Immunologie parasitaire

I-Définition d’un antigène :

On nome antigène toute substance qui introduite dans un organisme est capable de susciter la
production d’anticorps, c’est le pouvoir immunogène ou l’immuno-génécité.

Le terme antigène recouvre une deuxième signification, celle d’un corps capable de réagir
spécifiquement avec le ou les anticorps correspondants, dans les réactions sérologiques.

Les parasites sont formés d'une mosaïque antigénique. Certains sont communs à plusieurs
espèces, provoquant de fréquentes réactions croisées. D’autres sont spécifiques de chaque
parasite ou de chaque stade chez le même parasite.

II-Source d’antigène :
Les antigènes sont préparés à partir des souches parasitaires entretenues au laboratoire soit
 Sur des animaux
(toxoplasme sur souris)
 A partir des milieux de culture (milieux NNN & leishmanies)
 A partir de la culture cellulaire (MRC5 & toxoplasme)

III-Type d’antigène :

 Antigènes figurés:
Représenté par le parasite entier vivant ou tué (toxoplasme). Ou une partie du parasite
(bilharzie), ce sont des antigènes très spécifiques et remarquables en raison de la rapidité et de
la constance de la réponse immunitaire qu’ils provoquent au cours de la primo-infection.

 Antigènes solubles :
Ce sont des produits d’excrétions ou de secrétions du parasite (Ag métabolique).Ils Sont très
immunogéne et induisent une réponse immunitaire importante. Les parasites sont soumis à un
cycle de trois congélations /décongélations successives suivies d’ultrasonication pour obtenir
des antigènes mixtes (membranaires et cytoplasmiques) ou une lyse osmotique pour isoler les
antigènes cytoplasmiques.

VI-Intérêts des antigènes :

La préparation des antigènes parasitaires a un double intérêt :
 Etude de la réponse humorale de l’organisme

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  Sérodiagnostic des parasitoses.

V-Intérêt du sérodiagnostic :
La sérologie représente la base du dépistage et du diagnostic dans certaines situations:
 En phase de migration larvaire (distomatose)
 Devant une Localisation uniquement viscérale des parasites (leishmaniose)
 Au stade chronique d'affections ayant évolué vers une séquestration des parasites dans
certains organes (trichinose)
 Dans les impasses parasitaires, de même, quand le parasite
reste à I' état larvaire chez I' homme (kyste hydatique)
 Enfin, le sérodiagnostic est utile Lorsque la charge parasitaire est faible.

IV-Les techniques utilisées dans le sérodiagnostic des parasitoses :

Les techniques utilisées en sérologie parasitaire sont des méthodes classiques en
immunologie. Aucune de ces techniques n'étant parfaite, et chaque technique sérologique
présentant des avantages et des inconvénients, il faut toujours associer au minimum deux
techniques différentes.

Les anticorps produits par I’ organisme peuvent être recherches dans le sérum et dans le LCR,
voire dans d'autres liquides biologiques.

Les méthodes sérologiques sont basées sur I’ utilisation d'antigènes figurés (antigènes
complets ou coupes de parasites) dans les réactions d'immunofluorescence ou d'agglutination,
ou d'antigènes solubles dans les réactions d'hemagglutination, d'électrosynérèse,
d'immunoélectrophorèse, d'Elisa ou de western-blot.

Ces différentes techniques sont utilisées en fonction des antigènes disponibles selon les
parasitoses recherchées.

 Les techniques utilisant un antigène figuré :

Immunofluorescence indirecte (IFI) :
Décrite par Goldman en 1957, cette technique utilise des parasites formolés et fixés sur une
lame à spots. Après incubation du sérum à différentes dilutions, la fixation des Ac spécifiques
sur l’antigène aboutit à la formation du complexe Ag-Ac qui sera révélé par une antiglobuline
marquée à la fluorescéine.

La réaction est quantitative, elle utilise des antigammaglobulines totales (détection des IgG)
avec un seuil de spécificité qui varie en fonction du parasite en cause.

Le résultat s’exprime par la plus forte dilution donnant une réaction positive, se traduisant par
une fluorescence intégrale de la membrane du parasite.

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La technique est reproductible, simple et facile à réaliser mais la lecture est délicate,
subjective et nécessite un microscope à fluorescence.

Immunofluorescence directe :
Cette technique utilise un anticorps dirigé contre la molécule recherchée (antigène
parasitaire). Cet anticorps est couplé à un fluorochrome. Ensuite pour révéler la préparation,
on peut utiliser un microscope à fluorescence.

