleados y que pueda comparar los resultados obtenidos con los valores
encontrados en literatura. Adicionalmente debe identificar el aminoácido desconocido de
acuerdo con los valores de pKa calculados.

Preguntas para tener en cuenta para el análisis de resultados del informe:

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● ¿Cuántas regiones buffer observa en su curva?

● ¿Cuántas regiones buffer esperaba encontrar?
● ¿Los pKa que puede extrapolar de su gráfica coinciden con los reportados?
● ¿Podrían los aminoácidos titulados ser buffer a pH fisiológico de 7,4?
● Encuentre el pI a partir de cada una de sus gráficas, y calcule con la ecuación de
Henderson Hasselbalch cuáles serían las proporciones de cada una de las especies
en ese pH. Discuta si los valores encontrados son los esperados.
● Para los aminoácidos con 3 valores de pKa, ¿es posible ver las 3 zonas buffer en las
gráficas?
● ¿Por qué los valores de pI cambian de un aminoácido a otro? ¿Qué dice esto acerca
de la naturaleza del aminoácido ?

13. CRITERIO DE EVALUACIÓN A LA PRESENTE PRÁCTICA:

Presentación del informe grupal, el cual debe entregarse en el formato que se les entregó
previamente, con las características allí mencionadas. En el cuaderno de laboratorio deben
registrarse todos los resultados obtenidos, y podrán ser revisados en la siguiente práctica.

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