UNIVERSIDAD NACIONAL “SAN LUIS GONZAGA”

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE
TOXICOLOGÍA
UNIDAD DIDÁCTICA II:
FENÓMENO TÓXICO
2020-I
 PRÁCTICAS DE LABORATORIO

Sesión 6
Determinación espectrofotométrica del
paracetamol
 Determinación espectrofotométrica del paracetamol

Logros del aprendizaje

• Conoce las características y efectos de un xenobiótico.

• Verifica el índice biológico de exposición de un agente
xenobiótico.
• Evalúa la existencia de una intoxicación aguda por un
xenobiótico, como es el caso del compuesto sintético
paracetamol o acetaminofén.
1

INTRODUCCIÓN
 PARACETAMOL (ACETAMINOFEN)

 Analgésico y antipirético
 No irrita la mucosa gástrica
Fenacetina
 No producen disfunción plaquetaria
 Las dosis terapéuticas (1 – 2 g)
recomendadas están lejos de la
dosis tóxica.
DOSIS TÓXICAS: > 7,5 a 8 g (Adultos).
Paracetamol
> 150-200 mg/Kg (niños)
 TOXICOCINÉTICA - TOXICODINÁMICA

 EXPOSICIÓN: Vía Oral

 ABSORCIÓN: Rápida y completa en TGI.
Biodisponibilidad: 60 -98%
 METABOLISMO: Principalmente a nivel hepático.
 DISTRIBUCIÓN: uniforme en todos los tejidos. Cruza
BHE y BP
 EXCRECIÓN: Principalmente con la orina.
Vida media: 2-4 h (> en extremos de la vida y disfunción hepática)
 La disminución de los niveles de
CYP450
35%
Glutatión, ocurren después de
5% 60%
N-Acetil-Parabenzoil- una sobredosis con paracetamol.
QuinoneImina Si lo niveles caen debajo del
30% de lo normal, la alta
reactividad del NAPQI, hace que
se incorpore a macromoléculas
celulares que contengan
Cisteína.
Antídoto Los enlaces covalentes de la
Tiene el efecto de destoxicar NAPQI causa necrosis
NAPQI hepatocelular sobre todo en área
Repone las reservas de centrolobulillar.
glutatión En riñón también puede ocurrir
Puede conjugarse directamente por la propia producción de
con NAPQI a causa de su grupo NAPQI por el CYP450 en el
sulfhidrilo (-SH). parénquima renal
 DOSIS
TERAPÉUTICAS: Se
TOXICOCINÉTICA
incrementa riesgo de
SOBREDOSIS daño hepático
1.Alcoholismo
< 125 mg/Kg (no hepatotoxicidad). 2. Uso de fármacos
> 250 mg/kg (daño hepático severo aprox. 50%). inductores del CYP450
> 350 mg/kg (daño hepático severo aprox. 100%). 3.Depleción de
Glutatión (anemia,
ayuno)

Necrosis
centro-
lobulillar
 Si los valores de paracetamol a
las 4 horas exceden los 150 TOXICOCINÉTICA
NOMOGRAMA DE RUMACK –
μg/ml se debe iniciar el
tratamiento con NAC MATTHEW
Se utiliza para determinar el riesgo
de hepatotoxicidad por Paracetamol
en relación al nivel plasmático y el
tiempo trascurrido desde la ingesta.
El Nomograma Rumack-Matthew no
El cue
60 ntr
en

% an
predice el grado de supervivencia y
de po
sa r a
rro rr
solo ha sido valido tras una
l l a i ba
rán d
he e es
intoxicación aguda. Los niveles
pa te
t ot n i v
Necrosis ox el séricos deben solicitarse 4 h
ici
da
ds después de la ingestión o en
centro- is
e
cualquier momento entre las 4 y 24
lobulillar h.
FASES DEL CUADROTOXICOCINÉTICA
DE INTOXICACIÓN

