Lucie - Pigeon 2441

Interactions moléculaires et cellulaires entre les
protéines E3-14.7K, FIP-1 et les microtubules :

application dans le transfert de gènes
Lucie Pigeon
To cite this version:

Lucie Pigeon. Interactions moléculaires et cellulaires entre les protéines E3-14.7K, FIP-1 et les mi-
crotubules : application dans le transfert de gènes. Sciences agricoles. Université d’Orléans, 2012.
Français. �NNT : 2012ORLE2084�. �tel-00912867�
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abroad, or from public or private research centers. publics ou privés.
UNIVERSITÉ D’ORLÉANS
ÉCOLE DOCTORALE SCIENCES ET TECHNOLOGIES

SANTE, SCIENCES BIOLOGIQUES ET CHIMIE DU VIVANT
Centre de Biophysique Moléculaire
THÈSE présentée par :

Lucie PIGEON
soutenue le : 20 Décembre 2012
pour obtenir le grade de : Docteur de l’université d’Orléans

Discipline/ Spécialité : Biologie Moléculaire et Cellulaire
Interactions moléculaires et cellulaires entre

les protéines E3-14.7K, FIP-1 et les
microtubules :
Application dans le transfert de gènes
THÈSE dirigée par :

Chantal PICHON Professeur d’Université, Orléans
Patrick MIDOUX Directeur de recherche INSERM, Orléans
RAPPORTEURS :
Daniel SCHERMAN Directeur de recherche CNRS, Paris
Jean-Serge REMY Directeur de recherche CNRS, Strasbourg
____________________________________________________________________
JURY
Karim BENIHOUD Professeur d’Université, Paris-Sud
Marc BOUDVILLAIN Directeur de recherche CNRS, Orléans, President du jury
Patrick MIDOUX Directeur de recherche INSERM, Orléans
Chantal PICHON Professeur d’Université, Orléans
Jean-Serge REMY Directeur de recherche CNRS, Strasbourg
Daniel SCHERMAN Directeur de recherche CNRS, Paris
Ernst WAGNER Professeur d’Université, Munich
_________________________________________________________________
Sommaire
Liste des abréviations ..................................................................................................... 6
INTRODUCTION ............................................................................................. 10
Généralités ............................................................................................................... 12
CHAPITRE I : THERAPIE GENIQUE ET VECTEURS NON VIRAUX ...................... 13
I-LA THERAPIE GENIQUE ......................................................................................... 13
I.1 : Principe et définition .............................................................................................. 13
I.2 : Les applications de la thérapie génique ................................................................ 13
Une stratégie thérapeutique en constante évolution .................................................. 13
L exemple de la Dystrophie Musculaire de Duchenne ................................................ 14
Applications aux maladies polygéniques ..................................................................... 17
I.3 : Les succès de la thérapie génique .......................................................................... 18
I.4 : Les vecteurs viraux en thérapie génique ............................................................... 19
I.4.2 : Limites d utilisation des vecteurs viraux ............................................................ 21
Taille de l'insert ............................................................................................................. 21
Immunogénicité ........................................................................................................... 22
Oncogénicité ................................................................................................................ 23
Bioproduction ............................................................................................................... 23
II-LES METHODES NON VIRALES DE TRANSFERT DE GENES ......................... 24
)). : )njection d acides nucléiques dits nus ................................................................. 24
Injection intratissulaire ................................................................................................ 24
Injection hydrodynamique .......................................................................................... 25
II.2: Méthodes physiques ............................................................................................. 26
Biolistique ..................................................................................................................... 26
Electroporation ............................................................................................................. 27
Magnetofection ............................................................................................................ 27
Sonoporation ................................................................................................................ 28
II.3 : Vecteurs synthétiques ou chimiques .................................................................. 28
1
II.3.1: Les liposomes cationiques .................................................................................. 30
Lipoplexes ...................................................................................................................... 31
II.3.2: Les polymères cationiques ................................................................................. 32
Polyplexes ..................................................................................................................... 32
Dissociation des polyplexes ..........................................................................................33
II.3.3 : Lipopolyplexes ................................................................................................... 34
III-TRANSFERT DE GENES ET BARRIERES INTRACELLULAIRES......................35
III.1 : Les barrières intracellulaires ................................................................................35
III.2 : Endocytose .......................................................................................................... 36
III.2.1 : Lipofection ........................................................................................................ 37
III.2.2 : Polyfection ....................................................................................................... 37
III.3 : Echappement des endosomes ............................................................................ 38
III.3.1 : Polyplexes ......................................................................................................... 38
III.3.2 : Lipoplexes......................................................................................................... 39
III.4 : Trafic cytosolique ................................................................................................ 41
III.5 : Importation nucléaire.......................................................................................... 41
CHAPITRE II : AMELIORATION DU TRAFIC CYTOSOLIQUE ............................ 43

I-TRAFIC CYTOSOLIQUE ......................................................................................... 43
Transport endosomal ................................................................................................... 43
ADNp nu ....................................................................................................................... 44
Virus .............................................................................................................................. 45
II-DYNEINE : PROTEINE MOTRICE DES MICROTUBULES ............................... 45
II.1 : Microtubules ......................................................................................................... 45
Structure ....................................................................................................................... 45
Dynamique des microtubules ...................................................................................... 46
Fonction des microtubules .......................................................................................... 48
II.2 : Dynéine ................................................................................................................ 49
II.2.1 : Différentes isoformes......................................................................................... 49
II.2.2 : Dynéine cytosolique 1 ....................................................................................... 49
II.2.2.1 : Structure et composition ................................................................................ 49
2
II.2.2.2 : Interactions...................................................................................................... 51
Interaction avec les microtubules ................................................................................ 51
Interaction avec la dynactine ........................................................................................ 51
Interactions via les chaînes légères ............................................................................. 52
II.2.2.3 : Dynamique ..................................................................................................... 54
II.2.2.4 : Fonction .......................................................................................................... 56
II.3 : Dynéine et trafic des virus ................................................................................... 56
Adénovirus .................................................................................................................... 57
Herpès virus .................................................................................................................. 58
Virus et chaîne légère de la dynéine ............................................................................ 58
III-DYNEINE & TRANSFERT NON VIRAL DE GENES ........................................... 59
III.1 : Interaction avec les chaînes légères de la dynéine ............................................ 59
DLC-AS de LC8 ............................................................................................................. 59
Interaction avec TCTEX-1 ............................................................................................ 60
III. : )nteraction avec NF B ......................................................................................... 61
))). : Utilisation de l héxon de la capside adénovirale ............................................... 62
CHAPITRE III : LA PROTEINE D’ADENOVIRUS E3-14.7K, FIP-1 ET LES

MICROTUBULES ........................................................................................................ 63
I-GENERALITES SUR LES ADENOVIRUS HUMAINS ........................................... 63
Infection adénovirale ................................................................................................... 64
Génome adénoviral ...................................................................................................... 65
Les protéines de la phase précoce ............................................................................... 66
Les protéines E3 ............................................................................................................ 67
II-LA PROTEINE E3-14.7K ......................................................................................... 69
II.1 : Structure ............................................................................................................... 69
II.2 : Activité biologique ............................................................................................... 70
Effet protecteur de la mort cellulaire induite par TNF ............................................. 71
)mplication dans la voie NF B ...................................................................................... 71
Effet protecteur de l apoptose induite par TRA)L ...................................................... 73
Effet protecteur de l apoptose induite par Fas ............................................................ 73
3
Acide arachidonique .................................................................................................... 74
)nteraction avec le facteur inducteur d apoptose ....................................................... 74
II.3 : Les protéines FIPs ................................................................................................ 75
FIP-2 .............................................................................................................................. 76
FIP-3 .............................................................................................................................. 77
FIP-4 .............................................................................................................................. 78
II.4 : La protéine FIP-1 .................................................................................................. 78
Une GTPase homologue de Ras ................................................................................... 78
Structure ....................................................................................................................... 79
Interaction avec E3-14.7K ............................................................................................. 80
Interaction avec Dynéine ............................................................................................. 80
PROJET ......................................................................................................................... 81
Résultats Partie I Etude des interactions entre E3-14.7K, FIP-1

et les microtubules in cellulo et identification du peptide P79-
98 responsable de la fixation sur la protéine FIP-1 .......................... 82
I-LES TECHNIQUES BASEES SUR LE TRANSFERT D’ENERGIE.......................... 84
I.1 : La technique de FLIM-FRET ................................................................................. 84
I.1.1 : Le principe ........................................................................................................... 84
Temps de vie de la fluorescence .................................................................................. 84
FRET et temps de vie d une molécule fluorescente .................................................... 85
FLIM-FRET ................................................................................................................... 86
I.1.2 : Mesure du temps de vie d une molécule fluorescente ...................................... 87
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) ................................................... 87
Préparation des analyses in cellulo ............................................................................. 88
I.1.3 : Exemple de mesure FLIM-FRET ......................................................................... 89
I.2 : La technique de FRET par photoblanchiment de l accepteur............................. 90
I.3- La technique de BRET............................................................................................. 91
I.3.1 : Le principe ............................................................................................................ 91
I.3.2 : BRET et interaction protéine protéine .............................................................. 92
4
I.3.3 : Le BRET comme technique de criblage ............................................................. 93
Courbe de Saturation ................................................................................................... 93
Compétition .................................................................................................................. 94
II- RESULTATS : )nteraction of adenoviral E -14.7K with microtubules network:
identification of P79-98 peptide derived from E3-14.7K which interacts with FIP-1
and mediates cell cycle arrest. .................................................................................... 94
Résultats Partie II Utilisation du peptide P79-98 dans le

transfert non viral de gènes ....................................................................... 1377
I- COUPLAGE PEPTIDE / ADNp ......................................................................... 138
II- RESULTATS : Enhancement of polyplexes transfection efficiency by the use of
P79-98 peptide from E3-14.7K that promotes a microtubules-mediated transport of
plasmid DNA. ............................................................................................................. 140
Conclusion Perspectives ................................................................................ 167

I-ETUDE DES INTERACTIONS E3-14.7K / FIP-1 ET LES MICROTUBULES ....... 168
II- UTILISATION DU PEPTIDE P79-98 DANS LE TRANSFERT DE GENES ....... 170
Optimisation de la méthode de couplage ADNp/peptide ......................................... 171
Synergie avec signal d importation nucléaire NF .................................................... 172
Applications dans les méthodes physiques de transfert de gènes ............................ 173
Cellules différenciées – Taille des plasmides ............................................................. 174
Références bibliographiques ....................................................................... 176
5
Liste des abréviations
AAV : Adeno associated vector
ADN : Acide désoxyribonucléique
ADNc : ADN complémentaire
ADNp : ADN plasmidique
ADP : Adenovirus Death Protein
AFM : Association Française contre les Myopathies
AIF : facteur inducteur d apoptose
ALD : Adrénoleucodystrophie
ANSM : Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé
AON : Oligoribonucléotide anti-sens
ARN : Acide ribonucléique
ARNm : Acide ribonucléique messager
ARP1 : Actin-related protein
as : Anti-sens
ASFV : Virus de la peste porcine africaine
ATP : Adénosine TriPhosphate
bio : Biotine
BCA : Bicinchoninic acid
BGSC : Bis-guanidium-spermidine-cholesterol
BGTC : Bis-guanidium-tren-cholesterol
BPF : Bonnes Pratiques de Fabrication
BPEI : PEI branchée
BRET : Bioluminescence Resonance Energy Transfer
CBM : Centre de Biophysique Moléculaire
CLIP170 : cytoplasmic linker protein
CFTR : Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator
Cl- : Ions chlorure
CLSM : Confocal laser scanning microscopy
CMH : Complexe Maleur d'Histocompatibilité
CMV : Cytomégalovirus
CTL : Lymphocytes T cytotoxiques
Da : Dalton
6
DC-Chol : [N-(n′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol
Dcyto : Constante de diffusion dans le cytoplasme
DD : Death domain –Domaine de mort
DDAB : DimethylDioctadecylAmmonium Bromide
DED : Death Effector Domain
DHC : Dynein Heavy Chain
Dhc1a : Dynéine cytoplasmique 1
Dhc1b : Dynéine cytoplasmique 2
DISC : Death Inducing Signaling Complex
DLC-AS : Dynein Light Chain Association Sequence
DMD : Dystrophie musculaire de Duchenne
DMEM : Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMPE : Dimethyl diMyristoyl PhosphatidylEthanolamine
DMRIE : 1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydoxyethylammonium bromide
DODAC : Dioctadecyldimethylammonium chloride
DOGS : Dioctadecylamidoglycyl-spermine
DOPC : 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
DOPE : Dioleoylphosphatidylethanolamine
DOSPA : 2,3-dioleyloxy-N-[2(spermine carboxaminino)ethyl]-N,N-dimethyl-1
propanaminium trifluroacetate
DOTA : 1,2-dioleoyloxy-3-(trimethylammonio)propane
DOTIM : 1-[2-(9(Z)-octadecenoyloxy)-ethyl]-2-(8(Z)- heptadecenyl)-3-(2-
hydroxyethyl)-imidazolinim chloride
DOTMA : N-[1-(2, 3-dioleyloxy) propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride
DSP : Dithiobis(succinimidylpropionate)
D-SPM : Dextran-spermine
DsRed : Discosoma Red Fluorescent Protein
DTBP : Diméthyl-3,3'-dithiobispropionimidate
DTS : DNA nuclear Targeting Sequences
Dw : Constante de diffusion dans l eau
Dyh1 : Dynéine cytoplasmique 1
Dyh2 : Dynéine cytoplasmique 2
DYNC1LI : Dynein Light Intermediate Chain
DYNC1I : Dynein Intermediate Chain
DYNLL : Dynein Light Chain LC8
7
DYNLRB : Dynein Light Chain RoadBlock
DYNLT : Dynein Light Chain TCTEX-1/TCTEL1
EGFR : Epidermal Growth Factor Receptor
EphA2 : Ephrin type-A receptor 2
ESE : Exonic Splicing Enhancer
FACS : Fluorescence-Activated Cell Sorting
FADD : Fas-associated Death Domain
FBS : Fetal Bovine Serum
FDA : Food and Drug Administration
FIP : Fourteen.7k Interacting protein
FIX : Facteur de coagulation hépatique IX
FLICE : FADD-Linterleukin 1b Converting Enzyme
FLIM : Fluorescence Lifetime Microscopy
FRAP : Fluorescence recovery after photobleaching
FRET : Förster resonance energy transfer
GDP : Guanosine DiPhosphate
GFP : Green fluorescent protein
GIP-1 : GTPase-interacting protein
GRMD : Golden retriever muscular dystrophy
GSK : GlaxoSmithKline
GTP : Guanosine TriPhosphate
H+ : Protons
HB : Homogenization buffer
His-lPEI : Histidylated-lPEI
HIV : Human immunodeficiency virus
HLA : Human Leukocyte Antigen
HLV : Hydrodynamic Limb vein
HSC : Cellules Souches Hématopoiétiques
HSV : Virus Herpès Simplex
HSV TK : Thymidine kinase du
IC74 : Intermediate Chain 74 kDa
ICS : Image Correlation Spectroscopy
IKKAP1 : IKK associated protein
IL2RG : chaîne γ du récepteur de l interleukine
IRF : Réponse Instrumentale
8
ITR : séquences Terminales Répétées Inversées
kb : Kilo bases
kDa : Kilo Dalton
kg : Kilogramme
LC7 : Light Chain 7
LC8 : Light Chain 8
LCA : Leber s congenital amaurosis
LGMD2B : Limb-Girdle Muscular Dystrophy type 2B
LIC : Light Intermediate Chain
LIS1 : Lissencephaly 1
LNA : Locked nucleic acid
LPD : Lipid-Polycation-DNA
LPEI : PEI linéaire
LPR : Lipid-Polycation-RNA
LTC : Lymphocytes T cytotoxiques
LTR : Long Terminal Repeats
MAP : Protéine Associée aux Microtubules
MLP : Major Late Promoter
miRNA : Micro ARN
MT : Microtubules
MTBD : Microtubule binding domain
MTOC : Centre organisateur des microtubules
NRP : NEMO Related Protein
NEMO : NF B Essential Modulator
NLS : Signal de Localisation Nucléaire
nNOS : Neuronal nitric oxide synthase
NUDEL : NUDE-like
OTCD : Ornithine TransCarboxylase Deficiency
PAGA : Poly(A-(4-aminobutyl)-L-acide glycolique)
PAMAM : Poly(amidoamine)
pB : Photoblanchiment
pDMAEMA : Poly(2-(diméthylamino)éthyl méthacrylate)
PEG : Poly(Ethylène)Glycol
PEI : Poly(EthylénImine)
PEIC : Poly(EthylènImine) bisCarbamate
9
PHP : Poly(4-hydroxy-L-proline ester)
pHPMA : Poly(N-2-hydroxypropylméthacrylamide)
Pi : Phosphate inorganique
PLGA : Poly(D,L-acide lactique co-glycolique)
PLL : Poly(L-lysine)
PNA : Peptide Nucleic Acid
PPA : Poly(phosphoramidate)
PPE : Poly(phosphoester)
PPE-EA : Poly(2-aminoéthyle propylène phosphate)
PPI : Poly(propylenimine)
PPZ : Poly(phosphazene)
PV : Papillomavirus
PVP : Poly(N-vinylpyrrolidone)
Qdot : Quantum Dots
RCC1 : Regulator Chromosome Condensation
RE : Reticulum endoplasmique
R)D : Internalisation et Dégradation Récepteur
RIP : Receptor-Interacting Protein
RPE65 : Retinal pigment epithelium-specific 65 kDa
ROI : Region of interest
RPP : Phosphoprotéine rabique
RRAGA : Ras-related GTP-binding protein A
RZZ : Rod–ZW10–Zwilch
s : Sense
SAINT-4 : Dioleylmethylpyridinium chloride
SCID-X1 : Severe Combined Immune Deficiency
siRNA : Small interfering RNA
SPAD : Single Photon Avalanche Diodes
SS-PAEI : Poly(amido éthylènimine)
STR : Streptavidine
SV : Simimian virus
TCTEX-1 : T-Complex Testis-Expressed-1
TCSPC : Time-Correlated Single Photon Counting
td-Tomato : Tandem dimer Tomato
TETA : Triéthylènetetramine
10
TK : Thymidine kinase
TNF : Tumor necrosis Factor
TNFR : Tumor necrosis Factor Receptor
TP : Protéine Terminale
TRADD : TNF-Receptor associated Death Domain
TRAF : TNF Receptor-Associated Factor
TRAIL : TNF-related apoptosis-inducing ligand
VIH : Virus de l )mmunodéficience (umaine
VLM : Vaincre La Mucoviscidose
VV : Virus de la vaccine
ZW10 : Zest White 10
11
INTRODUCTION
"Si on considère le but d un médicament comme étant la restauration d une fonction
particulière du corps, alors l ADN doit être tenu comme le médicament absolu"
Aphosian, 1970.
Depuis la fin des années 1980, la thérapie génique apparaît comme une stratégie
thérapeutique au potentiel révolutionnaire dans le traitement d un grand nombre de
maladies qu elles soient d ordre génétiques ou non. Une meilleure connaissance des
mécanismes moléculaires et des gènes impliqués dans l apparition et le développement de
certaines pathologies a élargi les applications de la thérapie génique aux maladies
polygéniques. La thérapie génique s attaque ainsi désormais à un large éventail de
pathologies tout en se focalisant toutefois principalement sur le traitement des cancers.
Les vecteurs chargés de délivrer efficacement des gènes thérapeutiques aux cellules sont
majoritairement des virus modifiés. Malgré des essais cliniques de thérapie génique
employant des vecteurs viraux mis en place depuis plus de 20 ans, la FDA (Food and Drug
Administration) et l'ANSM (Agence nationale de sécurité du médicament et des produits
de santé n'ont jusqu'à aujourd'hui autorisé la commercialisation d aucun traitement. En
effet les traitements viraux de thérapie génique posent toujours des problèmes majeurs de
sécurité sanitaire. Les vecteurs non viraux basés sur l utilisation de lipides ou polymères
cationiques sont parallèlement activement développés et représentent une alternative aux
vecteurs viraux.
L efficacité des différents vecteurs chimiques réside dans leur capacité à franchir les
différentes barrières qui s opposent au transfert de gènes. En effet, pour que le transfert de
gènes soit efficace, le gène thérapeutique doit franchir des barrières biologiques extra- et
intracellulaires pour atteindre le noyau des cellules cibles. Parmi ces barrières, le trafic
cytosolique est un élément clé de l efficacité du transfert de gènes. Au cours de mon projet
de thèse je me suis intéressée à l amélioration du trafic cytosolique d un ADN plasmidique
transféré par des vecteurs non viraux. La stratégie exposée dans ce manuscrit s inspire de la
capacité des virus à exploiter le mouvement de la dynéine, protéine motrice des
microtubules, pour rejoindre activement le noyau des cellules infectées. Notre stratégie a
consisté à identifier puis à exploiter un motif peptidique de la protéine E3-14.7K
10
d Adénovirus connue pour interagir avec la chaîne légère de la dynéine TCTEL via la
protéine cytosolique FIP-1.
Dans une première partie de ce manuscrit je présenterai tout d abord les différents
types de vecteurs non viraux employés en thérapie génique (Généralités – Chapitre I).
J évoquerai ensuite le trafic cytosolique dans le cadre du transfert non viral de gènes et les
stratégies s inspirant des virus ayant pour but de l améliorer Généralités – Chapitre II).
Dans une dernière partie des généralités, je me suis intéressée à la protéine E3-14.7K
d Adénovirus dont nous souhaitons exploiter l interaction avec la dynéine (Généralités –
Chapitre III). Les résultats obtenus sont présentés sous la forme de deux manuscrits
rédigés en anglais :
- « Interaction of adenoviral E3-14.7K with microtubules network: identification of P79-98

peptide derived from E3-14.7K which interacts with FIP-1 and mediates cell cycle arrest. »
qui est soumis à la publication dans la revue J. Cell Science.
- «Enhancement of polyplexes transfection efficiency by the use of P79-98 peptide from
E3-14.7K that promotes a microtubules-mediated transport of plasmid DNA» qui est
accepté à la publication dans la revue Small.
Enfin une conclusion générale permettra d établir le bilan des résultats obtenus et
d évoquer les perspectives de travail suite à mes résultats.
11
Généralités
12
Généralités - CHAPITRE I : Thérapie génique et vecteurs non viraux
CHAPITRE I :
THERAPIE GENIQUE ET VECTEURS NON VIRAUX
I- LA THERAPIE GENIQUE
I.1 : Principe et définition
La thérapie génique est le transfert, véhiculé ou non par un vecteur, de molécules

d acides nucléiques à visée thérapeutique dans les cellules d un patient atteint d une
pathologie d ordre génétique ou non. Les acides nucléiques utilisés en thérapie génique
peuvent être des ADNs (Acide DésoxyriboNucléique) ou ARNs (Acide RiboNucléique), les
vecteurs chargés de les délivrer aux cellules sont majoritairement de type viral ou
chimique lipides, polymères . Le transfert d acides nucléiques est appelé transfection ou
transduction. L expression génique de ces cellules s en trouve modifiée afin de prévenir,
stopper ou reverser une pathologie d origine génétique ou non. Le transfert d acides
nucléiques nu est peu efficace et très variable selon les types cellulaires. Le succès de la
thérapie génique repose donc sur deux éléments cruciaux et d importance égale : la nature
de la molécule d acide nucléique thérapeutique et le vecteur.
Depuis 1990 près de 1500 essais cliniques utilisant des vecteurs viraux ou chimiques
ont été approuvés à travers le monde www.wiley.co.uk. Pour la plupart d entre eux, le
transfert d acides nucléiques est réalisé ex vivo sur des cellules préalablement prélevées au
patient. Les cellules génétiquement modifiées lui sont ensuite réimplantées, on parle alors
de thérapie génique cellulaire. Considérée comme une stratégie séduisante mais
particulièrement délicate en ce qui concerne le ciblage, la dose et la voie d administration,
le transfert de gènes in vivo reste envisagé et représente l un des défis majeur pour la
thérapie génique.
I.2 : Les applications de la thérapie génique
Une stratégie thérapeutique en constante évolution
L objectif initial de la thérapie génique est de restaurer l expression d un gène
13
fonctionnel dans un organisme pour corriger un déficit monogénique tel que la

Mucoviscidose ou la Dystrophie Musculaire de Duchenne. La thérapie génique avait alors
pour but d outrepasser les multiples inconvénients liés à l administration directe de
protéines recombinantes thérapeutiques tels qu une faible biodisponibilité, une forte
toxicité systémique, une instabilité in vivo et une bioproduction difficile et onéreuse.
Aujourd hui, les applications liées à la thérapie génique dépassent le cadre unique
du transfert de gènes pour le traitement des maladies monogéniques Martini et al., 2011;
Bordignon et al., 1995; Welsh et al., 1999. Une meilleure connaissance des mécanismes
moléculaires et des gènes impliqués dans l apparition et le développement de certaines
pathologies réoriente la thérapie génique sur l utilisation d acides nucléiques autres que
l ADNc codant une protéine tels que l ARN, siRNA Small interfering RNA), des petits
ADN anti-sens ou encore miRNA (microRNA) au potentiel thérapeutique. La thérapie
génique bascule ainsi vers une notion plus large de thérapie basée sur l utilisation des
acides nucléiques comme médicament.
L exemple de la Dystrophie Musculaire de Duchenne
Cette évolution de la thérapie génique s illustre parfaitement avec l exemple de la

Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD). La DMD est une maladie génétique
musculaire mortelle et incurable provoquée par la mutation du gène de la dystrophine
Hoffman et al., 1987; Koenig et al., 1987. Cette protéine est impliquée dans le maintien de
la fibre musculaire. Les différentes mutations du gène entraînent soit un déficit de la
synthèse de dystrophine, soit une altération de cette dernière la rendant moins
fonctionnelle. La séquence codante humaine de la dystrophine résulte de 79 exons et se
traduit par un ADNc (ADN complémentaire) de très grande taille (14kb) Kunkel et al.,
2005. La taille du gène thérapeutique est un paramètre critique pour l utilisation des
vecteurs viraux (Chapitre I - I.4.2 : Limites d utilisation des vecteurs viraux , des stratégies
alternatives ont alors été mises en place après des études génétiques et phénotypiques de
grande envergure permettant de mieux comprendre les différentes versions de la maladie
Gillard et al., 1989; Koenig et al., 1989; England et al., 1990; Beggs et al., 1991.
Ces études, notamment celles concernant la Dystrophie Musculaire de Becker,

révèlent que la délétion d'une grande partie du gène de la dystrophine a peu de
conséquences phénotypiques tant que les parties cruciales restent dans le même cadre de
14
lecture Flanigan et al., 2009. Cette découverte a ouvert la porte à de nouvelles approches
thérapeutiques. La première est de générer puis transférer un gène raccourci mais
fonctionnel, tel que la minidystrophine (6-8 kb) ou la microdystrophine (<4 kb) dont il
existe plusieurs versions (Figure 1). L'autre approche consiste à restaurer le cadre de
lecture directement sur le gène muté par saut d'exon en utilisant un ou plusieurs petits
oligoribonucléotides anti-sens AONs , la dystrophine finale ne sera amputée que d un ou
plusieurs exons mutés et se comportera comme une dystrophine de type Becker
responsable d un phénotype myopathique plus modéré Lu et al., 2011 (Figure 2). Des
AONs modifiés résistants à la RNase ( modifications type -O-méthyl
phosphorothioates ou aux nucléases Morpholinos s hybrident sur le préARNm au niveau
des exons mutés. Les AONs ciblent des motifs au sein du ou des exons d intérêt séquence
ESE - exonic splicing enhancer site) mais peuvent également cibler les sites donneur ou
accepteur d épissage. )ls provoquent ainsi l épissage du ou des exons ciblés en même temps
que les introns qui les encadrent.
Figure 1 : Représentation schématique de la dystrophine, utrophine, minidystrophines et

microdystrophines. La dystrophine est constituée de 4 domaines principaux : - Le domaine N
(H pour Hinge)- Le domaine C terminal (C). Adapté de Duan, 2011.

terminal (N) - Le domaine central (ou domaine Rod) contenant 24 unités répétées et les 4 régions charnière
15
Figure 2 : Explication schématique de la stratégie du saut d'exon dans le cas de la Dystrophie

Musculaire de Duchenne (DMD). Dans le cas de la DMD, le cadre de lecture est perdu (dans cet exemple par
délétion des exons 48–50, qui est la mutation la plus fréquente chez les patients), aboutissant à une dystrophine
tronquée. Un oligoribonucléotide anti-sens (AON) peut être utilisé afin de retrouver le cadre de lecture (cadre du
bas). Des AONs spécifiques peuvent s'hybrider à l'exon 51 aboutissant ainsi à son épissage de même que les deux
fonctionnelle. Adapté de Aartsma-Rus et al., 2007.

