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    Dosage

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    Mme youyou
    Ce document décrit la méthode de dosage des protéines tissulaires par la méthode de Bradford. Il explique le principe du dosage, qui implique le changement de couleur du bleu de Coomassie lorsqu'il se lie aux acides aminés des protéines. Le document détaille ensuite le protocole expérimental, y compris la préparation des réactifs, des homogénats tissulaires et la réalisation du dosage ainsi que d'une gamme d'étalonnage.

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    Ce document décrit la méthode de dosage des protéines tissulaires par la méthode de Bradford. Il explique le principe du dosage, qui implique le changement de couleur du bleu de Coomassie lorsqu'il se lie aux acides aminés des protéines. Le document détaille ensuite le protocole expérimental, y compris la préparation des réactifs, des homogénats tissulaires et la réalisation du dosage ainsi que d'une gamme d'étalonnage.

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    Dosage

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    dosage

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    Ce document décrit la méthode de dosage des protéines tissulaires par la méthode de Bradford. Il explique le principe du dosage, qui implique le changement de couleur du bleu de Coomassie lorsqu'il se lie aux acides aminés des protéines. Le document détaille ensuite le protocole expérimental, y compris la préparation des réactifs, des homogénats tissulaires et la réalisation du dosage ainsi que d'une gamme d'étalonnage.

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    Matière: Biochimie Alimentaire Responsable de la matière : Dr. REGGAMI.

    Y
    TP n 06 : Dosage spectrophotométrique des protéines tissulaires par la méthode de
    Bradford

    TP n° 06 : Dosage spectrophotométrique des protéines


    tissulaires par la méthode de Bradford

    1. Introduction
    Les méthodes de dosage des protéines sont nombreuses et présentent chacune
    des caractéristiques différentes : sensibilité, interférents, réponse plus ou moins
    différente selon la composition en acides aminés, etc....
    Le choix d'une méthode dépend donc du contexte. Citons quelques méthodes :
    par l'intermédiaire du dosage de l'azote total protéique (méthode de kjeldahl), par
    mesure directe de l'absorbance en domaine UV à 280 nm (méthode de Christian-
    Warburg), par méthodes spectrophotométriques après mise en œuvre d'une réaction
    chimique (méthode du Biuret, méthode de Lowry) ou de la fixation d'un colorant
    (méthode de Bradford) ...

    2. Principe
    La méthode de Bradford est un dosage spectrophotométrique, basé sur le
    changement d'absorbance après la fixation d'un colorant, se manifestant par le
    changement de la couleur du Bleu de Coomassie après liaison (complexification) avec
    les acides aminés basiques (arginine, histidine, lysine.) et les résidus hydrophobes
    des acides aminés présents dans la ou les protéines. La forme anionique (liée) du
    colorant est bleue, et possède un spectre d’absorption maximal estimé
    historiquement à 595 nm. Les formes cationiques (libres) du colorant sont rouges et
    marrons, absorbant à 465-470 nm. Le changement d'absorbance est proportionnel à la
    quantité de colorant lié, indiquant donc la concentration en protéines dans
    l'échantillon.

    3. But
    L’objectif de la présente manipulation est le dosage des protéines de quelques
    tissus biologiques (tissus hépatique, musculaire, intestinal, etc….) par la méthode de
    Bradford en comparaison avec une gamme d’étalonnage.

    4. Réactifs et matériel
    4.1. Réactifs et produits chimiques
    EDTA (Acide Ethylène Diamine Tétra Acétique): 7.4448 g.
    Bleu de Coomassie (G 250) : 0.1 g
    Ethanol (95 %) : 50 ml.
    Acide Orthophosphorique (85%) : 100 ml
    Eau distillée : 3L
    Glaçons (Cubes)

    4.2. Matériel
    Spectrophotomètre + 2 cuves + Papiers joseph.
    Tubes à essais + 4 portoirs + Agitateur des tubes.
    Agitateur magnétique (Plaque chauffante) + barreau aimanté.

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    Matière: Biochimie Alimentaire Responsable de la matière : Dr. REGGAMI.Y
    TP n 06 : Dosage spectrophotométrique des protéines tissulaires par la méthode de
    Bradford

    Bécher de 100 ml + entonnoir + Pipettes (1ml, 2ml, 5ml) + Pipeteur.


    Balance analytique + Spatule+ Verre de montre + Mortier et pilon en
    porcelaine.
    Matériel biologique congelé (1g de foie, 1g de muscle, 1g d’intestin…etc).

    5. Mode opératoire
    5.1. Préparation de la solution d’EDTA (0.02 M)
    EDTA………………………………………..7.4448 g.
    Eau distillée………………………………qsp 1000 ml.

    5.2. Préparation du Réactif de Bradford


    Bleu de Coomassie (G 250)……………………. 0.1 g.
    Ethanol (95 %)………………………………….50 ml.
    Agitation pendant deux heures (agitateur magnétique) puis ajouter :
    Acide Orthophosphorique (85%)……………...100 ml.
    Eau distillée………………………………qsp 1000 ml.
    Ce réactif doit être filtré puis ; il peut être conservé pendant 1 mois à une
    température de 4°C et à l'abri de la lumière.

    5.3. Préparation de l'homogénat


    Mettre 200 mg de tissu congelé dans un mortier en présence de 8 ml d'une
    solution d'EDTA à 0.02M.
    Mettre le mélange dans un bain de glace.
    Broyer à l'aide d'un pilon en porcelaine.

    5.4. Dosage
    Prélever 0,1 ml de l'homogénat.
    Ajouter 5 ml du réactif de Bradford.

    Blanc (témoin) Échantillon


    Réactif (R) 5 ml 5 ml
    Eau distillée 0,1 -
    Échantillon (l'homogénat) - 0,1 ml

    Homogénéiser
    Laisser reposer 5 min.
    Lire la densité optique à 595 nm, contre le blanc.
    La densité optique obtenue est rapportée sur une courbe d'étalonnage
    préalablement tracée. La concentration des protéines est déterminée par
    comparaison à une gamme étalon d'albumine sérique bovine (1 mg/ml)
    réalisée dans les mêmes conditions.

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    Matière: Biochimie Alimentaire Responsable de la matière : Dr. REGGAMI.Y
    TP n 06 : Dosage spectrophotométrique des protéines tissulaires par la méthode de
    Bradford

    Réalisation de la gamme d'étalonnage des protéines


    BSA………………………………..l g.
    Eau distillée………………qsp 1000 ml.

    Tubes 1 2 3 4 5 6
    BSA (µl) 0 20 40 60 80 100
    Eau distillée (µl) 100 80 60 40 20 0
    Réactif de Bradford (ml) 5 5 5 5 5 5

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