24-72 h

72-96 h
Necrosis
centro-
lobulillar
2

MATERIALES Y
REACTIVOS
MATERIALES
Fiola 10 mL Tubos de ensayo
Fiolas 50 mL taparrosca
Fiola 100 mL
Fiola 250 mL
Fiolas 1000 mL EQUIPOS
Pipeta 1 mL Espectrofotómetro Visible
Pipeta 2 mL Balanza analítica
Pipeta 10 mL Refrigeradora
Propipeta Agitador vórtex
Gradilla Micropipetas
REACTIVOS
Cloruro de sodio
Acetato de etilo
Solución Stock de Paracetamol (5 g/L): Disolver 500 mg de
Paracetamol en 100 mL de agua destilada.
Tampón de Acetato sódico 0.3 M (pH 3.6.): Disolver 3.1 g
de Acetato sódico en 800 mL de agua destilada y añadir 16
mL de Ácido acético glacial. Completar con agua destilada
hasta 1000 mL con agua destilada. La solución es estable
cuando se almacena a 4°C.
 Solución de HCl 0,02 M: Medir 1.7 mL de HCl conc. y
llevar a una fiola de 1000 mL. Enrasar hasta la marca de
aforo con agua destilada.
 Solución de Nitrato férrico 0.54%: Disolver 540 mg de
Nitrato férrico en 100 mL de solución de HCl 0,02 M;
filtrar y guardar en un frasco de color oscuro. La solución
es estable a temperatura ambiente (24°C) durante 2
semanas.
 Solución de 2,4,6-tris-(2-piridil)-triazina 0.8 F (TPT):
Disolver 624 mg de TPT en 250 mL de HCl 0,02 M; filtrar
y guardar en un frasco de color oscuro. La solución es
estable cuando se almacena a 4°C.
3

DESARROLLO DE
LA PRACTICA
 1 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES STANDARD:

 A partir de la solución stock de Paracetamol (5,0 mg/mL)

preparar seis soluciones de diferentes concentraciones:
Medir los
volúmenes
calculados de la
Solución stock y
llevarlos a la
fiola
correspondiente.
Enrasar con
agua destilada
hasta la marca
de aforo.
Homogeneizar
por inversión.
- Se dispondrá también de un blanco (agua destilada).
 2 TRATAMIENTO DE LAS SOLUCIONES STANDARD:

 Disponer de 6 tubos de ensayo para el tratamiento de las

soluciones estándar. En cada tubo de ensayo agregar 1 mL de
acetato de etilo y una pizca de cloruro sódico (0,1 g).
 Seguidamente agregar 0,5 mL de la solución estándar
correspondiente. Agitar vigorosamente durante 1 minuto.
 Después de la
separación de las
fases, transferir 0.1 mL
de la capa orgánica de
cada tubo.
 Luego, agregar a cada
tubo, 2,5 mL de
solución tampón de
acetato de sodio,
0,3 mL de solución de
Tripiridiltriazina y
0,1 mL de solución de
nitrato férrico 0.54%. .
 Mezclar y llevar a baño maría hirviente (100° C) durante 10
minutos.
 Llevar al espectrofotómetro para determinar la absorbancia de las
soluciones estándar de Paracetamol a una longitud de onda de
593 nm. Calibrar con el blanco de agua destilada que fue tratado
de forma similar que los estándares.
 3 PREPARACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN:

MÉTODO MANUAL
 Se grafica en papel milimetrado la y
Absorbancia real vs Concentración
de Paracetamol. La absorbancia real

DIVISIONES PROPORCIONALES
del estándar en el eje de las
ordenadas (y) y la concentración en el
eje de las abscisas (x).

Absorbancia
 La absorbancia real (o lectura
corregida) se obtiene restando a la
Absorbancia de la Solución Standard
la Absorbancia del Blanco. Cada
standard se procesa por triplicado, x
considerando el valor promedio para la
Concentración de paracetamol
gráfica y los cálculos. ESTÁNDARES PREPARADOS
 x y
 
