Ácido Clavulánico

PROCESO DE PRODUCCION DEL
ACIDO CLAVULANICO
Karen Alzate-Lopez
Jessica Alexandra Lopez-Marín
Carina Hernández-Arbeláez
TUTORA
Juliana Osorio Echavarría
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA BIOQUÍMICA

SECCIONAL ORIENTE
EL CARMEN DE VIBORAL-ANTIOQUIA
VIA LA CEJA- KILÓMETRO 6
ÁCIDO CLAVULÁNICO
El ácido clavulánico es un inhibidor de β-lactamasas el cual se utiliza en la combinación en

ciertos antibióticos para tratar alguna resistencia a los antibióticos. Su efecto inhibidor se
descubrió en 1976 utilizando procesos de fermentación a partir de su principio activo el
cual es Streptomyces Clauligerus, dando lugar a un producto de gran importancia comercial
también disponible en combinaciones y sea con amoxicilina o tetraciclina debido a su
acción les confiere resistencia a estos antibióticos aumentando su espectro antibacteriano.
MRICROORGANISMO Y MEDIO DE CONSERVACIÓN:

Se utilizó un liofilizado de la cepa Streptomyces Clauligerus, la activación se realizó en
caldo TSB (medio nutritivo que favorece el crecimiento de algunos microorganismos) a
28°C por 36 horas, en el cual se evidencia el siguiente proceso:
Estas bacterias colonizan sustratos con restos de materia orgánica, formando una red de
hifas ramificadas que dan lugar al micelio sustrato. Estas hifas obtienen los nutrientes de la
degradación del material orgánico gracias a sus numerosas encimas hidrolíticas; en la
primera fase las sustancias más alejadas empiezan a acumular sustancias de reserva, hasta
que después de un tiempo debido a la carencia de nutrientes, reciben una serie de señales
que disparan la expresión de genes implicados en la formación del micelio aéreo. Estas
hifas se nutren de los productos de degradación del micelio sustrato viejo” y en una
segunda etapa sufren un proceso de curvatura, enrollamiento, formación de sep0tos y
engrosamiento de la pared celular para dar lugar a una cadena de esporas unicelulares que
con las condiciones adecuadas germinan y desarrollan un nuevo micelio sustrato.
Luego de ser activada la sepa se almacenó a -80°C en tubos eppendorf con medio ESB y
glicerol al 40% y estos tubos también se emplearon para realizar los demás ensayos.
MEDIO DE CULTIVO:
Los inóculos empleados para desarrollar cada ensayo se prepararon utilizando una mezcla
de Erlenmeyers de 500ML, el contenido de jun tubo de ensayo con 100ML de medio TSB e
incubándolos a 28°C y 220 rpm por 36 horas. De esto se pudo obtener la DO600NM que
osciló entre 0,6 y 0,8.
Un medio de cultivo compuesto de glicerol 20g por litro, harina de soja 15g por litro y cas
aminoácidos 5g por litro, regulados con MOPS (buffer 100mM) y un ph de 7,0, realizando
una esterilización en autoclave a 121°C durante 20 minutos
METODOS EXPERIMENTALES:
Se llevaron a cabo 5 cultivos de fermentación por triplicado en Erlenmeyers de 500ML, a
cada frasco se le adicionaron 100ML del medio del cultivo a evaluar y la biomasa
contenida en 10ML de inóculo. Esta biomasa se obtuvo centrifugando 10ML de inóculo a
5000rpm por 10 minutos eliminando lo que se encuentra en la superficie y re suspendiendo
la biomasa con 10ML de medio de prueba del Erlenmeyer y retomándolo nuevamente al
Erlenmeyer. Estos frascos fueron sellados con tapones de algodón para permitir la difusión
del oxígeno al cultivo y fueron incubados a 28°C y 220rpm por 36 horas.
Con el medio de cultivo seleccionado se evaluaron 3 concentraciones para el glicerol: 20
gL-1 (2%) 50 20 gL-1(5%) y 100 20 gL-1(10%), todos los cultivos se realizaron bajo las
mismas condiciones operacionales. Al final del periodo de incubación se realizaron
muestras para cuantificar la concentración de biomasa y de AC con el fin de determinar las
diferencias entre cada ensayo.
