FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

DEPARTEMENT GENETIQUE

LICENCE GENETIQUE MOLECULAIRE APPLIQUEE

SEQUENCAGE DE L’ADN

 Noms et Prénoms des membres étudiants :

- DAHAM MOHAMMED TAYEB
- CHAIB NASSIM MOHAMMED
- BOUSSOURA KAMEL

ANNEE UNIVERSITAIRE 2022-2023

 SOMMAIRE

I – INTRODUCTION……………………………………………..……………3

II – DEFINITION DU CONCEPT………………………………………...
…..3

III - IMPORTANCE DU SEQUENCAGE……………………………………4

IV - LES TECHNIQUES DE SÉQUENÇAGE DE

L’ADN………………….5

IV-1 LA TECHNIQUE DE MAXAM-

GILBERT………………………….....6

IV-2 LA TECHNIQUE DE SANGER…………………………………………

7

V -LE PRINCIPE DE SÉQUENÇAGE DE GRANDS

GÉNOMES………….9

VI – CONCLUSION…………………………………………………………..10

VII – REFERENCES
BIBLIOGRAPHIQUES……………………………...11
I – INTRODUCTION

La structure de l’ADN (Acide désoxyribonucléique) a été décrite en 1955, dès lors la

biologie a connue des progrès technologiques dont le séquençage qui constitue un des
évènements clés de ce progrès. Le séquençage démarre une nouvelle ère, tant en biologie
fondamentale qu’en biotechnologie.

Le principe du séquençage d'un génome, est de fragmenter aléatoirement ce génome

(dérivés du génome sous forme de grands morceaux d'ADN) ainsi le séquençage consiste en
la détermination de la séquence nucléotidique de l’ADN présent dans chaque cellule d’un
organisme donné. Pour obtenir des morceaux d'ADN de milliers de paires de bases (A C G T),
faciles à manipuler.[1]

Depuis, le séquençage d’ADN est devenu un outil primordial en biologie moléculaire ,

en médecine et dans de nombreuses autres disciplines des sciences de la vie. Le séquençage a
été décrit il y a plus de 30 ans et n’a cessé d’évoluer depuis cette période sur le plan des
méthodes et de techniques. [3]

Le séquençage d’ADN est devenu une technique indispensable dans les laboratoires de
biologie moléculaire. Les connaissances acquises grâce à cette méthode et la possibilité de
séquencer des génomes de grande taille, tel que le génome de l’être humain (Human 
Genome  Project ), qui a pris plus  d’une décennie pour  le compléter , ont poussé à
développer des techniques de séquençage de plus en plus sophistiquées. 

II – DEFINITION DU CONCEPT DU SEQUENCAGE DE L’ADN

Ceci dit, le séquençage de l’ADN constitue une méthode dont le but est de déterminer
la succession linéaire des bases A, C, G et T faisant parties de la structure de l’ADN. La
lecture de cette séquence permet d’étudier l’information biologique contenue par celle-ci.

La structure de l’ADN chez chaque individu est unique et spécifique, la séquence de

l’ADN permet de nombreuses applications dans le domaine de la médecine, comme, par
exemple :

 Les études génétiques,

 Le diagnostic des maladies,
 L’étude de paternité,
  La criminologie,
 La synthèse de médicaments,
 Les enquêtes épidémiologiques (COVID). 

Dans les références bibliographiques, le mot séquençage peut se retrouver sous deux
dénominations différentes. Dans les études de génomes, le terme de reséquençage est utilisé à
la place de séquençage. Cette dénomination, essentiellement utilisée en génétique, désigne le
séquençage d’un segment d’ADN suivi de la comparaison du résultat obtenu avec celui d’une
séquence de référence connue.[3]

Une autre dénomination employée : le séquençage de novo. Dans ce cas, il s’agit du

séquençage d’un génome pour lequel il n’existe pas de séquence référence. Il s’agit donc de la
détermination d’une séquence inconnue.

Le séquençage d’ADN : soit le reséquençage, soit le séquençage de novo, utilise les mêmes
techniques.
III - IMPORTANCE DU SEQUENCAGE

Le génome humain contient plus de (03) six milliards de paires de bases, qui
représentent notre patrimoine génétique. Seulement la moitié des gènes identifiés ont un
impact fonctionnel connu chez l’humain. Et nous possédons un petit génome indépendant,
celui de la mitochondrie (d’environ 16 500 bases). [2]

Sachant que l’exome, est celui qui comprend uniquement la partie codante du
génome, représente une très faible proportion du génome, c’est cette partie qui est la plus 
étudiée.