CONCENTRACIÓN ABSORBANCIA
ABSORBANCIA
mg/mL REAL

Blanco 0  Ablanco ---

Sol. Standard 1 0,05 Aestándar 1 Aestándar 1 – Ablanco 

Sol. Standard 2 0,1 Aestándar 2 Aestándar 2 – Ablanco 
Sol. Standard 3 0,2 Aestándar 3 Aestándar 3 – Ablanco 
Sol. Standard 4 0,3 Aestándar 4 Aestándar 4 – Ablanco 
Sol. Standard 5 0,4 Aestándar 5 Aestándar 5 – Ablanco 
Sol. Standard 6 0,5 Aestándar 6 Aestándar 6 – Ablanco 

Areal = Aestándar – Ablanco

 Absorbancia real = Absorbancia de la Solución Estándar – Absorbancia del Blanco

• Ubicar los puntos de y

intersección absorbancia –
concentración del
estándar.
• Luego trazar una recta

Absorbancia
manualmente procurando
que los puntos
experimentales se
encuentren lo más
próximamente posible de
la recta trazada. Esta recta
representa la relación
x
señal/concentración.
Concentración de paracetamol (mg/mL)
 MÉTODO ECUACIÓN DE LA RECTA

 Con los valores de absorbancia real se

determina la ecuación de la recta a través del
Análisis de regresión lineal de los datos y = mx ± b
obtenidos (regresión de mínimos cuadrados).
Σ  Xi  X  Yi  Y  
Cálculo de la pendiente (m) : m
Σ Xi  X 
2

Cálculo de la ordenada al origen (b) : b  Y  mX

Verificación de la linealidad de la Σ  Xi  X  Yi  Y  
recta experimental. r
Σ Xi  X  .Σ Yi  Y 
2 2
Coeficiente de correlación:
El coeficiente de correlación (r) debe tomar un valor próximo a 1.
 MÉTODO DEL FACTOR

 Con los valores de la concentración y absorbancia

real de cada estándar se obtiene el factor particular,
resultando ser el Factor del método aplicado el
F=
valor Promedio de los datos obtenidos. x
x y
y

Promedio
 4 DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PARACETAMOL

4.1. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA:

SUERO: Rotar varias veces el vial
para que sea posible una
Limpiar la zona de punción de la buena mezcla con el
anticoagulante.
piel con un desinfectante.
La muestra se obtiene utilizando
una aguja descartable Nº 20 x 1 ½,
siendo suficiente la cantidad de 5 mL.
La muestra se recibe en un vial con
anticoagulante .

ORINA:
Recolectar una muestra de orina
en un recipiente estéril.
4.2. TRATAMIENTO DE LA MUESTRA:
Para realizar la determinación de la concentración de
Paracetamol en una muestra problema, el procedimiento es
exactamente el mismo que para las soluciones estándar y el
blanco.
En este caso se toma 0,5 mL de suero o de orina.

INTERFERENTES: Aminofenazona, Fenilbutaona,

Dipirona, Ácido acetilsalicílico, Fenilefrina, Salicilamina,
Oxifenbutazona (concentración tóxica).
NO INTERFERENTES: Ácido ascórbico, Cafeína, Nicotina,
Fenacetina, Fenilpropanolamina, Fenobarbital y
Dextropropoxifeno.
4.3. ESTIMACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PARACETAMOL:

MÉTODO MANUAL

 Sobre el gráfico de la Curva de

calibración, interpolar el resultado y
de la absorbancia de la muestra,
de manera que pueda hallarse la
correspondiente concentración del

Absorbancia
analito.
ABSORBANCIA REAL: 0,064
Como para el eje “y” un cuadradito equivale a
0,050/20=0,0025, entonces esta lectura se ubicaría en la
división número 0,064/0,0025=26

Como para el eje “x” un cuadradito equivale a 0,1/20=0,005, y

la interpolación le corresponde a la división número 23,
entonces la CONCENTRACIÓN DE PARACETAMOL x
equivale a: 23 x 0,005= 0,115 mg/mL (115 µg/mL)
Concentración de paracetamol (mg/mL)
 MÉTODO ECUACIÓN DE LA RECTA

 La concentración de Etanol de una muestra se

halla a partir de la ecuación de la recta hallada
para los datos de las concentraciones de los
x=y±b
estándares (y = mx + b): m
Concentración Paracetamol (mg/mL) = Absorbancia Muestra ± Ordenada en el origen
Pendiente de la recta

