Universidad Nacional

Federico Villarreal Facultad de Ciencias Naturales y

Matemáticas

Escuela Profesional de Química

QUÍMICA ORGÁNICA 3

DOCENTE :
Candy Janice Ruiz Martel
ALUMNAS:
Calsin Hurtado, Raquel
Carrillo de la Cruz, Erminia
Huallpa Franco ,Miriam
 Universidad Nacional Facultad de Ciencias Naturales y
Federico Villarreal Matemáticas

Desarrollo y aplicación de metodología por cromatografía

en capa fina para determinar el perfil de alcaloides
oxindólicos pentacíclicos en especies sudamericanas del
género Uncaria
Ligia M.M. Valente1*, Flaviane F. Alves1, Giselle M. Bezerra1, Maria Beatriz S. Almeida2,
Sandra L. Rosario2, José L. Mazzei3, Luiz A. d’Avila3, Antonio C. Siani2

Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de

Janeiro, Centro de
Tecnologia, Bloco A, 21910-240, Rio de Janeiro, RJ, Brasil,

Revista Brasileira de Farmacognosia Brazilian Journal of Pharmacognosy 16(2):

216-223, Abr./Jun. 2006
 INTRUDUCCION

Es la más estudiada,
destacada por sus actividad
inmunoestimulante y
citotóxico
El género U. tomentosa
Uncaria(Rubiaceae),tí
pico de las regiones Actualmente es una planta
tropicales ,está de alto valor comercial en
representado en Brasil y en el mundo
América del sur y
Central por dos
especies ,ambas son Se ha destacado por su
enredaderas perennes U.guianensis
demostrada actividad
antinflamatoria y
antioxidante
 Alcaloides
Son sustancias orgánicas nitrogenadas con
carácter básico mayoritariamente de origen ejemplo
vegetal con una estructura química compleja que
ejercen acciones farmacológicas diversas
OBJETIVO
Comparar los perfiles cromatográficos en CCD de los
alcaloides, tanto por el uso de extracto metanólico crudo
como por fracciones enriquecidas de estos alcaloides
obtenidos al someter el extracto crudo a la clásica partición
ácido-base y tratamiento con resina de poliamida básica 6 .
 MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE
ALCALOIDES
Cromatografía
en capa
delgada
Fósforo de
corteza de Extractos crudo Cromatografía
Extracto crudo
tallo de U. con resina básica en capa
con metanol
Tomentosa poliamida 6 delgada

Partición ácido- base

EXTRACTO CRUDO
•Materiales:
 
• 750 mg de corteza de tallo de Uncaria Tomentosa ( recolectado en
Cruzeiro do Sul, Acre)

Instrumentación:
• Dispositivo de sonicación (ultrasonido)
• Centrifugadora
  
Se adicionaron 2,5 mL

750 mg Uncaria Tomentosa

( seco y molido)

Se llevó a sonicación Seguido de una

por 10 min. (agita las centrifugación
partículas de la durante 5 min. Se
muestra) extrae el líquido
sobrenadante
TRATAMIENTO CON RESINA DE POLIAMIDA
BÁSICA 6
•Materiales:
 
• 300 mg de resina de Nylon 6 Radilon S natural (poliamida 6)
granulometría (53 – 125 𝜇𝑚)

• Agitador magnético
 Se retiró una alícuota de 3 mL y se
  le agregó 300 mg de resina de
Nylon 6 Radilon S natural
(poliamida 6) granulometría (53 –
Sobrenadantes
125 )

Se transfirieron a una
fiola de 10 mL y se
aforó con metanol

El sobrenadante se La mezcla se mantuvo

secó a presión en agitación magnética
reducida y se pesó por 15 min.
PARTICIÓN ÁCIDO-BASE
•Materiales:
 
• HCl 0,1 N (0,15 ml/ mg)
• Pera de decantación
• Acetato de etilo

• Ultrasonido
 El extracto seco se trató con
una solución de HCl 0,1 N
Sobrenadantes Se secó a presión (0,15 ml/mg). La mezcla se
recogidos reducida y se pesó colocó en el baño de
ultrasonido (5 min)

 
Fracción orgánica (rica en
alcaloides) Se extrae con
Fase orgánica acetato de etilo
Se secó con (3 veces)

Se filtró Fase acuosa

Se evaporó a presión Se extrajo con el mismo

reducida y se pesó volumen de acetato de
etilo (4 veces)   La fracción acuosa se
Las muestras se aplicaron a basificó con a PH (9 –
las placas por duplicado 10)
DESARROLLO DEL MÉTODO CCD
• Se
  desarrollaron en placas de gel de sílice prefabricadas (hoja de cromatografía
Merck, gel de sílice 60 F254; 0,2mm).
• Las muestras fueron aplicada manualmente utilizando una microjeringa de 25 .