introns qui l'encadrent. Le cadre de lecture retrouvé permet la synthèse d'une dystrophine tronquée mais
Un oligonucléotide -O-methylphosphorothioate (PRO051) développé par la

société Prosensa et un oligonucléotide de type morpholino ARN (AVI-4658) développé par
le laboratoire GSK (GlaxoSmithKline) sont destinés à environ 13 % des patients souffrant
de DMD dont l'effet délétère peut être corrigé par saut de l'exon 51 (Figure 2). PRO051 a
fait l objet d'un essai clinique chez l homme de phase )/)) au cours duquel jeunes
garçons ont reçu une fois par semaine, pendant 48 semaines, une injection systémique de
PRO051 à une dose de 6 mg/kg Goemans et al., 2011 ; Cirak et al., 2011. Le traitement
permet une amélioration des capacités motrices des patients mesurée par le « test de
marche durant six minutes ». Un essai de phase III incluant un groupe sous placebo est
actuellement en cours. Prosensa développe cinq autres oligonucléotides anti-sens sur les
exons , , , et du gène de la dystrophine permettant d élargir à % le nombre
de patients traitables.
Un autre domaine prometteur appliqué dans le traitement de la DMD est

l'identification de modificateurs géniques. La surexpression de la follistatine, inhibiteur
naturel du facteur de transcription myostatine agissant ainsi comme un stimulateur de la
croissance musculaire, permet de réduire les myopathies chez la souris et les primates
Wagner et al., 2002; Kota et al., 2009.
16
Applications aux maladies polygéniques
Du fait de ces alternatives thérapeutiques, la thérapie génique de maladies

polygéniques est actuellement en cours de développement pour le traitement des maladies
cardiovasculaires Baumgartner et al., 2001, de l arthrite rhumatoïde et d autres maladies
auto-immunes Evans et al., 2000; Seroogy & Fathman, 2000, ainsi que certaines
pathologies du système nerveux central Giordano et al., 2008 ou d origine virale
Bushschacer & Wong-Staal, 2001; Tsygankov et al., 2009.
La thérapie génique s attaque ainsi à un large éventail de pathologies tout en se

focalisant toutefois principalement sur le traitement des cancers. Ainsi en 2012, 39 essais
cliniques ont été nouvellement approuvés dans le monde ciblant principalement le cancer
(64,4%), les maladies monogéniques ne représentant que 8,7%. La thérapie génique
permet de combattre l'apparition et le développement du cancer par plusieurs fronts :
- Diverses stratégies Koom et al., 2012; Yu et al., 2010, ont étés utilisées comme le
transfert d un gène suppresseur de tumeur comme par exemple p . A l'inverse, d'autres
stratégies s'intéressent à l'inactivation de gènes inducteurs de tumeur en utilisant la
technologie anti-sens pour bloquer l'ARN messager (ARNm) d'un proto-oncogène He et
al., 2010.
- Les tissus sains ou tumoraux peuvent être sensibilisés par modification de l'index
thérapeutique de certaines drogues tout en essayant de préserver les tissus sains
avoisinants, c est la stratégie du gène suicide. Le système le plus utilisé à ce jour est celui
de la thymidine kinase du virus herpès simplex (HSV TK). Le principe repose sur la
transfection des cellules cibles (cancéreuses) avec le gène codant la HSVTK. Dans un
deuxième temps, la prodrogue (le ganciclovir) non toxique administrée par voie
systémique est catalysée en drogue active et cytotoxique, ganciclovir monophosphate, au
niveau des cellules exprimant la TK Su et al., 2012. Un effet "bystander" permet à la
drogue de diffuser au-delà des cellules transfectées.
- L'immunothérapie anti-tumorale a pour but de modifier la spécificité de la

réponse immunitaire anti-tumorale soit en stimulant les processus conduisant à la
reconnaissance de la tumeur par le système immunitaire de l hôte Gilboa & Vieweg, 2004 ;
Chen et al., 2010), soit en améliorant les propriétés cytotoxiques des lymphocytes.
17
- Certaines stratégies se focalisent sur le réseau vasculaire de la tumeur. Par

exemple, on délivre dans l'environnement immédiat de la tumeur un gène codant pour un
inhibiteur du VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) responsable de la
néoangiogenèse tumorale Favaloro et al., 2012; Lu et al., 2012.
I.3 : Les succès de la thérapie génique
Après un premier essai en 1993, c est en qu a lieu le premier grand succès de la

thérapie génique. Cet essai clinique français s attaque au traitement chez l enfant d'un
grâve déficit immunitaire appelé SCID-X1 (Severe Combined Immune Deficiency)
provoqué par la mutation du gène codant pour la chaîne γ du récepteur de l interleukine
)L RG . Le transfert du gène de la chaîne γc commune à de nombreux récepteurs
cytokine) dans des cellules souches hématopoïétiques CD34+ a permis le traitement
efficace d enfants atteints par cette maladie génétique Cavazzana-Calvo et al., 2000. Le
succès était cependant partiel puisque que 4 enfants sur 10, pour l'essai clinique français, et
1 enfant sur 10, pour un essai clinique similaire réalisé en Angleterre, ont déclarés une
leucémie Hacein-Bey-Abina et al., 2008.
En 2008, trois protocoles thérapeutiques apportent des résultats positifs dans le

traitement de la LCA Leber s Congenital Amaurosis chez l'homme Bainbridge & Ali et
al., 2008; Cideciyan et al., 2008; Maguire et al., 2008. La stratégie consiste en des
injections subrétinales répétées de faibles doses de vecteur AAV (Adeno Associated
Vector) de sérotype 2 qui permettent d'éviter toute réponse immune importante contre le
vecteur Barker et al., 2009. Ce vecteur permet l'expression de la protéine RPE65 (Retinal
Pigment Epithelium-specific 65 kDa). Les patients traités recouvrent une sensibilité à la
lumière, et dans certain cas une partie de la vision. Des études supplémentaires montrent
qu'un an après le traitement est toujours efficace Cideciyan et al., 2009. De plus, les
bénéfices visuels de ce traitement sont d'autant plus importants lorsqu'il est réalisé chez
de jeunes enfants Maguire et al., 2010.
Des résultats prometteurs ont été obtenus chez le chien pour le traitement de
l'hémophilie B. L'utilisation d'un vecteur AAV2 (Adeno associated vector serotype 2) a
permis le transfert du gène codant pour FIX (Facteur de coagulation hépatique IX) et son
expression stable pendant plus de 8 ans LoDuca et al., 2009; Niemeyer et al., 2009. Cet
18
effet thérapeutique n'a pas encore été atteint chez l'homme à cause de réactions
immunitaire liées à la présence d'anticorps dirigés spécifiquement contre la capside du
sérotype 2 d'AAV chez l'homme Manno et al., 2006; Mingozzi et al., 2007. Un AAV de
sérotype 8 de moindre séroprévalence chez l homme a été utilisé lors d un essai clinique de
phase )/)) conduit chez l homme en . Les problèmes de réponse immunitaire
apparaissent comme le problème majeur de cet essai. Les résultats rapportent toutefois
une expression sur le long terme du transgène FIX à un niveau thérapeutique chez des
patients atteints d hémophilie B sévère Nathwany et al., 2011.
De nouveaux vecteurs, lentivirus derivés du VIH (Virus de l )mmunodéficience

Humaine), permettent de meilleurs taux de transfection des HSCs (Cellules Souches
Hématopoiétiques) associés à une expression élevée du transgène. Ces paramètres ont
rendu possibles la thérapie génique pour la -thalassémie May et al., 2000; Pawliuk et al.,
2001. Les résultats d'un essai clinique français sont prometteurs, en effet un patient n'a pas
eu besoin de transfusion sanguine pendant plus de 16 mois après le traitement Kaiser,
2009.
Un autre grand succès de la thérapie génique concerne le traitement de

l adrénoleucodystrophie ALD . L ALD est une maladie neurodégénérative sévère liée à l X
qui touche les garçons entre 5 et 12 ans. Elle est causée par une mutation au niveau du
gène ABCD1 codant pour la protéine ALD, elle entraîne la démyélinisation du système
nerveux central. En 2009 un essai clinique français a permis le transfert ex vivo d une copie
saine du gène ABCD à l aide d un vecteur lentiviral dans des cellules hématopoïétiques
CD34+Cartier et al., 2012. Seize mois après la réimplantation des cellules l imagerie du
cerveau des quatre enfants traités montre l arrêt de la démyélinisation cérébrale.
Aujourd hui, plusieurs années après le traitement trois d entre eux ont une vie et une
scolarité normale ELA, 2012.
I.4 : Les vecteurs viraux en thérapie génique
19
Les virus sont les vecteurs « historiques » de la thérapie génique, utilisés depuis
plus de trente ans ils sont à l origine de ses principaux succès. Si des stratégies alternatives
non virales sont de plus en plus étudiées, les vecteurs viraux représentent encore à l heure
actuelle plus de 65% des vecteurs employés (Figure 3).
Figure 3 : Vecteurs utilisés dans les essais cliniques de thérapie génique en 2012.
Les vecteurs viraux représentent 66,8% des vecteurs employés. Les stratégies non virales sont
représentées par la lipofection et le transfert d'ADN nu et représentent 24,2%. Adapté de
Journal of Gene Medicine, 2012.
I.4.1 : Les différents vecteurs viraux
L exploitation de la capacité naturelle des virus à délivrer leur information

génétique (ADN ou ARN) afin d'administrer un gène dans un but thérapeutique fut
envisagée à l aube du génie génétique et de la biologie moléculaire Tatum, 1966. Les virus
employés pour les protocoles cliniques sont de différents types (Figure 4), tous sont des
virus recombinants défectifs pour la réplication. Ce résultat est obtenu en supprimant tout,
ou partie, des régions codantes du génome viral, mais en laissant intactes les séquences
(généralement les séquences répétées terminales) qui sont nécessaires à des fonctions
telles que l'emballage du génome dans la capside du virus ou l'intégration de l'ADN viral
dans la chromatine hôte. La cassette d'expression de choix est alors clonée dans le
squelette viral en place de ces séquences qui ont été supprimées.
Les caractéristiques des principaux vecteurs viraux sont présentées dans le Tableau
1. Comme on peut le voir dans ce tableau, aucun vecteur viral n est idéal. Si les vecteurs
intégratifs (rétrovirus, lentivirus) permettent une intégration stable du matériel génétique
dans le génome des cellules cibles, le risque de mutations insertionnelles peut être à
20
l origine de l apparition de cancers. Le risque d apparition de réactions immunitaires sont

particulièrement élevés pour l utilisation des adénovirus et d (SV- alors qu ils présentent
le très grand avantage de pouvoir transférer des inserts de très grandes tailles
Tableau 1 : Les principaux vecteurs viraux.
Adapté de Thomas et al., 2003.
I.4.2 : Limites d utilisation des vecteurs viraux
Taille de l'insert
Selon le vecteur viral la longueur du transgène thérapeutique est variable. Les virus
adénoviraux ne posent aucune limite de taille. Les rétrovirus et lentivirus permettent
l'insertion de gènes d'une taille inférieure à 7,5kb. Les virus adéno-associés sont les plus
restrictifs et ne permettent l'insertion que de petits gènes inférieurs à 3,5kb.
La limite de taille est un paramètre crucial dans le traitement de maladies

monogéniques telles que la mucoviscidose (gène CFTR de 7,2kb), la dystrophie musculaire
de Duchenne (gène dystrophine de 14kb) dont les gènes mutés sont particulièrement
longs. Des stratégies alternatives peuvent être envisagées telles que le saut d'exon, le
transfert de gène homologue (Chapitre I - I.2 - L exemple de la Dystrophie Musculaire de
Duchenne) mais qui ne peuvent pas être systématiquement employées. Des stratégies plus
complexes et moins efficaces que le transfert de gènes classique comme la
concatémérisation d'AAV sont imaginées dans le traitement de la dystrophie des ceintures
21
LGMD2B (Limb-Girdle Muscular Dystrophy type 2B) où le gène de la dysferline est

supérieur à 6,2kb Lostal et al., 2010.
Immunogénicité
Les problèmes de réponse immunitaire sont considérés comme le "talon d'Achille"

de la thérapie génique virale Nayak et al., 2010. Les adénovirus sont les vecteurs viraux les
plus immunogènes. La capside adénovirale induit le système immunitaire adaptatif
déclenchant une réaction immunitaire à médiation cellulaire par les lymphocytes T
cytotoxiques (CTL) et une réponse immunitaire à médiation humorale par les anticorps
neutralisants produits par les lymphocytes B. Les protéines structurales virales peuvent
aussi d'entrer le complexe maleur d'histocompatibilité de classe I (CMH) et cibler les
cellules transduites par des CTLs préexistants Kafri et al., 1998; Thomas et al., 2001. Les
autres groupes de vecteurs sont moins inflammatoires et immunogènes, cependant pour
ces vecteurs une immunité humorale pré-existante contre les types sauvages de ces virus
peut entraîner une réaction immune.
La virulence de ces réponses immunes est une préoccupation majeure des essais
cliniques réalisés chez l'homme. En 1999 ces risques se sont malheureusement avérés
mortels pour le 18ème et dernier patient d'un essai clinique de phase I dans le traitement de
13
l'OTCD ornithine transcarboxylase deficiency . Ce patient a reçu l injection de . X
particules virales (3X109 unités de particules infectieuses/kg) par l'artère hépatique droite.
Quatre jours après la délivrance du traitement une puissante réponse immunitaire
provoque le décès du jeune homme de 18 ans Lehrman, 1999; Wilson, 2011. A la lumière
de ce cas, le statut immunitaire des participants aux essais cliniques de thérapie génique
est scrupuleusement surveillé avant et après l'administration des vecteurs DNA Advisory
Committee, 2002.
Outre les potentielles conséquences tragiques pour les patients, les problèmes
d'immunogénicité sont un facteur majeur limitant la réussite de la thérapie génique virale.
L'existence de la réponse immunitaire humorale, déclenchée par l'infection virale, limite
toute stratégie thérapeutique qui nécessite des injections répétées de vecteurs. Elle
diminue de plus l'efficacité de transfert de gènes et peut mener à la destruction des cellules
infectées Kay, 2011.
22
Oncogénicité
La thérapie génique virale peut mener au développement de cancers suite au

phénomène de mutation insertionnelle. Ce phénomène est le fait des rétrovirus et
lentivirus dont l'ADN est intégré au génome cellulaire. L'insertion a la capacité d activer le
potentiel transformant d un gène voisin par différents mécanismes qui impliquent tous les
régions non codantes présentes dans les LTR (Long Terminal Repeats) virales qui
contiennent des séquences activatrices de la transcription présentes aux deux extrémités
du provirus.
L'intégration du génome viral dans la chromatine hôte a longtemps été considérée

comme aléatoire. Le risque d'intégration au sein d'une séquence cancérogène était donc
très considérée comme très faible de l'ordre de 1 sur 10 millions d'insertions Stocking et
al., 1993. Une étude a démontré que ce risque n'était pas négligeable et que l'intégration
rétrovirale n'est pas aussi aléatoire que l'on pouvait le penser. L'analyse de centaines de
sites d'intégration du HIV (dont certains lentivirus sont dérivés) révèle que le génome viral
est intégré préférentiellement au sein de gènes transcriptionnellement actifs plutôt que
dans des régions non codantes Schröder et al., 2002.
Ce phénomène a provoqué les cas de leucémies dans l'essai clinique français de la

SCID-X1 Hacein-Bey-Abina et al., 2008. Des études concernant le site d'intégration du
transgène l'ont localisé près de l'oncogène LMO2 Hacein-Bey-Abina et al., 2003.
L'apparition des cas de leucémies seraient la combinaison de deux phénomènes : la
croissance des lymphocytes T traités due à l'expression du transgène et l'activation de
LMO2 au sein de ces mêmes cellules. Après l'annonce de ces cas la FDA (Food and Drug
Administration) a placé un arrêt temporaire de tous les essais de thérapie génique utilisant
des vecteurs rétroviraux dans les cellules souches sanguines en janvier 2003.
Bioproduction
Le défi de la production virale réside en grande partie dans la conception

d infrastructures industrielles adaptées à la manipulation de grandes quantités de virus. En
France peu de plateformes et centres permettent la production de vecteurs viraux de grade
clinique produits selon les normes de niveau III de biosécurité de Bonnes Pratiques de
Fabrication (BPF). Deux-mille douze marque l'ouverture d'un nouveau centre de
23
bioproduction : Généthon Bioprod. La mission de Généthon Bioprod sera de fabriquer des

candidats thérapeutiques pour des essais cliniques menés en France ou à l international
dans le p respect de la réglementation des produits pharmaceutiques.
L utilisation de vecteurs viraux en thérapie génique pose de sérieux problèmes

d immunogénicité et de cancérogénicité remettant en cause la sécurité des stratégies
virales. De surcroît, les limitations concernant la taille du transgène et la production des
particules virales représentent des obstacles majeurs à leur utilisation.
II-LES METHODES NON VIRALES DE TRANSFERT DE GENES
Des méthodes de transfert de gènes non virales sont développées en alternative aux
virus. Parmi elles on retrouve l injection d acides nucléiques non vectorisés dits nus , des
méthodes physiques, et des méthodes chimiques (lipides et polymères cationiques).
)). : )njection d acides nucléiques dits nus
Injection intratissulaire
L'injection d'ADN plasmidique (ADNp) directement dans un tissu sans utilisation

d'un agent qu'il soit chimique ou physique permet de transfecter des cellules in vivo. Des
injections d'ADNp nu dans le muscle squelettique Wolff et al., 1990 le foie Hickman et
al., 1994; Zhang et al., 1997 et la peau Choate et al., 1997 ainsi que des inhalations dans
les poumons Meyer et al., 1995 ont été réalisées et ont conduits à un faible niveau
d'expression des gènes transférés. L'ADNp nu étant de grande taille, vulnérable aux
nucléases et de nature hydrophile est difficilement internalisable dans les cellules, ceci
rend cette méthode difficilement envisageable dans le cadre de la thérapie génique.
Les stratégies qui ont pour ambition d'améliorer cette méthode de transfert de
gènes se sont orientées d abord vers l'utilisation de protéines, ou de substances chimiques,
destinées à augmenter l'internalisation de l'ADNp dans les cellules. Le greffage de l'ADNp
avec la transferrine via un pont streptavidine-biotine a permis l'augmentation de la
transfection in vitro Sato et al., 2000. L'utilisation de solvants, copolymères non ioniques
et solutions hypotoniques ont été utilisés comme adjuvants à l'injection. D'autres
stratégies tentent de protéger l'ADNp de la dégradation dans l'environnement
24
extracellulaire en utilisant des inhibiteurs de nucléases et ont démontrées un bénéfice in

vitro Ross et al., 1998 et in vivo dans le muscle Walther et al., 2005.
Injection hydrodynamique
L'injection hydrodynamique chez la souris par la veine caudale permet de

transfecter l'ADNp au niveau du foie (organe hautement perfusé) avec une efficacité très
importante Zhang et al., 1999. L'efficacité de transfert de gènes est dépendante de
plusieurs paramètres tels que la structure de l'organe, le volume d'injection et la vitesse
d'injection. Dans le modèle murin cela consiste à injecter au niveau de la veine de la queue
1,6 à 1,8mL de solution saline contenant l ADNp pour une souris de g soit à % du
poids total), dans un temps rapide de 5 secondes. Grâce à cette méthode 30% to 40% des
hépatocytes sont généralement transfectés par une injection hydrodynamique de g
d'ADNp Liu et al., 1999.
Malgré des résultats impressionnants chez la souris cette méthode d'injection

représente un défi chez l'homme. La transposition chez l homme consisterait à injecter un
volume de 7,5 L de solution saline (contenant plus de 200 mg d'ADNp) injectée à haute
pression. Cette extrapolation démontre les difficultés d'adaptabilité chez l'homme où de
plus les pathologies hépatiques sont souvent associées à d'autres problèmes de santé.
Des études de faisabilité sont réalisées chez le gros animal, notamment chez le porc
et le chien, pour limiter le volume et la vitesse de l injection. D autres stratégies adaptent
ce type d injection à la délivrance au niveau d un membre. C est le principe de l (LV
(Hydrodynamic Limb vein). Le traitement de thérapie génique est injectée dans la veine
saphène de la jambe après qu un garrot ait été installé pour bloquer la circulation sanguine
au niveau de ce même membre. Cette technique est particulièrement efficace puisqu elle
permet un haut niveau de transfection dans les cellules musculaires squelettiques (> 50%)
(Figure 4) Herweijer & Wolff, 2007; Wooddell et al., 2011. Cette technique a démontré
son efficacité dans le traitement de la DMD chez le chien GRMD (Golden Retriever
Muscular Dystrophy) Qiao et al., 2009.
25
Figure 4 : Procédure de délivrance HLV au niveau de la jambe. Un

brassard placé au niveau de la jambe au moment de l injection de la solution
d ADNp permet l augmentation de la pression vasculaire. L ADNp est injecté
à l aide d un cathéter au niveau de la veine saphène. L ADNp est distribué
uniquement dans le membre isolé. Adapté de Herweijer1 & Wolff,
2007.
II.2: Méthodes physiques
Plusieurs stratégies de transfert de gène physique ont été développées ces dernières
années pour des applications in vitro et in vivo. Ces différentes méthodes physiques:
méthode mécanique (biolistique ou gene gun), électrique (électroporation), magnétique
magnétofection ou acoustique sonoporation perturbent transitoirement l organisation
de la membrane cellulaire ce qui permet à l ADN de pénétrer les cellules par diffusion.
Biolistique
La biolistique (aussi appelée gene gun) a été pour la première fois employée chez
les plantes Klein et al., 1992, elle est actuellement la méthode la plus employée pour le
transfert de gènes chez les végétaux. Elle est désormais utilisée chez l homme pour le
transfert de gènes au niveau de la peau, des muscles, des tumeurs ou organes exposés suite
à une procédure chirurgicale Muangmoonchai et al., 2002. Les cellules ou les tissus sont
bombardés par des macroparticules de métal (or, tungstène ou argent) enrobées de
molécules d ADN et accélérées grâce à un gaz inerte hautement pressurisé (élium . La
26
pression, la taille des particules, et la fréquence sont des paramètres critiques qui
déterminent l efficacité de la pénétration tissulaire du transfert de gène, et la toxicité
Uchida et al., 2002. Le problème principal de cette méthode réside dans la pénétration
superficielle (seulement quelques millimètres) des particules au sein des tissus traités, ce
paramètre limite son utilisation chez l homme à la peau.
Electroporation
L électroporation est une méthode physique utilisée pour le transfert de gènes in

vitro comme in vivo, ses applications concernent la plupart des tissus même si la peau et
les muscles sont particulièrement concernés Heller et al., 2005. De brèves impulsions
électriques induisent une perméabilisation transitoire et réversible de la membrane
cellulaire qui autorise l entrée d ADN au sein de la cellule. L application des impulsions
électriques nécessitent le contact des tissus à traiter avec des électrodes, une procédure
chirurgicale préalable est donc indispensable pour atteindre les organes internes. De plus
les courants électriques de hauts voltages peuvent provoquer des dommages irréversibles
aux tissus traités, cette technique reste invasive et quelque peu toxique.
Magnétofection
La magnétofection est l usage de forces magnétiques pour faciliter l apport des

acides nucléiques aux cellules cibles. Elle a permis in vitro d augmenter jusqu à plusieurs
centaines de fois l efficacité de transfection aussi bien pour le transfert de gènes viral que
non viral Scherer et al., 2002; Krotz et al. 2003. Une augmentation de l efficacité de
transfert de divers vecteurs viraux et non viraux a également été observée in vivo dans la
zone gastro-intestinale et dans les vaisseaux sanguins mais aussi dans l épithélium des
voies aériennes Scherer et al., 2002 ; Xenariou et al., 2006. D un point de vue pratique le
vecteur utilisé est associé à des nanoparticules superparamagnétiques et le transfert est
ciblé en appliquant un champ magnétique qui va permettre de concentrer le vecteur dans
une zone d intérêt. )l a été montré in vitro, sur différentes lignées cellulaires, et en utilisant
un vecteur à base de PEI couplé à des nanoparticules superparamagnétiques
(magnétofectine), que la magnétofection agit en accélérant la sédimentation des
magnétofectines à la surface des cellules et non en agissant sur l endocytose qui est le
mécanisme d entrée dans la cellule des vecteurs à base de PE) poly ethylénimine Huth
et al,. 2004.
27
Sonoporation
La sonoporation est basée sur l'utilisation d ultrasons couplés à des microbulles de

gaz. Les ultrasons, en tant qu'ondes mécaniques, permettent l'oscillation de microbulles de
gaz suivant les phases de compression et d'expansion. L'interaction des microbulles avec la
cellule suivie de leur oscillation va induire une perméabilisation de la membrane
plasmique et permettre la formation de pores. Les pores ainsi formés permettent l'entrée
de l'ADNp nu.
Des expériences de sonoporation au niveau du tendon d'Achille de souris ont

permis d'observer une expression stable du transgène pendant plus de 100 jours. De la
même façon cette méthode a été utilisée dans un modèle de souris transgénique invalidée
pour le gène de la fibromoduline et a permis une restauration du phénotype au niveau des
tendons Delalande et al., 2011. La limite principale de la sonoporation en thérapie
génique reste la trop faible efficacité de transfection comparativement à d'autres systèmes
Unger et al., 2001.
II.3 : Vecteurs synthétiques ou chimiques
L'utilisation de lipides et de polymères cationiques pour le transfert de gènes a été

décrite pour le première fois en 1987 respectivement par Felgner et Wu Felgner et al.,
1987; Wu et al., 1987. Ces molécules cationiques forment des complexes électrostatiques
avec l'ADN (chargé négativement). Les complexes ainsi formés permettent de protéger
l'ADN de la dégradation dans le milieu extracellulaire ainsi que de faciliter les interactions
avec la membrane cellulaire.
Depuis 1995 des lipides, polymères et lipo-polymères ont été utilisés dans des essais
cliniques de thérapie génique notamment pour la vaccination anti-tumorale et pour le
traitement de différents cancers ainsi que de la mucoviscidose (Tableau 2). Des vecteurs
chimiques de faible toxicité et immunogénicité pourraient permettre d élaborer des
protocoles comportant des administrations répétées d acides nucléiques.
28
Tableau 2 : Les vecteurs synthétiques utilisés dans les essais de thérapie génique.
Nombre
NCT Investigateur Pathologie Vecteur Acide Nucléique Année Délivrance
patients
Instillation
00004471 Université Alabama Mucoviscidose Liposome DMRIE/DOPE Gène CFTR (PGT-1) 9 1995
nasale
Université Carcinome Liposome
00009841 ADN anti-sens EGFR 20-36 1999 Intratumorale
Pittsburgh (tête/cou) DC-cholestérol
H. Lee Cancer Carcinome Injection
00006033 Liposome DOTMA/cholestérol Gène Interleukine 2 (IL2) 80 2000
research institute (tête/cou) intratumorale
Université Oligonucléotide anti-
00024661 Tumeurs solides Liposome LErafAON 30 2001 Intraveineuse
Georgetown sens c-raf
Mélanome & HLA-B7
00050388 Vical Liposome DMRIE/DOPE - 2002 Intratumorale
Carcinome -microglobuline
M. D. Anderson Cancer du
00059605 Liposome DOTAP Gène fus-1 32 2003 Intraveineuse
Cancer center poumon
Université de Cancer de la Infusion dans la
00393809 Polymère PEI Gène DTA-H19 18 2006
Jerusalem vessie vessie
Hôpital universitaire Carcinome Récepteur Somastatine 2
01274455 Polymère PEI 24 2010 Intratumorale
de Toulouse pancréatique Déoxycitidine kinase
DC-Chol, [N-(n′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol - DMPE dimethyl dimyristoyl phosphatidylethanolamine - DMRIE, 1,2-dimyristyloxypropyl-3-
dimethyl-hydoxyethylammonium bromide - DOPC 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine - DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine - DOTAP, 1,2-dioleoyloxy-3-
(trimethylammonio)propane - DOTMA N-[1-(2, 3-dioleyloxy) propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride - EGFR epidermal growth factor receptor - HLA human
monophosphate kinase - EphA2 Ephrin type-A receptor 2. Données issues de l'U.S. National Institutes of Health http://clinicaltrial.gov.
leukocyte antigen- PEI Poly(ethylenimine) - SiRNA small interfering RNA - sst2 somatostatin receptor 2 - dck::umk désoxycytidine kinase et uridylate
29
II.3.1 : Les liposomes cationiques
Les liposomes cationiques sont des vésicules lipidiques composées d'une bicouche
de lipides cationiques. Depuis les premiers résultats de transfert de gènes obtenus par
Felgner suite à l utilisation de DOTMA (N-[1-(2,3-dioleyl)propyl]-N,N,N-
trimethylammonium chloride) des centaines de lipides cationiques destinés au transfert de
gènes ont été développés Felgner et al., 1987; Liu et al., 2003. Une liste non exhaustive est
présentée dans la figure 5.
Figure 5 : Structure des lipides cationiques utilisés en transfert de gènes. BGSC, bis-guanidium-
spermidine-cholesterol; BGTC, bis-guanidium-tren-cholesterol; DC-Chol, 3[N-(n′,N′-
dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol; DDAB, dimethyldioctadecylammonium bromide; DMRIE,
1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydoxyethylammonium bromide; DODAC,
dioctadecyldimethylammonium chloride; DOGS, dioctadecylamidoglycyl-spermine; DOSPA, 2,3-
dioleyloxy-N-[2(spermine carboxaminino)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminium trifluroacetate; DOTAP,
1,2-dioleoyloxy-3-(trimethylammonio)propane; DOTIM, 1-[2-(9(Z)-octadecenoyloxy)-ethyl]-2-(8(Z)-
heptadecenyl)-3-(2-hydroxyethyl)-imidazolinim chloride; DOTMA,N-[1-(2,3-dioleyl)propyl]-N,N,N-
trimethylammonium chloride; GS2888, Boc-arginine dimyristylamide; lipid #67, 3-฀-(sperminecarbamoyl)
(trimethylammonio)acetyl)-d-glutamate chloride. Adapté de Tros de Ilarduya et al., 2010

cholesterol; SAINT-4, dioleylmethylpyridinium chloride; TMAG, didodecyl-N-(a-
Les lipides cationiques sont des molécules amphiphiles comportant trois domaines
: une chaîne hydrophobe composée principalement d'acides gras, une tête polaire
hydrophile mono ou multi-cationique, et un groupe espaceur. Ces trois domaines sont
reliés la plupart du temps par un squelette glycérol Tranchant et al., 2004.
30
La charge positive des dérivés monocationiques provient d amines quaternaires

simples DOTMA ou hydroxyéthylées DMR)E , et d amines tertiaires DC-Chol). Les
charges des dérivés multicationiques proviennent généralement de la spermine (DOSPA
ou DOGS). Certains phospholipides neutres comme le dioléylphosphatidyléthanolamine
(DOPE), dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) ou le cholestérol Semple et al., 1996; Hong
et al., 1997; Liu et al., 1997 sont utilisés comme co-lipides pour faciliter la formation des
liposomes. L incorporation de lipides neutres permet de diminuer la quantité de charges
positives au sein des liposomes, les lipides cationiques sont en effet toxiques et sont tous
d origine synthétique.
Lipoplexes
Lorsqu'il est mélangé avec des liposomes cationiques l'ADN plasmidique est
condensé en structures nano ou micrométriques appelées lipoplexes. Les lipoplexes se
forment spontanément via des interactions électrostatiques unissant les liposomes
polycationiques et l'ADN polyanionique Pedroso de Lima et al., 2001. Les lipoplexes sont
organisés en multiples bicouches lipidiques au sein desquelles l'ADN s'intercale (Figure 6)
Koynova et al., 2010. La taille des lipoplexes est très variable, elle est comprise en
moyenne entre 50 nm et 1 m Labat-Moleur et al., 1996; Song et al., 1997; Templeton et al.,
1997.
Figure 6 : Structure multilamellaire des lipoplexes. (A) Le mélange de

lipososomes cationiques unilamellaires et d ADN est à l origine de la formation de
lipoplexes. (B Les lipoplexes ont une structure multilamellaire résultant d une
alternance de bicouches lipidiques entre lesquelles l ADN est confiné. C) Vue
(bleu), ADN (vert). Adapté de Caracciolo et al., 2010.

agrandie de la structure des lipoplexes, lipides cationiques (rouge), lipides neutres
31
La taille et la structure des lipoplexes sont des paramètres déterminants pour

l'efficacité de transfection. Ainsi à composition lipidique identique les structures de
lipoplexes en phase héxagonale inversée plus fusiogènes permettent une meilleur efficacité
de transfection que les phases lamellaires Koltover et al., 1998; Smisterova et al., 2001.
II.3.2: Les polymères cationiques
De nombreux polymères cationiques linéaires ou branchés sont utilisés en transfert

de gènes in vitro et in vivo. Dans le tableau 3 est reportée une liste non exhaustive des
différents polymères cationiques utilisés pour le transfert de gènes. La Poly(l-lysine) (PLL)
est le premier polymère cationique a avoir été utilisé in vivo dans le cadre de la thérapie
génique Wu and Wu, 1988. La poly(ethylenimine) (PEI) est actuellement le polymère le
plus performant pour la transfection, elle a été utilisée pour la première fois en 1995
Boussif et al., 1995; Godbey et al., 1999; Hildebrandt et al., 2003. Elle existe sous forme
branchée (BPEI) ou linéaire (LPEI), et présente la plus forte densité en groupement amines
non protonés à pH physiologique. Cependant, comme de nombreux autres polymères
cationiques non-dégradables, la PEI est fortement cytotoxique Schaffer et al., 2000. Des
versions moins toxiques ont été développées en introduisant des ponts biodégradables au
sein de la structure de la PEI Lim et al., 1999 diminuant en contrepartie son efficacité. De
même le greffage de résidus histidines sur la LPEI permet de réduire très fortement la
toxicité Bertrand et al., 2011.
Polyplexes
Les polymères forment spontanément des complexes avec l'ADN grâce aux
interactions électrostatiques entre leurs groupements amines chargés positivement et les
charges négatives des groupements phosphates de l'ADN. Les polyplexes ainsi formés ont
une taille moyenne d environ nm avec des formes toroïques et globulaires.
Comparativement aux lipides cationiques les polymères condensent plus fortement l'ADN.
32
Tableau 3 : Polymères utilisés en transfert de gènes.
Polymère Abréviation Caractéristique