ABSORBANCIA REAL: 0,064

El valor 0,064 corresponde a la absorbancia (y) y si la ecuación de la recta para los datos experimentales de los
estándares resultó ser y = 0,5176x - 0.0035 entonces tendríamos que 0,064 = 0,5176x – 0,0035.
Por tanto, la CONCENTRACIÓN DE PARACETAMOL es: (0,064 + 0,0035) = 0,130 mg/mL (130 µg/mL)
0,5176
 MÉTODO DEL FACTOR

 La concentración de Paracetamol de una

muestra se calcula multiplicando su
absorbancia con el factor hallado para los x=y.F
datos de las concentraciones de los
estándares:

Concentración PARACETAMOL (g/L) = Absorbancia Muestra x Factor

ABSORBANCIA REAL: 0,064

El valor 0,064 corresponde a la absorbancia (y). Si el Factor es 2,063, entonces la
CONCENTRACIÓN DE PARACETAMOL es: 0,064 x 2,063 = 1.32 mg/mL (132 µg/mL)
 CASO PRÁCTICO N° 01:
Ingresa al servicio de emergencias una niña de 5 años por
presentar vómitos y somnolencia. En los antecedentes se
constata ingesta de 14 comprimidos de Paracetamol 500 mg. La
dosis total de paracetamol fue de 7,0 g lo que corresponde a 538
mg/Kg. La ingesta se produjo aproximadamente 2 h antes de su
atención hospitalaria.
Se realizó lavado gástrico a la llegada no observándose restos
visibles del fármaco.
Los parámetros bioquímicos se mantuvieron normales a lo largo
de la evolución a excepción de las transaminasas.
En la determinación del nivel sérico de Paracetamol a las 8 horas,
procesando la muestra por triplicado, se obtuvieron lecturas de
absorbancia a 593 nm con los valores de: 0,175; 0,177; 0,178,
previa calibración del equipo con el blanco.
Se le pide reportar:
1. El nivel sérico de Paracetamol aplicando los tres métodos
estudiados:
Manual
Factor
Ecuación de la recta
2. Evaluar si el nivel sérico de paracetamol encontrado es
indicativo de necesidad de administrar antídoto N-acetilcisteína
(riesgo de hepatoxicidad según Nomograma de Rumack-Matthew).
 CURVA DE CALIBRACIÓN:

  ABSORBANCIA
ABSORBANCIA
CONCENTRACIÓN REAL
mg/mL
MESA 1 MESA 2 MESA 3 PROMEDIO

Blanco 0,0 0.110 0.112 0.105

Sol. Standard 1 0,05 0.132 0.132 0.129
Sol. Standard 2 0,1 0.152 0.153 0.160
Sol. Standard 3 0,2 0.208 0.211 0.208
Sol. Standard 4 0,3 0.278 0.279 0.274
Sol. Standard 5 0,4 0.320 0.316 0.318
Sol. Standard 6 0,5 0.363 0.366 0.363
 FACTOR DEL MÉTODO:
 
CONCENTRACIÓN ABSORBANCIA F = concentración
mg/mL REAL absorbancia

Blanco 0,0
Sol. Standard 1 0,05
Sol. Standard 2 0,1
Sol. Standard 3 0,2
Sol. Standard 4 0,3
Sol. Standard 5 0,4
Sol. Standard 6 0,5
PROMEDIO
 ECUACIÓN DE LA RECTA:

 
CONCENTRACIÓN ABSORBANCIA
Con los valores de la concentración
mg/mL REAL de los estándares (X) y absorbancia
de estos (Y) se determina la ecuación
Blanco 0,0 de la recta a través del Análisis de
Sol. Standard 1 0,05 regresión lineal (regresión de
Sol. Standard 2 0,1 mínimos cuadrados).
Sol. Standard 3 0,2
Sol. Standard 4 0,3
Sol. Standard 5 0,4 y = mx ± b
Sol. Standard 6 0,5
Utilizar archivo Excel proporcionado
por la asignatura.
Gracias…