Tincion de Gram

Tincion de gram
bacteriologia
La tinción:
es un proceso por el cual las moléculas de un colorante se absorben a una superficie.

El uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los microorganismos y
poder realizar la observación en microscopio óptico. Dado que las bacterias son casi
incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas
y no pueden observarse claramente sin algún tratamiento previo. De acuerdo a la
reacción que ocurre, existen diferentes tipos de tinción:
· Simple: el colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología celular.
· Diferencial: el colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre células

bacterianas o entre partes de una misma célula, estas técnicas utilizan más de un
colorante o bien ciertos reactivos complementarios para la tinción.
Los colorantes más usados son: azul de metileno, cristal violeta, safranina, estos son
catiónicos y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados
negativamente, como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos.
Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de
teñirlas, proceso conocido como fijación. Después de esta habitualmente se
realiza la tinción. La fijación produce generalmente encogimiento de las células,
la tinción por el contrario, hace que las células parezcan mayores de lo que son
realmente.
Algunos colorantes teñirán mejor solo después de que la célula haya sido
tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. El
mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de manera que
ahora sí podrá atacar el colorante.
Tinción de Gram:
1) Las células son fijadas por medio del calor sobre un portaobjetos,
se tiñen primero con una solución de cristal violeta y son lavadas después
para quitar el exceso de colorante. En este punto las células Gram
positivas y Gram negativas, están teñidas de azul/violeta.
2) El portaobjetos se cubre con una solución de yodo-yoduro potásico.

El KI hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las células y forma un
complejo insoluble en agua con el cristal violeta. En este punto las células
se mantienen iguales.
3) Se inicia con la decoloración usando una solución de Alcohol-acetona,
sustancias en las que es soluble el complejo I2-Cristal violeta. Algunos
microorganismos no se decoloran. La diferencia esencial entre los dos
tipos de células es la resistencia que presentan ante la decoloración.
Después de la decoloración las células Gram positivas son azul\violeta, y
las Gram negativas son incoloras.
4) Para poner de manifiesto las células Gram Negativas se utiliza
una coloración de contraste. Habitualmente es de color rojo, como la
safranina.
TINCIONES
Tinción negativa
No se trata de una tinción propiamente dicha ya que no se utilizan colorantes con

cromóforos, ni se lleva a cabo ninguna reacción entre estructuras celulares y los
colorantes. En este caso el frotis se hace con una gota de una solución de
nigrosina o tinta china, ambos son productos particulados, insolubles, que
formarán una película opaca a la luz. En este tipo de tinción se prescinde de la
fijación por calor, se deja secar la preparación y se observan los microorganismos
brillantes sobre un fondo oscuro.
Material necesario
Cultivos bacterianos de Staphylococcusaureus y Micrococcus luteus, frasco

lavador, cristalizador, soporte y colorantes (safranina y cristal violeta), asa de
siembra, aceite de inmersión.
Procedimiento
·Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña alícuota

de un cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril.
·Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el portaobjetos con el
asa de siembra. Dejar secar.
·Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el portaobjetos.
·Cubrir con una película de colorante (cristal violeta o safranina) durante 1
minuto.
·Lavar el exceso de colorante con agua.
·Dejar secar al aire.
·Añadir una gota de aceite de inmersión.
·Observar con objetivo de inmersión (100 x).
La tinción simple nos proporciona exclusivamente información acerca de la
forma, tamaño y tipo de agrupación de los microorganismos. Sin embargo
tiene la ventaja de ser un método muy sencillo y rápido.
TINCIÓN DIFERENCIAL
Las tinciones diferenciales se utilizan ampliamente en microbiología;

consisten en la aplicación de dos colorantes que contrastan en su intensidad
o color y un paso intermedio que provoca una respuesta diferente entre
microorganismos distintos o entre determinadas células dentro de una
población. La diferenciación puede ser provocada por un agente químico o
físico, permitiendo observar dos tipos de respuestas diferentes a la tinción
en una misma muestra. Las dos tinciones diferenciales más utilizadas en
bacteriología son la tinción de gram y la tinción de ácido alcohol
resistencia.
la tinción diferencial más utilizada de forma rutinaria y prácticamente la primera
prueba a la que se someten las muestras de cualquier origen antes de su estudio.
Proporciona una información esencial, además de sobre la forma, tamaño y
agrupación celular, como es el tipo y composición de la pared que presentan las
bacterias. La tinción de Gram divide a las bacterias con pared del Dominio Bacteria
en dos grandes grupos: bacterias con pared de tipo gram positiva y bacterias con
pared de tipo gram negativa.
Material necesario
Cultivos de bacterias gram positivas: Bacillus cereusy.
Gram negativas: Escherichia coli, frasco lavador, cristalizador, soporte, portaobjetos,
asa de siembra, cristal violeta, safranina, lugol y alcohol, aceite de inmersión.
 Poseen una pared  Poseen una pared
celular interna y una celular más compleja:
pared de  -pared celular interna
 peptidoglucano.  -pared de
 No tiene membrana peptidoglucano
externa  - bicapa lipídica
externa
 Membrana externq
GRAM POSITIVAS GRAM