La finalisation de la séquence complète du génome humain qui se trouve dans le

noyau de la cellule sous forme d’ADN s’est faite en 2006. Mais, les génomes de plusieurs
agents infectieux, de faune et de flore ont également été séquencés dans leur totalité.

Les recherches biomédicales et biologiques ont été modifiées grâce à ses séquençages,
en ouvrant la porte à des découvertes dans le domaine médical et dans de nombreuses
disciplines biologiques (anthropologie, agronomie, environnement…).

Le développement des connaissances est en plein croissance, le séquençage est devenu

un instrument nécessaire à la compréhension des cycles de la vie. Le but est d’essayer
d’améliorer la santé humaine et l’équilibre écologique à l’échelle terrestre.
Les applications du séquençage sont multiples, citons quelques une :

 Diagnostic et traitement de nombreuses maladies humaines (exemples : cancers,

maladies infectieuses, maladies héréditaires…)
 Variants génétiques associés à une pathologie (par exemple, le diabète)
 Rassembler des informations sur le génome (structure, fonction, évolution) et étude
des variations du génome (polymorphismes bialléliques, insertions, délétions,
insertions/délétions

Avec la description de la technique de séquençage dis

l’Amplification en chaine par polymérase (PCR) en 1985, le séquençage s’est démocratisé
dans les laboratoires de biologie moléculaire. Depuis 2000, outre la PCR, de nouvelles
techniques de séquençage se sont développées.

VI - LES TECHNIQUES DE SÉQUENÇAGE DE L’ADN

Les deux premières techniques fondatrices de séquençage de l’ADN, sont celle des
deux américains Maxam et Gilbert et celle du britannique Sanger, qui ont été décrites
simultanément en 1977.
En 2005, est apparu les premiers séquenceurs de nouvelle génération,  permettant  
une  diminution  des  coûts  et  une  augmentation  considérable  du  débit  de  séquençage.[1]
 Figure 1 Evolution des techniques de séquençage

IV-1 LA TECHNIQUE DE MAXAM-GILBERT[2]

Cette technique est maintenant délaissée et n’est plus utilisée au sein des laboratoires
de recherche.
Cette technique est une méthode chimique de traitement de l’ADN, elle est publiée
parallèlement avec celle de Sanger en 1977, a fortement contribué à l’histoire de la biologie
moléculaire.
C’est une méthode chimique de séquençage. En départ, les réactifs clivent
spécifiquement après chacune des bases A, C, G, [A + G], [C + T]. La propriété de certains
agents chimiques, l’hydrazine, le diméthyl sulfate (DMS) et l’acide formique sont les éléments
clés de cette méthode, car ils modifient les bases de l’ADN.
Puis, la pipéridine est ajoutée et brise les brins d’ADN au niveau des bases modifiées.
Les agents chimiques sont utilisés de telle facon qu’ils n’agissent qu’avec un faible
pourcentage des bases de l’ADN étudié.
Les changements sont le fruit des opérations suivantes :
 Le DMS agit au niveau des bases « G ».
 L’acide formique agit au niveau des bases « A + G ».
 L’hydrazine agit au niveau des bases « C + T » (en milieu alcalin, l’hydrazine agit
uniquement au niveau des « C »).
L’ADN à séquencer est marqué à une extrémité. Un marqueur radioactif est le plus
souvent utilisé.
Le produit de séquence est déposé sur un gel d’acrylamide, puis la séquence est lue
après autoradiographie (figure2). L’ADN étudié peut être simple ou double brin. Cette
technique permettait d’analyser des fragments allant jusqu’à 500 pb.[3]
 Figure 2 Méthode de Maxam-Gilbert 

Un fragment amplifié par PCR et marqué radio activement par le phosphore radioactif
(P32), ensuite ce fragment est modifié par un agent chimique, comme l’hydralazine. Cette
dernière modifie les bases C et T et en milieu alcalin, uniquement les bases C [2].
Par la suite, l’addition de pipéridine casse de manière aléatoire et au moins une fois au
niveau de chaque base C modifié. Des fragments de taille différente sont obtenus en fin du
processus.
L’ADN cible est traité par chacun des produits de modification spécifique de base,
dans quatre tubes séparés :
1. hydralazine C + T ;
2. hydralazine C en milieu alcalin ;
3. diméthyl sulfate G ;
4. acide formique A + G,
Tout cela est suivi d’un traitement par la pipéridine. Les fragments coupés aléatoirement et
au moins une fois après chaque base spécifique sur l’ADN cible sont de taille différente. La
mise de ces derniers dans un gel d’acrylamide spécifique suivie d’une autoradiographie
permet de déduire la séquence de l’ADN au cours de la lecture du gel dans le sens 5′ → 3′ de
bas en haut du gel.[2]