Poly(éthylène)glycol PEG Inerte
Polyéthylènimine PEI Cationique
Dithiobis(succinimidylpropionate) DSP PEI Biodégradable
Diméthyl-3,3'-dithiobispropionimidate DTBP PEI Biodégradable
Poly(éthylènimine) biscarbamate PEIC PEI Biodégradable
Poly(L-lysine) PLL Cationique
PLL Histidinylée Biodégradable
Poly(N-vinylpyrrolidone) PVP Neutre
Poly(propylenimine) PPI Dendrimère
Poly(amidoamine) PAMAM Dendrimère
Poly(amido éthylènimine) SS-PAEI Biodégradable
Triéthylènetetramine TETA Cationique
Poly(B-aminoester) Biodégradable
Poly(4-hydroxy-L-proline ester) PHP Biodégradable
Poly(allylamine) Cationique
Poly(A-(4-aminobutyl)-L-acide glycolique) PAGA Biodégradable
Poly(D,L-acide lactique co-glycolique) PLGA Biodégradable
Poly(N-éthyle-4-vinylpyridinium bromide) Cationique
Poly(phosphazene) PPZ Biodégradable
Poly(phosphoester) PPE Biodégradable
Poly(phosphoramidate) PPA Biodégradable
Poly(N-2-hydroxypropylméthacrylamide) pHPMA Cationique
Poly(2-(diméthylamino)éthyl méthacrylate) pDMAEMA Cationique
Poly(2-aminoéthyle propylène phosphate) PPE-EA Biodégradable
Chitosan Polysaccharide
Chitosan
Chitosan galactosylé
synthétique
Chitosan
Chitosan N-Dodecylate
synthétique
Histone Naturel
Collagène Naturel
Dextran-spermine D-SPM Polysaccharide
Adapté de Al-Dosari & Gao, 2009.
Dissociation des polyplexes
La taille des polyplexes (de l'ordre de 100 nm) étant supérieure au diamètre des
pores nucléaires (39 nm), l'ADNp doit être dissocié du polymère pour pouvoir entrer dans
33
le noyau des cellules en absence de division. Cependant le mécanisme de dissociation est à

l'heure actuelle toujours mal connu.
Une diminution des forces électrostatiques unissant l'ADNp et la PLL favorise la

dissociation des complexes dans le cytoplasme et provoque une augmentation de
l'efficacité de transfection de 10 à 50 fois. Ce résultat a été observé après diminution du
nombre de charges de la PLL suite à la substitution d un certain nombre de groupements
amines par des résidus gluconoyles non chargés Erbacher et al., 1997; Pichon et al., 2002.
La cinétique de dissociation de polyplexes a été réalisée par microscopie à

fluorescence grâce au double marquage des polyplexes permettant de suivre la localisation
de l'ADN et du polymère individuellement. Après 4 heures d'incubation avec les cellules
B16F10 les polyplexes PEI/ADNp ne sont pas dissociés Ogris et al., 2001. Un autre travail
montre qu'après 18 heures d'incubation avec des cellules de carcinome pancréatique (PaTu
8902) la plupart des polyplexes étaient dissociés Bieber et al., 2002.
De façon intéressante, grâce à des expériences de FRAP et de FRET Breuzard et al.

mettent en évidence la présence de polyplexes LPEI et PLL-histidine au sein du noyau de
cellules HeLa et C2C12 dès les premières heures de la transfection Breuzard et al., 2008.
La question de l entrée des polyplexes à travers les pores nucléaires est toujours sans
réponse, en effet le diamètre du pore nucléaire nm est limitante pour l entrée de
polyplexes dont la taille est comprise entre 70 et 300nm. La possible dissociation des
polyplexes dans le cytosol suivie de leur reconstitution dans le noyau est envisagée, de
même que des modifications de forme et de taille des polyplexes.
II.3.3 : Lipopolyplexes
Les lipopolyplexes représentent une autre classe de vecteurs non viraux García et
al., 2007. Ces vecteurs hybrides sont des complexes ternaires LPD (Lipid-Polycation-DNA)
ou LPR lorsqu ils sont formés avec de l ARNm Lipid-Polycation RNA). De la PLL,
protamine, histone, et des polypeptides synthétiques ont été utilisés pour condenser
l'acide nucléique. Les polyplexes ainsi formés sont formulés avec des liposomes. La
structure de ces complexes ternaires n est cependant pas encore bien élucidée García et
al., 2007; Mockey et al., 2007; Perche et al., 2012.
34
III-TRANSFERT DE GENES ET BARRIERES INTRACELLULAIRES
III.1 : Les barrières intracellulaires
La clé de l efficacité des différents vecteurs chimiques réside dans leur habilité à
franchir les différentes barrières intracellulaires s opposant au transfert de gènes. En effet
pour que le transfert de gènes soit efficace l acide nucléique doit franchir de nombreuses
barrières biologiques (extracellulaires et intracellulaires) pour atteindre le noyau des
cellules cibles. Brièvement, l acide nucléique doit passer la membrane plasmique
délimitant la cellule, traverser le cytosol et enfin franchir l enveloppe nucléaire (Figure 7).
Pour accomplir ce trajet les vecteurs chimiques doivent disposer de moyens permettant de
surmonter ces multiples barrières.
Figure 7 : Les barrières intracellulaires du transfert de gènes par des vecteurs chimiques.
Pour un transfert de gènes efficace la molécule d ADNp thérapeutique doit être acheminée de l extérieur de
la cellule jusqu au compartiment nucléaire pour être accessible par la machinerie cellulaire
transcriptionnelle. (1) Les complexes doivent être endocytés par la membrane cellulaire. (2) Une fois dans
la cellule les complexes vecteurs/ADNp doivent s échapper des endosomes, (3) se déplacer dans le cytosol
des cellules et (4)être importés dans le noyau cellulaire.
35
III.2 : Endocytose
Les cellules eucaryotes internalisent en permanence les fluides, des

macromolécules et autres particules par le processus d endocytose. Dans la plupart des
cellules quatre mécanismes de bases sont à l origine de l endocytose : la macropinocytose,
l endocytose clathrine dépendante, l endocytose cavéoline dépendante, et la voie clathrine
et cavéole indépendante (Figure 8). Ces différents mécanismes contrôlent des
phénomènes physiologiques complexes tels que la présentation des antigènes,
l homéostasie cellulaire, l immunosurveillance ou la transduction des signaux hormonaux.
Figure 8 : Les voies d endocytose dans les cellules eucaryotes. Quatre voies d endocytoses
principales sont décrites chez les cellules mammifères : la macropinocytose, l endocytose clathrine
dépendante, l endocytose cavéoline dépendante, et la voie clathrine et cavéole indépendante. Adapté de
Veldhoen et al., 2008.
36
III.2.1 : Lipofection
Des observations en microscopie permettent de détecter les lipoplexes au sein de

vésicules intracellulaires après incubation avec des cellules in vitro. Les lipoplexes peuvent
donc pénétrer la cellule par endocytose El Ouahabi et al., 1999 et non par fusion avec la
membrane plasmique. L'internalisation des lipoplexes est majoritairement un phénomène
cellulaire dépendant qui est dans la plupart des cas le fait d'une endocytose clathrine
dépendante. L'utilisation d'un inhibiteur de cette voie, la chlorpromazine, inhibe
drastiquement l'internalisation et l'efficacité de transfection de différentes formulations de
lipides cationiques (DOTAP, SAINT-2) Pichon et al., 2010. De plus la mutation de Eps15,
une protéine nécessaire à la formation des puits à clathrine, permet d'obtenir le même
résultat inhibiteur Zuhorn et al., 2002. La voie clathrine dépendante n'est pas la voie
unique d'endocytose des lipoplexes étant donné qu'une inhibition totale de
l'internalisation n'est obtenue avec aucun des types d'inhibition. Cela suggère que des
voies secondaires sont empruntées simultanément à la voie principale d'endocytose, ou
alternativement lorsque celle-ci est bloquée. Ainsi, l'inhibibition de la voie d'endocytose
des cavéoles grâce à la filipin III inhibe de 10 à 20% l'efficacité de transfection de SAINT-
2/DOPE en cellules COS7 et HepG2, démontrant un rôle secondaire de cette voie Zuhorn
et al., 2002. La voie des cavéoles peut cependant être majoritaire quand des lipoplexes à
base de DOTAP/DOPE sont enveloppés d'albumine sérique humaine Pichon et al., 2010.
La taille des lipoplexes est un paramètre déterminant de la voie d'endocytose. Pour

des lipoplexes dont la taille moyenne est de 200 nm, la voie clathrine dépendante est la
voie d'entrée principale Zuhorn et al., 2002;Rejman et al., 2005. Pour des lipoplexes de
plus grande taille (supérieure à 300 nm) il est supposé que la voie principale soit caveolae
dépendante par analogie avec des études réalisées sur des particules de latex Rejman et
al., 2005.
III.2.2 : Polyfection
De façon similaire, tous les polymères cationiques condensent l'ADN en petites

particules et facilitent son absorption cellulaire par endocytose grâce à des interactions
avec la surface anionique des cellules. Cependant, la voie d'endocytose des différents
37
polyplexes et leur toxicité est dépendant du type cellulaire et de la nature du polymère

Midoux et al., 2008; Pichon et al., 2010.
La voie d'endocytose des polyplexes est dépendante de la composition du polymère

impliqué dans la complexation de l'acide nucléique. A titre d'exemple au sein des cellules
HepG2 (lignée heptacellulaire), les polyplexes composés de polylysine histidinylée sont
internalisés via la voie clathrine dépendante et la macropinocytose mais le processus de
transfection est uniquement le fait de cette dernière Gonçalves et al., 2004. Le constat est
inversé lorsqu'on s'interesse à la PEI qu'elle soit branchée ou linéaire von Gersdorff et al.,
2006.
En fonction du type cellulaire, la voie d'endocytose d'un polymère donné peut aussi
être différente. Aussi, si les complexes à base de PEI pénètrent les HepG2 par la voie
clathrine dépendante, c'est la voie des cavéoles qui est impliquée pour ces mêmes
complexes dans les cellules HeLa von Gersdorff et al., 2006. De la même façon les
polyplexes d'alginate-chitosan sont internalisés par la voie clathrine dépendante en
HEK293T et COS-7 alors que c'est la voie des cavéoles en cellules CHO Douglas et al.,
2008.
III.3 : Echappement des endosomes
De nombreuses stratégies s intéressent à la sortie des endosomes des complexes

ADNp/vecteurs chimiques. La théorie du flip-flop et l utilisation de lipides fusiogéniques
dans la formulation de lipososome, ainsi que le phénomène d éponge à protons pour les
polymères cationiques PEI et histidinylés, sont les phénomènes principalement impliqués.
III.3.1 : Polyplexes
L'efficacité d'un polymère relève en grande partie de sa capacité à s'extraire des

endosomes après son endocytose. Le mécanisme le plus invoqué dans ce processus est
celui du phénomène d éponge à protons". Ce phénomène est provoqué par l afflux de base
faible à l intérieur des vésicules d endocytose acide. Des polymères cationiques ont été
développés pour induire ce phénomène. C est le cas de la PE) et des polymères et résidus
38
riches en histidine ou imidazole. La PEI présente des amines secondaires non protonés à
pH physiologique et protonables en milieu acide. A pH endosomal ces amines secondaires
en se protonant neutralisent les protons générés dans la lumière des endosomes par une
ATPase spécifique. L augmentation d ions (+ au sein des endosomes est contrebalancée
par l entrée d'ions chlorure Cl_) dans les vésicules. Après neutralisation des protons un
phénomène osmotique est induit qui conduit à la destabilisation de la membrane des
endosomes et un relargage du contenu dans le cytosol (Figure 9) Sonawane et al., 2003.
La LPEI ne présente que des amines secondaires alors que la BPEI contient des
amines secondaires ainsi que d'autres amines non protonables. La LPEI a meilleur pouvoir
tampon que la BPEI, cela explique en partie la meilleure efficacité de transfection de la
LPEI par rapport à la BPEI.
Cet effet éponge à protons peut être obtenu en utilisant l histidine, qui présente un
noyau imidazole protonable à p( endosomal ≤ , dans la composition de polymères
cationiques. Le greffage de résidus histidine sur la PLL permet d augmenter très fortement
l efficacité de transfection comparativement à la polylysine nue Midoux & Monsigny,
1999.
Figure 9 : L'effet éponge à protons. (1)Le polyplexes à base de PE) accroît l accumulation de protons
dans les endosomes, (2) provoquant une entrée passive d ions chlorure contre-ion). (3) Par gonflement
osmotique la membrane endosomale est rompue. Adapté de Medina-Kauwe et al., 2005.
III.3.2 : Lipoplexes
Après internalisation par endocytose, les lipoplexes se retrouvent piégés au sein des
vésicules endosomales. Les endosomes peuvent alors soit fusionner avec les lysosomes,
afin de dégrader leur contenu, soit le relarguer à l'extérieur de la cellule. L'échappement
des endosomes s'avère donc essentiel pour un transfert de gènes efficace.
39
La nature positive des lipoplexes peut contribuer à la déstabilisation de la

membrane endosomale et à la libération de l acide nucléique vers le cytoplasme de la
cellule par un mécanisme de «flip-flop» entre les lipides cationiques et les lipides
anioniques de la paroi cytoplasmique (Figure 10). Cette stratégie a également été
développée dans le cas des lipides cationiques
Figure 10 : Echappement des endosomes des lipoplexes grâce au mécanisme de «flip-flop». (1)
Après endocytose les lipides cationiques induiraient (2 ) une inversion des lipides anioniques de l extérieur
vers l interieur de la vésicule endosomale (3). Les lipides anioniques permettent la neutralisation des
lipides cationiques et la libération du de l ADN dans le cytoplasme (4). Adapté de Medina Kauwe et
al., 2005.
En marge de ce mécanisme de «flip-flop», des lipides auxiliaires neutres et

fusiogènes permettent d une autre façon la déstabilisation de la membrane endosomale. Le
lipide DOPE est un lipide fusiogénique sensible au pH, c'est un composant de nombreuses
formulations de liposomes principalement pour son rôle dans la déstabilisation de la
membrane endosomale Farhood et al., 1995. Au pH physiologique (pH7) le lipide DOPE
forme une bicouche lipidique stable. Lorsque le pH s'acidifie (pH5-6), comme c'est le cas
au sein des endosomes, la bicouche lipidique se réarrange en une structure hexagonale
inversée qui fusionne et déstabilise la membrane endosomale. Au cours de ce processus les
acides nucléiques contenus dans la vésicule peuvent être ainsi relargués dans le cytosol.
De la même façon que pour les polymères cationiques, des lipides histidinylés ou
comportant des groupements imidazoles ont été développés pour faciliter l échappement
endosomal Midoux et al., 2009.
40
III.4 : Trafic cytosolique
Dans la mesure o‘ la stratégie développée dans mon travail de thèse s intéresse à

l amélioration du trafic cytosolique du transfert non viral de gènes, cette partie fera l objet
d un chapitre complet dans la suite des généralités Généralités - Chapitre II).
III.5 : Importation nucléaire
Le passage de l enveloppe nucléaire est une des barrières principale qui s oppose au
transfert de gènes, en particulier dans les cellules post-mitotiques ou quiescentes
Mortimer et al., 1999 ; Escriou et al., 2001. En effet lorsque les cellules procèdent à leur
division par la mitose, l enveloppe nucléaire est rompue, les plasmides présents dans le
cytoplasme peuvent donc entrer dans le noyau à ce stade du cycle cellulaire. Bien qu étant
faible, la transfection des cellules qui ne se divisent pas est toutefois possible. En absence
de division les particules d ADNp doivent pénétrer le noyau par un complexe
macromoléculaire MDa qui perfore l enveloppe nucléaire appelé complexe du pore
nucléaire (NPC) Dowty et al., 1995. En fonction du type cellulaire transfecté il a été
évalué que seul 1 à 10% des plasmides internalisés par les cellules se retrouvent dans le
compartiment nucléaire Cohen et al., 2009. L amélioration du passage nucléaire de
l ADNp est donc un élément clé pour l optimisation des stratégies de transfert de gènes.
La principale stratégie visant à l amélioration de l importation nucléaire d ADNp

exploite la capacité de certaines protéines à être activement internalisées via le NPC grâce
à une séquence peptidique appelée signal de localisation nucléaire (NLS). La séquence NLS
de ces protéines est prise en charge par l importine , celle-ci se dimérise ensuite avec
l importine . Le dimère ainsi formé empreinte le NPC pour rejoindre le noyau. Une fois
dans le noyau la protéine RanGTP reconnait le complexe, elle induit un changement
conformationnel des importines qui libèrent le NLS. L approche la plus développée pour
l amélioration de l importation nucléaire d ADNp est de le coupler avec des peptides NLS
(Figure 11A par des interactions électrostatiques, un couplage covalent ou par l utilisation
de « clamp PNA » (Peptide Nucleic Acid) Lam & Dean, 2010. Utilisés in vivo les ADNp
couplés à des peptides NLS induisent une meilleur expression du transgène dans les souris
injectées en intra-musculaire accompagnées d une augmentation des CTLs Choi et al.,
2007.
41
Une autre stratégie consiste à insérer dans la séquence du plasmide une séquence
DTS (DNA nuclear Targeting Sequence), ce type de séquence permet l interaction avec un
ou plusieurs facteurs de transcription (tels que NF B, Oct … . Les facteurs de
transcription étant fonctionnels dans le noyau ils possèdent des séquences NLS pour leur
importation nucléaire. L interaction DTS / facteur de transcription permet le passage du
pore nucléaire de l ADNp grâce aux importines (Figure 11B). Parmi ces séquences la
séquence 3NF a été mise au point au laboratoire Breuzard et al.,2008 ; Gonçalves et al.,
2009. Cette séquence consiste en une triple répétition de la séquence d interaction à NF B
(GGACTTTCC). Les trois séquences sont séparées par une séquence espaceur de 5bp
(AGCTG), optimisée in silico, pour une meilleure reconnaissance de trois facteurs de
transcription NF B simultanément. Des expériences d hybridation in situ montrent que la
présence de la séquence NF augmente l importation nucléaire d ADNp ainsi que
l expression luciférase. De façon intéressante il a été montré que la présence de deux
séquences 3NF, encadrant la cassette d expression, au sein d un plasmide prolonge
l expression de luciférase in vitro. De plus cette version plasmidique est celle qui est
associée à la plus forte expression de luciférase in cellulo.
Figure 11 : Méthodes pour améliorer l importation nucléaire d ADNp. Un certain nombre

d'approches différentes ont été développées pour promouvoir la reconnaissance des plasmides par les
membres de la famille importine, de façon à augmenter leur importation nucléaire. (A L ADNp peut être
couplé directement avec un peptide NLS. (B La séquence de l ADNp dispose d une séquence DTS DNA
targeting sequence qui lui permet d interagir avec un ou plusieurs facteur de transcription . Adapté de
Dean et al., 2005.
42
Généralités - CHAPITRE II : Amélioration du trafic cytosolique
CHAPITRE II :
AMELIORATION DU TRAFIC CYTOSOLIQUE
Comme il a été précisé dans le Chapitre I, le transfert de gènes par des vecteurs non
viraux est un procédé complexe dont l'efficacité repose entre autres sur la capacité de
l'ADN thérapeutique à atteindre le noyau. Ainsi après internalisation par endocytose et
échappement des endosomes, l'ADN thérapeutique peut se retrouver dissocié du vecteur
ce qui le rend vulnérable aux DNases intracellulaires. La durée de vie de l'ADN dans le
cytosol est de ce fait courte de l'ordre de 60 à 90 min en cellule HeLa et COS-1 Lechardeur
et al., 1999, voir même très courte de l'ordre de 5 min dans des cellules musculaires
Bureau et al., 2004. Le transport de l'ADN jusqu'au noyau doit ainsi être le plus actif
possible pour un transfert de gènes efficace. Des stratégies mimant les virus tentent
d exploiter la dynéine, protéine motrice des microtubules, qui exerce un mouvement en
direction du noyau cellulaire.
I-TRAFIC CYTOSOLIQUE
Transport endosomal
Les complexes ADNp/vecteurs chimiques sont internalisés par endocytoses par les
cellules. Ainsi avant l étape d échappement des endosomes les polyplexes comme les
lipoplexes se retrouvent à l intérieur de ces vésicules prises en charge par les microtubules
par l intermédiaire des protéines motrices Kulkarni et al., 2005. Ce transport endosomal
des complexes est dépendant de l intégrité du réseau de microtubules, en effet la
dépolymérisation des microtubules par le Nocodazole inhibe le mouvement des complexes
Suh et al., 2003; Kulkarni et al., 2006. Le mouvement de ces vésicules s apparente à un
mouvement de va et viens, le transport étant pris en charge de façon alternative par la
kynésine et la dynéine qui ont toutes deux une direction contraire Kulkarni et al., 2005 ;
Kulkarni et al., 2006 ; de Bruin et al., 2007.
En fonction de la cinétique d échappement des complexes des vésicules

d endocytose, les complexes se retrouvent plus ou moins loin du centre organisateur des
43
microtubules (MTOC) qui se trouve à proximité du noyau cellulaire. La distance les

séparant du noyau réduit leur chance d être importé dans le noyau.
ADNp nu
Lukacs et al ont étudié la mobilité d'ADN fluorescent de tailles variables après

microinjection dans le cytoplasme de cellules HeLa Lukacs et al., 2000. Les constantes de
diffusion des différentes molécules dans le cytoplasme (Dcyto) ont été obtenues par FRAP
(Fluorescence recovery after photobleaching) et comparées aux constantes de diffusion
dans l'eau (Dw . Cette étude a montré que les petits fragments d ADN compris entre et
250 bp diffusent facilement à travers le cytoplasme (0,06 < Dcyto / Dw < 0,2), leur petites
tailles leur permet ensuite de pénétrer librement le noyau. Entre 250 et 2000 bp leur
constante de diffusion ne cesse de diminuer (Dcyto / Dw < 0,05). Au delà de 2000 bp la
diffusion est très faible, voir même nulle pour les molécules de plus grandes tailles (Dcyto /
Dw < 0,01). De façon cohérente avec ces résultats il a été démontré qu'après microinjection
d'ADNp de plus de 7 kb dans le cytosol, moins de 0,1% est exprimé dans la cellule
comparativement à une injection nucléaire Pollard et al., 1998.
Plusieurs paramètres peuvent être à l'origine de la mobilité réduite des molécules

d'ADN dans la cellule eucaryote : le blocage par des partenaires protéiques et
l'encombrement cellulaire. La nature polyanionique de la molécule d'ADN pourrait
entraîner des interactions avec des protéines positivement chargées, c'est le cas par
exemple avec les histones dans le compartiment nucléaire. L'encombrement que constitue
le cytosquelette apparaît comme l'obstacle principal de la diffusion de l'ADN, en
particulier le réseau d'actine. Après déstabilisation du réseau d'actine, la fraction mobile de
l'ADN ainsi que sa constante de diffusion est augmentée Dauty et al., 2005. De plus, dans
ces mêmes conditions la constante de diffusion de l'ADN dans le cytoplasme s'affranchit
de la taille des molécules.
En 2006, Vaughan et Dean émettent l hypothèse que de l ADNp nu se déplace dans

le cytosol le long des microtubules en exploitant la dynéine àpartir de résultats obtenus
par microinjection et électroporation d ADNp nu. Au cours de cette étude, les plasmides
employés présentent une séquence DTS (DNA nuclear Targeting Sequences) qui
empêchent de généraliser cette hypothèse à l ensemble des molécules d ADNp nu
Vaughan & Dean, 2006 (Chapitre II - III.2 : )nteraction avec NF B .
44
Virus
Les virus, de par leur taille, rencontrent les mêmes problèmes de mobilité que les
macromolécules telles que l ADN nu au sein de la cellule. Des stratégies de déstabilisation
du squelette d'actine existent chez certains virus. SV40 par exemple active par son entrée
une cascade de signalisation thymidine kinase qui mène à une dissociation locale des
filaments d'actine Pelkmans et al., 2002. La stratégie principale développée par la plupart
des virus consiste à exploiter un complexe protéique moteur, la dynéine, une fois dans le
cytosol (Chapitre II - II.3 Dynéine et trafic des virus). Par diverses interactions la dynéine
tracte les particules virales le long des microtubules en direction du noyau cellulaire.
II-DYNEINE : PROTEINE MOTRICE DES MICROTUBULES
II.1 : Microtubules
De la même façon que les filaments d'actine et les filaments intermédiaires, les
microtubules (MTs) composent le cytosquelette des cellules eucaryotes (Figure 12). Ils
sont impliqués dans un grand nombre de processus cellulaires et leur intégrité est
indispensable au fonctionnement de la cellule.
Structure
Les microtubules forment des structures tubulaires creuses d'un diamètre de 25 nm.
Leur paroi est constituée en moyenne de 13 protofilaments de tubuline qui s'assemblent
latéralement entre eux. Chaque protofilament est constitué d'un enchaînement hélicoïdal
d hétérodimères d' et de  tubuline. Toutes deux sont capables de lier le GTP mais seul le
GTP lié à la sous-unité  est échangeable et hydrolysable en GDP et phosphate inorganique
(Pi) Mandelkow et al., 1988.
45
Figure 12: Structure et disposition des microtubules dans la cellule. Les microtubules sont des
structures tubulaires creuses constituées de 13 protofilaments de tubuline. L'extrémité négative des
microtubules est arrimée au MTOC ou centrosome tandis que l'extrémité positive pointe vers la
périphérie de la cellule.
Les microtubules sont des structures polarisées, chaque extrémité peut être
considérée comme un pôle. Le pôle négatif présente exclusivement des sous-unités , à
l'autre extrémité le pôle positif expose des sous-unités  Mitchinson et al., 1993. En règle
générale les extrémités positives des microtubules se localisent en périphérie cellulaire, les
extrémités négatives quant à elles se regroupent à proximité du noyau au niveau du centre
organisateur des microtubules (MTOC) (Figure 12).
Dynamique des microtubules
Les microtubules sont des structures très dynamiques qui se réorganisent

continuellement. Ils alternent des phases d'élongation et de raccourcissement au cours
desquelles des transitions appelées catastrophes et sauvetages subviennent Mitchison et
al., 1984; Dimitrov et al., 2008. Cette instabilité dynamique se produit principalement au
niveau de l extrémité positive + , l'extrémité négative -) étant la plupart du temps
séquestrée au niveau du centrosome. On parle d'un phénomène de "tapis roulant" lorsque
l'extrémité (-) est libre et en dépolymérisation alors que l'extrémité (+) est en phase de
croissance.
46
La théorie de la "coiffe GTP" est un modèle qui tente d'expliquer cette instabilité
mécanique. Pendant l'élongation, des dimères de tubuline liés à deux molécules de GTP
(une par monomère de tubuline) sont incorporés à l'extrémité en croissance des
microtubules. La molécule de GTP associée avec la  tubuline est hydrolysée après un laps
de temps qui autorise l accumulation de tubuline-GTP jusqu à former une «coiffe ou
couronne GTP». Cette coiffe stabilise l'élongation du microtubule Pantaloni & Carlier,
1986. L'hydrolyse du GTP provoque un changement de conformation des sous-unités et
affaiblit les liaisons dans la structure des microtubules. La perte de la coiffe entraine ainsi
un évènement de catastrophe qui peut aller jusqu'à la dépolymérisation totale du MT.
Avant d'atteindre cette situation critique un processus de sauvetage permet de restaurer la
polymérisation du MT et de reformer une coiffe GTP (Figure 13).
Figure 13: Modèle de la "coiffe GTP" expliquant l instabilité des

microtubules. Des dimères de tubuline GTP sont incorporés aux microtubules
en formation et forment une coiffe. L hydrolyse du GTP entraîne la perte de la
coiffe, les microtubules se dépolymérisent suite à un processus de catastrophe.
Les microtubules peuvent entrer à nouveau en polymérisation suite à un
processus de sauvetage.
La dynamique des microtubules, notamment l'équilibre entre polymérisation et

dépolymérisation, est régulée par un groupe de protéines appelées MAPs (Protéines
Associées aux Microtubules). Les MAPs sont divisées en deux groupes selon leur activité au
47
niveau de la formation des microtubules. Certaines MAPs sont des stabilisateurs, l'exemple
le plus connu est la protéine tau, qui interagissent avec les microtubules et favorisent leur
polymérisation. D'autres MAPs déstabilisent les microtubules en favorisant leur
dépolymérisation, c'est le cas de la stathmine. Tau et stathmine sont les MAPs les plus
étudiées à cause de leur implication dans des pathologies neurodégénératives et le cancer
Devred et al., 2010.
De nombreuses modifications post-traductionnelles de la tubuline ont été

identifiées Janke & Bulinski, 2011. Parmi elles, on trouve la phosphorylation,
l'ubiquitylation, la palmitoylation, la détyrosination, la Δ2-tubuline génération, la
polyglutamylation, la polyglycylation et l'acétylation Westermann & Weber, 2003; Wloga
& Gaertig, 2010. La fonction biologique de ces modifications n est pas encore totalement
comprise, il est toutefois clair qu'elles influencent la dynamique et la stabilité des
microtubules. Par exemple l'acétylation et la détyrosination sont directement corrélées à la
durée de vie des microtubules et ont tendance à les stabiliser.
Fonction des microtubules
Le réseau de microtubules est particulièrement dynamique et joue un rôle crucial

dans un grand nombre de fonctions cellulaires critiques telles que l'architecture cellulaire,
la division cellulaire, le transport vésiculaire, le mouvement des organites et des
chromosomes ou encore la migration cellulaire.
Les dynéines et kinésines sont deux familles de complexes protéiques moteurs qui
assurent des mouvements contraires le long des microtubules. Elles guident de façon
active des organites et vésicules à travers le cytoplasme. La tête de ces complexes interagit
avec les microtubules, la queue quand à elle interagit avec des vésicules et organites
intracellulaires. Les kinésines à l exception de la kinésine 14) se déplacent en direction de
l extrémité + des microtubules, soit en périphérie cellulaire. Nous nous intéresserons
dans la suite de ce chapitre aux dynéines qui réalisent un mouvement vers l extrémité -)
en direction du noyau cellulaire qui pourraient être exploitées pour la transfection avec
des vecteurs chimiques.
48
II.2 : Dynéine
II.2.1 : Différentes isoformes
La dynéine est une famille de protéines qui réalise un mouvement rétrograde le

long des microtubules, c'est à dire de la périphérie cellulaire jusqu'au noyau. Toutes les
isoformes de dynéines s'organisent de façon similaire et sont des complexes
macromoléculaires composés de chaînes lourdes, intermédiaires et légères Asai & Koonce,
2001. Au sein de ce complexe, c'est la chaîne lourde présente en deux exemplaires qui est
responsable de l'activité motrice. Les différentes isoformes de la chaîne lourde sont à la
base des différents isoformes de dynéine. On distingue ainsi de multiples dynéines
axonémales (bras de dynéine interne et externe) et deux dynéines cytoplasmiques : - La
dynéine cytoplasmique 1 ou MAPC1, Dhc1a et Dyh1 (non-axonémale) - La dynéine
cytoplasmique 2 ou Dhc1b et Dyh2 (non-axonémale) Gibbons, 1995.
La dynéine cytoplasmique 1 est le moteur moléculaire majeur pour le déplacement

des organites et autres vésicules (appelés cargos) dans le cytoplasme de la plupart des
cellules eucaryotes. Dans la suite de ce chapitre nous nous intéresserons donc
exclusivement à la dynéine cytosolique 1, ainsi le terme dynéine s'appliquera uniquement à
cet isoforme.
II.2.2 : Dynéine cytosolique 1
La dynéine cytosolique 1 a été découverte en 1987 et initialement appelée MAPC1

pour sa relation avec les microtubules Paschal et al., 1987. Elle a ensuite été rapidement
identifiée comme une protéine motrice rétrograde grâce à son activité d'hydrolyse de l'ATP
et son mouvement opposé à celui de la kinésine-1 Paschal & Vallee, 1987.
II.2.2.1 : Structure et composition
La dynéine est un complexe protéique de 1,2 MDa. Elle est composée de deux têtes
globulaires qui se rejoignent en une base commune par l'intermédiaire de tiges minces, ce
sont les deux chaînes lourdes de la dynéine (DHC : Dynein Heavy Chain) de 530 kDa
(Figure 14). On retrouve au niveau de ces DHCs, le site d'interaction avec les microtubules
49
et le site d'hydrolyse de l'ATP. A la base de ce complexe moteur se trouvent deux chaînes

intermédiaires de 74 kDa (IC74 : Intermediate Chain) et quatre chaînes intermédiaires
légères (LICs : Light Intermediate Chains) qui interagissent directement avec les DHCs
King, 2000. Trois différents homodimères de chaînes légères interagissent quant à elles
avec les ICs : TCTEX-1 (DYNLT), LC8 (DYNLL) et LC7 (DYNLRB) Makokha et al., 2002;
Allan, 2011. Des délétions réalisées au niveau de l )C révèlent que l interaction de LC
nécessite la présence d un motif KETQT situé en N-terminal de IC74, TCTEX-1
interagissant par l intermédiaire d une séquence RRLNK Lo et al., 2001; Mok, 2001.
Figure 14: Composition et structure de la dynéine cytoplasmique.