NEGATIVAS
Tipo de tinción diferencial empleado
en bacteriología para la visualización de
bacterias:
Bacterias resistentes a la tinción gram
•Mycobacterias
•Mycoplasmas
•Formas L
•Protoplastos y esferoplastos
Funciones
•Identificación preliminar.
•Control calidad de aislamiento bacteriano.
Tinción de ácido-alcohol resistencia
Se trata de un procedimiento de tinción diferencial, conocido como método de
Ziehl-Neelsen, que tiene gran relevancia por su aplicación clínica. Permite
poder distinguir aquellos microorganismos cuya coloración resiste la acción
de alcoholes y ácidos suaves (ácido-alcohol resistentes) de otros que no
resisten la decoloración (no ácido-alcohol resistentes).
Dentro de las bacterias ácido alcohol resistentes encontramos dos importantes
patógenos: Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae,
microorganismos responsables de la tuberculosis y la lepra respectivamente.
Tinción Simple
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen
con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de
lactofenol).
· El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver
elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes
proteicos, por ejemplo de la célula huésped, pero no actúa sobre los
polisacáridos de las paredes celulares de los hongos.
la tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes capsuladas
(Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta
china y la cápsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos.
Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces
para observar la presencia de leucocitos.
· En la imagen: Cryptococcus neoformans en una tinción con tinta china.
Tinción GRAM: Morfología Bacteriana

Ya hemos visto que la tinción de GRAM aporta dos ideas básicas para la deficinión
"taxonómica" de las bacterias: el color que adquieren tras la tinción y la forma que
presentan las células bacterianas.
En lo relativo a la coloración, ya hemos explicado anteriormente que hablamos de
microorganismos Gram-positivos cuando aparecen teñidos de color azul-violeta y de
Gram negativos cuando se visualizan de color rojo-rosado.
Formas básicas en que se puede visualizar la morfología bacteriana en una tinción
GRAM:
Cocos
Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la división celular. Diplococos, aparecen
por pares. Estreptococoss, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en
grupos irregulares, a veces de gran tamaño
Material necesario:
• Placa Petri con agar chocolate
• Asa de siembra o material estéril para sembrar
• Mechero de alcohol
• Agua destilada
• Colorantes de tinción Gram (cristal violeta, lugol, alcohol-acetona 1:1,
safranina)
• Cristalizador y varillas de tinción
• Portaobjetos
• Alcohol 96º
• Papel secante
• Microscopio óptico
Procedimiento Tinción de Gram
En primer lugar, para realizar una tinción, lo que tenemos que tener son
microorganismos sembrados. Dichos microorganismos los hemos el día anterior
mediante la técnica de siembra de estría múltiple, los hemos dejado incubar
durante 24 horas a 37ºC en la incubadora para así obtener las colonias de los
diferentes microorganismos. En este caso son microorganismos de la orofaringe.
Siempre que “destapemos” una placa con colonias, deberá hacerse en condiciones de
esterilidad. Para conseguir estas condiciones podemos utilizar un mechero Bunsen o
un mechero de alcohol. Con el mechero, conseguiremos que se forme un ambiente de
esterilidad alrededor de la llama, por lo tanto, si trabajamos cerca del mechero,
tendremos un ambiente estéril.
A la hora de comenzar con la tinción, lo primero que hay que realizar es un frotis
del microorganismo, para ello hay que añadir una gota pequeña de agua destilada
(cuanto mayor sea la gota, tardará más tiempo en secarse).
Debemos coger la muestra con el asa bacteriológica previamente esterilizada.
Para ello encendemos el mechero de alcohol y ponemos el asa en posición
vertical encima del mechero hasta que el hilo del extremo del asa se quede
totalmente incandescente.
Después debemos esperar a que se enfríe porque si tocamos con el hilo
incandescente las colonias podemos matar al microorganismo.
Abrimos la placa con las bacterias y con el asa tocamos en el agar para
comprobar que éste está frío.
A continuación, cogemos unas colonias de las bacterias y las extendemos sobre la
gota de agua destilada.
Una vez extendido, volvemos a esterilizar el asa, ya que todo material debe ser
esterilizado antes de volver a ser guardado. A continuación, lo que tenemos que hacer es
fijar la muestra, la cual se puede fijar con metanol o se puede fijar con calor. En este caso
utilizaremos la fijación por calor.
Tenemos que hacer movimientos circulares o en zig zag por encima de la llama del
mechero, levantando constantemente la muestra para que no se nos queme el tiempo
suficiente para que la muestra quede totalmente seca y por lo tanto fijada.
Una vez fijada la muestra apagamos el mechero por seguridad.
Ahora, vamos a teñir nuestra siembra de microorganismos en el portaobjeto con