IV-2 LA TECHNIQUE DE SANGER

La méthode de Sanger a dépassé la méthode de Maxam-Gilbert pour la remplacer et

reste à ce jour la principale méthode de séquençage utilisée dans les laboratoires.
Son principe est le suivant :

1. Au début, il faut impérativement amplifier l’ADN cible par le PCR,

2. Dénaturer l’ADN amplifié afin d’obtenir un ADN simple brin.
3. À l’aide d’une amorce spécifique et complémentaire du brin étudié (sens ou antisens),
soit celle utilisée pour la PCR ou fifférente, une ADN polymérase effectue alors la
synthèse de l’ADN complémentaire à partir de cette amorce.
4. De l’extrémité 5′ vers l’extrémité 3′, cette enzyme ajoute les désoxyribonucléotides-
triphosphates (dNTP) complémentaires et de manière aléatoire et inconstante des
didéoxyribonucléotides triphosphates (ddNTP), par exemple un ddGTP sera parfois
ajouté à la place d’un dGTP.
 5. La réaction se faisant dans un seul tube, les ddNTP (ddATP, ddGTP, ddCTP et
ddTTP) sont marqués à l’aide de fluorophores différents pour chaque ddNTP
(fluorophores « quatre couleurs »).
6. Lorsqu’un ddNTP est inclu à la place d’un dNTP, l’ADN polymérase ne peut plus
continuer sa polymérisation.
7. La réaction d’extension s’arrête (en effet, le didéoxynucléotide ne possède pas de
groupe 3′-hydroxyle indispensable à la réaction de polymérisation de l’enzyme).[3]

Remarque importante, au cours de la réaction, pour chaque « base » de l’ADN cible, au

moins une fois, un ddNTP complémentaire sera incorporé à la place d’un dNTP.

A la fin de la réaction, nous obtiendrons des fragments de taille différente. Puis vient
l’étape de l’analyse de la réaction.
Une adaptation de cette technique consiste à marquer les didésoxynucléotides plutôt
que les amorces, ce qui permet de n’utiliser qu’un seul mélange au lieu des quatre
nécessaires dans le cas d’un marquage des amorces.

Différentes méthodes d’analyse sont possibles. Aujourd’hui, l’électrophorèse

capillaire réalisée sur un automate de séquençage est la méthode de choix. Lors de la
migration, chaque fragment (contenant un ddNTP marqué par un fluorophore) sera excité par
un laser et le signal obtenu analysé par un logiciel spécifique.
L’analyse informatique des signaux permet d’obtenir la séquence étudiée, par
exemple, sous forme d’un électrophorégramme, qui peut etre lue manuellement mais prends
plus de temps.
Des logiciels d’analyse des séquences peuvent être utilisés. Dans tous les cas,
l’analyse d’un fragment d’ADN après PCR se fait toujours à l’aide d’une amorce sens et
antisens afin de confirmer la séquence (et une éventuelle anomalie de séquence).
Cette technique permet d’obtenir des séquences de longueur comprise entre 400 et
850 pb. Comme déjà indiqué, cette technique, décrite pour la première fois en 1977, reste la
plus utilisée dans les laboratoires, notamment dans les institutions hospitalières.
De nos jours, les séquenceurs utilisés sont quasiment acheté par des sociétés qui les
commercialisent.
D’autre développements de la méthode de Sanger sont en cours et notamment la
miniaturisation de la technique. À titre d’exemple, récemment des auteurs ont réussi à
séquencer 600 pb en 6,5 minutes à l’aide d’une puce constituée d’une micro fluidique
permettant une électrophorèse avec un capillaire de 7,5 cm de long constitué d’une polymère
spécifique [2].

Sans cesse améliorée depuis plus d’une dizaine d’années, elle semble atteindre
aujourd’hui ses limites même si des améliorations, notamment la miniaturisation de cette
technique sont en développement.