La chaîne intermédiaire de la dynéine (IC) et la chaîne légère intermédiaire
(LIC) se lient directement à la chaîne lourde. Les chaînes légères LC8, LC7
et TCTEX- s assemblent à l )C. L )C interagit avec la sous-unité p150 de la
dynactine, ainsi qu avec la sous unité ZW Zest White de RZZ Rod–
ZW10–Zwilch). LC8 se lie à des protéines adaptatrices telles que NUDE
(nuclear distribution protein E) NUDEL (NUDE-like) ou Egalitarian. LIS1
(Lissencephaly 1) interagit avec AAA1 de la chaîne lourde. Adapté de
Kardon & Vale, 2009.
50
II.2.2.2 : Interactions
Interaction avec les microtubules
La dynéine interagit directement avec les microtubules par l'intermédiaire d'un

petit domaine globulaire appelé MTBD (MicroTubule Binding Domain) localisé à
l'extrémité d'une longue et fine tige de 10 à 15 nm au niveau du domaine AAA4 de la DHC
Gibbons et al., 2005. L'interface d'interaction du MTBD avec les microtubules est
constituée d'un groupe d'hélices H1, H3, et H6. La structure du MTBD a été résolue par
cristallographie Carter et al., 2008 et par identification des mutations qui empêche
l'interaction avec les microtubules Koonce & Tikhonenko; 2000.
Interaction avec la dynactine
La dynéine interagit de façon indirecte avec certains cargos cellulaires qu'elle

transporte par l'intermédiaire de la dynactine (activateur de la dynéine). Le complexe
dynactine a une masse moléculaire de 1 MDa et est constitué de 11 sous-unités différentes .
Parmi elles on retrouve la sous-unité p150 qui interagit avec les microtubules Walterman-
Storer et al., 1995; Culver-Hanlon et al., 2006; Kobayashi et al., 2006 et l'IC du complexe
moteur Karki & Holzbaur, 1995; Vaughan et al., 1995. Le blocage de l'IC de la dynéine ou
de p150 par des anticorps inhibe la mobilité de la dynéine in vitro et in cellulo Burkhardt et
al., 1997; Schroer & Sheetz, 1991; Gaglio et al., 1997; Steffen et al., 1997; Waterman-Storer et
al., 1997; King & Schroer, 2000.
La présence de la dynactine aux côtés de la dynéine est essentielle pour une activité
totale de la protéine motrice Gill et al., 1991; Schroer & Sheetz, 1991; Karki & Holzbaur,
1999; Boylan et al., 2000; Schroer, 2004. La dynactine contribue par différents aspects à
l'accomplissement des fonctions de la dynéine :
- Elle lui permet de s'arrimer aux microtubules au niveau de leurs extrémités positives en
reconnaissant entre autres les protéines CLIP170 (Cytoplasmic Linker Protein) Dujardin et
al., 1998; Coquelle et al., 2002 et EB1 Faulkner et al., 2000; Mimori-Kiyosue et al., 2000.
- La dynactine augmente l activité motrice de la dynéine Karki & Holzbaur, 1999; King &
Schroer, 2000. Il semblerait que la présence d'un second site de liaison avec les
microtubules au niveau de p150, capable de diffuser seul sur les microtubules collaborerait
51
au mouvement de la dynéine Culver-Hanlon et al., 2006.
- Sa fonction la plus connue est d'occuper le poste d'adaptateur entre la dynéine et les
vésicules et organites Kardon et al., 2009. Le filament ARP1 (Actin-Related Protein) de la
dynactine est un partenaire de la III spectine que l'on retrouve à la surface de l'appareil de
golgi et d'autres membranes cellulaires Holleran et al., 2001. De plus, sa sous-unité p150
interagit avec des GTPases régulatrices que l'on retrouve sur la membrane des vésicules
provenant du réticulum endoplasmique Watson et al., 2005.
Interactions via les chaînes légères
De la même façon que la dynactine, les homodimères LC8 et TCTEX-1 permettent

l interaction du complexe dynéine avec des cargos. Les homodimères de chaînes légères de
la dynéine interagissent donc d une part avec le reste du complexe dynéine )C et
d autre part avec les cargos. Bien qu étant différentes en ce qui concerne leur séquence,
LC8 et TCTEX-1 ont des structures tertiaires très similaires comprenant deux hélices
suivies par cinq feuillets . La structure tertiaire des deux types d homodimères est ainsi
similaire cependant les interactions que chacun d eux engage avec les cargos sont
différentes.
L homodimère LC interagit avec les deux )C au niveau des sillons qui se

trouvent entre les deux monomères (Figure 15A). C est au niveau de ces mêmes sites qu a
lieu l interaction avec les molécules cargos. Pour que cet homodimère joue son rôle
d adapteur avec les molécules à transporter, une des deux chaînes intermédiaires doit donc
être remplacée. L interaction avec ces sites est régie par une séquence peptidique
consensus bien connue, l )C et les molécules cargos partagent ainsi des motifs
protéiques hautement conservés. Les motifs de liaisons à LC8 sont de deux types :
KXTQTX ou XG(I/V)QVD [Rapali et al., 2011]. Au sein de ces deux classes de peptide de
liaison, la glutamine (Q) a une position centrale, elle interagit avec la partie N-terminale
de la seconde hélice de LC tandis que le reste du peptide se cale dans le sillon
intermonomérique. Toutefois on peut noter que les protéines MYO5A [Hodi et al., 2006],
Pak1 [Day et al., 2004] et GRINL1A [Garcia-Mayoral et al., 2010] ont leur motif de liaison à
LC8 est dépourvu de glutamine.
52
De même que pour LC8, un motif peptidique de acides aminés d )C assurant la

liaison avec TCTEX-1 a été identifié Mok et al., 2001; Lo et al., 2005. Au sein de ce peptide
une séquence consensus (R/K)(R/K)XX(R/K) est retrouvée dans de nombreuses protéines
d interaction à TCEX-1. TCTEX-1 peut donc interagir avec les cargos et IC74 soit par le
même site soit par deux sites opposés de la structure garantissant moins de compétition
(Figure 15B).
Outre IC74, TCTEX-1 interagit avec de nombreux autres partenaires cellulaires

comme la rhodopsine [Tai et al., 1999], Doc-2 [Nagano et al., 1998], le récepteur CD155 du
virus de la polio [Mueller et al., 2002], le récepteur de l hormone parathyroïde [Sugai et al.,
2003], la protéine VP26 de la capside du virus Herpes simplex [Douglas et al., 2004], ou
encore la protéine FIP-1 [Lukashok et al., 2000] dont nous reparlerons plus loin.
Les séquences protéiques hautement conservées connues pour interagir avec les
chaînes légères de la dynéine sont appelées DLC-AS (Dynein Light Chain Association
Sequence) [Moseley et al., 2007].
Figure 15 : Représentation de l interaction Dynéine/cargo par l intermédiaire des

chaînes légères. (A) Les dimères LC8 interagissent avec la chaîne intermédiaire IC74 et les
cargos au niveau des mêmes sites par l intermédiaire d un même motif peptidique KXTQTX ou
XG(I/V)QVD. (B) TCTEX-1 interagit avec la chaîne intermédiaire IC74 (R/K)(R/K)XX(R/K) et
certains cargos par deux mécanismes différents qui n impliquent de ce fait aucune compétition.
Adapté de Wu et al., 2005.
53
II.2.2.3 : Dynamique
Au cœur du mécanisme de transport de la dynéine se trouve le cycle d'hydrolyse de

l'ATP et les changements conformationnels qu'elle entraîne sur le complexe moteur
White & Lauring, 2007. La DHC est une ATPase composée de six domaines AAA+
(ATPases Associated with cellular Activities) organisés en un anneau dont seuls quatre
sont capables d'hydrolyser l'ATP. L'hydrolyse de l'ATP par les domaines AAA2 et AAA4 a
un rôle de régulation, leur mutation n'est pas délétère à la mobilité de la dynéine. C'est
l'hydrolyse au niveau des sites AAA1 et AAA3 qui provoque les changements
conformationnels à l'origine de la dynamique Kon et al. 2004; Imamula et al., 2007; Cho et
al. 2008.
La force motrice est générée par un changement de position du domaine de liaison

(domaine qui fait le pont entre la queue et le domaine AAA1 de la DHC) qui agit comme
un levier au cours du cycle d'hydrolyse de l'ATP Burgess et al., 2003; Houdusse & Carter,
2009. Ce phénomène est couplé avec une modification de l'affinité du MTBD avec les
microtubules. Le couplage de ces deux phénomènes est la clé du mouvement de la
dynéine, et nécessite une communication entre la tête et la tige Carter et al., 2011.
En l'absence d'ATP, la dynéine s'accroche aux MTs par l'intermédiaire du MTBD au

niveau de la tête (Figure 16A). Lorsque la dynéine lie l'ATP cela provoque son
détachement des microtubules (Figure 16B) Johnson, 1985. Un changement
conformationnel entraîne alors "l'armement" du domaine de liaison (Figure 16C). Le
MTBD se lie à nouveau sur les microtubules ce qui stimule l'activité ATPase du domaine
AAA1 (Figure 16D). La libération d'énergie permet le "désarmement" du domaine de
liaison qui créé la force motrice (Figure 16E) Imamula et al., 2007.
La figure schématise le mouvement d une seule chaîne lourde, or les deux D(Cs
fonctionnent en alternance dans un mouvement coordonné. On dit que la dynéine
"marche" sur les microtubules, ainsi lorsqu un des MTBD est libre le second est en
interaction avec les microtubules. La technique de piège optique (optical trap) permet
d analyser des forces de l ordre de la centaine de piconewton, et de détecter des
déplacements à l échelle du nanomètre Rice et al., 2003. Cette technologie a été utilisée
pour étudier in vitro le déplacement de billes de polystyrènes liées à la dynéine le long des
microtubules Mallik et al., 2004. En règle générale, on admet que le mouvement de la
54
dynéine est d environ m/s dans la cellule, cependant cette étude nous apprend que le
pas de la dynéine varie en fonction des pressions qu on lui impose. En effet, en fonction
des forces qui lui sont appliquées la dynéine a un pas qui peut être de 8, 16, 24 ou 32 nm
Mallik et al., 2004. Plus les forces sont importantes et plus la taille de son pas diminue;
cette adaptabilité est unique puisqu aucune autre protéine motrice n a cette capacité. La
dynamique de la dynéine sur les microtubules est actuellement encore mal connue
comparativement à celle de la kinésine.
)l est à noter que la dynéine a un mouvement qui n est pas strictement

unidirectionnel. Gennerich et al. ont montrés que lorsque des forces de l ordre de -10 pN
sont imposées au complexe moteur, son mouvement est orienté en direction de l extrémité
positive des microtubules Gennerich et al., 2007.
Figure 16 : Mouvement rétrograde de la dynéine suivant le cycle d hydrolyse de l ATP. (A,B)

En fixant l ATP le MTBD de la dynéine perd son affinité pour les microtubules. (C,D) Le domaine de liaison
de la chaîne lourde s arme l affinité du MTBD pour les microtubules est alors retrouvée. (E) L hydrolyse de
l ATP désarme le domaine de liaison ce qui provoque le mouvement du complexe moteur.
55
II.2.2.4 : Fonction
La dynéine a de nombreuses fonctions. Parmi elles, le transport rétrograde le long

des microtubules de vésicules et organites est la plus étudiée. Ainsi la dynéine est
impliquée dans le mouvement des mitochondries, de protéines, d'ARN, des lysosomes, des
endosomes tardifs [Chevalier-Larsen & Holzbaur, 2006; Lin & Collins, 1992; Aniento et al.,
1993]. Elle participe à la formation du réticulum endoplasmique et à la localisation de
l'appareil de golgi au niveau du centrosome [Corthesy-Theulaz et al., 1992]. Elle a de plus
un rôle dans la stabilité du réseau de MTs [Ross et al., 2008]. Présente dans les
kinétochores [Pfarr et al., 1990], elle participe à la ségrégation des chromosomes au cours
de la division cellulaire [Matanis et al., 2002].
II.3 : Dynéine et trafic des virus
Le cytoplasme constitue un environnement très encombré où les structures

cytosquelettiques et autres organites entravent la diffusion de molécules supérieures à 500
kDa. Ainsi en absence d'un phénomène actif de transport, il a été évalué qu'un virus type
Herpes mettrait plus de deux ans à parcourir 10 m dans le cytoplasme [Dohner & Sodeik,
2005]. Certains virus utilisent la dynéine pour réaliser leur déplacement en direction du
MTOC pendant le processus d'infection. Ce transport actif le long des microtubules est
déterminant pour un processus d'infection viral efficace. En effet, il a été montré que seul
% des particules d adénovirus atteignent le noyau après dépolymérisation des
microtubules à l'aide de Nocodazole [Suomalainen et al., 1999; Engelke et al., 2011]. Il en va
de même pour d autres virus : herpes simplex virus (HSV) [Sodeik et al., 1997; Mabit et al.,
2002], hépatite B [Funk et al., 2004], cytomegalovirus humain [Ogawa-Goto et al., 2003],
virus de l immunodéficience humaine (VIH) [McDonald et al., 2002], virus de la peste
porcine africaine (ASFV) [Jouvenet et al., 2004], parvovirus [Suikkanen et al., 2003], virus
influenza [Lakadamyali et al., 2003], papillomavirus (PV) [Schneider et al., 2011].
Ce transport actif est un des paramètres cruciaux qui explique l'efficacité des
vecteurs viraux en thérapie génique. Selon les types de virus le recrutement de la dynéine
engage des processus et des partenaires différents Dodding & Way, 2011 (Tableau 4). On
peut citer les exemples des adénovirus et virus herpès qui ont des mécanismes de
recrutement de la dynéine différents.
56
Tableau 4: Protéines virales impliquées dans l interaction des virus avec la dynéine.
DYNLL (Dynein Light Chain LC8) – DYNLRB (Dynein Light Chain RoadBlock) – DYNC1LI (Dynein Light
Intermediate Chain) – DYNC1I (Dynein Intermediate Chain). Adapté de Merino-Garcia et al., 2011.
Adénovirus
Suite à l'injection d'anticorps anti-dynéine et à la surexpression de dynamitine, les

adénovirus perdent la capacité de rejoindre le noyau Leopold et al., 2000; Suomalainen et
al., 1999. La dynéine a donc été identifiée comme étant indispensable au mouvement des
adénovirus, cependant jusqu'à très récemment le processus de son recrutement sur les
microtubules était inconnu. C est en que Bremner et al. ont montrés par co-
immunoprécipitation que c est l héxon sous-unité de la capside) qui interagit directement
avec l )C et la L)C de la dynéine Bremner et al., 2009]. Ces interactions peuvent avoir lieu
à la condition que l héxon ait été soumis à un p( acide. Ce résultat suggère que seuls les
virus ayant transités par des vésicules d endocytose sont capables de recruter la dynéine.
La microinjection d anticorps ciblant l )C de la dynéine ou l héxon de la capside virale,
l extinction de la dynéine ou la surexpression d héxons empêche l accumulation de virions
dans le noyau. La dynactine n est pas impliquée dans le processus de recrutement de la
dynéine par les adénovirus. De la même façon, les protéines accessoires de la dynéine
(NudE, NudEL, LIS et ZW10) n interviennent pas dans ce processus.
57
Herpès virus
Pour les virus de type (erpès, l interaction avec la dynéine a lieu avec des protéines
de la capside et des protéines téguments qui l'entourent. La technique double hybride a
permis d identifier l interaction entre les protéines UL , UL , UL VP directement
avec différents composants du complexe moteur Martinez-Moreno et al., 2003; Douglas et
al., 2004]. La protéine UL9 présente une séquence consensus de liaison à DYNLL1 aussi
appelée LC8 (746-KSTQT-750) Martinez-Moreno et al., 2003]. La petite protéine de la
capside VP26 s'attache directement aux LCs TCTEX-1 et TCTEX-3. L'importance relatives
des protéines téguments et de la capside dans le recrutement de la dynéine est encore mal
connue Diefenbach et al., 2008].
Virus et chaîne légère de la dynéine
Parmi les différentes sous unités constituant la dynéine ce sont les chaînes légères
(LCs) qui sont majoritairement ciblées par les virus, et en particulier LC8. Les virus font
appel à un mécanisme bien connu pour recruter la dynéine qui sont les séquences DLC-AS
de LC8. Ce motif de liaison à LC8 est donc présent dans de nombreuses protéines virales
(Tableau 5).
Tableau 5: Protéines virales interagissant avec LC8 grâce à une séquence DLC-AS.
Protéine Virus Séquence DLC-AS Référence

Protéine P Rage RSSEEDKSTQTT [Rodriguez-Crespo et al., 2001]
Protéine P Mokola KSTEDKSTQTP [Rodriguez-Crespo et al., 2001]
TILVSRSTQTG
UL19 Herpès Humain 7 [Martinez-Moreno et al., 2003]
LGHFTRSTQTS
UL9 Herpès Humain 1 GVQMAKSTQTF [Martinez-Moreno et al., 2003]
VP35 Ebola PKTRNSQTQTD [Kubota et al., 2009]
ADE41 Adénovirus CITLVKSTQTV [Martinez-Moreno et al., 2003]
p54 Peste porcine africaine VTTQNTASQTM [Martinez-Moreno et al., 2003]
Adapté de Rapali et al., 2011.
58
III-DYNEINE & TRANSFERT NON VIRAL DE GENES
L idée d exploiter la dynéine pour améliorer le trafic cytosolique d ADNp dans le

cadre du transfert non viral de gènes est assez récente. Actuellement encore peu de
publications se font l écho de cette stratégie possible. Depuis le début des années 2000, ces
études s orientent principalement sur le ciblage des chaînes légères de la dynéine dont
certains motifs d interaction sont particulièrement bien caractérisés. Dans cette partie, des
travaux utilisant NF B ou l héxon de la capside adénovirale seront aussi présentés.
III.1 : Interaction avec les chaînes légères de la dynéine
DLC-AS de LC8
Comme nous avons pu le voir précédemment (Chapitre II - II.2.2.- Interactions via

les chaînes légères), les DLC-AS sont des séquences protéiques hautement conservées qui
permettent l interaction avec les chaînes légères de la dynéine. Les DLC-AS de LC8 sont
particulièrement bien décrites et sont de deux types KXTQTX ou XG(I/V)QVD.
Le travail de Moseley et al. en est à l origine des premiers travaux concernant

l utilisation des DLC-AS dans le transfert non viral de gènes. Ce travail concerne la
phosphoprotéine rabique (RPP) qui présente une séquence DLC-AS de LC8 (DKSTQT)
ainsi qu une séquence NLS (KKYK). La présence de la séquence DLC-AS assure
l interaction avec la dynéine et augmente l accumulation nucléaire de la protéine RPP ainsi
que d autres protéines présentant un NLS. Cette augmentation implique l augmentation
du taux d importation nucléaire et est dépendante de l intégrité des microtubules ainsi que
de l interaction avec la dynéine. Ces résultats suggèrent le mécanisme suivant : la séquence
DLC-AS permet l association de la protéine à la dynéine, la dynéine tracte ensuite la
protéine dans un mouvement rétrograde le long des microtubules à proximité du noyau,
finalement la protéine pénètre dans le noyau grâce à sa séquence NLS.
Suite à cette étude, le potentiel d un peptide DLC-AS de LC8 a été étudié pour
améliorer le trafic intracellulaire de cargos artificiels. Ce peptide de 12 acides aminés
(PRMLHRSTQTTNC) est issu de la séquence de la protéine adénovirale BS69 Kelkar et al.,
2004. Les études biochimiques réalisées indiquent que ce peptide a la capacité d interagir
avec le LC8 libre dans le cytoplasme, a contrario de la LC8 du complexe moteur.
59
L incorporation de ce peptide dans la formulation de polyplexes qu il soit greffé sur l ADNp

ou sur un polymère cationique ne montre aucune amélioration du transfert de gènes. Deux
arguments peuvent expliquer cette situation. Tout d abord LC est une protéine qui n est
pas uniquement associée à la dynéine, seul 12% de la LC8 intracellulaire se trouve intégrée
au complexe moteur King et al., 1996. De plus des études structurales de la dynéine
montrent que les sites d interaction des séquences DLC-AS de LC8 sont naturellement
occupés par les chaînes intermédiaires IC74 Fan et al., 2001. Un peptide DLC-AS de LC8
exogène a donc une probabilité réduite de rencontrer sa cible sur le complexe moteur où
une forte compétition inhibe son interaction. Partant de ces constats les séquences DLC-
AS de LC seraient donc de mauvais candidats pour l interaction avec la dynéine d ADNp
thérapeutique Bergen & Pun, 2007.
En 2011, une publication rapporte toutefois un effet positif du transfert de gènes

avec une séquence DLC-AS de LC8 Tanaka et al., 2011a. Après formation des complexes
entre le vecteur cationique Stéaroyl-CH2R4H2C et l ADNp, le peptide de 15 acides aminés
(CKSSQDKSTQTTGDC) est greffé grâce à une liaison disulfure sur le vecteur. Si la
présence du peptide inhibe de plus de % l internalisation des complexes d ADNp par les
cellules, l expression du transgène est en contrepartie faiblement mais significativement
améliorée. La séquence DLC-AS améliorerait le trafic des rares polyplexes ayant transfectés
les cellules Tanaka et al., 2011b.
Interaction avec TCTEX-1
Les différences qui opposent LC8 et TCTEX-1 tendent à démontrer que des
séquences ciblant TCTEX- seraient des candidats plus performants pour l interaction avec
la dynéine d ADNp thérapeutique. En effet, contrairement à LC8, les dimères de TCTEX-1
peuvent interagir avec les chaînes intermédiaires IC74 et les cargos par deux mécanismes
différents au sein du complexe dynéine ce qui n implique par conséquent aucune
compétition Wu et al., 2005. En outre TCTEX-1 se retrouve presque exclusivement au sein
du complexe dynéine DiBella et al., 2001. Ces séquences garantiraient de ce fait une
meilleure spécificité et seraient moins en compétition.
Les 40 derniers acides aminés de la protéine L2, protéine de la capside du

papillomavirus humain, a été identifiée comme interagissant avec TCTEX-1 Florin et al.,
2006. Kwon et al. ont rapporté qu une partie de la séquence de L a été exploitée en
60
transfert de gènes sans toutefois préciser si elle a été greffée sur l ADNp ou le vecteur
Kwon et al., 2008. La séquence ne montre aucun effet positif sur l efficacité de
transfection.
Pour analyser cet échec, il est important de s intéresser aux acides aminés
d intérêt au sein de la protéine L Figure 17). Lorsqu on observe la séquence de ce
fragment protéique on identifie la présence de la séquence consensus (R/K)(R/K)XX(R/K)
(II.2.2.2 -Interactions via les chaînes légères) présente chez IC74 et qui lui permet de se lier
à TCEX-1 pour constituer le complexe moteur dynéine. Une trop forte compétition entre le
peptide testé en transfection et )C peut expliquer l échec de cette stratégie.
Figure 17: Séquence protéique des 40 derniers acides aminés de la protéine

L2 de la capside du papillomavirus humain. On identifie une séquence consensus
présente chez IC74 et retrouvée dans de nombreuses protéines d interaction à TCEX-1.
))). : )nteraction avec NF B
La présence de sites B au niveau de l ADNp augmente l efficacité de transfection

des cellules. Ces sites B permettent l interaction de l ADNp avec les protéines de NF B
p et p qui disposent d un NLS Mesika et al., 2001 ; Gonçalves et al., 2009. Si
l augmentation de la transfection observée est une conséquence de l amélioration de
l importation nucléaire grâce aux importines et , elle serait aussi en partie due à
l interaction avec la dynéine. Le transport intracellulaire d ADNp disposant de motifs B
répétés en tandem -GGGGACTTTCC- et complexé avec la protéine p ADNp-p50) a
été étudié en microscopie confocale après microinjection Mesika et al., 2005. Le transport
de l ADNp-p50 dans le cytoplasme serait facilité grâce à une interaction avec la dynéine.
L interaction avec la dynéine serait médiée par l importine qui ferait le lien entre le
complexe moteur et p50.
61
Une autre explication peut être envisagée en s intéressant au travail de Mikenberg

et al. qui a montré que la sous-unité p de NF B interagit directement avec l )C de la
dynéine ainsi que p150 de la dynactine dans les cellules neuronales. Ces interactions
seraient nécessaires pour la localisation nucléaire de NF B en situation d inflammation
Mikenberg et al., 2007. Les hétérodimères p50-p65 se déplaceraient sur les microtubules
grâce l interaction de p avec la dynéine.
))). : Utilisation de l héxon de la capside adénovirale
En 2001, l héxon de la capside adénovirale a été conjugué de façon covalente à la PE)

pour étudier principalement son effet sur l importation nucléaire d ADNp dans le cadre du
transfert de gènes non viral. Les polyplexes formulés en présence d héxon augmentent de
fois l expression du transgène Carlisle et al., 2001. L implication de l héxon de la
capside adénovirale dans la migration du virus sur les microtubules n étant pas connue a
cette époque, le trafic des polyplexes ainsi formulés n a pas été étudié. Les auteurs
concluent que l effet de l héxon sur l efficacité de transfection serait la conséquence d une
meilleure importation nucléaire de l ADNp.
62
Généralités - CHAPITRE III : La protéine E3-14.7K d’adénovirus, FIP-1 et les microtubules
CHAPITRE III :
LA PROTEINE D’ADENOVIRUS E3-14.7K, FIP-1 ET LES
MICROTUBULES
Dans ce chapitre, nous nous intéressons à la protéine E3- . K d Adénovirus.

Certaines publications indiquent qu in vitro E3-14.7K interagirait avec la chaîne légère de la
dynéine TCTEL1 (homologue à TCTEX- par l intermédiaire de la protéine cytosolique
FIP-1 Lukashok et al., 2000. Sur cette base, nous souhaitons exploiter l interaction d E -
. K avec la dynéine pour améliorer le trafic nucléocytoplasmique d ADNp dans le cadre
du transfert de gènes par des vecteurs chimiques.
I- GENERALITES SUR LES ADENOVIRUS HUMAINS
Chez l homme, plus d une cinquantaine de sérotypes d adénovirus ont été

répertoriés, ils sont alors responsables de maladies relativement bénignes. Ces virus
infectent essentiellement les cellules épithéliales des muqueuses respiratoires, gastro-
intestinales ou oculaires. Ils peuvent parfois atteindre le foie ou les reins. Les sérotypes
humains sont classés en six sous-groupes (A à F) selon des critères biochimiques,
génétiques et structuraux. Les sérotypes les plus étudiés sont les sérotypes 2 et 5 (utilisé en
thérapie génique) qui appartiennent tous les deux au sous-groupe C.
Les adénovirus sont des particules virales non enveloppées d un diamètre de à

nm. )ls sont constitués extérieurement d une capside icosaédrique (Figure 18A). Trois
protéines composent principalement la capside : l héxon constituant les faces
icosaèdriques, le penton base et la fibre qui s associent pour former le complexe penton à
chacun des sommets. Les protéines internes )))a, V), V))) et )X s associent aux hexons et
pentons pour assurer la stabilité de la capside. Les protéines V, VII et Mu interagissent
avec l ADN viral pour former des structures nucléoprotéiques. Un exemplaire de la
protéine Terminale TP est lié de façon covalente à chacune des extrémités des brins
d ADN (Figure 18B).
63
Protéines capsides
Héxon
Fibre
Penton
base
Protéines ciment
V
VII
Mu
Protéines internes
VIII
IX
IIIa
B
A VI
Figure 18 : Morphologie et structure des adénovirus. (A) Adénovirus humain de sérotype 5 observé
par microscopie électronique à transmission en cryomicroscopie. (B) Schéma structural de la capside des
adénovirus. Adapté de Bakkouri et al., 2008 ; Russell et al., 2000.
Infection adénovirale
Les adénovirus pénètrent la cellule après reconnaissance de récepteurs spécifiques

au niveau de la membrane plasmique tels que CAR (Récepteur Coxsackievirus et
adenovirus) et acide sialique Bergelson et al., 1997; Nemerow et al., 2000. Après cette
reconnaissance une deuxième interaction s effectue avec les intégrines via la
séquence peptidique RGD contenue dans les fibres. Cette interaction induit l endocytose
des particules virales via des vésicules à clathrine puis passent dans les endosomes. Les
fibres de la capside déstabilisent les endosomes, les virions sont ensuite relargués dans le
cytosol et migrent le long des microtubules jusqu au pore nucléaire Suomalainen et al.,
1999 (Figure 19). Après désassemblage de la capside, le génome adénoviral et les
protéines qui lui sont associées sont importées dans le noyau où les gènes précoces puis
tardifs sont transcrits Russell., 2000; Whittaker et al., 2000.
64
Figure 19 : L infection adénovirale. Adapté de Barnett et al., 2002
Génome adénoviral
Le génome adénoviral est une séquence d ADN double brin linéaire de à kb.
Ses extrémités sont formées par des ITR (séquences Terminales Répétées Inversées) qui
interviennent dans la réplication du génome viral. Les deux brins d ADN sont codants et
subdivisés en deux régions principales (Figure 20) :
- La région E (pour Early) correspond aux gènes précoces impliqués dans la

préparation de la cellule à la réplication de l ADN viral. La phase précoce intervient
environ 1h après le début de l'infection adénovirale. Elle code des protéines fonctionnelles
dont nous parlerons plus précisément dans le prochain sous-chapitre.
- La région L (pour Late) correspond aux gènes transcrits tardivement qui sont
impliqués dans la formation des nouvelles particules virales. La transcription de l unité
transcriptionnelle L intervient au moment de la réplication de l ADN viral. In vitro la phase
tardive commence à ( après l infection. Le promoteur MLP Major Late Promoter
contrôle la synthèse d un transcrit polycistronique qui est à l origine de ARNm qui
65
codent presque exclusivement pour des protéines structurales. Les protéines structurales
néosynthétisées sont importées dans le noyau où sont assemblées les capsides virales
vides, l ADN viral y est ensuite empaqueté Philipson et al., 1984.
MLP
L1

L2

L3

L4

L5
E1A E1B 
E3
  
E2A

E4


E2B
Phase précoce Phase tardive
Figure 20 : Organisation génomique de l adénovirus de sérotype .
Les protéines de la phase précoce
Les protéines exprimées au cours de la phase précoce interagissent entre elles ainsi
qu avec les protéines de la cellule hôte afin de préparer la synthèse de nouveaux virions.
Les ARNm codants pour les protéines adénovirales précoces sont transcrits depuis six
différents loci du génome viral. La région précoce 1A (E1A) est la première région à être
transcrite, suivie par E1B, E3 puis E4 Nevins et al., 1977; Lewis et al., 1980. Le promoteur
E2 est le dernier à être activé (Figure 20).
Les gènes issus de la région E1A sont les premiers à être transcrits et traduits. Les
protéines de la région E A R et R ont un rôle régulateur dans l expression des
gènes viraux et cellulaires. En effet 289R stimule la transcription des autres régions E ainsi
que le cycle cellulaire de la cellule hôte en rendant actif les facteurs de transcription E2F
Frisch et al., 2002. Suite à l activation de gènes favorisants la croissance cellulaire, le
rythme du cycle des cellules infectées est perturbé, les cellules deviennent quiescentes et
s accumulent en phase S du cycle cellulaire Babiss et al., 1985; Cress and Nevins et al.,
66
1996. L expression des gènes E1A sensibilise les cellules infectées à la mort associée au
TNF- .
Le changement de rythme de la mitose de la cellule infectée permet l'accumulation

des acteurs de l apoptose parmi lesquels p et BAX Villunger et al., 2003. Afin d'enrailler
la lyse de la cellule infectée avant la multiplication des particules virales, l'adénovirus va
développer différentes stratégies menées par les protéines des régions E1B, E3 et E4
s attaquant aux différentes voies d'apoptose et aux mécanismes de l immunité.
Certaines protéines favorisent le métabolisme du virus. Ainsi, l'association des

protéines E1B-55K et E4-34K induit le transport des ARNm viraux dans le cytoplasme de la
cellule hôte Goodrum et al., 1999; Weigel et al., 2000. A l inverse, 243R coopère avec E1B-
19K et 55K pour inhiber la traduction des ARNm cellulaires en bloquant leur transport du
noyau jusqu au cytoplasme Babiss et al., 1985. Le fonctionnement des mécanismes de
l immunité sont perturbés par la protéine E -gp19K qui empêche les molécules du CMHI
d'être exprimées à la surface de la cellule Bennett et al., 1999. L expression des protéines
précoces relève d une régulation complexe qui implique les niveaux d expression des
protéines de types E1A et E4. Après avoir été toutes traduites et amenées à maturité au
niveau du cytoplasme de la cellule hôte, la plupart d entres elles sont adressées au niveau
du noyau de la cellule. En revanche, une partie des protéines de types E1B, E3 et E4 reste
dans le cytoplasme de la cellule.
Les protéines E3
L unité de transcription virale E code pour sept protéines qui sont, dans l ordre du
génome adénoviral, E3-12.5K Hawkins & Wold, 1992, E3-6.7K, E3-gp19K Persson et al.,
1980, E3-11.6K ou ADP (Adenovirus Death Protein, E3- . K ou R)D )nternalisation et
Dégradation Récepteur) Tollefson et al., 1990, E3- . K ou R)D Tollefson et al., 1990 b
et E3-14.7K Persson et al., 1978; Tollefson et al., 1988. En règle générale, les protéines E3
s attaquent aux mécanismes de défense cellulaire comme la présentation antigénique,
l apoptose, et la réponse inflammatoire. )l est intéressant de noter que certaines protéines
E3 sont des protéines transmembranaires, qui se localisent dans le RE, le Golgi, les
membranes plasmique et nucléaire Wold et al., 1994; Burgert & Blusch., 2000 . En ce sens
la région E est unique puisqu aucune autre unité de transcription adénovirale ne code
pour des protéines transmembranaires.
67
Le système immunitaire peut contrôler l infection virale par la reconnaissance et

l élimination des cellules infectées par les Lymphocytes T cytotoxiques CTLs . Les CTLs
reconnaissent les épitopes peptidiques viraux présentés par les molécules CMH de classe I
situées à la surface des cellules infectées. La reconnaissance du complexe antigène/CMHI
déclenche la libération de facteurs cytotoxiques tels que perforine et granzymes. Ces
derniers peuvent induire l apoptose cellulaire par les voies caspase dépendante et
indépendante Trapani et al., 2000. L apoptose des cellules infectées peut être aussi
déclenchée par l expression de facteurs proapoptotiques tels que Fas ligand, TNF (Tumor
necrosis Factor), TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand). Les protéines E3
contrôlent ces mécanismes de protection contre l infection virale.
E3-gp19K retient les molécules CMH de classe I dans le RE Burgert, 1996.