PARÁMETROS:
Ancho de aplicación de la muestra, espacio de elución, tipos de desarrolladores,
concentración de muestras y sistemas de fase móvil.
Sistemas de fase móvil: Se probaron cuatro sistemas solventes que combinaban los
mayores potencial de separación de alcaloides pentacíclicos en problema con
facilidad de manejo.
• 
acetato de etilo/hexano (95:5), cloroformo/acetona(5:4), cloroformo/metanol (95:5),
acetato de etilo/isopropanol/hidróxido de amonio (16:3:1)

Distancia de desarrollo: Se utilizaron placas cromatográficas de 11,5; 15 y 20 cm de

longitud, con un espacio de rodadura de 10; 13,5 y 18,5 cm respectivamente.

Concentración mínima de detección y en consecuencia de la concentración ideal de

análisis: Se preparó una solución de 5 mg/ml de la muestra de referencia de metanol. De
esta solución se aplicaron alícuotas de 6, 10, 16, 20, 26, 30 y 36 .

Ancho de las bandas de aplicación de la muestra: se ensayó con 0,5 y 1 cm.

La visualización de las manchas se realizó mediante exposición UV a 254 nm y el
revelado, mediante pulverización con Dragendorff/ nitrito de sodio al 10%. Las placas se
documentaron mediante fotografía digital.
APLICACIÓN DE LA METODOLOGÍA
DESARROLLADA (CCD)
El método desarrollado se aplicó en análisis de muestras de tallo y
hojas en U. guianensis, recolectada en Juruema, Mato Grosso y donada
por O.N.G. Pro-Natura, y en muestras de hojas y corteza U. tomentosa,
recolectada en Acre y donada por Embrapa- Acre.
El método también se aplicó en el análisis de cuatro hierbas
medicinales basadas en U. tomentosa de diferentes proveedores,
comprados aleatoriamente a minoristas local. La descripción de los
fitoterápicos analizados y su respectivos procedimientos de extracción
se pueden encontrar en la tabla 1.
Tabla 1. Las muestras se aplicaron a las placas por duplicado.
 RESULTADOS

Se eligió la distancia de desarrollo de10cm(placa cromatográfica de 11cm de longitud)esta

placa cromatográfica , proporciono una mejor separación de los alcaloides.

En CCA el ancho de aplicación fue de1cm que proporcionó una mejor resolución de las bandas de
alcaloides en comparación con 0,5 cm ( para extracción crudo ,con risina de poliamida 6 y particon de
ácido base)

 Las muestras obtenidos para los seis alcaloides en los cuatro sistemas de eluyentes
probados, utilizando un ancho de aplicación de la muestra y una distancia de revelado de
1 y 10 cm respectivamente (placa cromatográfica de 11,5 cm)
  El sistema de fase móvil que se elegido fue el de acetato de etilo / hexano 95: 5
,porque presenta una mejor separación de los alcaloides

 La concentración óptima de análisis fue la que se utilizó una alícuota de 10 μL de la

solución madre de 5 mg / ml.( una muestra que contengas 6 alcaloides que queremos
encontrar )

 Esta fue la concentración más baja que permitió la visualización de los alcaloides
oxindólicos
Figura 2. Perfi l dos alcalóides oxindólicos da amostra de
referência nos quatro sistemas de fase móvel testados.

