Génie Génitique

UNIVERSITE DE JIJEL
 Département : biologie moléculaire et cellulaire

 Spécialité : licence 3 biochimie
DEVOIR DE GENIE GENETIQUE
Applications du clonage moléculaire dans le domaine de l’industrie

pharmaceutique
 Réalisé par : Proposé par :

 Bezazel Faiza Madame : Asma CHERBAL
 Dridi Noura
 Bouaziz Ikhlas
Année Universitaire : 2023/2024

1) Généralités :
Le marché biopharmaceutique en plein essor génère une demande croissante en molécules

thérapeutiques, notamment des protéines complexes impossibles à synthétiser chimiquement. Les capacités
de production actuelles, principalement basées sur des technologies éprouvées (bactéries, levures, cellules de
mammifères), s'avèrent insuffisantes et coûteuses. De nouvelles technologies prometteuses (cellules aviaires,
animaux et végétaux transgéniques) émergent, mais nécessitent encore validation.
Le clonage moléculaire s'impose comme une solution pour répondre à ce défi. Cette technique permet
de reproduire fidèlement des molécules spécifiques, telles que des protéines thérapeutiques ou des antigènes,
en grande quantité. Elle offre une alternative plus efficace et plus rapide aux méthodes traditionnelles,
contribuant ainsi à l'accélération du développement et de la production de médicaments.
2) Différentes applications du clonage moléculaire dans la bio production de

protéines thérapeutique :
Grâce au génie génétique qui permet de modifier ou d'altérer l'ADN, on peut produire des protéines
recombinantes thérapeutiques. Ces protéines constituent des traitements importants pour une variété de
maladies, telles que le diabète, le cancer, les maladies infectieuses, les maladies auto-immunes et les
maladies génétiques.
 Les protéines thérapeutique produit par le clonage :
 Les hormones :
L'insuline humaine :
-C'est la première protéine recombinante approuvée pour un usage médical en 1982.
-Elle est utilisée pour traiter le diabète de type 1 et 2.
-Produite par des bactéries (Escherichia coli) des levures (Saccharomyces cerevisiae ou Pichia
pastoris) en plus de plusieurs cellules de mammifères.
L'hormone de croissance humaine :

-Stimule la croissance osseuse et musculaire.
-Utilisée pour traiter les enfants souffrant de déficit en hormone de croissance.
-Produite par les bactéries (E.coli) , les levures (Saccharomyces cerevisiae et Pichia pastoris) en plus
des cellules de mammifères (CHO) et des plantes (Nicotiana tabacum et Nicotiana benthamiana)
L'érythropoïétine (EPO) :
-Stimule la production de globules rouges.
-Utilisée pour traiter l'anémie due à l'insuffisance rénale, à la chimiothérapie ou à d'autres causes.
-Produite par les cellules de mammifères tel que NS0 (myélome de souris) et les levures
 Les anticorps monoclonaux :

-Molécules très spécifiques qui ciblent et neutralisent des cellules ou des molécules spécifiques.
-Utilisés pour traiter divers cancers, des maladies auto-immunes et d'autres affections.
-Produits par différentes cellules de mammifères comme les cellules CHO (ovaires de hamster
chinois), les cellules de NSO (myélome de souris) et cellules embryonnaires de rein humain HEK
293 De plus les levures (Pichia pastoris) et les plantes
 Les cytokines :
L’interféron :
-Possède des propriétés antivirales et anticancéreuses.
-Utilisé pour traiter divers cancers, l'hépatite C et la sclérose en plaques.
-Produite par des cellules de mammifères comme les cellules NS0 (myélome de souris), cellules
HEK (rein embryonnaire humain), ainsi que les levures (Saccharomyces cerevisiae)
 Les facteurs de coagulation :

Facteur VIII (FVIII) :
-Le FVIII recombinant (rFVIII) est produit par des cellules CHO ou HEK293 transfectées avec
l'ADNc du FVIII humain.
-Le rFVIII est utilisé pour traiter l'hémophilie A, une maladie génétique héréditaire caractérisée par
une déficience en FVIII.
-Le rFVIII est plus sûr et plus efficace que les produits dérivés du plasma, et il a considérablement
amélioré la qualité de vie des patients hémophiles.
Facteur IX (FIX) :
-Le FIX recombinant (rFIX) est produit par des cellules CHO ou BHK transfectées avec l'ADNc du
FIX humain.
-Le rFIX est utilisé pour traiter l'hémophilie B, une maladie génétique héréditaire caractérisée par
une déficience en FIX.
-Le rFIX est plus sûr et plus efficace que les produits dérivés du plasma, et il a permis de réduire le
risque de complications chez les patients hémophiles.
3) Un exemple de protéine recombinante thérapeutique : (l’insuline) :