 Techniques utilisant un antigène soluble:

Techniques d’immuno-précipitation :
 Double diffusion en gélose (technique d’ouchterlony)
La diffusion conjointe d’un antigène et d’un sérum à testé vis-à-vis de cet antigène entraine
après 24 à 48h, l’apparition d’une ligne de précipitation au point d’équivalence entre la source
d’antigène et l’anticorps correspondant.

Lorsque plusieurs antigènes sont présents dans le système, ils se conduisent indépendamment
les uns des autres et l’on obtiendra alors autant d’arcs de précipitation que d’antigènes
réactogènes.

Mode opératoire :
 Dans des boites de pétri de 5 cm de diamètre, couler 5ml d’une solution d’agarose à
1% en tampon véronal PH8.2 additionnée de 5% de citrate de sodium. Ce dernier étant
destiné à éliminer une protéine C éventuelle.
 Après solidification de l’agarose (1 à 4h environ à la température de du laboratoire ou
30 minutes à +4°C) découper les réservoirs à l’emporte-pièce.
 Remplir les réservoirs à l’aide d’effilure de pipette (antigène hydatique au centre, les
sérums à testé dans les alvéoles périphériques)
 Après diffusion des réactifs (15 à 20mn) placer la boite en chambre humide.
 Laisser diffuser 24h à la température du laboratoire, puis 24 à 48h à +4°C
 On peut effectuer la lecture soit directement sur fond noire. Soit après coloration au
bleu de coumassie.

Lecture :
La réaction est dite positive s’il y a apparition des lignes de précipitation indiquant la
présence d’un complexe antigène –anticorps. Elle est négative dans le cas contraire.

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  Immunoélectrophorèse
Les fractions antigéniques placées dans un champ électrique migreront en fonction de leur
charge le long de l’axe de migration.

La diffusion, perpendiculairement à cet axe, d’un immun-sérum montrera des arcs de

précipitation formés aux points de rencontre des anticorps spécifiques avec les fractions
antigéniques correspondantes

Mode opératoire :
 On utilise des lames de verre porte- objet numérotées préalablement enduites de
gélose à 1% dans l’eau distillée. Une fois les lames séchées couler un gel d’environ
2mm d’épaisseur sur chaque lame. Ce gel est formé d’agarose à 1% dans un tampon
véronal sodique à PH 8.2 (3ml)
 Mettre les lames coulées à +4°C 30mn avant l’emploi.
 Tracer les gouttières et les puis d’Ag
 Déposer l’Ag dans le puis additionné de bleu de bromophénol à 2 ‰
 Effectuer la migration électrophorétique pendant 2h 30 sous un potentiel de 25volt
 Eviter les gouttières et y déposer les sérums à examiner (0.2ml du sérum concentrés
3fois)
 Placer les lames en chambre humide et laisser diffuser 24h à la température du
laboratoire et 24h à +4°C
 Immerger les lames dans une solution de citrate de sodium à 5% pendant 3H
 Laver pendant 3jours les lames dans une solution de lavage (Na Cl 0.15M)
 Sécher les lames en déposant sur le gel une bande de papier filtre découpé au même
format puis en le plaçant une nuit à l’étuve à 37°C
 Après séchage complet, enlever la bande de papier filtre et plonger les lames 10mn
dans la solution de coloration (amido-schwarz)
 Décolorer par passage de 10mn dans deux bains successifs de solution de décoloration
(acide acétique à 4%)
 Arrêter la décoloration en rinçant les lames sous l’eau et laisser sécher.

Lecture :
La présence d’arcs spécifiques de précipitation indiquerait une infestation.

 Electrosynérèse
Cette méthode dérive en fait de la technique d'immunodiffusion double d'Ouchterlony. Elle
consiste à accélérer la diffusion par un champ électrique. Les conditions électrophorétiques

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sont choisies de façon à ce que les antigènes et les anticorps migrent en sens inverse (ceci est
possible car le pHi des Immunoglobulines est supérieur à celui de beaucoup de protéines).
L’hemagglutination passive :
Proposée par Jacob et al en 1957, elle est basée sur l’agglutination d’hématies de mouton
sensibilisées par l’antigène en présence de différentes dilutions du sérum contenant les
anticorps spécifiques.