La producción del ácido clavulánico fue realizada por duplicado en un birreactor de
laboratorio de 5L (biostat B braun), con un volumen de 3L e inóculo al 10% v/v. La
fermentación fue llevada a cabo con una temperatura de 28°C, 400rpl y con un flujo de
aire de 1vvm, el ph fue controlado en 6,8 más / 0,2 con soluciones de NaOH (2N) y HCL
(2N) Las cuales fueron adicionadas automáticamente. La espuma generada se controló
adicionando 2ML de antiespumante (Antifoam2004) al inicio de la fermentación, el cultivo
se desarrolló por 140h y se tomaron muestras periódicas para poder determinar las
concentraciones de AC, biomasa y glicerol.
METODOS ANALÍTICOS:
Las muestras de la fermentación fueron sometidas a centrifugación con 14.000rpm por 10
minutos con una temperatura de 4°C, los pellets fueron utilizados para determinar las
concentraciones de biomasa y los sobre nadantes fueron diluidos con solución de MOPS,
después se filtraron a través de una membrana de PTFE de 0,2mm todo esto antes de
realizar el análisis de AC y glicerol.
DETERMINACIÓN DE BIOMASA:
El micelio utilizado para los procesos de lavó 2 veces con 10ML de solución salina (0,9%)
y su biomasa fue determinada mediante la técnica colorimétrica de DNA, basada en la
lectura de la absorbancia a 600mm del color azul generado por la reacción de la
difenilamina con la desoxirribosa
DETERMINACIÓN DE ÁCIDO CLAVULÁNICO:
La concentración fue determinada por HPLC empleando métodos descritos por founstone
and Reading. De la AC encontrado en cada muestra fue derivatizado con imidazol y
analizado en un HPLC, operado con columna C18 m-Bondapack fase reserva, una fase
inmóvil compuesta por una solución de 94% v/v de KH 2PO4 y 6% v/v de metanol, a un
flujo de 1ML/min y un detector de arreglo de diodos (se detectó a 311nm de AC
derivatizado).
DETERMINACIÓN DE GLICEROL:
Por medio de espectrofotometría se determinó la concentración de glicerol a 412nm, basado
en la oxidación del ácido perclórico.
FERMENTACIÓN EN BIORREACTOR DE
LABORATORIO:
Después de ser evaluar y encontrar el medio
apropiado para la producción de ácido
clavulánico y definida la concentración de
glicerol para este medio, se cultivó en un
fermentador la Streptomyces Clauligerus con el
fin de determinar su crecimiento, consumo de
sustrato y la producción de ácido clavulánico.
ETAPA FINAL:
Para la derivatización de AC se usó 1 mL de caldo de cultivo; el medio se centrifugó a
14000 rpm durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante se clarificó mediante filtro de jeringa
con un
tamaño de poro de 0.2 µm. Seguidamente se tomaron 300 µL de sobrenadante y se
mezclaron con 100 µL de solución de imidazol 3 M con pH de 6.8 y se incubaron a 25°C
durante 15 minutos, a 220 rpm. Al cabo de este tiempo, la mezcla se congeló a –20°C
durante 15 minutos para detener la reacción. Finalmente, la mezcla se descongeló durante
10 minutos a 25°C y se filtró nuevamente. Cabe resaltar que posterior al muestreo y entre
procedimientos, el sobrenadante con AC se mantuvo en hielo para evitar la degradación.
DIAGRAMA DE PROCESO PROCESON INTERNO
DE LA CEPA
ACTIVACION DE LA
CEPA EN ENCUBADORA
36 HORAS DESPUES
UPSTREAM
FEMENTACION CON
GLICEROL Y LEVADURA DE
VERVEZA TRANSFORMACION
SEPARACION POR CENTRIFUGADO
DURANTE 10 MINUTOS A 4C°
DOWNSTREAM
SEPARACION POR FILTRO DE

JERINGA CON PORO DE 0.2
CONGELAMOS LA MEZCLA A 20C° PRODUCTO FINAL
PARA DETENER LA REACCION
15 MIN
BIBLIOGRAFIA
 Análisis de flujos metabólicos en la producción de ácido clavulánico a partir de
Streptomyces clavuligerus, Sanchez Henao Claudia Patricia
 Effects of bioreactor hydrodynamics on the physiology of Streptomyces, Bioprocess
Biosyst Eng

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