* L'insuline est une protéine composée de deux chaînes d'acides aminés : -Chaîne A : 21 acides aminés
-Chaîne B : 30 acides aminés
* Ces deux chaînes sont liées entre elles par trois ponts disulfures :
-Deux ponts disulfures interchaînes entre la chaîne A et la chaîne B
-Un pont disulfure intrachaîne dans la chaîne A
* Les chaînes A et B de l'insuline sont produites séparément dans des cellules d'E. coli.
* Le processus de production des deux chaînes est similaire, mais utilise des plasmides et des cellules
d'E. coli distincts
 Les étapes de production d’insuline recombinant :
 Etape 1 : Isolation de l'ARNm pour la l'insuline : Cette étape consiste à isoler l'ARN messager
(ARNm) codant pour l’insuline humaine à partir des cellules des îlots de Langerhans
 Étape 2 : Transcription inverse : Synthèse de l'ADNc complémentaire à l'ARNm à l'aide d'une
enzyme spéciale : la transcriptase inverse. L'ADNc obtenu par le processus de transcription inverse
est ensuite coupé par deux enzymes de restrictions :
-EcoRI : Cette enzyme reconnaît la séquence GAATTC et coupe l'ADNc entre les bases G et A.
-BamHI : Cette enzyme reconnaît la séquence GGATCC et coupe l'ADNc entre les bases G et G.
 Étape 3 : Extraction de plasmide à partir du la bactérie E.coli : Le plasmide pBR322 possède deux
gènes de résistance aux antibiotiques :
-Gène de résistance à la tétracycline : Confère au cellule la capacité de survivre en présence de
l'antibiotique tétracycline
-Gène de résistance à l’ampicilline : Confère au cellule la capacité de survivre en présence de
l'antibiotique ampicilline.
* Les enzymes de restriction EcoRI et BamHI coupent l'ADN plasmidique de la bactérie E. coli à
des séquences spécifiques (les sites de restriction).
* L'enzyme BamHI Coupe au niveau de gêne de résistance à la tétracycline dans la séquence
GGATCC.
 Étape 4 : Insertion et ligature : Insertion du gène de l'insuline humaine dans le plasmide pBR322 a
l'aide d'un ADN Ligase afin d'obtenir un plasmide recombiné.
 Étape 5 : Transformation : Introduction des vecteurs recombinant dans les bactéries.
 Étape 6 : Sélection des bactéries recombinantes :
* Première sélection : Les bactéries sont clonées dans un milieu contenant de l'ampicilline. Seules
les bactéries qui ont reçu un plasmide pBR322 survivront, car ce plasmide leur confère une
résistance à l'ampicilline.
* Deuxième sélection : Les clones bactériens sont ensuite cultivés dans un milieu contenant de la
tétracycline. Cette fois, les clones qui meurent sont ceux qui ont reçu un plasmide pBR322
recombinant. En effet, le plasmide pBR322 recombinant a intégré un gène de résistance à la
tétracycline, qui est inactivé lors de la recombinaison.
 Étape 7 : Production d'un plasmide recombinant contenant les gènes de l'insuline humaine et de la β-
galactosidase :
1. Extraction du plasmide recombinant : On extrait le plasmide recombinant contenant le gène de
l'insuline humaine à partir des bactéries.
2. Digestion par EcoRI et ligature du gène lacZ : On utilise l'enzyme de restriction EcoRI pour
couper le plasmide recombinant et un fragment d'ADN contenant le gène de la β-galactosidase
(lacZ) et On utilise l'enzyme ADN ligase pour insérer le gène lacZ dans le plasmide recombinant,
créant un nouveau plasmide recombinant.
3. Transformation : Le nouveau plasmide recombinant est introduit dans des bactéries par
transformation.
 Étape 8 : La sélection : Les bactéries sont cultivées dans un milieu contenant l'ampicilline et le
substrat de l'enzyme B-galactosidase (X-gal)
-Les Bactéries qui apparaissent en bleu : sont les bactéries recombinantes (qui ont reçu le gène LacZ
codée pour l'enzyme B galactosidase capable d'hydrolyser leur substrat x -gal)
-Les bactéries qui apparaissent en blanche : sont les bactéries non recombinantes (qui n'a pas reçu le
gène LacZ, L’enzyme B galactosidase n'a pas été fabriquée et leur substrat x-gal n’a pas été
hydrolysé)
-Toutes les étapes mentionnées ci-dessus sont répétées de la même manière avec la chaîne beta qui sont
réfusionnée avec la chaîne alpha, est donc l’insuline humaine recombinée est prête à l’emploi.
Processus de production d’insuline par la technologie de l’ADN recombinant
Bibliographie :
1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3181932/
4. https://www.medecinesciences.org/en/articles/medsci/full_html/2019/12/msc190035/
msc190035.html
5. https://fr.openinsulin.org/lutilisation-des-micro-organismes-dans-la-production-de-medicaments/
6. https://www.larousse.fr/encyclopedie/animations/Production_dinsuline_par_g%C3%A9nie_g
%C3%A9n%C3%A9tique_m%C3%A9dicament_recombinant/1100478
8. https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1046592803002286
9. https://www.nature.com/articles/nrd4436
10. https://www.youtube.com/watch?v=oU-lDXBZofM

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 Les anticorps monoclonaux :

 Les facteurs de coagulation :

3) Un exemple de protéine recombinante thérapeutique : (l’insuline) :

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