Son seuil de positivité varie en fonction des kits commercialisés, et nécessite l’incubation des
sérums avec des hématies non sensibilisées à la recherche des agglutinines irréguliers. Un
résultat positive s’exprime par la formation d’un voile dans le puis et un résultat négatif
s’exprime par un point de sédimentation au fond du puits.

L’hemagglutination passive est utilisée pour le dépistage mais doit être toujours couplée à
une technique complémentaire.

C’est une technique d’exécution rapide et de lecture facile, mais elle manque de sensibilité
pour les faibles titres d’anticorps.

Les réactions immuno-enzymatique :

 Enzym linked immunosorbent assay (ELISA) :
Décrite par Engvall et Perlmann en 1972. Les anticorps contenus dans le sérum à tester sont
mis en contact avec des cupules sensibilisées par un antigène à dominance cytoplasmique
enrichie d’antigène membranaire puis révélés par une anti-immunoglobuline humaine
marquée à une enzyme ( peroxydase), l’addition du substrat-chromogène spécifique de
l’enzyme génère une réaction colorée dont la densité optique est mesurée par
spectrophotométrie et comparée à une gamme étalon de sérums titrés.

C’est une technique automatisée, reproductible avec une bonne sensibilité et une bonne
spécificité. Elle permet de révéler les différentes classes d’immunoglobuline, mais elle
nécessite un matériel spécialement adapté et une rigueur dans l’exécution.

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  ELISA inverse :
Proposée par Schaefer et al en1989. La première étape est une immunocapture de l’isotype à
étudier, le support est sensibilisé par un anticorps monoclonal ou polyclonal anti-IgM ou anti-
IgA. Le sérum est ensuite ajouté et les anticorps correspondants sont captés sur le support.
Après lavage, l’antigène parasitaire est ajouté soit directement marqué à une enzyme (ELISA
reverse) ou couplé à un anticorps marqué à une enzyme (ELISA double sandwich). L’ajout du
substrat-chromogène révèle une réaction coloré dont l’intensité est proportionnelle à la
quantité d’anticorps spécifiques retenus dans les cupules. On obtient des index de fixation
permettant une évaluation semi-quantitative de la présence des anticorps.

L’ELISA inverse présente l’avantage d’éviter l’interférence des IgG par compétition et du
facteur rhumatoïde mais son inconvénient est de ne permettre qu’une évaluation semi-
quantitative du taux d’anticorps.

Immunoblotting ou western blot :

Introduite dans le diagnostic par Towbin et coll en 1979, elle représente une méthode
analytique extrêmement performante qui permet de séparer les fractions les plus spécifiques
de la mosaïque antigénique.

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Cette technique comporte plusieurs étapes a commencé par une migration électrophorètique
verticale de l’antigène soluble du parasite à travers un minigel de polyacrylamide (SDS page),
puis un électrotransfert à travers une membrane de nitrocellulose. L’incubation des bandes de
nitrocellulose avec les dilutions des sérums à tester est suivie d’une révélation
immunoenzymatique des anticorps spécifiques qui apparaissent sous forme de bandes colorée.

L’analyse des profils d’anticorps permettra de différencier entre les anticorps maternels et
ceux du nouveau né. Elle permet également de différencier la réponse en anticorps dans deux
milieux biologiques différents sérum/LCR au cours de la toxoplasmose cérébrale et
sérum/humeur aqueuse au cours de la toxoplasmose oculaire. Aussi elle permet de confirmer
le diagnostic par apparition des bandes spécifiques (14-16Kd pour la leishmaniose).

C’est une technique très sensible et spécifique, peut être utilisée pour les différents isotypes
d’immunoglobine, elle reste cependant longue et onéreuse et la reproductibilité dépendra de
chaque étape.

IIV-Exploration de l’immunité a médiation cellulaire IDR :

Intradermoréaction à la leishmanine (réaction de Monténégro)
C’est une réaction d’hypersensibilité retardée provoquée par l’injection intradermique de
promastigotes de culture tuées.

Une injection de solution phénolée sans parasites est faite à proximité, comme témoin d’une
éventuelle sensibilité du patient au phénol.

Après 48 à 72H, une réaction positive donne un nodule induré entouré d’érythème. Cette
réaction est positive chez les patients ayant fait une leishmaniose viscérale antérieure, elle
reste positive après la guérison durant toute la vie.

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IIIV-Application des différentes techniques dans le diagnostic des parasitoses :