diferentes tipos de tinciones para poder visualizar cada microorganismo (bacteria) al
microscopio.
Las tinciones se realizan en un cristalizador, también utilizamos varillas de tinciones y

el porta con la muestra.
Vamos a utilizar diferentes reactivos para la tinción. En primer lugar el cristal
violeta, en segundo lugar el lugol,
Vamos a utilizar diferentes reactivos
para la tinción. En primer lugar el
cristal violeta, en segundo lugar el
lugol
usaremos también alcohol de 96º (el

decolorante puede estar formado por
una mezcla de alcohol, alcohol-
acetona y por diferentes mezclas),
y por último la safranina.
Qué va a ocurrir? Las bacterias gram positivas y las bacterias gram negativas tienen
diferente grosor en el peptidoglicano de su pared celular, de tal forma que cuando
echemos el cristal violeta se nos van a teñir tanto las gram positivas como las gram
negativas. El lugol lo que hará, será fijar el colorante del cristal violeta a las
bacterias, con el alcohol (o mezcla decolorante), lo que haremos será eliminar el
cristal violeta de las gram negativas y por último, la safranina, va a teñir solamente a
las gram negativas que son las que están decoloradas. Por lo tanto, las gram positivas
estarán teñidas de cristal violeta y las gram negativas de safranina (color fucsia).
El protocolo será aplicar a las bacterias fijadas cristal violeta durante un minuto,
luego lavar con el frasco lavador. A continuación, añadir lugol durante un minuto,
volver a lavar con el frasco lavador. Después, añadir durante 10 o 15 segundos la
mezcla de alcohol o alcohol-acetona…, lavar la muestra con el frasco lavador. Y
finalmente, añadir safranina durante un minuto y lavar con agua destilada.
Por lo tanto, tal y como hemos dicho, aplicamos el cristal violeta.
Una vez que ha transcurrido el minuto lo lavamos con agua destilada.
Ahora vamos a añadir el lugol justo por encima de la zona de la muestra y
esperamos otro minuto
Ya ha transcurrido el minuto y lavamos con agua destilada. A continuación
decoloraremos la muestra con el alcohol. Para conseguirlo hay que incorporar el
porta de un lado para ir añadiendo el alcohol y que vaya resbalando para abajo.
Cada protocolo estipula un tiempo pero con 15 segundos aproximadamente la
muestra quedará decolorada.
Tras los 15 segundos de decoloración, aclararemos con agua destilada para que el
alcohol no siga actuación, porque si no paramos el proceso de decoloración a
tiempo, todas las bacteria quedarían decoloradas, no solamente las gram negativas
y por lo tanto no podríamos diferenciar unas de otras.
Por último, aplicamos a la muestra la safranina y lo dejamos actuar durante otro

minuto.
Transcurrido el minuto, volvemos a aclarar la muestra con agua destilada y
dejaríamos que la muestra se secara.
Posteriormente observaremos la muestra con el microscopio.

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es un proceso por el cual las moléculas de un colorante se absorben a una superficie.

· Diferencial: el colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre células

2) El portaobjetos se cubre con una solución de yodo-yoduro potásico.

No se trata de una tinción propiamente dicha ya que no se utilizan colorantes con

Cultivos bacterianos de Staphylococcusaureus y Micrococcus luteus, frasco

·Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña alícuota

Las tinciones diferenciales se utilizan ampliamente en microbiología;

GRAM POSITIVAS GRAM

Tinción GRAM: Morfología Bacteriana

Procedimiento Tinción de Gram

Ahora, vamos a teñir nuestra siembra de microorganismos en el portaobjeto con

Las tinciones se realizan en un cristalizador, también utilizamos varillas de tinciones y

usaremos también alcohol de 96º (el

Por último, aplicamos a la muestra la safranina y lo dejamos actuar durante otro

Posteriormente observaremos la muestra con el microscopio.

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