1:CHCl3/MeOH 95:5; 2:Hexano/AcOEt 5:95; 3:AcOEt/iPrOH/

NH4OH (16:3:1); 4:CHCl3/Acetona 5:4. Fase estacionária: gel
de sílica; visualização: UV, 254 nm; dist. desenvolvimento: 10
cm; conc. amostra de referência: 5 mg/mL; vol. aplicado: 10µL
1-Especiofilina, 2-Mitrafilina, 3-Uncarina F, 4-Isomitrafilina,
5-Pteropodina, 6-Isopteropodina. Fase móvel: Hexano/AcOEt
5:95; fase estacionária: gel de sílica; visualização: UV, 254 nm;
dist. desenvolvimento: 10 cm; conc. amostra de referência: 5 mg/
mL; conc. padrões: 1 mg/mL; vol. aplicado: 10 μL.

 La fue más práctica que rociar con reactivo

Dragendorff / nitrito de sodio 10%, que mostró
manchas inestables de color amarillo-marrón
(Figura 3) CCvisualización bajo una lámpara UV de
254 nm (Figuras 2 y 3)

Figura 3. Identificação dos alcalóides oxindólicos presentes na amostra de

referência.
 Figura 4. Revelação da amostra de referência por
borrifamento
com reagente de Dragendorff/nitrito de sódio 10%.

MP: Mistura de Padrões; AR: Amostra de Referência. Fase

móvel: Hexano/AcOEt 5:95; fase estacionária: gel de sílica;
dist. desenvolvimento: 10 cm; conc. amostra de referência:
5
mg/mL; conc. padrões: 1 mg/mL; vol. aplicado: 10 μL.
Figura 5. Comparação entre os perfis de alcalóides de uma amostra de U. tomentosa em
relação a diferentes métodos de extração.

EM: Extrato MeOH bruto; RB: Extrato MeOH tratado com resina
básica Poliamida 6; AR: Amostra de Referência; PAB: Extrato
MeOH submetido à partição ácido-base. Fase móvel: Hexano/
AcOEt 5:95; fase estacionária: gel de sílica; visualização: UV, 254
nm; dist. desenvolvimento: 10 cm; conc. amostra de referência e
de PAB: 5 mg/mL; conc. extratos: 50 mg/mL; vol. aplicado: 10μL.
 Figura 6. Perfil dos alcalóides em amostras de fitoterápicos
comerciais à base de U.tomentosa.

A,B,C,D: ver Quadro 1; AR: Amostra de Referência. Fase móvel: Hexano/AcOEt 5:95; fase
estacionária: gel de sílica; visualização: UV, 254 nm; dist. desenvolvimento: 10 cm; conc.
amostra de referência: 5 mg/mL; conc. amostras de fi toterápicos: 50 mg/mL;
vol. aplicado:10 μL.
Tabela 1. Faixa de valores de Rf dos alcalóides oxindólicos marcadores

valores determinados a partir do cromatograma da amostra de referência (AR)

nas diversas placas cromatográficas apresentadas.
Fase móvel: Hexano/AcOEt 5:95; fase estacionária: gel de sílica; dist.
desenvolvimento: 10 cm.
 DISCUSIÓN
Las pequeñas variaciones que ocurrieron en el Rf de algunas sustancias posiblemente
se deban a oscilaciones en la saturación de la cámara cromatografíca.
Tabla 1. Descripción de los medicamentos herbales analizados basados en Uncaria tomentosa y sus respectivos
procedimientos de extracción

Medicina Forma Composición y parte de la Procedimiento de extracción **

herbaria farmaceutica planta utilizada *
A cápsula gelatinosa corteza en polvo (410 mg / apertura manual de la cápsula y extracción
dura cápsula) de su contenido (747 mg / 10 mL)
B comprimido no declarados (190 mg de trituración de la tableta seguida de
planta / tableta) extracción (1621 mg / 10 ml)
C comprimido Extracto y excipientes de trituración de la tableta seguida de
corteza de raíz seca (100 mg extracción (638 mg / 10 ml)
de extracto / tableta)
D cápsula gelatinosa hoja en polvo (330 mg / apertura manual de la cápsula y extracción
dura cápsula) de su contenido (754 mg / 10 mL)

*Según lo informado por el fabricante;

** todas las extracciones se realizaron con MeOH.
 La comparación de los cromatogramas obtenidos con los dos
métodos de extracción probados contra el cromatograma del
extracto crudo (Figura 5), ​revela que la mejor visualización de
los alcaloides se logró cuando se utilizó la fracción enriquecida
por la partición ácido-base (PAB). El cromatograma del
extracto crudo, en cambio, reveló muchas impurezas en la
base, dificultando o incluso impidiendo la visualización de
alcaloides de menor Rf [especofilina (1) y mitrafilina (2)].