L explication du mécanisme se trouve dans la structure de la protéine qui comprend deux
composantes essentielles : - Un domaine d interaction avec les molécules CM(. – Un
domaine de localisation au RE au niveau du domaine transmembranaire et de l extrémité
cytoplasmique de la protéine).
Un complexe de deux protéines E , R)D , confère une résistance à la cytolyse

induite par le TNF . De surcroît ce complexe protéique inhibe l expression des récepteurs
apoptotiques EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), TRAIL (1 et 2) et Fas de la
surface des cellules infectées en induisant leur internalisation et leur dégradation dans les
lysosomes Mahr & Gooding , 1999; Burgert & Blusch et al., 2000 ; Tollefson et al.,1998.
C est de cette fonction que provient l origine du nom du complexe RID.
La protéine E3-14.7K est principalement connue pour protéger les cellules infectées
de la mort cellulaire induite par TNF- et pour son implication dans l inhibition de la
réponse inflammatoire. Nous allons nous attarder sur les différents mécanismes d action
d E -14.7K.
68
II-LA PROTEINE E3-14.7K
La protéine E3- . K fait l objet de plusieurs publications rapportant son activité

anti-cytotoxique liée au TNF , mais son mécanisme d action n est cependant toujours pas
complètement résolu. Cette protéine est exprimée par de nombreux sérotypes
adénoviraux et sa séquence est hautement conservée Horton et al., 1990. Contrairement
à d autres protéines E , E -14.7K ne contient pas de domaine transmembranaire et a une
double localisation nucléaire et cytoplasmique Gooding et al., 1990.
II.1 : Structure  Kim & Foster, 2002
Des études biophysiques réalisées sur la protéine E3-14.7K ont permis de résoudre
en partie l organisation et la structure de cette protéine (Figure 21). E3-14.7K adopte une
structure tertiaire composée d un enchainement de six feuillets encadrés de part et
d autre par deux hélices . Pour délimiter les différents domaines structuraux de la
protéine, E3- . K a été soumise à la protéolyse par la trypsine ou l -chymotrypsine.
L analyse des produits de digestion enzymatique révèle que les sites de protéolyse sont
rares, en effet les deux tiers en C-terminal d E -14.7K sont particulièrement résistants à la
protéolyse. De plus E3-14.7K a la capacité de lier le zinc et d autres ions divalents comme le
cobalt avec un rapport stœchiométrique : . En solution la protéine E3-14.7K pourrait
s assembler en une structure multimérique composée de neufs monomères.
La mutation ponctuelle des différents résidus cystéines en positions 44, 50 et 119

inhibe l activité anti-apoptotique d E3-14.7K Ranheim et al., 1993. D après Foster et Kim
ces mutations la protéine E3-14.7K empêcheraient la liaison au zinc, cruciale pour
l accomplissement de son action anti-apoptotique. Aucun résultat biologique n appuie
cette hypothèse jusqu à présent.
69
Structure
secondaire
Structure
secondaire
Figure 21 : Alignement des séquences protéiques des protéines E3-14.7K issues de différents
sérotypes d adénovirus humains. L alignement des séquences protéiques est réalisé avec le programme
CLUSTALW. La structure secondaire est prédite à l aide des serveurs Predict Protein et PS)PRED.  , sites
de clivage de la trypsine en condition native ;  , résidus cystéine (C) d E – . K du sérotype d adénovirus
qui, lorsqu il est muté en Sérine S inhibe le rôle anti-apoptotique de la protéine. Adapté de  Kim &
Foster, 2002.
II.2 : Activité biologique
Des rats infectés par voie intranasale avec un adénovirus mutant dont l expression
d E -14.7K est invalidée présentent une réponse inflammatoire pulmonaire moins sévère
comparativement à une infection un adénovirus sauvage Ginsberg et al., 1989. A l inverse
chez un modèle murin de pneumonie une augmentation des infiltrations alvéolaires est
observée en l absence d E -14.7K Sparer et al., 1996. L expression du gène d E -14.7K par
le virus de la vaccine VV a un effet antagoniste sur l activité anti-virale du TNF chez la
souris Tufariello et al., 1994. Ces études in vivo révèlent principalement le rôle protecteur
d E3-14.7K vis-à-vis de la mort cellulaire induite par TNF mais aussi une action ambig“e
sur la réponse inflammatoire.
70
Effet protecteur de la mort cellulaire induite par TNF (Figure 22A)
Indépendamment des autres protéines adénovirales, E3-14.7K protège les cellules

de l apoptose induite par le TNF . Cet effet anti-apoptotique n est pas la conséquence
d une perte d affinité du récepteur TNF (TNFR) pour son ligand, ou de sa délocalisation de
la membrane cellulaire Horton et al., 1991. L explication du processus vient du rôle
inhibiteur d E - . K sur l internalisation du récepteur TNFR après liaison du TNF par
E3-14.7K, perturbant de ce fait la suite de la cascade de signalisation induite par TNF
Schneider-Brachert et al., 2006.
Le TNF est une cytokine proinflammatoire qui a de nombreuses fonctions

biologiques qui se transmettent par l interaction avec deux récepteurs spécifiques à la
surface cellulaire : TNFR1 et TNFR2. Alors que TNFR1 est exprimé dans la plupart des
tissus, l expression de TNFR est limitée aux cellules du système immunitaire. En présence
de son ligand TNF le récepteur TNF se trimérise, les domaines de mort DD) des
monomères TNFR et de l adaptateur TRADD TNF-Receptor associated Death Domain)
s associent. L interaction avec TRADD permet l activation des caspases et l apoptose. Le
TNFR est aussi un activateur de la voie NF B via le recrutement indirect de R)P et TRAF
par TRADD. Le recrutement des protéines TRADD, FADD et de la procaspase 8 au niveau
du TNF-R1 forme le complexe DISC (Death Inducing Signaling Complex). Le DISC permet
l oligomérisation et l activation de la caspase déclencheuse de la cascade de caspases.
En inhibant l internalisation du récepteur TNFR , E -14.7K interdit le recrutement

des protéines du DISC Schneider-Brachert et al., 2006. Cependant le recrutement de RIP
et de TRAF impliqués dans l activation de NF B induite par le TNF n est pas affecté par
E3-14.7K
Implication dans la voie NF B (Figure 22B-C)
E3- . K est directement impliquée dans la voie NF B grâce à son interaction avec
FIP-3 (Fourteen.7k Interacting protein 3). Qui est plus connue sous les noms NEMO
NF B Essential Modulator , )KKγ et )KKAP )KK associated protein-1).
NF B désigne un groupe de facteurs de transcription dont la version la plus connue

est l hétérodimère p /p . NF B peut activer des facteurs anti-apoptotiques impliqués
dans la réponse liée au TNFR1 Tai et al., 2000. Brièvement, NF B est régulée par les
71
protéines ) Bs inhibitrices qui le retiennent dans le cytoplasme. En réponse à une

stimulation TNF , les ) Bs sont phosphorylées par un complexe ) B kinase auquel
participe FIP-3) conduisant à leur ubiquitination suivie de leur dégradation par le
protéasome. NF B ainsi libre migre dans le noyau et joue son rôle de facteur de
transcription Karin & Ben-Neriah, 2000.
Si FIP- est généralement considérée comme un élément activateur de NF B

Yamaoka et al., 1998. Son rôle est toutefois plus celui d un régulateur. Lorsque FIP-3 est
surexprimée par transfection transitoire, l activité transcriptionnelle de NF B est inhibée
Li et al., 1998. FIP- interagit et inhibe deux protéines essentielles pour l activation de
NF B : RIP et NIK. En outre, FIP-3 inhibe l activation de NF B par TNF dans les cellules
(EK lorsqu elle est cotransfectée avec le récepteur TNFR ou )KK .
En interagissant avec FIP-3, E3-14.7K bloquerait son interaction avec RIP et lèverait
par conséquent son action inhibitrice de NF B Wold et al., 1999. De plus en présence
d E -14.7K, FIP-3 qui est normalement localisé dans le noyau et le cytosol, se retrouve
piégé dans le cytoplasme.
Malgré ces différents éléments, il n est pas clairement admis qu E -14.7K active la
voie NF B. Klingseisen et al. indiquent qu E - . K n affecte pas l activation de NF B
Klingseisen et al, 2012, alors que Carmody et al. défendent qu E -14.7K inhibe la voie
NF B Carmody et al., 2006. De façon intéressante par la présence de sites B au sein du
promoteur adénoviral E , NF B peut induire la transcription des gènes E . En activant
cette voie, E3-14.7K activerait sa propre synthèse Deryckere et al., 1995.
L étude minutieuse de la bibliographie permet toutefois de conclure sereinement

qu E -14.7K agit sur la voie NF B pour protéger les cellules de l apoptose induite par le
TNF , soit en stimulant le rôle activateur de F)P-3 soit en bloquant son activité inhibitrice.
L activité de NF B ainsi stimulée permet d activer la traduction de gènes anti-apoptotiques
Ye et al, 2000.
E3-14.7K interagit aussi avec la protéine FIP-2 (Fourteen Interacting protein 2) qui
présente % d homologie avec F)P-3, et qui à ce titre elle est aussi appelée NRP (NEMO-
related protein) Schwamborn et al, 2000. FIP-2 est clairement impliquée dans l apoptose
et la signalisation de NF B. En effet la transcription de F)P-2 est activée en réponse au
72
TNF- et agit comme un inhibiteur de la voie NF B Li et al, 1998; Sudhakar et al, 2009.
De plus, lorsque FIP-2 est surexprimée, elle inhibe l effet anti-apoptotique d E -14.7K. Par
l intermédiaire d un domaine présent dans la partie C-terminal présent de FIP-2 et de FIP-
3, ces deux protéines sont capables de lier et d inhiber R)P et entreraient en compétition
dans le cadre de cette interaction Zhu et al, 2007. Le rôle respectif de FIP-2 et 3 dans
l implication d E - . K dans la voie NF B notamment concernant R)P est encore inconnu.
Effet protecteur de l apoptose induite par TRA)L (Figure 22D)
Les adénovirus codent pour trois protéines qui, séparément, sont capables d inhiber
l apoptose induite par TRA)L TNF-related apoptosis-inducing ligand . )l s agit de R)D ,
E1B-19K et E3-14.7K. Le mécanisme par lequel E3- . K inhibe l apoptose induite par TRA)L
est encore inconnu Tollefson et al, 2001.
Effet protecteur de l apoptose induite par Fas (Figure 22E)
Outre l effet lié au TNF , E - . K serait capable de bloquer l apoptose initiée par
la voie Fas. La voie Fas a un mécanisme de déclenchement de l apoptose plus simple que la
voie liée au TNF . En présence de son ligand FasL , le récepteur Fas se timérise, les
domaines de mort DD des monomères Fas et de l adaptateur FADD Fas Associated
Death Domain) entrent en interaction. La protéine FADD possède un domaine DED
Death Effector Domain qui lui permet de recruter des procaspases par l intermédiaire
de ses domaines DED homologues. L accumulation des procaspases au sein de ce
complexe suffit à leur activation en caspases 8 (aussi appelé FLICE pour FADD-Like
Interleukin-1beta-Converting Enzyme). En fonction des lignées cellulaires où la voie Fas
est initiée, les caspases 8 permettent soit : - Le déclenchement de la cascade des caspases
en clivant directement la procaspase-3 (lignées cellulaires appelées de type I). – Le clivage
de Bid qui peut alors causer la fuite du cytochrome c des mitochondries et activer
indirectement la cascade de caspases.
Par son interaction directe avec la caspase 8, E3- . K inhiberait l activation de la

cascade de caspase et ainsi serait capable d inhiber la voie d apoptose Fas Chen et al.,
1998. La séquence protéique d E .7K responsable de son interaction avec FLICE est
comprise entre les acides aminés 31 à 128  Kim & Foster, 2002. Il est important de noter
73
que la caspase en tant qu élément de la cascade de caspase est aussi partie prenante de la
voie d apoptose liée au TNF .
Acide arachidonique
E3- . K inhibe l activation de la phospholipase A PLA et empêche par

conséquent la synthèse d acide arachidonique. Son mécanisme d action est mal connu, il
est cependant différent du complexe R)D qui bloque directement la translocation de la
PLA2 du cytoplasme à la membrane cellulaire Dimitrov et al., 1997. Sachant que PLA2
peut être activée par le clivage de caspase, le rôle inhibiteur de la caspase d E -14.7K peut
expliquer en partie ce phénomène Wissing et al., 1997.
)nteraction avec le facteur inducteur d apoptose (Figure 22F)
Le facteur inducteur de l apoptose A)F ou F)P-4 (Fourteen Interacting protein 4)

est une molécule pro-apoptotique localisée dans l'espace intermembranaire
mitochondrial. Pour exercer son activité pro-apoptotique, AIF doit être libéré dans le
cytosol puis pénétrer dans le noyau. La voie d apoptose qui implique A)F est indépendante
des caspases, à lui seul AIF est capable de provoquer l'apoptose nucléaire. E3-14.7K
interagit avec FIP-4, le rôle de cette interaction dans l activité anti-apoptotique d E -14.7K
n est pas encore élucidée Li et al., 1996. )l est toutefois à noter qu au cours de l infection
adénovirale AIF ne se retrouve dans le noyau que très tardivement dans le cycle infectieux
Fessler & Horwitz, 2004.
74
Figure 22 : Activité anti-apoptotique d E -14.7K. (A) E3- . K bloque l internalisation du récepteur

TNF . (B) E3- . K active la voie NF B protectrice de l apoptose par son interaction avec F)P-3 (ou NEMO) et
(C) FIP-2. (D) E3- . K inhibe l apoptose induite par TRA)L par un mécanisme encore mal connu. (E) Par son
interaction directe avec la caspase 8, E3- . K inhibe l activation de la cascade de caspase et donc la voie
d apoptose Fas et TNFR. (F) E3-14.7K interagit avec FIP-4 (aussi appelé AIF), le rôle de cette interaction dans
l activité anti-apoptotique d E - . K n est pas encore élucidée.
II.3 : Les protéines FIPs
Comme nous venons de le voir, les partenaires protéiques intracellulaires d E -14.7K

sont appelés FIPs pour Fourteen.7K Interacting Proteins. Quatre protéines FIPs ont été
identifiées par la technique double hybride chez la levure (Figure 23). FIP-2, 3 et 4 ont
déjà été mentionnées dans ce chapitre lors de l évocation de l activité biologique d E -14.7K
(II.2 : Activité biologique). FIP- quant à elle occupe une place à part n étant pas clairement
liée à l apoptose.
75
Figure 23 : Les partenaires d interaction d E -14.7K. Quatre protéines appelées

FIPs (Fourteen-Interacting proteins). FIP-1 est impliquée dans la signalisation cellulaire
grâce à son implication dans le trafic intracellulaire de macromolécules. FIP-2 est
impliquée dans la voie de signalisation du TNF . F)P-3 est une protéine régulatrice de la
voie NF B. F)P-4 est une molécule pro-apoptotique localisée dans l'espace
intermembranaire mitochondrial.
FIP-2
FIP-2 est une protéine cytoplasmique de 67 kDa composée de deux domaines

« leucine zipper » et présenterait un domaine en doigt de zinc dans sa partie C-terminale.
La partie C-terminale de FIP-2 (acides aminés 395 à 577) interagit avec E3-14.7K Li et al.,
1998. FIP- est exprimée de façon ubiquitaire bien qu elle soit majoritairement
représentée dans la rétine, le cerveau, le cœur, le muscle squelettique, le placenta et le rein
Li et al., 1998; Rezaie et al., 2005; De Marco et al., 2006. FIP-2 est aussi connue sous les
noms NRP et Optineurine (OPTN) soulignant pour le premier son implication dans la voie
NF B et pour le second son rôle dans l apparition de glaucomes primaires à angle ouvert
(POAG : Primary Open Angle Glaucoma).
NRP (NEMO Related Protein) fait référence à la grande homologie constatée entre
FIP-2 et NEMO (FIP-3). Toutes deux entrent en compétition pour interagir et d inhiber R)P
76
Zhu et al, 2007(II.2 : Activité biologique). Malgré les % d homologie entre F)P-2 et
NEMO FIP- est incapable de se substituer à NEMO au sein du complexe ) B kinase
activateur de NF B.
Des mutations au sein du gène FIP-2, fortement exprimée au niveau de la rétine,

sont associées à l apparition de certains glaucomes Rezaie et al, 2002; Rao et al, 2011. FIP-2
est nommée dans ce cadre Optineurine (Optic neuropathy-inducing protein). La mutation
E50K du gène FIP-2 provoque la mort liée au TNF des cellules ganglionnaires de la rétine,
FIP- ne pouvant plus jouer son rôle inhibiteur de NF B Chalasani et al, 2007.
La surexpression de FIP- protège les cellules d une mort cellulaire induite par (2O2
en inhibant la libération du Cytochrome c par les mitochondries. La rétention du
Cytochrome c empêche de ce fait l activation de la caspase par l apoptosome et par
conséquent la cascade de caspases au cœur du déclenchement de l apoptose Rao et al,
2011.
FIP- interagit avec certains partenaires intracellulaires qui l implique dans le trafic
vésiculaire parmi lesquels Rab8, Huntingtine et Myosine VI Hattula & Peränen, 2000;
Sudhakar et al, 2009; Sahlender et al, 2005. Myosine VI est une protéine motrice qui se
déplace, contrairement aux autres protéines Myosine, en direction du pôle négatif des
filaments d actine Wells et al., 1999. Un motif RRL au niveau de la queue de Myosine VI
interagit avec la partie C-terminale de FIP-2, les deux protéines étant colocalisées au
niveau de l appareil de Golgi. La déplétion en F)P-2 grâce à des siRNA révèle son
implication dans l exocytose de vésicules golgiennes Sahlender et al, 2005.
FIP-3
Comme il a été précisé précédemment E3-14.7K est impliquée directement dans la

voie NF B grâce à son interaction avec F)P-3 Li et al., 1999. FIP-3 est plus connue sous les
noms NEMO et )KKγ soulignant son rôle dans la voie NF B. Le mécanisme par lequel
l interaction d E -14.7K et FIP- a un rôle protecteur de l apoptose liée au TNF est
développée dans le paragraphe II (II.2 : Activité biologique).
77
En 2000, la mutation du gène codant FIP- est désignée comme responsable d une
maladie rare l Incontinentia pigmenti ou syndrome de Bloch-Sulzberger Smahi et al.,
2000. Cette maladie provoque de grâves lésions cutanées et s accompagne d atteintes
ophtalmologiques anomalies vasculaires rétiniennes, décollement de rétine… dentaires
(anodontie partielle, dents coniques, alignement anormal) et neurologiques (retard
mental, convulsions . L absence de F)P- rend le complexe ) B kinase non fonctionnel
inhibant par conséquent l activité de NF B Smahi et al., 2000; Aradhya et al, 2002. Les
cellules mutées sont rendues vulnérables à l apoptose liée au TNF .
FIP-4
FIP- , appelée aussi facteur inducteur d apoptose A)F , est la première protéine
mitochondriale identifiée impliquée dans le déclenchement de la mort cellulaire
indépendante des caspases Susin et al., 1999. En dehors d un contexte apoptotique A)F
est encrée dans la membrane mitochondriale interne par l intermédiaire d un domaine N-
terminal transmembranaire. A)F est impliquée dans le métabolisme mitochondrial, c est
une flavine adenine dinucléotide oxidoréductase qui joue un rôle dans la phosphorylation
oxydative (OxPhos) Joza et al., 2009. Les cellules et souris déficientes en AIF montre une
sensibilité accrue au stress oxydatif suggérant un rôle anti-oxydant de FIP-4. De plus ces
souris mutantes présentent la particularité d être protégée du diabète et de l adipogénèse
suite à une alimentation hypercalorique Pospisilik et al. 2007.
II.4 : La protéine FIP-1
Une GTPase homologue de Ras
En 1995 Schürmann et al. sont les premiers à isoler FIP-1 au sein d une banque
d ADNc humains en utilisant des oligonucléotides dégénérés issus de séquences
hautement conservées présentes au sein des protéines GTPases. FIP-1 est alors
initialement nommé RagA ou RRAGA (Ras-related GTP-binding protein A) Schürmann et
al., 1995.
Les GTPases homologues de Ras, parmi lesquelles on retrouve FIP-1 (RagA),

constituent une superfamille incluant de nombreuses protéines impliquées dans la
signalisation. Ces protéines alternent entre un état actif associé au GTP et un état inactif
78
associé au GDP Boguski & McCormick, 1993. Outre Rag cinq autres sous-familles
appartiennent à la superfamille Ras : Ras, Rho, Rab, Ran, et ARF. Ces sous-familles ont en
commun six domaines conservés trois sont des sites de liaisons phosphate/magnésium
(PM1-PM , les trois autres sont impliqués dans l interaction au GTP/GDP G -G3)
Valencia et al., 1991.
Surexprimée au niveau de la glande surrénale puis du muscle squelettique FIP-1 est

toutefois présente dans la plupart des tissus humains. Parmi les tissus examinés les
poumons apparaissent comme les plus dépourvus en FIP-1 Li et al., 1997; Schürmann et
al., 1995.
Structure
La région N-terminale de FIP-1 présente des motifs hautement conservés dans la

superfamille Ras : - Les domaines de liaison phosphate/magnésium PM1, PM2 et PM3. – Le
domaine d interaction au GTP/GDP G . Le domaine G présent chez F)P-1 (127-HKMD) est
en partie différent des autres membres Ras (NKXD). Le domaine G3 qui est généralement
représenté par un motif TSA ou TCA n est pas identifiable chez F)P-1, deux séquences
putatives (156-ECAC et 162-TSI) semblent en être une alternative. Il est à noter que G3 est
le domaine le moins conservé entre les protéines Ras et n est qu indirectement impliqué
dans la liaison au GTP.
La région C-terminale de FIP- , qui n est pas impliquée dans la liaison au GTP/GDP,
est plus longue que les autres membres de la superfamille Ras présentant une séquence
supplémentaire de acides aminés. Cette région contient un enchaînement d acides
aminés hydrophobes (259-276) constituant potentiellement une structure hélicoïdale
d interaction avec la membrane Schürmann et al., 1995.
L ordre et la distance entre les différents domaines de liaisons au GTP de FIP-1 sont
identiques aux autres protéines homologues de Ras. La structure des 200 acides aminés de
FIP-1 en N-terminal impliqués dans la liaison au GTP est similaire à celle de Ras et ARF
Pai et al., 1990; Amor et al., 1994.
79
Interaction avec E3-14.7K
En 1997, Li et al. identifient FIP- comme le premier partenaire intracellulaire d E -

. K. Par la technique double hybride l interaction de F)P-1 de tailles variables issues de
cellules HeLa a été démontrée avec E3-14.7K. Cette interaction a été confirmée in vitro
entre GST-E3-14.7K produite en bactérie et FIP-1, leur localisation serait de plus identique
en cellule murine C3HA Li et al., 1997.
La délétion des 34 premiers résidus, comprenant un domaine de liaison au GTP, ou

les 43 acides aminés en C-terminal de FIP-1 abolie complètement son interaction avec E3-
14.7K Li et al., 1997. Concernant E3-14.7K, Foster & Kim ont identifié une version
tronquée d E -14.7K (31–128) qui serait toujours capable de lier FIP-1, cette même séquence
interagirait avec la caspase 8 (FLICE)  Kim & Foster, 2002.
Il est intéressant de noter que FIP- présente % d homologie avec RagB. Les
différences entre ces deux protéines consiste en sept substitutions d acides aminés et un
ajout de 33 acides aminés en N-terminal de RagB. En dépit de cette très forte homologie
RagB n est pas un partenaired E -14.7K
Interaction avec Dynéine Lukashok et al., 2000
La technique de double hybride a permis de révéler qur FIP-1 interagit

spécifiquement avec une protéine appelée GIP-1 (GTPase-interacting protein). Cette
interaction entre FIP-1 et GIP-1 est confirmée in vitro et in vivo sans que l ajout de TNF
soit nécessaire. Après analyse de la séquence par le programme BLAST les 113 acides
aminés de GIP- révèlent % d homologie avec la protéine TCTEL , chaîne légère du
complexe moteur dynéine Watanabe et al., 1996.
FIP- est capable d interagir simultanément avec TCTEL et E -14.7K servant ainsi
d intermédiaire entre la protéine précoce adénovirale et la chaine légère du complexe
moteur dynéine.
Dans la mesure où E3- . K n est pas une protéine structurale de la capside
adénovirale et n est pas exprimée au moment du transport nucléocytoplasmique des
particules virales, elle n est pas impliquée dans l interaction de la capside adénovirale avec
la dynéine Bremner et al., 2009.
80
PROJET
Comme nous l avons vu précédemment (Généralités-Partie I), de nombreuses
barrières s opposent au transfert de gènes par des méthodes non virales. Parmi elles, la
migration de l ADNp dans le cytosol apparaît comme un paramètre critique pour
l efficacité du transfert de gènes. En effet, une fois sorti des endosomes, la migration
d ADNp nu est nulle dans le cytosol des cellules eucaryotes.
Des stratégies consistent à s inspirer des virus pour optimiser le trafic intra-
cytosolique de l ADNp en direction du noyau. Au cours de l infection virale certains virus
réalisent un déplacement actif en exploitant le mouvement de la dynéine, protéine motrice
des microtubules. Pour la plupart, les virus font appel à un mécanisme bien connu pour
recruter la dynéine qui sont les séquences DLC-AS (Dynein Light Chain Associated
sequence) de LC8 (Chaîne Légère 8 de la dynéine). Ce motif de liaison à LC8 est donc
présent dans de nombreuses protéines virales (Généralités-Partie II). Cependant nous nous
sommes intéressés à la protéine E3- . K d Adénovirus Généralités-Partie III), car
certaines publications indique qu in vitro E3-14.7K interagirait avec la chaîne légère de la
dynéine TCTEL par l intermédiaire de la protéine cytosolique FIP-1 Lukashok et al.,
2000. Les différences qui opposent LC8 et TCTEL1 tendent à démontrer que des séquences
ciblant TCTEL seraient des candidats plus performants pour l interaction avec la dynéine
d ADNp thérapeutique. En effet, contrairement à LC8, les dimères de TCTEL1 peuvent
interagir avec les chaînes intermédiaires IC74 et les cargos par deux mécanismes différents
au sein du complexe dynéine ce qui n implique par conséquent aucune compétition Wu et
al., 2005. Sur cette base, mes travaux ont consisté à exploiter l interaction d E -14.7K avec
la dynéine (TCTEL1) pour améliorer le trafic nucléocytoplasmique d ADNp dans le cadre
du transfert de gènes par des vecteurs chimiques.
Dans une première partie de ce travail, je me suis concentrée sur l étude in cellulo
de la connexion entre E3-14.7K, FIP-1, TCTEL1 et les microtubules. Une fois établi les
interactions entre les différents partenaires, j ai ensuite identifié une séquence peptidique
de acides aminés responsable de l interaction directe d E -14.7K avec FIP-1, et
indirectement avec la dynéine. Dans une dernière partie, j ai greffé le peptide sur l ADNp
et ensuite étudié l influence de ce peptide sur le trafic de l ADNp au cours du processus de
transfection. Enfin j ai évalué son influence sur l efficacité de transfection.
81
Résultats
Partie I
Etude des interactions entre E3-
14.7K, FIP-1 et les microtubules in
cellulo et identification du peptide
P79-98 responsable de la fixation sur
la protéine FIP-1
82
Résultats – PARTIE I : Identification du peptide P79-98
Lukashok et al. ont mis en évidence l interaction entre la protéine d Adénovirus E -