V -LE PRINCIPE DE SÉQUENÇAGE DE GRANDS GÉNOMES

L’automatisation à l’aide de robots a permis de séquencer de nombreux génomes dont

le génome humain. Le travail a été considérable et n’a pu être effectuée que grâce à une
robotisation et une informatisation poussées dans des instituts dédiés à ces séquençages à
grande échelle. [4]

À ce jour, plus de 280 génomes procaryotes ont ainsi été totalement séquencés. Pour
réaliser le séquençage d’un grand génome (eucaryote ou procaryote, par exemple), une carte
physique du génome est d’abord constituée. Il s’agit d’établir des repères sur le génome à
l’aide de marqueurs spécifiques de chaque chromosome. Schématiquement, deux types de
marqueurs sont utilisés :

 les polymorphismes (avec étude de la liaison génétique entre ceux-ci). Ce type de

marqueurs a été étudié soit à l’aide d’enzymes de restriction, soit à l’aide de
microsatellites (séquences répétées dont le nombre de répétition est le plus souvent
variable au même locus) ;

 les séquences uniques polymorphes ou non appelées aussi sequence tagged

sites (STS).
Ensuite, il y a eu l’avènement de nouvelles méthodes, citons par exemple : La
technique shotgun ou la methode live-seq.

V-1 La méthode Shotgun [2]:

Cette méthode est aussi appelée technique du séquençage aléatoire globale, utilisée
généralement pour le séquençage d’un grand nombre de génomes notamment bactériens.
Deux méthodes de shotgun pour le séquencage de génomes existent et sont :
 A/Le shotgun "génome complet" (whole-genome shotgun) s'applique normalement
aux génomes relativement simples, en exploitant au maximum les informations de
cartographie et la bioinformatique pour éviter les misassemblages. Employé par Celera.

B/Le shotgun hiérarchique ou "clone par clone" implique de générer un jeu de clones

de grande taille (100-200kb) couvrant le génome puis de soumettre au shotgun uniquement
des clones bien choisis. Ceci élimine les risques d'erreur "longue distance".

V-2 -La méthode Live-seq [2]:

C’est est une méthode de séquençage du génome très peu invasive. Cette méthode a
pour objectif de préserver les cellules pour permettre de suivre l’activité des gènes dans le
temps. Elle repose sur la microscopie à force fluidique.

     L’objectif du Live-seq est le séquençage du transcriptome de cellules uniques, plus précis

que le séquençage de tissus composés de plusieurs types cellulaires. 

VI - CONCLUSION
La diffusion de la méthode de Sanger, la commercialisation d’automates utilisant des
fluorophores quatre couleurs ainsi que le déploiement de la PCR dans les laboratoires ont
considérablement amélioré les procédures de séquençage.

Plusieurs technologies de séquençage existent et il est important de bien les choisir en

fonction de l’application désirée.

Le séquençage nouvelle génération (next generation sequencing [NGS]) repose sur

une approche de séquençage en parallèle de millions de courts fragments (librairie) dont la
taille varie de 200 à 400 paires de bases.[4]

Puisque le séquençage de nouvelle génération engendre beaucoup d’informations et de
paramètres, il est nécessaire d’apprendre et de manipuler avec aisance les différents  outils  et
logiciels bio informatiques  pour  analyser  adéquatement les données.

En effet, connaître l’enchaînement complet des bases nucléotidiques qui constituent un

génome, c’est connaître toute l’information nécessaire à la vie.[5]
D’autres technologies sont toujours à développer, dans le but : d’améliorer le
rendement, la rapidité et le coût du séquençage.
VII- REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
[1] J.LAMORIL & ALL , « Les techniques de séquençage de l’ADN : une révolution en
marche », Immuno-analyse & Biologie Spécialisée, Volume 23, Issue 5, October 2008, Pages
260-279
[2] A.MAXAM & W.GILBERT, « A new method for sequencing DNA », Proc Natl Acad
USA Vol 74 N°2 pp 560-564, Fevrier 1977.

[3]F.THURIOT, « Améliorer le diagnostic des maladies musculaires en utilisant le

séquençage d’ADN à haut débit : une perspective canadienne », thèse de phd en biochimie,
2021.
[4] P.GUEGUEN, S.REDON, C.LE MARECHAL, « Puces à ADN (microArrays) et
séquençage de nouvelle génération », ELSEVIER , Volume 2015, Issue 473, June 2015, pp
63-70.
[5] E.EL FAHIME & M.ENNAJI MLY , « Évolution des techniques de séquençage », Les
technologies du laboratoire, Vol 2 N°5 2007, Université Hassan II , Maroc