Por otro lado, el tratamiento del extracto crudo con la resina

básica - Poliamida 6 (RB), cuya función es retener los taninos,
proporcionó una visualización muy satisfactoria de los
alcaloides. Para obtener estos resultados, se utilizaron 10 μL de
una solución de 50 mg / mL (500 μg aplicados) tanto para el
extracto crudo como para el semipurificado por resina básica y
para la fracción obtenida por reparto ácido-base el mismas
condiciones que la muestra de referencia (50 μg aplicados).
Figura 5. Comparación entre los perfiles de alcaloides de una muestra de U. tomentosa
en relación a diferentes métodos de extracción.
 En el análisis de los fitoterápicos se eligió el método de
extracción de resina (Figura 6). En este caso, la practicidad de la
extracción en fase sólida se combina con el objetivo de realizar
un análisis comparativo más detallado entre los diferentes
fabricantes. Por tanto, se puede ver que el fitoterápico B, a
diferencia de los demás, no contiene los puntos donde se
encuentran los alcaloides

Medicina Forma Composición y parte de la

herbaria farmaceutica planta utilizada *
A cápsula gelatinosa corteza en polvo (410 mg /
dura cápsula)
Figura 6. Perfil de alcaloides en muestras de B comprimido no declarados (190 mg de
foteroterapias comerciales basadas en U. planta / tableta)
tomentosa. C comprimido Extracto y excipientes de
corteza de raíz seca (100 mg
de extracto / tableta)
D cápsula gelatinosa hoja en polvo (330 mg /
dura cápsula)
Para las muestras de plantas, la opción de aplicar el extracto crudo directamente a la placa cromatográfica (Figura 7),
permitió un rápido cribado preliminar de la presencia y perfil de alcaloides en este material, observando la ausencia y la
aparente menor cantidad de alcaloides oxindólicos pentacíclicos en muestras de U. guianensis en comparación con U.
tomentosa. Como lo demuestran las diferentes placas cromatográficas presentadas, el método cromatográfico desarrollado,
independientemente de la forma de extracción de los alcaloides, demostró ser confiable, reproductivo y selectivo para el
marcador de los puntos donde se encuentran los alcaloides oxindólicos pentacíclicos, lo que permitió un análisis cualitativo
del perfil de estos alcaloides en muestras analizadas

UGC y UGF: tallo y hoja de U. guianensis, respectivamente;

UTC y UTF: tallo y hoja de U. tomentosa respectivamente; AR:
Muestra de referencia. Fase móvil: Hexano / AcOEt 5:95; fase
estacionaria: gel de sílice; visualización: UV, 254 nm; dist.
desarrollo: 10 cm; conc. muestra de referencia: 5 mg / mL;
conc. muestras: 50 mg / ml; vol. aplicado: 10 μL.
Figura 7. Perfiles de alcaloides en muestras de U. tomentosa y
U. guianensis
 Se vio que nuestro mejor sistema de fase móvil es el acetato de etilo / hexano 95: 5 que
presenta una mejor separación de los puntos donde se encuentran los alcaloides. Con la cual
podemos visualizar adecuadamente la separación de los alcaloides con menor RF. Con la cual
es posible la identificación de los alcaloides oxindolicos presentes en la muestra.

Tabla. Rango de valores de Rf de los alcaloides

oxindólicos marcadores
 Conclución
 El método desarrollado en CCD demostró ser confiable, reproducible y
selectivo para los puntos donde se encuentran los alcaloides, siendo aplicado
en el análisis de muestras de hojas y tallos de ambas especies y también de
fitoterápicos comerciales basados ​en U. tomentosa

 La concentración para el extracto crudo y para el semipurificado de la

fracción enriquecida en alcaloides, obtenida por reparto ácido-base feu
diez veces mayor , en relación al extracto crudo.
 Se puede concluir que todos los métodos de extracción tienen ventajas y desventajas, ya
sea por el costo, la gran cantidad de pasos o la menor eficiencia de visualización de las
manchas de los puntos donde se encuentran los alcaloides, y que la elección se puede
hacer en términos del número de muestras, recursos disponibles y objetivos de análisis