14.7K, la protéine cytosolique FIP-1 et la chaîne légère de la dynéine TCTEL1 Lukashok et
al., 2000. Par des études in vitro de transcription traduction ils ont identifié FIP-1 comme
faisant le lien entre E3-14.7K et TCTEL1.
Dans un premier temps, j ai utilisé des techniques biochimiques, d imagerie

confocale, de pB-FRET FRET par photoblanchiment de l accepteur et de FL)M-FRET
(Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy - Förster Resonance Energy Transfer) pour
étudier les interactions in cellulo entre E3-14.7K FIP-1 et les microtubules. La technique de
BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) m a ensuite permis d identifier un
peptide d E -14.7K de 20 acides aminés (P79-98) responsable de son interaction directe
avec FIP-1 et j ai montré que le peptide P79- est capable d interagir avec les microtubules
in vitro et in cellulo.
FIP-1 est impliqué dans le contrôle du cycle cellulaire en participant à la formation

des asters induite par la protéine RCC1 au niveau des centrosomes. De façon intéressante,
je montre que lorsque P79-98 ou E3-14.7K sont surexprimés dans les cellules HeLa, le cycle
cellulaire est perturbé de façon similaire. Cet effet sur le cycle cellulaire de P79-98 est un
élément nouveau qui permet d isoler sa spécificité parmi les rôles multiples d E -14.7K. En
effet P79- ne montre aucun effet activateur de la voie NF B contrairement à la protéine
E3- . K totale. L activation de la voie NF B par E -14.7K est liée à son interaction directe
avec FIP-3 (NEMO). Le peptide P79- n interagirait pas avec F)P-3 et est donc spécifique
de l interaction avec F)P-1.
Les techniques de FLIM-FRET, pB-FRET, BRET sont toutes trois basées sur le
transfert d énergie et ont pour vocation d étudier les interactions protéine-protéine. Dans
la mesure où ces techniques sont relativement récentes, leurs principes et utilisation
seront détaillées dans une première partie. Dans une deuxième partie, les résultats obtenus
seront présentés sous la forme d un manuscrit rédigé en anglais qui est soumis à la
publication dans la revue J. Cell Science.
83
I-LES TECHNIQUES BASEES SUR LE TRANSFERT D’ENERGIE
I.1 : La technique de FLIM-FRET

I.1.1 : Le principe
Temps de vie de la fluorescence
Après une absorption de photons suite à une excitation lumineuse, une molécule
fluorescente se retrouve dans un état de haute énergie, généralement singulet S , aussi
appelé état excité. Par un phénomène de relaxation non-radiative, la molécule se stabilise
en un état excité S1 de moindre énergie. Pour les molécules fluorescentes, le retour à l état
fondamental (S1 à S0) se fait en restituant une partie de cette énergie sous forme de
photons émission lumineuse ou fluorescence. L excitation et l émission de la molécule
fluorescente se font à deux longueurs d onde diﬀérentes, l émission étant de plus basse
énergie par rapport à l excitation (Figure 24A). Chaque molécule fluorescente peut être
caractérisée par trois paramètres principaux :
- Sa section efficace d absorption. Ce paramètre évalue le "pouvoir absorbant" de la

molécule, plus sa section efficace est grande et plus un ﬂuorophore est susceptible d être
excité.
- Son rendement quantique. Ce paramètre reflète l efficacité de l émission de fluorescence

pour une molécule donnée. Il est défini par le rapport entre le nombre de photons de
fluorescence émis et le nombre de photons absorbés par la molécule. Les fluorochromes
ont des rendements quantiques Phi, φ compris entre , et .
- Son temps de vie. Ce paramètre correspond au temps moyen Tau, τ pendant lequel la
molécule reste dans son état excité avant de retourner à son état de bas niveau d énergie. )l
s agit donc du temps moyen que met la molécule pour émettre un photon. Les durées de
vie de fluorescence sont généralement très courtes de l ordre de quelques nanosecondes,
l excitation doit donc être une impulsion ultra-brève. A l échelle d une population de
molécules, l intensité de fluorescence émise décroît exponentiellement c est la
décroissance ou déclin de l intensité de fluorescence (Figure 24B). Le FLIM (Fluorescence
Lifetime Imaging Microscopy) mesure le temps de vie en l enregistrant le déclin de
l intensité de fluorescence. Les techniques de mesure des durées de vie de fluorescence
84
font appel à des détecteurs ultra-rapides et très sensibles ainsi qu à des sources laser
pulsées adaptées.
Figure 24 : Temps de vie de la fluorescence. (A) Diagramme de "Perrin-Jablonsky". La flèche (1) met
en évidence le processus d'absorption d énergie, la flèche celui de la relaxation non-radiative dans l'état
excité et la flèche (3) indique la fluorescence. (B) La durée de vie de fluorescence est le temps moyen
pendant lequel une molécule reste à l état excité. A l échelle d une population de n molécules la durée de vie
est τ = τ1 + τ2 + τ3+….+ τn /n et se traduit par une fonction exponentielle τ= /K avec K=constante cinétique
du processus de désexcitation radiatif (r) et non radiatif (nr) (K=Kn+Knr).
FRET et temps de vie d une molécule fluorescente
Le phénomène de FRET (Förster Resonance Energy Transfer) est un processus non

radiatif par lequel de l énergie d un fluorophore donneur à l état excité est transmise à un
autre fluorophore (accepteur) à proximité immédiate (1-10nm). Pour que le FRET ait lieu
un chevauchement entre le spectre d émission du donneur et le spectre d absorption de
l accepteur est indispensable. Au cours de notre étude, nous avons choisi comme donneur
d énergie la GFP Green fluorescent protein et deux différentes protéines fluorescentes
acceptrices ont étés utilisées DsRed2 et td-Tomato, toutes deux émettant dans le rouge.
Lorsqu il y a transfert d énergie entre le donneur et l accepteur, le FRET s ajoute aux

autres processus non radiatifs de désexcitation. La fonction de la courbe de déclin de
fluorescence s en trouve alors modifiée, le temps de vie moyen de fluorescence du donneur
est ainsi diminué (Figure 25). Cette propriété est exploitée dans la méthode FLIM-FRET.
85
Figure 25 : FRET et temps de vie d une molécule fluorescente.

Lorsqu il y a FRET l intensité de fluorescence du donneur ainsi que son
temps de vie moyen τ sont diminués. Le FRET s ajoute à la constante
cinétique du processus de désexcitation non radiatif (Knr).
FLIM-FRET
La technique de FLIM-FRET (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy - Förster

Resonance Energy Transfer permet de quantifier le transfert d énergie entre deux
partenaires suite à la mesure du temps de vie de la fluorescence du donneur. Une
diminution plus ou moins importante du temps de vie du donneur est révélatrice d une
plus ou moins grande proximité entre les deux partenaires fluorescents.
Comparativement aux techniques classiques de FRET la technique de FLIM-FRET

est moins dépendante des concentrations et intensités relatives des deux partenaires qui
peuvent être particulièrement variables d une cellule à une autre. De plus, elle est moins
dépendante du photoblanchiment et des recouvrements de spectres.
86
I.1.2 : Mesure du temps de vie d une molécule fluorescente
Les méthodes de mesure du temps de vie des molécules fluorescentes peuvent être
classées en deux groupes : les méthodes dans le domaine fréquentiel et le domaine
temporel. Parmi les méthodes dans le domaine temporel, le mode de comptage de photon
unique corrélé dans le temps (Time-Correlated Single Photon Counting, TCSPC), est
développé par la société Becker & Hickl (Becker & Hickel, Allemagne). Cette technique est
adaptable sur les microscopes confocaux de marque Zeiss comme Leica. C est cette
technique que nous avons employé au cours de notre étude.
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC)
Comme le suggère le nom de la technique, les mesures sont basées sur la détection
de photons de fluorescence uniques. Le principe TCSPC consiste en la mesure précise de la
durée séparant le moment de l excitation de la molécule fluorescente de l arrivée du
premier photon de fluorescence émis. Le départ de la mesure est défini par le moment de
l excitation par une brève impulsion laser détecté par une photodiode rapide. L arrivée du
premier photon de fluorescence est détectée par un photomultiplicateur rapide de photon
unique de type SPAD (Single Photon Avalanche Diodes) (Figure 26A). Le détail de
l appareillage que nous avons utilisé est indiqué Page 102-103.
A chaque impulsion laser un seul photon est détecté, la mesure de son temps
d arrivée et sa position en xy sont enregistrés. La durée entre l'impulsion laser et la
détection du photon est mesurée plusieurs millions de fois pour rendre compte de la
nature statistique de l'émission de fluorescence sur la totalité du champ d étude. Pour une
même position, les photons sont triés de façon à obtenir un histogramme de distribution
du nombre de photons en fonction du temps décrivant une courbe de déclin de
fluorescence (Figure 26B). En tout point du champ d analyse, et par conséquent de l image
acquise, la durée de vie moyenne de fluorescence est déterminée à partir de la courbe de
déclin de la fluorescence. Les durées de vie de fluorescence sont ensuite obtenues en
utilisant le logiciel SPC)mage Becker & (ickel grâce à l ajustement par un déclin mono-
exponentiel χr2= 1.0) des courbes de déclin de fluorescence déconvoluées de la fonction de
réponse instrumentale (IRF).
87
Figure 26 : Mesure de déclin de fluorescence par le mode de comptage de photon unique

corrélé dans le temps. (A Le train d impulsions du laser sert de signal de déclenchement d un
convertisseur temps-amplitude. Chaque impulsion émise par le photomultiplicateur suite à la détection
d un photon de fluorescence sert de signal d arrêt du convertisseur temps-amplitude. (B) Affichage de la
courbe de déclin de fluorescence points bleus ainsi que celle de la courbe d ajustement rouge et de la
réponse instrumentale (IRF-vert en une position xy de l image grâce au logiciel SPC)mage Becker &
(ickel . La qualité de l ajustement est déterminé par la valeur de χ réduit, plus il est proche de et plus
l ajustement est correct.
Préparation des analyses in cellulo
Dans le cadre de nos études, des cellules HeLa, ensemencées sur des lamelles de
verre, ont été cotransfectées avec deux plasmides : un plasmide de fusion à la GFP
(donneur) et un plasmide de fusion avec la DsRed2 ou td-Tomato (accepteur). Quarante-
huit heures après transfection, les cellules sont fixées au para-formaldéhyde et montées sur
lames. Elles sont ensuite conservées à -20°C avant la mesure du temps de vie de la GFP par
la technique TCSPC.
88
I.1.3 : Exemple de mesure FLIM-FRET
Les résultats d expériences de FLIM-FRET sont représentés classiquement comme

indiqué dans la figure 27. Dans cet exemple, les cellules HeLa coexpriment la protéine
cytosolique FIP- en fusion avec l eGFP donneur et la protéine E -14.7K en fusion avec la
td-Tomato (accepteur). Dans un premier temps, une acquisition de l émission du donneur
et de l accepteur est réalisée individuellement en épifluorescence Figure 27) pour vérifier
l expression d un seul ou des deux fluorophores dans les cellules analysées. On observe
ainsi par exemple qu à l instar des cinq autres cellules analysées, la cellule en haut à droite
de la figure exprime uniquement le donneur, en l occurrence F)P-1-eGFP.
L acquisition du déclin de la fluorescence est ensuite réalisée par la technique TCSPC, les
informations sont traitées par le logiciel SPCImage qui fournit les éléments représentés en
figure et . La figure représente l intensité de fluorescence au niveau des
cellules analysées. La figure représente l image du temps de vie de la fluorescence ; le
code couleur est le même que celui de l histogramme de distribution du temps de vie de la
fluorescence. Les cinq cellules en bas à gauche de l image coexpriment le donneur et
l accepteur, le temps de vie moyen du donneur étant mesuré à . ns (pic de gauche de
l histogramme . La cellule en haut à droite de l image exprime uniquement le donneur son
temps de vie moyen est mesuré à . ns pic de droite de l histogramme . Ce résultat permet
d affirmer la présence de FRET entre F)P-1-eGFP et E3-14.7K-dt-Tomato, et de conclure à
leur interaction au sein des cellules HeLa.
89
Figure 27 : Représentation des résultats de FLIM-FRET. Cellules HeLa cotransfectées avec des
plasmides permettant l expression de la protéine cytosolique F)P-1 en fusion avec l eGFP donneur et la
protéine d Adénovirus E -14.7K en fusion avec la td-Tomato (accepteur). (1) Une acquisition du donneur et
de l accepteur est réalisée individuellement en épifluorescence. 2 )mage de l intensité de fluorescence. 3)
Image et histogramme de distribution du temps de vie de la fluorescence, le code couleur est identique. Voir
texte pour plus de précision.
I.2 : La technique de FRET par photoblanchiment de l accepteur
La technique de FRET par photoblanchiment de l accepteur est appelée pB-FRET.

Lorsqu une molécule fluorescente est excitée par une quantité excessive d énergie, elle
perd ses capacités de fluorescence, c est le photoblanchiment pB . Le photoblanchiment
permet d éteindre sélectivement l émission d un fluorophore dans toute ou partie d une
cellule.
Dans une situation o‘ un transfert d énergie FRET intervient entre deux

fluorophores, l intensité du donneur est diminuée puisqu une partie des photons qu il
émet est transféré à l accepteur plutôt qu émis sous forme de fluorescence. A l inverse, en
absence de FRET, cette intensité sera plus forte. Dans la technique de pB-FRET l intensité
de la fluorescence du donneur est comparée avant et après extinction de l accepteur par
photoblanchiment.
90
I.3- La technique de BRET

I.3.1 : Le principe
Le BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) est une technique basée sur
le transfert d énergie non radiatif par résonnance dont le donneur d énergie est une
molécule bioluminescente le Coelentéramide. La molécule acceptrice d énergie est
typiquement une protéine fluorescente (YFP, GFP ou eGFP) Galés et al., 2005. L enzyme
Renilla luciférase effectue une dégradation oxydative de la Coelentérazine en
Coelentéramide générant ainsi de la lumière. Lorsque la luciférase est à proximité d une
protéine GFP ou YFP, l énergie de résonance de la bioluminescence émise par lE
Coelentéramide peut être transférée à la GFP qui fluoresce à une autre longueur d onde
(Figure 28) Xu et al., 1999.
Le transfert d énergie entre la luciférase à la GFP est dépendant de plusieurs

paramètres : - L orientation des deux protéines. - La distance qui sépare les deux
partenaires (<100 Å). - Le chevauchement des spectres d émission du Coelentéramide et
l excitation de l accepteur fluorescent Angers et al., 2001
Figure 28 : Principe du BRET. La protéine X est en fusion avec la Renilla luciférase (RLuc) et la
protéine Y est en fusion avec la GFP. (A Lorsque les protéines X et Y n entrent pas en interaction aucun
transfert d énergie n a lieu entre Rluc Coelentéramide et la GFP. Seul le signal de bioluminescence à
470nm est émit. (B) Un signal de BRET est mesuré lorsque les deux protéines X Yfusionnées interagissent
et réduisent la distance de leur fluorophores à moins de 100 Å.
91
I.3.2 : BRET et interaction protéine protéine
La technique de BRET est une méthode de choix pour étudier des interactions
protéine-protéine. Ces études d interaction peuvent être réalisées directement dans les
cellules vivantes, mais aussi à partir de lysats cellulaires ou de protéines recombinantes
purifiées Pfleger & Eidne, 2006. La figure 29 présente le protocole de BRET pour une
analyse in cellulo de l interaction de deux partenaires protéiques.
La première étape du BRET consiste en la construction de plasmides d expression

eucaryotes permettant l expression des deux partenaires protéiques en fusion avec RLuc et
eGFP. Ces plasmides sont ensuite transfectés simultanément dans la lignée cellulaire
d intérêt cellules (eLa dans le cadre de notre étude Figure 29 (1)). Quarante-huit
heures après transfection, les cellules sont ensemencées en microplaque (Figure 29 (2)) et
le substrat (Coelentérazine) de la Renilla luciférase est incubé directement en présence des
cellules vivantes (Figure 29 (3)). La lecture du signal BRET est obtenue grâce à un
spectrofluoromètre type Mithras LB 940 (Berthold Instruments, Oak Ridge, TN) capable
de détecter la luminescence du donneur et la fluorescence de l accepteur Figure 29 (4)).
Le signal BRET est un rapport obtenu en divisant l émission de l accepteur à nm par
l émission du donneur à nm.
Figure 29 : Illustration du protocole de BRET sur cellules vivantes utilisant

un luminomètre à microplaques. Voir texte pour plus de précision. Adapté de
Pfleger et al., 2006.
92
I.3.3 : Le BRET comme technique de criblage
Courbe de Saturation
Les mesures de BRET résultant d une interaction spécifique entre deux partenaires
sont représentées par une courbe de saturation. Pour ce faire, le signal de BRET est
représenté en fonction du rapport entre l émission de fluorescence de l accepteur eGFP et
l émission de bioluminescence du donneur d énergie Rluc .
S il y a interaction spécifique entre les deux partenaires, le signal de BRET
augmente pour une même concentration de donneur, en fonction de la concentration de
l accepteur d énergie jusqu à atteindre un plateau Hamdan et al., 2006 ; Mercier et al.,
2002. L atteinte du plateau traduit la spécificité de l interaction entre les deux partenaires,
en effet en excès de donneur par rapport à l accepteur, le signal de BRET reste constant. La
valeur maximale de BRET obtenue est appelée BRETmax. Dans la situation d une interaction
non spécifique le signal de BRET n est pas saturable et augmente linéairement Figure 30).
Ce signal non spécifique peut aussi être désigné comme «bystander BRET» Mercier et al.,
2002.
Figure 30 : Courbe de saturation de BRET. Lorsqu il y

a interaction spécifique entre les deux partenaires de BRET, le
signal de BRET est représenté par une courbe saturation.
L atteinte du plateau traduit l interaction spécifique entre les
deux partenaires.
93
Compétition
Dans le cadre de notre étude nous avons utilisé la technique de BRET pour cribler
cinq peptides chevauchants d E - . K susceptibles d entrer en compétition dans
l interaction entre E3-14.7K et FIP-1.. Une courbe de saturation de BRET est réalisée en
présence de lysat cellulaire de HeLa exprimant transitoirement E3-14.7K en fusion avec
RLuc et la protéine recombinante FIP- en fusion avec l eGFP. La compétition se traduit
par une diminution ou une perte du transfert d énergie spécifique entre les deux
partenaires Pfleger & Eidne, 2006.
II- RESULTATS : Interaction of adenoviral E3-14.7K with microtubules network:

identification of P79-98 peptide derived from E3-14.7K which interacts with FIP-1
and mediates cell cycle arrest.
94
Interaction of adenoviral E3-14.7K with dynein motors and microtubules
network: identification of P79-98 peptide derived from E3-14.7K which interacts
with FIP-1 and mediates the cell cycle arrest.
Lucie Pigeon1, Cristine Gonçalves1, Gilles Breuzard1, Etienne Henry2, Eric Deprez2,
Patrick Tauc2, Jean-Pierre Gomez1, Séverine Morisset-Lopez1, Patrick Midoux1 and
Chantal Pichon1*.
1
Centre de Biophysique Moléculaire, CNRS UPR4301, Inserm and University of Orléans,
Orléans, 45071, cedex 02, France.

2
Laboratoire de Biologie et Pharmacologie Appliquée, CNRS, Ecole Normale Supérieure
Cachan, Institut d'Alembert, 94235, France.
*Corresponding author: Chantal.pichon@cnrs-orleans.fr
Key Words: adenovirus; Early region 3, dynein; TCTEL1; FRET; BRET; FLIM
Running title: E3-14.7K/FIP-1 interactions.
95
Summary
In this study, we have investigated the connection between E3-14.7K, FIP-1 and the
microtubules network in order to improve knowledge on the role of their interactions
in cellulo. E3-14.7K of human adenoviruses is expressed during the early phase of the
infection to inhibit apoptosis of host cells. E3-14.7K is a multifunctional protein that
interacts with four FIPs proteins (FIP-1, -2, -3, -4) involved in various apoptosis
pathways. Compared to other FIPs proteins, the role of the E3-14.7K/FIP-1 interaction
is not clearly understood. Previous in vitro study showed that FIP-1 was able to bind to
TCTEL1, one of the dynein light chain. Here, in cellulo interaction studies based on
colocalization experiments by confocal microscopy, FRET, FLIM and BRET techniques
as well as biochemical analyses were conducted to more deeply delineate the
connection between E3-14.7K, FIP-1 and TCTEL1. A 20 amino acids motif named P79-
98 (amino-acid residues from 79 to 98 of E3-14.7K), was identified as responsible for
the E3-14.7K/FIP-1interaction. We also showed that P79-98-tagged Qdots were able to
bind to isolated microtubules in vitro and colocalized with the microtubules network
inside HeLa cells. Moreover, overexpression of E3-14.7K or P79-98-luciferase chimeric
protein promoted the arrest of the cell cycle with an accumulation of HeLa cells in the
S phase. Noteworthy, the expression of P79-98 chimeric protein did not interfere on
NF B activation showing P -98 specificity. Altogether, our results highlight the
crucial roles of P79-98 motif both in the E3-14.7K/FIP-1 interaction inside the
microtubules network and in the cell cycle. Moreover, P79-98 could be a new
microtubule targeting signal opening its use for targeting cargo via microtubules and
blocking the cell cycle.
96
Introduction
During their early phase of infection, adenoviruses express several proteins which are
necessary to downregulate the immune response of their host cells (Burgert et al.,
2002; Wold et al., 1999). The early region 3 (E3) of group C human adenoviruses
encodes seven immunoregulatory proteins including three proteins that inhibit the
cytolytic effects of tumor necrosis factor alpha (TNF- (Lichtenstein et al., 2004; Wold
et al., 1995). One of them is a 14.7-kDa protein (E3-14.7K) that protects cells,
independently of the other adenoviral proteins, against TNF- (Gooding et al., 1988;
Gooding et al., 1990; Horton et al., 1991; Krajcsi et al., 1996), Fas ligand (Chen et al.,
1998) and TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)-induced apoptosis
(Tollefson et al., 2001).
E3-14.7K has been found to be located both in the nuclear and in the cytoplasm, each
localization related to its action on cellular pathways through four cellular proteins
interaction (Gooding et al., 1990). These interacting proteins have been identified by
the yeast two-hybrid techniques and were designated as FIPs (Fourteen. seven K-
interacting proteins). FIP-1 is a small GTPase previously known also as RagA or RRag
for Ras-related GTP-binding protein A. This protein is a functional human homologue
of Saccharomyces cervisiae Gtr1p (Nakashima et al., 1996). FIP-1 interacts with RagC
and RagD (Sekiguchi et al., 2001), and also with NOP132 nucleolar protein (Sekiguchi et
al., 2004). FIP-2, also known as NF B Essential Modulator (NEMO) Related Protein
(NRP) (Schwamborn et al., 2000) or Optineurin (Klingseisen et al., 2012), is involved in
the TNF- signaling pathway. As a crucial subunit of the IKK complex, FIP-3 (NEMO
or )KKγ is a key regulator of NF B pathway (Li et al., 1999; Yamaoka et al., 1998). FIP-4
or AIF (Apoptosis-Inducing Factor) is a mitochondrial protein which translocates into
97
the nucleus in response to apoptotic stimuli and the significance of its interaction with
E3-14.7K is still unknown (Li and Horwitz, 1996).
By contrast to the above cited partners of E3-14.7K, FIP-1 was not described to be
directly involved in any apoptosis pathway yet (Li et al., 1997). FIP-1 was found
associated with cell cycle control by affecting aster formation induced by chromosome-
binding protein RCC1 (Regulator of chromosome condensation 1) at centrosomes and
by controlling microtubule assembly originating from this structure during mitosis
(Pennisi, 1999; Wilde and Zheng, 1999). As E3-14.7K, FIP-1 is localized both in the
cytoplasm and in the nucleus. It shuttles between the cytoplasm and the nucleus
depending on its nucleotide state. FIP-1 association with the Ran/Gsp1 GTPase pathway
makes it responsible for the nucleus-cytoplasm trafficking of macromolecules (Hirose
et al., 1998). Moreover, FIP-1 is known to interact with the light chain TCTEL1 of
dynein motor complex (Lukashok et al., 2000). By their interaction with TCTEL1, some
macromolecules are towed along microtubules towards the cell nucleus (Mueller et al.,
2002; Tai et al., 1999). In a previous study, in vitro binding assay has shown that FIP-1 is
the bridging protein allowing E3-14.7K to form a complex with TCTEL1 (Lukashok et
al., 2000). The formation of the complex was independent on the addition of TNF-
(Lukashok et al., 2000). The peptide sequence of E3-14.7K that is responsible for its
binding to FIP-1 has been indentified and it corresponds to the 31–128 amino acids
sequence (Kim and Foster, 2002).
In mammalian cells, the interactions between E3-14.7K, FIP-1 and TCTEL-1 have not
been extensively studied. Li et al., have reported that E3-14.7K and FIP-1 were
colocalized in perinuclear area of C3HA murine cells (Li et al., 1998). Lukashok et al.,
have observed interaction between FIP-1 and TCTEL1 by coimmunoprecipitation and
98
immunolabelling experiments in human embryonic kidney HEK 293T cells and in
human lung carcinoma A549 cells, respectively (Lukashok et al., 2000). In this work,
we ought to determine in more details intracellular interactions between E3-14.7K, FIP-
1 and TCTEL1. For this purpose, we first analyzed the interaction between E3-14.7K,
FIP-1 in HeLa cells using colocalization experiments, Fluorescence Resonance Energy
transfer (FRET)/ Fluorescence Lifetime Microscopy (FLIM) or Bioluminescence
Resonance Energy transfer (BRET) techniques as well as biochemical approaches. Our
data demonstrate that E3-14.7K interacts with microtubules network via FIP-1 thanks
to a 20 amino acids motif located in the fifth strand of E -14.7K. This peptide named
as P79-98, was able to bind to microtubules either isolated or in HeLa cells context.
We also found that the arrest of cell cycle was induced when cells overexpress E3-14.7K
or chimeric protein bearing the P79- sequence. Noteworthy, no impact on NF B
activation was observed showing the existence of P79-98 specificity toward FIP-1
amongst other FIPs molecules. Altogether, our results highlight the role of the P79-98
motif both in E3-14.7K/FIP-1 interaction inside the microtubules network and in the
cell cycle disruption.
Results
E3-14.7K is interacting with FIP-1 and TCTEL1 to form a microtubule interacting
complex.
Our first goal was to validate our plasmid vectors encoding either FIP-1 or E3-14.7K
fused with eGFP and to assess their distribution in HeLa cells. Since FIP-1/RagA has
been found to interact with GIP1 (GTPase interacting protein-1)/TCTEL1, the light
chain of dynein motor (Li et al., 1998), we compared the distribution of E3-14.7K and
99
FIP- to that of -tubulin-eGFP. Fig. 1 shows that these 3 proteins have a fibrillar-like
network distribution similar to that of microtubules, clearly different to the diffuse
distribution of eGFP (Fig. 1D).
Next, the colocalization of FIP-1, E3-14.7K and microtubules was assessed in HeLa cells
co-transfected with plasmids encoding for FIP-1 fused with eGFP and for E3-14.7K fused
with td-Tomato. To facilitate the intracellular localization of these fluorescent
proteins, cells were treated first with DSP to cross-link proteins that are in close
interaction. Then, they were gently permeabilized with digitonin in order to wash out
soluble proteins that are not interacted with any partners in the cytoplasm. In a
representative image shown in Fig. 2A, FIP-1 was found as green spots close to
immunostained microtubules (red). Interestingly, the distribution of these green spots
is organized as a fibrillar network. In Fig. 2B, punctuate fluorescent staining of FIP-1-
eGFP and E3-14.7K-Tomato was observed in the center of the cell. Moreover, FIP-1-
eGFP spots were aligned as above and some of them were colocalized with E3-14.7K-
Tomato in the perinuclear area as indicated by the yellow foci. Of note, the position of
eGFP tag, at N- or C-terminus of FIP-1, had no influence on their subcellular
localization (data not shown). These observations are in line with those reported by Li
et al., in C3HA murine cells (Li et al., 1997).
To assess whether FIP-1 and E3-14.7K proteins are in close interaction in cellulo, we
performed FRET experiments in cell context, either by measuring the steady state
fluorescence intensity (pB-FRET methodology) or the fluorescence lifetime of the
donor. First, pB-FRET experiments were conducted on HeLa cells that co-expressed
FIP-1-eGFP as a fluorescent donor and E3-14.7K-Tomato as a fluorescent acceptor.
When the excited donor transfers its energy to the acceptor, FRET accounts for a
100
decrease of the fluorescence emission of the donor and a concomitant increase of the
emission of the acceptor (Lakowicz et al., 2006). FRET cannot occur anymore when the
acceptor is photobleached. As a consequence, an increase of the fluorescence emitted
by the excited donor should be observed after photobleaching when FRET initially
occurs between the donor and the acceptor. In contrast, in the absence of any
interaction, the fluorescence emission of the donor is not influenced by the
photobleaching of the acceptor. In our experiments, when E3-14.7K-Tomato was
photobleached before the excitation of FIP-1-eGFP, the fluorescence emission of FIP-1-
eGFP was clearly increased in bleached regions of interest (Fig. 2C), demonstrating
that FIP-1 and E3-14.7K are in close proximity compatible with an energy transfer
between eGFP and td-Tomato. Note that FIP-1 was also localized in the nucleus as
observed previously in HEK 293 cells (Li et al., 1997).
FIP-1 is also known to be responsible for nucleocytoplasmic trafficking (Hirose et al.,
1998) of several macromolecules and this is mediated through an interacting partner
which is TCTEL1, one of dynein light chain (Lukashok et al., 2000). Even though FIP-1
and TCTEL1 interaction has been evidenced by in vitro assay using reticulocyte lysate
system with T7 expressing vectors, this interaction has not yet been demonstrated in
cellulo. For this purpose, a triple colocalization experiments were performed on cells
that co expressed FIP-1-eGFP (green) and E3-14.7K-mCherry (red) and the
microtubules were immunostained and revealed with a Cy5-tagged secondary antibody
(blue). As shown in Fig. 2D, FIP-1-eGFP were found close to microtubules (blue). This
is in accordance with the role of TCTEL1/GIP-1, the light chain of dynein, as a bridging
protein between FIP-1 and the microtubule filament (Lukashok et al., 2000). FIP-1-
101
eGFP and E3-14.7K-mCherry were clearly colocalized (see enlarged area) and aligned
along microtubules, confirming the results shown in Fig. 2C.
Second, we performed FLIM-FRET (Fluorescence Lifetime Microscopy) experiments
which are particularly well suitable to readout a FRET interaction in the cell context. In
contrast to the emission intensity, the fluorescence lifetime of the donor which
corresponds to an intensive parameter is independent of the fluorophore
concentration. This approach allows the measurement of the fluorescence lifetime of
the donor which corresponds to the mean time spent by the donor in the excited state
(Wallrabe and Periasamy, 2005). The donor lifetime value is expected to decrease when
FRET occurs. Moreover, as stated above, the ability to measure fluorescence lifetimes
of fluorescent proteins in the cell context is less dependent of their relative
concentrations and intensities, photobleaching as well as spectral bleed through (Alcor
et al., 2009; Chen et al., 2003). FLIM-FRET was then used to confirm the interaction
between FIP-1, E3- . K, TCTEL and -tubulin. In our experiments, the fluorophore
donor was eGFP and two different protein acceptors were used: td-Tomato or DsRed2.
We first measured the fluorescence lifetime of eGFP in cells that coexpress either eGFP
and td-Tomato or eGFP and DsRed2. In these cells, the lifetime values of eGFP
fluorescence were comprised between 2.1 and 2.2 ns (± 0.04) a value corresponding to
that of free eGFP 2.2 ns (Fig. 3A-B) in accordance with reported values (Llères et al.,
2009). This lifetime decreased to ≈ . ns ± . in cells coexpressing F)P-1-eGFP and
E3-14.7K-Tomato (Fig. 3C) indicating that FRET occurs between these 2 proteins and
confirming pB-FRET results (Fig. 2C). Note that the remaining subpopulation of donor
characterized by a lifetime value of 2.2 ns corresponds to the donor lifetime when no
FRET occurs accounting for cells characterized by a defect in the expression of the
102
chimeric acceptor protein. A significant reduction of eGFP lifetime ≈ . ns ± . was
also observed in cells co expressing eGFP- -tubulin and E3-14.7K-Tomato (Fig. 3D),
indicating the interaction between these 2 molecules albeit in a less efficient manner
than observed for FIP-1-eGFP and E3-14.7K-Tomato. Accordingly, in cells coexpressing
E3-14.7K-eGFP/TCTEL1-DsRed2, the lifetime of eGFP was about 1.7 ns (± 0.04) (Fig. 3E).
These data indicate for the first time interaction of E3-14.7K between both dynein light
chain TCTEL1 and microtubules in cellulo. The FLIM-FRET data allows us to propose
the interaction pattern of E3-14.7K shown in Fig. 4A.
Determination of a E3-14.7K derived peptide responsible for its interaction with
FIP-1.
Next, we determined the peptide sequence of E3-14.7K that is responsible for its
interaction with FIP-1 and consequently with the other partners. Kim and Forster have
previously determined by protein-binding experiments that the determinants of E3-
14.7K for recognition of FIP-1 are retained within residues 31–128 of its C-terminal
fragment (Kim and Foster, 2002). Therefore, we selected overlapping peptides of 20
amino lengths covering this 97 amino acid sequence of the C-terminal fragment (Fig.
4B). To screen the interaction of these peptides with FIP-1, we performed
bioluminescence resonance energy transfer (BRET) which is a sensitive tool for
monitoring macromolecular interactions (Pfleger et al., 2006) and particularly well-
adapted for screening studies. E3-14.7K fused with Renilla (E3-14.7K-Rluc) luciferase
was used with FIP-1-eGFP. Cytosolic extract of cells expressing E3-14.7K–Rluc was
incubated with recombinant FIP-1-eGFP produced in E. Coli. Of note, we have first
checked by immunoprecipitation experiments that recombinant E3-14.7K was able to
103
recognize either FIP-1-eGFP produced in E. Coli (Supplementary Fig. 1, lane E) or
expressed in HeLa cells (Supplementary Fig. 1 lane B, C).
In BRET experiments shown in Fig. 4C, a constant amount of cytosolic extract from
cells expressing E3-14.7K–Rluc was incubated with increasing amounts of recombinant
FIP-1-eGFP. The observed saturation curve evidences the energy transfer between
these 2 molecules. This indicates that a specific interaction occurred between FIP-1 and
E3-14.7K. To determine the peptide derived from E3-14.7K that can counteract this
interaction, we performed similar BRET experiments in the presence of 10 µM of either
peptides (P38-57, P50-69, P65-84, P79-98, and P106-125). Amongst the 5 selected
peptides, only P79-98 induced a significant decrease of BRET ratio suggesting a
competition between this peptide and E3-14.7K/FIP-1 interaction. In presence of 200
µM of P79-98, the interaction between E3-14.7K-Rluc and FIP-1-eGFP was fully
abolished. By contrast, no competition was observed with other peptides.
Interaction of P79-98 with microtubules.
To get deeper insight into the role of the P79-98 in the E3-14.7K/FIP-1 interaction, we
determined whether P79-98 peptide was sufficient to mediate the binding to
microtubules.
This peptide was then biotinylated (P79-98-bio) and labeled with Qdot 545
streptavidin (P79-98-Qdot) (Fig. 5A). The interaction was first assessed in vitro on
isolated polymerized X-rhodamine microtubules. Binding assay was done by
incubating P79-98-Qdot with isolated microtubules in cytosolic extract of HeLa cells
supplemented with ATP. Fluorescence microscopy observations show that P79-98-
Qdot bind to microtubules (Fig. 5C, D) whilst the control corresponding to Qdot
without the peptide does not (Fig. 5B). This interaction was also evidenced following
104
microinjection of P79-98-Qdot in HeLa cells expressing mRFP-tubulin (Supplementary
Fig. 2).
Next, we assessed this interaction could also occur endogenously. Plasmids encoding
either P79-98-Tomato or a control peptide P37-58-Tomato were constructed and used
to transfect HeLa cells stably expressing eGFP- -tubulin. Confocal microscopy analyses
of these cells evidenced that P79-98-Tomato was colocalized with eGFP- -tubulin (Fig.
6A) in contrast to P37-58-Tomato (Fig. 6B), confirming the propensity of P79-98 to
interact with microtubules and suggesting the ability of P79-98 to act as a microtubule
targeting signal.
Biological activity of P79-98.
FIP-1 has been described to participate in cell cycle control by affecting aster formation
induced by chromosome-binding protein RCC1 at centrosomes (Pennisi, 1999; Wilde
and Zheng, 1999). It controls the microtubule assembly originating from this structure
during mitosis. Knowing that E3-14.7K is strongly interacting with FIP-1 and that it is
also associated with microtubules, we have tested the influence of E3-14.7K via P79-98
on the control of cell cycle by FIP-1. HeLa cells were transfected with plasmids
encoding E3-14.7K-Rluc, P79-98-Rluc or RLuc. Two days post-transfection, the cell
cycle of these transfected cells was analyzed by flow cytometry. Remarkably, the cell
cycle of HeLa cells overexpressing E3-14.7K or P79-98 was different to that of control
cells (Fig. 7A). Indeed, cell cycle of these transfected cells show that no cell population
was found in G2/M phase (0% versus 13.70%) in favor to an increase of cell percentage
in S phase (43.43% versus 31.78%). Note that the cell cycle of cells expressing RLuc was
similar to non transfected cells (data not shown). Altogether, these observations might
105
suggest that the cell cycle blockade observed could be due to the binding of E3-14.7K to
FIP-1 via P79-98 sequence, blocking FIP-1 involvement in the cell division.
Since E3-14.7K is also known to be involved in NF B pathway mainly due to its
interaction with FIP- NEMO, )KKγ , we investigated the impact of P79-98 on NF B
pathway in cells stably expressing firefly luciferase gene under NF- B promoter. These
cells were transfected with plasmids expressing RLuc, P37-58-Rluc, P79-98-Rluc or E3-
14.7K-Rluc. One day post-transfection, NF B pathway was activated by TNF-
treatment. Then, firefly luciferase activity was measured to monitor NF B activation
and subsequently that of Renilla luciferase activity as readout of transfection efficiency.
As shown in Fig. 7B, whatever the Rluc-proteins expressed, TNF- treatment enhanced
the firefly luciferase activity. This enhancement was 10-fold higher when E3-14.7K-Rluc
was expressed compared to that obtained with P37-58-Rluc and P79-98-Rluc
expressions which display similar enhancement level than Rluc expression. Therefore,
the region of E3-14.7K that is involved in FIP-3 interaction is not present on P37-58 and
P79-98 peptides.
Discussion
The type 2 adenovirus E3-14.7-kDa protein is one of seven gene products expressed by
early region 3 (E3) of group C human adenoviruses (Ad). E3-14.7K has been reported to
play a central role in regulating host cell response during adenovirus infection via FIPs
interactions. This protein is expressed during the early phase of the infection and its
primary role is to inhibit apoptosis of host cells in response to TNF- activation. E3-
14.7K binds with four FIPs proteins that interact with different partners involved in
various apoptosis pathways (Horwitz, 2001; Horwitz, 2004).
106
The present study aims to understand intracellular interactions between FIP-1, E3-
14.7K and microtubules network which are still ill-known. FIP-1 named also as Rag A is
a member of Ras GTPase family acting as a biological switch (Boguski and McCormick,
1993). It shuttles between the nucleus and the cytoplasm and its subcellular
localization is changed depending on the nucleotide-bound forms, either GDP-or GTP-
bound forms. FIP-1 has been found to bind to the light chain of cytoplasmic dynein
TCTEL1/Tctex-1 and several intracellular proteins (Lukashok et al., 2000). Cytoplasmic
dynein is a protein motor complex that uses ATP hydrolysis to transport cargoes
toward the minus end of microtubules. Data reported so far concerning E3-14.7K and
FIP-1 interactions have been obtained mainly from in vitro studies.
Here, we show for the first time, direct intracellular interactions between E3-14.7K and
FIP-1 and microtubules via TCTEL1 (Fig. 3). Data from FLIM-FRET experiments clearly
demonstrate a direct interaction between E3-14.7K and FIP-1. Based on the FRET
lifetime values, it is highly suggested that E3-14.7K and FIP-1 are in closer proximity
compared to E3-14.7K/tubulin reinforcing the idea that FIP-1 could be the bridging
molecule between microtubules and E3-14.7K. The role of the functional interaction of
E3-14.7K with microtubules is unknown but it is unlikely related to the migration of
adenoviral particles on the microtubules. Indeed, adenovirus exploits dynein via
interaction with viral hexon to cross the cytoplasm during early phase of infection
(Bremner et al., 2009). Since E3-14.7K is not produced at this time of infection, the role
of its interaction with FIP-1 and TCTEL1 has to be deciphered. Note that microtubules
and dynein motors are implicated in the vesicular trafficking particularly in vesicles
migration along the endocytosis process (Horgan and McCaffrey, 2011). E3-14.7K has
been reported to inhibit TNF- induced apoptosis upon inhibition of the
107
internalization of TNF receptor 1 (TNFR1) via vesicle formation from the cell surface.
TNF- mediated apoptosis is initiated by the recruitment of TNF receptor-associated
death domain (TRADD), Fas-associated death domain (FADD), and caspase-8 to the
death domain of TNFR1 which results in the death-inducing signalling complex (DISC)
formation. DISC is established within minutes after TNFR1 internalization via clathrin
coated vesicles ending up to so called TNF receptosomes which are death signalling
vesicles (Schneider-Brachert et al., 2006). The formation and/or trafficking of these
TNF receptosomes could involve microtubules-mediated transport. Inhibition of
TNFR1 endocytosis prevents TNF- induced D)SC formation and E -14.7K affected the
assembly of endocytic machinery including Rab5 and dynamin 2 at the site of activated
TNFR1 (Schneider-Brachert et al., 2006). Noteworthy that FIP-1 (Rag A) is a member of
Ras GTPase family. As other small GTPases (Rab GTPases), FIP-1 could mediate the
transport of these vesicles along microtubules by recruiting adapters/motors or
molecular binding directly to molecular motors. One hypothesis would imply that the
binding of E3-14.7K to FIP-1 could compete with the binding of FIP-1 to those vesicles
inhibiting their transport along microtubules and the trafficking of TNF receptosomes.
Furthermore, the fusion of TNF receptosomes with trans-Golgi vesicles is required to
activate acid sphingomyelinase and cathepsin D. This trafficking is mediated by
microtubules which could also be altered by interaction of FIP-1 with E3-14,7K.
As said above, E3-14.7K is also found to interact with FIP-2, blocking TNF- induced
cytolysis. FIP-2 is known to be involved in the retrograde and anterograde vesicular
trafficking (Ying and Yue, 2012). Recently, E3-14.7K has been clearly shown to inhibit
TNF- cytolysis via its recruitment to TNFR . (owever, this effect is independent to
the presence of FIP-2. Indeed, siRNA knockdown of FIP-2 did not alter the protective
108
effect of E3-14.7K infection (Klingseisen et al., 2012). Interestingly, in knocked down
FIP-2 cells, E3-14.7K and TNFR1 were still co-immunoprecipitated suggesting that E3-
14.7K interacts with TNFR1.
In another hand, the interaction of E3-14.7K with FIP-3 is related to its action on the
NF B pathway independently of TNF- receptor internalization (Schneider-Brachert et
al., 2006).
Here, using BRET methodology, we have identified among several peptides derived
from E3-14.7K, the peptide P79- containing residues from to located in
structures of E3-14.7K that is responsible of E3-14.7K/FIP-1 interaction (Figs 4, 5, 6).
This is in line with previous data indicating that the determinants of E3-14.7K for
recognition of FIP-1 are retained within residues 31–128 of its C-terminal fragment (Kim
and Foster, 2002).
It has been reported that FIP-1 seems to be involved in the Ran/Gsp 1 GTPase pathway.
Moreover, Ran-GTP has also recently been associated with cell cycle control by
affecting aster formation induced by chromosome-binding protein RCC1 at
centrosomes and controlling microtubule assembly originating from this structure
during mitosis. We observed that overexpression of E3-14.7K induced arrest of cell
cycle in S phase (Fig. 7A). Similar effect was obtained with P79-98 peptide responsible
for the interaction between E3-14.7K and FIP-1 meaning that E3-14.7K blockade of the
cell cycle occurred upon FIP-1 recognition. This is in agreement to the probable
involvement of FIP-1 in the cell division via Ran-GTP as stated above. In contrast, we
showed that P79- has no effect on NF B pathway Fig. B which would mean that
this part of the E3-14.7K protein is not involved in the apoptosis inhibition mediated by
FIP-3.
109
Overall, we would like to propose from our results that E3-14.7K produced by
adenoviruses could act as a decoy to trap FIP-1 protein and interfering its activity
relative to its involvement in cellular trafficking (Fig. 8).
Since E3-14.7K induces apoptosis and a cell cycle blockade, therapeutic application
could be possible especially for cancer treatment. P79-98 peptide that bears the cell
cycle arrest function of E3-14.7K could be exploited for cancer growth inhibition as
itself or by determining agonist peptides. The binding of P79-98-tagged cargo to
microtubules would be also of great interest to target intracellular trafficking of
molecules, macromolecules or drug delivery systems via microtubules. This research
exploitation is ongoing in our laboratory.
Materials and Methods
Cells and cell culture:
HeLa cells (human epithelial ovarian carcinoma; CCL2, ATCC, Rockville MD, USA)
were routinely grown at 37°C in a humidified atmosphere of 5% CO2 in Minimum
Essential Medium (MEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum
(FBS), 1% of a 100× non-essential amino acid solution, 1% of a 100x Glutamax and 100
U/ml penicillin and 100 g/mL streptomycin (PAA Laboratories, Les Mureaux, France).
HeLa FIP-1-eGFP cells and HeLa eGFP- -tubulin cells: These clones were HeLa cells
that stably expressed either FIP-1-eGFP or eGFP- -tubulin. They were grown in the
same medium as HeLa cells but in the presence of 400 µg/ml of G418 (PAA
Laboratories, Les Mureaux, France). These cells were prepared by transfection of HeLa
cells with plasmid encoding FIP-1-eGFP or eGFP- -tubulin (Clonetech) complexed
with Histidylated-lPEI (His-lPEI) (30) prepared at a DNA/polymer weight ratio of 1:6.
110
After 48 h, 800 g/mL of G418 was added to the medium for selection of clones that
stably expressed the transgene. Clones were collected, amplified and those expressing
the fluorescent protein were selected by flow cytometry (FACSort, Becton Dickinson
Grenoble, France; ex = 488 nm; em = 530 ± 30 nm). Then, positive clones were
subcloned using a cell sorter (FACSVantage, Becton Dickinson; ex = 488 nm;
em = 530 ± 30 nm).
(EK /NF B-luc cells: These cells were human embryonic kidney (HEK 293) cells
which are stably expressing the Firefly luciferase gene under NF- B promoter
(Promega). They were grown in DMEM High Glucose (4.5%) cell medium
supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin, 1% streptomycin and
g/mL hygromycin. To activate the NF B pathway, the cells were treated with
ng/mL of human TNF- Sigma in complete medium for hours.
The absence of mycoplasma infection in the cell lines was routinely checked by using
MycoAlert® Mycoplasma Detection Kit (Lonza, Levallois Perret, France).
Plasmids:
pTCTEL1-DsRed2, pE3-14.7K-RLuc and pE3-14.7K-Tomato were pDNA encoding
TCTEL1 fused with DsRed2 or E3-14.7K fused with Renilla luciferase and td-Tomato.
Briefly, the cDNAs encoding Dynein Light chain 1 (NCBI Reference Sequence:
NM_006519.2) and Human adenovirus 5 E3-14.7K protein (NCBI Reference Sequence:
AP_000224.1) without stop codon were synthesized by Genscript (Piscataway, NJ,
USA). TCTEL1 and E3-14.7K cDNA were then subcloned (HindIII/EcoRI) in pDsRed2-
N1, or pRLuc-N1 (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) and ptd-Tomato-N1 (Clonetech)
under the control of the human cytomegalovirus (CMV) promoter.
111
pP38-57-Tomato and pP79-98-Tomato were pDNA encoding P38-57 and P79-98 fused
with td-Tomato. Single stranded sense (s) and antisense (as) oligonucleotides coding
for P38-57 and P79-98 were synthesized by Eurogentec (Anger, France): sP38-57:
atgggcgaattcATGGTTAACTTGCACCAGTGCAAAAGGGGTATCTTTTGTCTGGTAAGCA
GGCCAAAGTCACCttggatccatgggc; asP38-57: gcccatggatccaaGGTGACTTTGGCCTGC
TTTACCAGACAAAAGATACCCCTTTTGCACTGGTGCAAGTTAACCATgaattcgcccat;
sP79-98: atgggcgaattcATGGTGGTCATGGTGGGAGAAAAGCCCATTACCATAACTCA
GCACTCGGTAGAAACCGAAGGCttggatccatgggc; asP79-98: gcccatggatccaaGCCTTCG
GTTTCTACCGAGTGCTGAGTTATGGTAATGGGCTTTTCTCCCACCATGACCACCATga
attcgcccat. s and as oligonucleotides of P38-57 or P79-98 were annealed in 1X annealing
buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 M NaCl and 1 mM EDTA, pH 7.5) for 10 min at 95°C.
Double stranded oligonucleotides were digested by EcoRI and BamHI and cloned in
fusion with td-Tomato in ptd-Tomato-N1.
pFIP-1-eGFP was a homemade plasmid DNA constructed from pcDNA-T7-FIP-1 (kindly
given by Prof MS Horwitz, Albert Einstein College of Medicine, New York, USA)
(Lukashok et al., 2000) and peGFP-N3 from Clontech (Mountair View, CA, USA)
encoding eGFP under CMV promoter.
Supercoiled DNA was isolated from E. Coli D( super competent bacteria
(Invitrogen, Cergy Pontoise, France) by alkali lysis and purification with Qiagen Mega
Kit Endotoxin free Plasmid (Qiagen, Courtaboeuf, France).
Chemicals:
Except when otherwise stated, chemicals were purchased from Sigma-Aldrich (Saint
Quentin Fallavier, France). E3-14.7K peptides containing either residues 38-57 (P38-57:
VNLHQCKRGIFCLVKQAKVT; Mw = 2810.33 Da), 50-69 (P50-69: LVKQAKVTYDSN
112
TTGHRLSY; Mw = 2810.33 Da), 65-84 (P65-84: HRLSYKLPTKRQKLVVMVGE; Mw =
2810.33 Da), 79-98 (P79-98: VVMVGEKPITITQHSVETEG; Mw = 2810.33 Da) or 106-125
(P106-125: GPEDLCTLIKTLCGLKDLIP; Mw = 2810.33 Da) and biotinylated P79-98
(VVMVGEKPITITQHSVETEG-Ttds-biotine (P79-98-bio) (Molecular weight = 2810.33
Da) were synthesized by JPT Innovative Peptide Solutions (JPT Peptide Technologies
GmbH, Berlin, Germany). Ttds was a (N-(3-{2-[2-(3-amino-propoxy)-ethoxy]-ethoxy}-
propyl)-succinamic acid linker. His-lPEI is lPEI (22kDa) modified with 16% histidine
residues per polymer molecule was synthesized as described (Bertrand et al., 2011).
Expression and purification of recombinant protein FIP-1-eGFP and E3-14.7K:
pTRC6His-FIP-1eGFP and pET28a-E3-14.7K plasmids encoded expression of
recombinant FIP-1-eGFP and E3-14.7K in E. coli BL21 (DE3) cells (Novagen). BL21 were
grown in a shaker incubator at 37°C in LB media supplemented with proper antibiotics,
and induced for 3 h at 30°C by addition of 1 mM IPTG at an OD600 nm of 0.6 - 0.8.
After 16 hours at 13°C, FIP-1-eGFP was extracted from bacterial pellet in Y-PER (Pierce)
containing 2 mM PMSF, 1 mM MgCl2 and inhibitor protease cocktail (Sigma-Aldrich).
E3-14.7K was extracted following inclusion body purification protocol with 0.5 M urea.
The soluble extracts were then loaded directly onto a Histidine affinity purification
resin (Novagen). FIP-1-eGFP and E3-14.7K were eluted in 200 mM and 100 mM
imidazole buffer, respectively.
Cytosolic extracts preparation:
HeLa cells were washed with ice-cold phosphate-buffered saline (PBS) containing 0.2%
BSA, scraped from the dish and resuspended in Homogenization buffer (HB: 250 mM
sucrose, 3 mM imidazole, 0.1% gelatin pH7.4). Cells were then lysed in HB completed
113
with inhibitor cocktail protease using 22G syringe. Cytosolic extract were collected
after centrifugation at 3000 rpm 4°C during 5 min.
Co-immunoprecipitation of FIP-1 and E3-14.7K:
Recombinant E3-14.7K protein was incubated in PBS at 4°C for 16 h either with HeLa
FIP-1-eGFP cytosolic extract or recombinant FIP-1-eGFP protein. Samples were pre-
cleared with normal mouse IgG (Santa Cruz, SC-2343) for 30 min at 4°C prior to
immunoprecipitation at 4°C for 16 h using anti-eGFP antibody coupled with agarose
beads (Santa Cruz, SC-9996AC). Beads were washed and collected by centrifugation at
3000 rpm during 5 min at 4°C. Beads were suspended in denaturing charge buffer,
boiled and analyzed in 12% SDS-PAGE gel.
Preparation of isolated microtubules:
Isolated microtubules were formed using X-rhodamine labeled -tubulin extracted
from bovine brain (Cytoskeleton Inc., ville). Microtubules were polymerized and
stabilized in vitro for fluorescence microscopy according to manufacturer instructions
in G-PEM buffer (80 mM PIPES, 2 mM MgCl2, 0.5 mM EGTA, 1 mM GTP, pH 6.9)
supplemented with 30% (w/v) glycerol and 20µM taxol. Isolated microtubules were
incubated with Qdot® labeled with P79-98-bio in cytosolic extract from HeLa cells
supplemented with 10mM ATP.
Images were acquired using a Zeiss Axiovert 200M microscope (Carl Zeiss Co. Ltd.,
Iena, Germany) equipped with a COLIBRI Lamp allowing fluorescence analysis (4 LED
ex 365nm, 470nm, 530nm 625nm).
Peptide conjugation with Quantum Dots (Qdot):
P79-98-bio was conjugated with Qdot streptavidin conjugate 545 (Invitrogen)
according to manufacturer s instructions. The conjugate was formed in PBS for h at
114
room temperature in 30-fold molar excess of P79-98-bio. Considering that 5 to 10
streptavidin molecules were covalently attached on the surface of Qdot, we assumed
that 15 to 30 P79-98-bio were conjugated per Qdot.
Microinjection experiments:
Microinjections were performed using an Eppendorf Femtojet in combination with an
Eppendorf Injectman NI2 micromanipulator (Eppendorf). HeLa cells were seeded on
35 mm Petri dish with an imprinted 500 µm relocation grid (Biovalley, Marne la Vallée,
France). Qdot samples were diluted in nucleocytoplasmic buffer (Adam et al., 1990)
and were loaded in glass injection capillary Femtotips II (Eppendorf), 0.5 µm inner and
0.7 µm outer diameter. Air was administrated at 50–100 hPa for 0.1–0.3 s.
Transfection:
Polyplexes were prepared at a DNA/polymer weight ratio of 1:6, i.e His-lPEI (15 µg in 15
µL of 10 mM HEPES buffer, pH 7.4) to pDNA (2.5 µg in 32.5 µL of 10 mM HEPES buffer,
pH 7.4). After mixing by vortex, the solution was kept for 30 min at room temperature
before use. For transfection, the volumes of the solutions containing polyplexes were
adjusted with complete HeLa medium. The cells were incubated with the transfection
mixtures (24-well; L; . g pDNA for h at °C. Then, the transfection medium
was replaced with a fresh medium.
Colocalization experiments:
Cells (1.5x105) were grown on glass coverslips in 4-wells plate two days before
experiments. They were transfected as described above with indicated pDNA/His-lPEI
polyplexes. Two days after transfection, cells were washed two times in PBS and fixed
with 4% p-formaldehyde during 15 min at 37°C. After two washes in PBS, cover slips
were mounted on slides using Vectashield mounting medium (Vector Laboratories,
115
Burlingame CA, USA). Confocal laser scanning microscopy (CLSM) analyses were
performed using a Zeiss Axiovert 200M microscope coupled with a Zeiss LSM 510
scanning device (Carl Zeiss Co. Ltd., Iena, Germany). The inverted microscope was
equipped with a Plan-Apochromat 63× objective (NA = 1.4) and a temperature
controlled stage.
pB-FRET experiments:
pB-FRET (photobleaching FRET) is the measurement of steady state fluorescence
intensity under confocale microscopy. These experiments were performed by using
FIP-1-eGFP as donor and E3-14.7K-Tomato as acceptor. eGFP was excited exc =
nm) at moderate laser power and emission was detected at em = nm. td-Tomato
was excited exc = nm and emission was recorded at em = nm. Two confocal
images were acquired under the same imaging conditions before and after
photobleaching fluorescence of td-Tomato exc = nm in square region of interest
RO) . )mages were recorded with Carl Zeiss s LSM )mage Browser software and were
calculated with the public-domain ImageJ software (Schneider et al., 2012).
BRET experiments:
HeLa were transfected with a plasmid expressing E3-14.7K-Rluc. Fourty hours after
transfection cytosolic extracts were processed as previously described. Fixed amount of
cytosolic extracts and increasing amount of FIP-1-eGFP produced in bacteria were
incubated into white 96 wells microplates (CELLSTAR-Greiner Bio-One). BRET were
performed using Coelenterazine H (Molecular Probes) at a final concentration of 5 M.
Signals were collected using a 450/58 filter (Luciferase) and a 480/LP (cutoff at 480
nm) filter (EGFP). BRET measurements were taken using the Mithras LB 940 with
116
MikroWin 2000 software (Berthold Technologies). All experiments were repeated at
least 2 times.
Determination of cell cycle:
HeLa cells transfected with pRLuc-N1, pE3-14.7K-RLuc or pP79-98-RLuc or
untransfected cells were harvested and washed in ice-cold PBS. Cells were resuspended
in propidium iodide solution (10 mg/ml) with DNase-free RNase (20 u/ml) in PBS, the
cell cycle status was tested by flow cytometry on a FACSort (Becton Dickinson). Cell
cycle distribution was studied with Modfit software (Verity Software House, Inc.).
Luciferase assays:
Cells in 24 wells plate were washed with PBS 24 h after transfection then harvested
using trypsin/EDTA solution. The lysis buffer (200 µl of 8 mM MgCl, 1 mM dithio
threitol, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, and 15% glycerol, 25 mM Tris–phosphate buffer,
pH 7.8) was added to the pellet. The suspension was mixed with a Vortex and kept for
10 min at room temperature. The solution was spun down (5 min, 800 g). For firefly
luciferase measurement, ATP (95 µl of a 2 mM solution in the homogenization buffer
without Triton X-100) was added to 60 µl of supernatant before addition of luciferin
(167 µM, 150 ml). The luminescence was recorded for 4s by using a luminometer
(Lumat LB 9501, Berthold, Wildbach, Germany). Experiments were done in triplicate.
The data shown correspond to the number of RLU per mg proteins. Protein
concentration was determined for each sample using the bicinchoninic acid (BCA)
colorimetric assay modified by Hill and Straka (Hill and Straka, 1988).
FLIM-FRET experiments:
The FLIM experiments were performed using an inverted Leica SP2 confocal
microscope (Leica Microsystems, Heidelberg, Germany) coupled to a 80-MHz mode-
117
locked Mai-Tai® Ti:Sapphire tunable laser (720-920 nm, 100 fs laser pulse; Spectra
Physics, Mountain View, CA, USA) for two-photon excitation. The time-resolved
fluorescence intensity was obtained using the time-correlated single-photon counting
approach. In FLIM/FRET experiments, the donor was eGFP and was excited at 900 nm.
Two different protein acceptors, compatible with eGFP as a donor, were used: td-
Tomato and DsRed2. Fluorescence emission of eGFP fusion proteins was detected in
descanned mode through the external port of the microscope and further filtered by a
bandpass filter (510 ± 42 nm) (Semrock). The external detector was a high-speed
photomultiplier (PMC-100, Becker & Hickl) connected to a SPC-830 TCSPC card
(Becker & Hickl). The card was configured in FIFO mode with 256x256 pixels and 256
time channels (48.8ps/channel). The excitation light pulse was triggered by a
Hamamatsu photodiode (model S4753). The power of the laser source was adjusted to
yield a photon counting rate in the 1-5×104 photons/s range. This value was found to be
optimal to ensure the single photon counting condition while minimizing
photobleaching of eGFP. From 20 to 25×103 photons per fluorescence intensity decay
were collected, which was found to be statistically relevant for the calculation of the
donor fluorescence lifetime. To ensure that the determination of the fluorescence
lifetime of eGFP cannot be influenced by the presence of the acceptor protein in the
absence of any interaction – for instance due to a bleed-through of fluorescence
emission – control cells were either transfected by free eGFP alone or co-transfected by
free eGFP and red-fluorescent acceptor proteins, i.e. not fused to another protein. The
fluorescence lifetime of free eGFP was found to be the same i.e. τ = . ns in the
absence or presence of free acceptor protein. Fluorescence lifetimes were calculated for
118
all pixels in the field of view (256×256 pixels) or for a particular selected region of
interest using the SPCImage software (Becker & Hickl GmbH).
Acknowledgments:
We warmly thank Prof Horwitz (Albert Einstein College of Medicine, New York, USA)
for kindky providing us plasmid encoding FIP-1, Dr Ronald Rooke from Transgene SA
for plasmid encoding E3-14.7K. We also acknowledge Dr Friedrich Piller (CBM,
Orléans) for his help in FIP-1 plasmids constructions and David Gosset (Cytometry and
Cellular Imaging platform CBM) for his technical assistance. We also thank Sara
Resina, Aida Duarte and Vedrana Bukal who have participated in this work during
their Master degree internship. The French Association Vaincre la Mucoviscidose
VLM and Association Française contre les Myopathies AFM are gratefully
acknowledged for their financial support. LP received a Ph.D fellowship from VLM.
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125
Fig. 1: Intracellular network of FIP-1, E3-14.7K and microtubules in HeLa cells.
HeLa cells were transfected with a plasmid encoding either (A) eGFP- -tubulin (B)
FIP-1-eGFP (C) E3-14.7K-eGFP or (D) eGFP. After 48 hours post-transfection, cells were
fixed with 4% PFA and analyzed under confocal microscope as described in Material
and Methods section. Shown are representative images of each sample. Scale bar: 5 µm.
126
Fig. 2:
(A) Colocalization of FIP-1-eGFP with microtubules in HeLa cells. HeLa cells were
transfected with a plasmid encoding FIP-1-eGFP (green). Two days after transfection,
cells were treated with 1mM of DSP for 10 min in HBSS pH7.2 before permeabilization
with digitonin. Cells were fixed and the staining of microtubules was performed with
mouse MAb anti- -tubulin revealed with Cy3 secondary anti-mouse antibodies (red).
Then, cells were analyzed by confocal microscopy. Scale bar: 5 µm.
127
(B) Intracellular distribution of E3-14.7K and FIP-1 in HeLa cells. Cells were
cotransfected with plasmids encoding FIP-1-eGFP (green) and E3-14.7K-Tomato (red).
Two days after transfection, cells were treated with 1mM of DSP for 10 min in HBSS
pH7.2 before permeabilization with digitonin. Cells were fixed and analyzed by
confocal microscopy. Scale bar: 5 µm.
(C) Determination of E3-14.7K/FIP-1 interaction by pB-FRET experiment. HeLa
cells were cotransfected with plasmids encoding FIP-1-eGFP and E3-14.7K-Tomato.
Two days after transfection, cells were fixed and pB-FRET experiments were performed
under confocal microscope. Upper lane: representative image of cell before bleaching;
Lower lane: the same cell after photobleaching at 543 nm of indicated region of
interest (ROI). Right: Zoom area of the ROI clearly showing the enhancement of GFP-
tagged FIP-1 fluorescence after photobleaching of td-Tomato fluorescence as indicated
by the fluorescence intensity scale pixels color.
(D) Triple colocalization between FIP-1, E3-14.7K and microtubules. HeLa cells
were cotransfected with plasmids encoding FIP-1-eGFP (green) and E3-14.7K-cherry
(red). Two days post-transfection, cells were treated with 1mM of DSP for 10 min in
HBSS pH7.2. Cells were then permeabilized, fixed and microtubules were stained with
mouse MAb anti- -tubulin revealed with Cy5-labeled secondary anti-mouse antibodies
(blue). Boxes on the right correspond to the enlarged ROI (square). Scale bar: 5 µm.
128
Fig. 3: FLIM-FRET experiments: E3-14.7K interacts with FIP-1, TCTEL1 and
microtubules. Experiments were performed with HeLa cells expressing (A) eGFP/td-
Tomato, (B) eGFP/DsRed2, (C) FIP-1-eGFP/E3-14.7K-Tomato, (D) eGFP- -tubulin/E3-
14.7K-Tomato, (E) E3-14.7K-eGFP /TCTEL1-DsRed2. For each panel the mean
fluorescence lifetime of GFP is represented (F).
129
Fig. 4: (A) Schematic representation of the interactions between E3-14.7K, FIP-1
and TCTEL1. (B) Location of the 5 selected peptides covering amino acids 38 to
125 of E3-14.7K. (C) P79-98 peptide inhibits interaction between FIP-1 and E3-
14.7K. HeLa cells were transfected with plasmid encoding E3-14.7K-Rluc. Two days
after transfection, cytosolic extracts were processed. Fixed amount of cytosolic extracts
and increasing amount of recombinant FIP-1-eGFP protein were incubated in the
absence or in the presence of peptides (competitive experiments) as described in
Material and Methods.
130
Fig. 5: P79-98 peptide binding to isolated microtubules. (A) Scheme of the loading
of streptavidin-Qdot® 545 with biotinylated P79-98 peptide. X-rhodamine labeled
microtubules (red) were polymerized in vitro and incubated with Qdot® 545 (B) alone
or (C and D) linked to P79-98 peptide in HeLa cytosolic extracts supplemented with
10mM ATP. Images shown are representative confocal microscopy images of each
sample.
131
Fig. 6: P79-98 peptide binding to microtubules in HeLa cells. HeLa cells stably
expressing eGFP- -tubulin were transfected with plasmids encoding (A) P79-98 or (B)
P38-57 fused to td-Tomato. Two days after transfection, cells were permeabilized with
digitonin. Cells were fixed and analyzed by confocal microscopy. Scale bar: 5 µm.
132
Fig. 7: Biological activity of P79-98 peptide. (A) E3-14.7K and P79-98 peptide
arrest the cell cycle. HeLa cells were transfected with plasmid encoding either E3-
14.7K or P79-98 peptide fused with Renilla luciferase. Two days post-transfection, the
cells were stained with propidium iodide and their fluorescence was measured by flow
cytometry. The cell cycle was analyzed with ModFit software. (B) Overexpression of
P79-98 peptide has no influence on NFκB pathway. (EK /NF B-luc cells were
transfected with plasmid encoding Renilla luciferase fused either with E3-14.7K, P38-57
or P79-98. One day later, cells were incubated for 6 h with human TNF- . Then, the
Luciferase (RLU) and Renilla luciferase (Rluc) activity were measured and expressed as
RLU/Rluc ratio.
133
Fig. 8: New schematic model for the function of E3-14.7K with FIPs.
(A) Once the TNF- bound to the TNF receptor, a complex of adaptor proteins is
found. Internalization of this complex results in formation of TNF receptosomes. As
other other small GTPases molecules, FIP-1 could be involved in trafficking of this TNF
receptosomes. The binding of E3-14.7K to FIP-1 could compete with the binding of FIP-
1 to TNF receptosomes vesicles inhibiting their transport along microtubules and their
intracellular trafficking. (B and C) E3- . K can also inhibits NF B via its interaction
with FIP-2, or NF B Essential Modulator (NEMO) Related Protein (NRP) and FIP-3
NEMO or )KKγ . D E -14.7K interacts with FIP-4 or AIF (Apoptosis-Inducing
Factor), a mitochondrial protein which translocates into the nucleus in response to
apoptotic stimuli.
134
Supplementary Fig. 1: Interaction between FIP-1 and E3-14.7K. Cytosolic extract of
HeLa cells stably expressing eGFP-FIP-1 alone or in presence of recombinant E3-14.7K
were pre-cleared with normal mouse IgG for 30min at 4°C prior to
immunoprecipitation at 4°C for 16 h with anti-eGFP antibody coupled with agarose
beads. Beads were washed and collected by centrifugation. Beads were suspended in
denaturing charge buffer, boiled and analyzed in 12% SDS-PAGE gel. Lane A: cytosolic
extract of HeLa cells stably expressing eGFP-FIP-1; Lane B: cytosolic extract of HeLa
cells stably expressing eGFP-FIP-1 plus recombinant E3-14.7K; Lane C: cytosolic extract
of HeLa cells stably expressing eGFP-FIP-1 plus recombinant E3-14.7K incubated with
10mM DSP; Lane D: Recombinant FIP-1-eGFP; Lane E: Recombinant FIP-1-eGFP plus
recombinant E3-14.7K in the presence of 10mM DSP.
135
Supplementary Fig. 2: P79-98 peptide binding to microtubules in cellulo. HeLa
cells transiently expressing mRFP-tubulin were microinjected with either (A) P79-98
linked to Qdot® 545 or (B) Qdot® 545 alone. Images shown are representative confocal
microscopy image. Scale bar: 5 µm.
136
Résultats
Partie II
Utilisation du peptide P79-98 dans le
transfert non viral de gènes
137
Résultats – PARTIE II : Utilisation du peptide P79-98 dans le transfert de gènes non viral
J ai identifié par la technique de BRET un peptide de 20 acides aminés (P79-98)

appartenant à la séquence de la protéine adénovirale E3- . K lui permettant d interagir
avec la protéine cytosolique FIP-1. P79-98 interagit de ce fait indirectement avec la dynéine
(Figure 31). La dynéine est un complexe protéique qui réalise un mouvement rétrograde le
long des microtubules, c'est à dire de la périphérie cellulaire jusqu'au noyau. La dynéine
est le moteur moléculaire majeur pour le déplacement des organites et autres vésicules
(appelés cargos) dans le cytoplasme en direction du noyau de la plupart des cellules
eucaryotes. La capacité du peptide P79- d interagir avec la dynéine a été exploitée pour
favoriser le trafic intracellulaire d ADNp dans le cytosol et augmenter la quantité de
plasmide à proximité du noyau et ainsi augmenter l efficacité du transfert non viral de
gènes.
Figure 31 : Schéma d interaction du peptide P -98. Le

peptide P79- issu de la protéine d Adénovirus E -14.7K interagit
avec FIP-1. Cette interaction le lie au complexe moteur dynéine des
microtubules.
I- COUPLAGE PEPTIDE / ADNp
Plusieurs méthodes peuvent être employées pour le couplage de peptides sur

l ADN. Ces méthodes peuvent être directes ou indirectes comme celle basée sur
l utilisation de PNA Peptide Nucleic Acid Dean et al., 2005. Avant d envisager ces
méthodes qui demandent un investissement important, j ai choisi de fixer le peptide sur
l ADNp grâce à un pont streptavidine/biotine. Le greffage est réalisé en trois étapes :
138
- Biotinylation du plasmide.
- Greffage du peptide biotinylé sur la streptavidine.
- Couplage entre le plasmide biotinylé et le peptide conjugué à la streptavidine.
La biotinylation de l ADN plasmidique en l utilisant le kit Label )T Mirus permet

de contrôler la quantité de biotines fixée par copies de plasmides. Comme toutes les
méthodes de greffage covalent l ajout de biotine sur l ADN est un phénomène aléatoire qui
peut intervenir au niveau de séquences indispensables pour la transcription. Le nombre de
biotines par copies de plasmide est donc critique pour l expression génique Figure 32).
Ainsi nous avons évalué la quantité minimale de biotine susceptible d être greffée par
molécule de plasmide sans modifier l expression génique. Les résultats montrent qu il est
possible de greffer une quantité de 16 à 48 biotines sur un plasmide de 9.6 kb soit une
biotine toutes les 200 à 600bp sans modifier son expression. Cela laisse une marge
suffisament importante pour un greffage de peptide via streptavidine.
1,E+08
2,E+07 1,E+07
1,E+07
RLU / mg protéines
4,E+06
1,E+06
1,E+05
2,E+04
1,E+04
Non biotinylé 16 à 48 biotines 64 à 192 biotines 160 à 480 biotines
Figure 32 : La biotinylation aléatoire inhibe la transcription

plasmidique. Les cellules HeLa sont transfectées avec le plasmide PTG11033
exprimant la luciférase. PTG11033 est biotinylé grâce au kit labetIT (MIRUS) de
façon à obtenir 16 à 46, 64 à 192, 160 à 480 biotines par copies de plasmides.
( après transfection l activité luciférase est mesurée.
Le choix du nombre de biotines par copies de plasmides est déterminant pour

l exploitation du P -98 dans le transfert de gènes. En effet le nombre de biotines doit être
suffisant pour coupler un nombre de peptides adéquat pour qu il soit disponible et efficace
dans la reconnaissance de ses partenaires cellulaires. Le nombre de sites de couplage ne
139
doit cependant pas dépasser un certain seuil au-delà duquel la transcription est inhibée
(Figure 32).
Sachant que quatre sites de liaison à la biotine sont disponibles par streptavidine
dont un est consacré à l interaction avec le plasmide, chaque site biotine présent sur le
plasmide présente donc le potentiel de lier trois peptides. Nous décidons donc de fixer à
trois le nombre de biotines par plasmide afin de pouvoir coupler 9 peptides par copie de
plasmide.
II- RESULTATS : Enhancement of polyplexes transfection efficiency by the

use of P79-98 peptide from E3-14.7K that promotes a microtubules-mediated
transport of plasmid DNA.
Les résultats obtenus sont présentés sous la forme d un manuscrit rédigé en anglais
qui est accepté à la publication dans la revue Small. « Enhancement of polyplexes
transfection efficiency by the use of P79-98 peptide from E3-14.7K that promotes a
microtubules-mediated transport of plasmid DNA ».
Nous avons mis au point une méthode standardisée de greffage de peptides sur
l ADNp grâce à un pont streptavidine-biotine. Des expériences de vidéomicroscopie nous
ont permis d étudier l influence du peptide P 9- sur le trafic de l ADNp au cours du
processus de transfection. Les particules d ADNp couplées au peptide P -98 montre un
transport linéaire de grande amplitude le long des microtubules après transfection avec les
polyplexes. Les particules d ADNp couplées au peptide contrôle P37-58 ont, quant à elles,
un mouvement quasi nul. De plus les particules d ADNp couplées au peptide P -98 sont
capables d interagir avec les microtubules in vitro et in cellulo. La présence du peptide P79-
sur l ADNp augmente l efficacité de transfection de polyplexes in vitro des cellules HeLa
jusqu à %.
Nos travaux montrent pour la première fois que l efficacité de transfection avec des
polyplexes peut être améliorée lorsque l ADNp est capable de migrer jusqu au noyau le
long des microtubules. Ces résultats représentent une grande avancée dans le domaine du
transfert non viral de gènes et participent à l élaboration de virus artificiels.
140
An E3-14.7K peptide that promotes microtubules-mediated transport of plasmid
DNA increases polyplexes transfection efficiency.
Lucie Pigeon, Cristine Gonçalves, David Gosset, Chantal Pichon and Patrick Midoux*.
*Corresponding author: Patrick.midoux@cnrs-orleans.fr
Centre de Biophysique Moléculaire, CNRS UPR4301, Inserm and University of Orléans,
45071 Orléans cedex 02, France.
Supporting Information is available on the WWW under http://www.small-
journal.com or from the author.
Keywords: DNA nanoparticles; dynein; microtubules; polyethyleneimine; polyplexes;
non-viral vectors
141
Abstract
Chemical vectors as cationic polymers and cationic lipids are promising alternatives to
viral vectors for gene therapy. Beside endosome escape and nuclear import, plasmid
DNA (pDNA) migration in the cytosol toward the nuclear envelope is also regarded as
a limiting step for efficient DNA transfection with non-viral vectors. Here, we have
exploited the interaction between E3-14.7K and FIP-1 to favor migration of pDNA along
microtubules. E3-14.7K is an early protein of human adenoviruses that interacts via
FIP-1 (Fourteen.7K Interacting Protein 1) protein with the light-chain components of
the human microtubule motor protein dynein (TCTEL1). In a previous work, we
identified the P79-98 peptide responsible of the E3-14.7K/FIP-1 interaction. In the
present work, we conjugated this peptide with pDNA and we demonstrated that it
mediates interaction of pDNA in vitro with isolated microtubules as well as with
microtubules in cellulo. Videomicroscopy and tracking treatment of images clearly
demonstrate that P79-98/pDNA conjugate exhibits a linear transport with large
amplitude of along microtubules upon 2 h transfection with polyplexes whereas
control pDNA conjugate exhibits small non-directional movements in the cytoplasm.
Remarkably, P79-98/peGFP polyplexes enhance by a factor 2.5 - up to 76% - the
number of transfected cells. Our results demonstrate for the first time that the
transfection efficiency of polyplexes can be drastically increased when the
microtubules migration of pDNA is facilitated by a peptide allowing pDNA docking to
TCTEL1. This is a real breakthrough in the non viral gene delivery field that opens hope
to build artificial viruses.
142
1. Introduction
Gene therapy is a promising strategy to cure genetic and acquired diseases, and several
[1–4]
clinical trials have been already reported. These remarkable results were obtained
by using viral vectors to introduce transgenes into the cells. However, the transgene
size that can be inserted into the viral genome is limited to 4.5-kb for adeno-associated
viruses (AAV), 7-kb for retroviruses and 8-kb for lentiviruses. In the case of the
Duchenne Muscular Dystrophy disease, the dystrophin cDNA is indeed as large as 14-
kb. This drawback is circumvented by insertion of minidystrophin genes into AAV
genome for skeletal muscle gene transfer.[5,6] Although they are weakly efficient yet,
electrostatic complexes between plasmid DNA (pDNA) and cationic polymers or
cationic lipids would be a non-viral alternative for gene therapy.[7,8] In this case, the
pDNA size is not considered as a limiting factor for the endocytosis and endosomal
escape of pDNA complexes because assembly via electrostatic interactions with
cationic molecules induces large size reduction of pDNA. The nuclear import of pDNA
through the nuclear pore that requires an active process might be pDNA size
dependent. In contrast, the transport of pDNA in the cytosol drastically depends on its
size. Indeed, it has been demonstrated that pDNA as high as 1-kp does not diffuse in
the cytosol.[9] Therefore, it is tempting to suggest that promoting the migration of
pDNA in the cytosol could help to increase the number of plasmid copies close to the
nuclear envelope before its passage through nuclear pores. This step could be favored
by an active migration of pDNA on microtubules. The cytoplasmic transport (diffusion
or transport velocities) of pDNA, polyplexes and lipoplexes is not yet well described. A
microtubules transport toward the perinuclear region of polyplexes made with PEI,
PEGylated PEI, EGF-PE) and cationic -cyclodextrin has been evidenced in COS-7 and
143
HeLa cells.[10–13] These studies revealed the presence of active transport periods for
polyplexes with linear or curvilinear trajectories in line with that measured for some
proteins moving along microtubules. However, it was not sure that those polyplexes
were inside or outside endocytic vesicles during these observations. Thus, these results
are likely to correspond to transport polyplexes inside endocytic vesicles rather than
cytosolic polyplexes along microtubules.
Viruses and certain proteins take advantage of microtubules to reach the
perinuclear region. The minus-end directed trafficking on the microtubule network is
facilitated by the dynein motor and its associated protein complex. For instance,
adenoviruses move along the microtubule network via interactions between the viral
capsid hexon and the dynein complex.[14,15] However, the mechanism involving capsid
hexon by which the virus binds to the dynein complex remains yet unknown.
Therefore, the discovery of proteins or peptides recognized by dynein is very
challenging for docking pDNA onto microtubules with the aim to favor its transport
toward the nuclear envelope. We have focused our attention on E3-14.7K/FIP-1
interaction.[16] FIP-1 (Fourteen .7K Interacting Protein 1) is a cytosolic protein that
interacts with GIP-1, a GTPase-interacting protein identical with the human homolog
of mouse dynein light chain Tctex-1 (TCTEL1), one of the light-chain components of
the human microtubule motor protein dynein.[17] E3-14.7K, one of the adenovirus E3
early proteins that inhibits TNF- induced apoptosis upon cells infection colocalizes
with FIP-1 in the cytoplasm around the nuclear membrane.[18] We recently
demonstrated that E3-14.7K binds to microtubules in cellulo thanks to FIP-1 and we
also identified a 20 amino acid peptide so called P79-98 containing residues 79 to 98
from the amino acids sequence of E3-14.7K that specifically interacts with FIP-1.[19]
144
Here, we demonstrate for the first time that when linked to a plasmid DNA, the
peptide P79-98 mediates interaction of pDNA with microtubules in vitro and in cellulo,
and dramatically enhances polyplexes transfection.
2. Results and Discussion
2.1. P79-98 is responsible of E3-14.7K/FIP-1 interaction. Bioluminescence
Resonance Energy Transfer (BRET) was used to monitor E3-14.7K/FIP-1 interaction.
BRET values showed the presence of a saturation curve when a constant amount of
cytosol extract from HeLa cells expressing E3-14.7K fused with Renilla luciferase (E3-
14.7K-Rluc) was incubated with increasing amounts of recombinant (r-) FIP-1-eGFP
(Figure 1). We previously reported that when 5 selected overlapping peptides of 20
amino lengths covering residues 31–128 of the C-terminal fragment of E3-14.7K were
screened for competition with E3-14.7K/FIP-1 interaction, only peptide P79-98
decreased BRET ratio indicating competition between this peptide and E3-14.7K/FIP-1
interaction.[19] Here, Renilla luciferase was fused either with peptide P79-98 (P79-98-
Rluc) or the control peptide P38-57 (P38-57-Rluc) in order to know whether P79-98
was able to target a specific interaction of a protein cargo (i.e. RLuc) with FIP-1. As
shown in Figure 1, BRET values indicated the presence of a saturation curve between
FIP-1-eGFP and P79-98-Rluc while no BRET ratio was detected between FIP-1-eGFP
and P38-57-Rluc. Thus, P79-98 can promote a specific interaction of a protein cargo
with FIP-1. These results prompt us to explore the capacity of P79-98 to increase the
cytosolic migration of pDNA thanks to FIP-1 and dynein.
2.2. Peptide/pDNA conjugation. pDNA was coupled with P79-98 or P38-57 via a
streptavidin (STR) bridge (Figure 2A). First, 3 biotinylated peptide molecules (P79-98-
bio or P38-57-bio) were linked per STR molecule in order to prevent an eventual
145
aggregation of biotinylated pDNA molecules (bio-pDNA) when STR contains more
than one free biotin site. The number of peptide bound per STR was evaluated by SDS-
PAGE. Figure 2B shows that the amount of free STR decreased when the amount of
P79-98-bio increased for a constant STR quantity (Figure 2Bb) while that of P79-98-
bio/STR conjugate increased (Figure 2Ba). Of note, samples were heat at 95°C to
discriminate free STR from STR loaded with peptide-bio. Indeed, this treatment
dissociates only unconjugated STR in 4 streptavidin monomers of 14 kDa (Figure 2Bb)
while STR loaded with peptide-bio is not dissociated and migrates closely to 65 kDa
(Figure 2Ba). When 3.5 P79-98-bio equivalents were mixed with STR, 3 P79-98-bio
were estimated to be linked per STR molecule and one free biotin site remained
available to bind to bio-pDNA. Only 3 biotin residues were linked to pDNA in order to
preserve high gene expression and to bind few P79-98 peptides per pDNA molecules.
Then, P79-98 conjugation with pDNA was achieved by mixing 6 P79-98-bio/STR
molecules with one bio-pDNA molecule. SDS-PAGE indicated that ~ 90% of bio-pDNA
was linked to P79-98-bio/STR leading to the formation of P79-98-bio/STR/bio-pDNA
(P79-98/pDNA) conjugate which did not migrate compared to P79-98-bio/STR that
migrated at 66 kDa molecular weight (Figure 2C).
2.3. P79-98/pDNA moves on microtubules. First, the binding of P79-98/pDNA to
microtubules was assessed using in vitro polymerized microtubules. Figure 3A shows a
clear interaction between P79-98/Cy5-pDNA and X-rhodamine microtubules. No
interaction was detected with Cy5-bio-pDNA (Figure 3B). Next, we sought to
determine the intracellular interaction between P79-98/Cy3-pDNA and microtubules
by transfecting GFP-tubulin HeLa cells with P79-98/Cy3-pDNA/His-lPEI polyplexes.
Confocal microscopy images show co-localisations between P79-98/Cy3-pDNA and
146
green microtubules upon 5 h transfection (Figure 4A). Moreover, P79-98/Cy3-pDNA is
aligned with microtubules. In contrast, when the transfection was performed with Cy3-
labeled STR-bio-pDNA without P79-98, pDNA did not colocalize and was not aligned
with microtubules although red spots were close to microtubules (Figure 4B). These
observations strengthen the binding P79-98/pDNA on microtubules in cellulo thanks
to P79-98. Videomicroscopy experiments were conducted to evidence a microtubules-
mediated P79-98/pDNA transport in GFP-tubulin HeLa transfected with P79-98/Cy3-
pDNA/His-lPEI polyplexes. When intracellular movements of pDNA were monitored
over 30 min after 2 h transfection, some fluorescent pDNA spots moving along
microtubules were observed (Video S1 and S2). Comparatively, only small amplitude
and unidirectional movements were observed in cells transfected with the control P38-
57/pDNA (Video S3). Tracking treatment of these images evidenced a clear linear
transport of some P79-98/pDNA with large amplitude along microtubules from
periphery toward the nucleus (Figure 5). These results demonstrate clearly a transport
of some P79-98/pDNA along microtubules. It is noticeable that no movement of P79-
98/pDNA was observed before 2 h transfection. This could correspond to the period
allowing endosome escape of pDNA upon polyplexes endocytosis. Upon 4 h
transfection, a large amount of P79-98/pDNA was accumulated around the nucleus in
contrast to P38-57/pDNA transfection (Figure S1). These results were in line with a
microtubules-mediated transport of P79-98/pDNA toward the nucleus. Confocal
microscopy and videomicroscopy experiments clearly show that P79-98 promotes
microtubules binding of pDNA and its transport toward the nuclear envelope upon
polyplexes transfection. These results are more convincing that those previously
reported for the migration of polyplexes where observations probably corresponded to
147
endocytic vesicles containing polyplexes rather than polyplexes outside vesicles.[10–13]
Here, we can claim that P79-98/pDNA was escaped from endosomes, interacted and
moved on microtubules because P79-98/pDNA buried inside endosomes is not
expected to interact with microtubules. P79-98/pDNA remaining inside endosomes
exhibited similar movements as P38-57/pDNA that does not interact with
microtubules.
2.4. P79-98 increases transfection efficiency. Hela cells were transfected with His-
lPEI polyplexes made with bio-peGFP conjugated either with STR, P38-57-STR, P79-98-
STR or P79-98(SS)-STR. The number of eGFP transfected cells was measured by flow
cytometry 48h after the transfection. First, same pDNA conjugates were prepared with
pDNA encoding luciferase in order to verify that pDNA substituted with 3 biotin
molecules and then coupled to either with STR or peptide-bio-STR were as efficient as
the unmodified pDNA to express luciferase. Gene expression of pDNA conjugates was
assessed by in vitro translation and transcription assay. Compared to pGEM4Z-Luc, the
luciferase activity was reduced at most 5% when the pGEM4Z-Luc was coupled with
biotin, STR or peptide-STR meaning that all these pDNA formulations have the same
capacity to express the transgene (Figure 6). As shown in Figure 7, the transfection
efficiency of HeLa cells was increased when P79-98 was linked to pDNA. Indeed, 60%
of the cells expressed eGFP when transfection was performed with P79-98/peGFP
whereas 38% were transfected with P38-57/peGFP. The latter percentage was close to
that obtained with peGFP without P38-57 (30%) (i.e. STR-bio-peGFP). These results
demonstrated the specific involvement of P79-98 in the enhancement of the
transfection efficiency with P79-98/peGFP. More remarkably, 76% of the cells were
transfected when P79-98 was linked to pDNA via a disulfide bridge (P79-98(SS)-STR)
148
between the peptide and biotin linked to STR. This enhancement can result from the
release of pDNA from microtubules upon cleavage of the disulfide bridge making
pDNA available for its nuclear import. It should be stressed that this cleavage can also
occur as soon as endosome escape and delivery of P79-98(SS)/pDNA in the cytosol. If
so pDNA cannot bind microtubules anymore. The enhancement of the transfection
efficiency suggests that once in the cytosol, the binding of P79-98(SS)/pDNA on
microtubules and its migration toward the nuclear envelope are likely faster than the
kinetic of the disulfide bridge reduction in the cytosol. The disulfide cleavage
occurring when P79-98(SS)/pDNA is close to the nuclear envelope. This is a
remarkable result because the enhancement of the transfection efficiency leads to an
increase of the number of transfected cells. In other words, the presence of P79-98 on
the plasmid promoting pDNA accumulation near the nuclear membrane thanks to a
microtubule transport is a benefit for its nuclear import in a larger number of cells.
P79-98 does not interact directly with dynein but with FIP-1, a cytosolic protein
identified to interact with TCTEL1.[17] Dynein comprises two light chains, LC8 and
TCTEL1, which interact with the IC74 intermediate light chains of dynein. The strategy
we employed here contrasts with those using Dynein Light Chain Associated
Sequences (DLC8-AS) of LC8 which have led to modest improvements of the
transfection efficiency.[20] DLC8-AS are highly conserved protein sequences of IC74
that interact with LC8. DLC8-AS are particularly well described and contain either
KXTQTX or XG (I / V) QVD motifs. For example, the DKSTQT sequence of the rabic
phosphoprotein (RPP) provides interaction with dynein and increases the NLS-
mediated nuclear accumulation of RPP which is dependent on microtubules integrity
and interaction with dynein.[21] Unfortunately, only 12% of the intracellular LC8 is
149
[22]
integrated within the cytosolic dynein motor complex and structural studies
showed that dynein sites interacting with DLC8-AS are naturally occupied by IC74
intermediate chains.[23] Therefore, a DLC8-AS exogenous peptide is unlikely to meet its
target due to strong competition with IC74. For instance, the PRMLHRSTQTTNC
peptide of the BS69 adenoviral protein containing the STQT motif did not improve the
transfection efficiency of polyplexes when the peptide was whether grafted on pDNA
or on the cationic polymer.[24] In addition, this peptide has the ability to better interact
with free LC8 in the cytoplasm than with LC8 within the motor complex.[20] In another
study, transgene expression was slightly improved when the CKSSQDKSTQTTGDC
peptide - containing also STQT motif – was linked to preformed polyplexes.[25] Thus,
DLC8-AS peptides do not seem to be good candidates for interaction of pDNA with
dynein. In contrast, FIP-1 binds to TCTEL1 and several lines of evidence indicate that
sequences targeting TCTEL1 guarantee a better specificity to promote interaction of
pDNA with dynein. First, TCTEL1 dimers interact with IC74 and cargo by two different
mechanisms within the dynein complex that are not in competition in contrast to
LC8.[26] Next, TCTEL1 is almost exclusively found within the dynein complex.[27] Here,
the interaction of P79-98/pDNA with TCTEL1 thanks to FIP-1 increases the
transfection efficiency probably by decreasing the risk of competition for the binding
of P79-98/pDNA on the dynein motor complex. The use of FIP-1 as a shuttle to bind
onto microtubules is very powerful. Indeed, a sequence of the C-terminal part of the L2
protein of the capsid of human papillomavirus interacting directly with TCTEL1 had
shown no positive effect on the transfection efficiency when grafted onto pDNA or
vector.[28, 29]
150
Here, P79-98 was linked to pDNA, a strategy similar to that we have used to
increase the nuclear import of pDNA by inserting NFĸB motifs in the pDNA
sequence.[30, 31]
P79-98 could be linked to the cationic polymer but if pDNA is
dissociated from its vector upon internalization, it could never interact with FIP-1 and
of course with microtubules. P79-98 was linked to pDNA via a streptavidin bridge but
other strategies are in progress to link P79-98 with pDNA without streptavidin.
3. Conclusions
In our research, we have investigated the capacity of the peptide P79-98
containing residues 79 to 98 from the amino acids sequence of E3-14.7K to mediate
migration of pDNA along microtubules. We demonstrated that this peptide fused to
Renilla luciferase allows a specific interaction with FIP-1 in cellulo. We also
demonstrated that P79-98 linked to pDNA, allows the binding of pDNA on isolated
microtubules. Confocal microscopy and videomicroscopy experiments clearly showed
that P79-98 promotes microtubules binding of pDNA and its transport toward the
nuclear envelope upon polyplexes transfection. Finally, we found for the first time that
the number of transfected cells with P79-98-pDNA polyplexes is dramatically
improved presumably thanks to this specific molecular signal enabling binding to
microtubules and migration toward the nuclear envelope. Our result is a real
breakthrough in the non-viral gene delivery field that opens the way to build artificial
viruses integrating several molecular signals for endosome escape, cytosol migration
and nuclear import, helping pDNA to reach the nucleus.
4. Experimental Section
4.1. Chemical compounds. Unless otherwise stated, chemical products were
purchased from Sigma-Aldrich. P38-57 (VNLHQCKRGIFCLVKQAKVT), P79-98
151
(VVMVGEKPITITQHSVETEG), bio-P38-57 (VNLHQCKRGIFCLVKQAKVT-Ttds-
biotin), bio-P79-98 (VVMVGEKPITITQHSVETEG-Ttds-biotin) and bio-SS-P79-98
(VVMVGEKPITITQHSVETEG-Ttds-K(SS)biotin) were synthesized by JPT Innovative
Peptide Solutions (GmbH, Berlin, Germany). Ttds was a (N-(3-{2-[2-(3-amino-
propoxy)-ethoxy]-ethoxy}-propyl)-succinamic acid linker and biotin was linked to the
Ttds carboxylic group. Linear polyethylenimine modified with 16% histidine residues
(His-lPEI) (kindly given by Prof H. Cheradame, LAMBE, Evry, France) was synthesized
as described.[32]
4.2. Plasmids. pLuc (pTG11033, 9514 bp, Transgene S.A., Strasbourg, France) and
peGFP (5130 bp) encoded the firefly luciferase (Luc) and the Yellow Fish enhanced
Green Fluorescent Protein genes under the control of the CMV promoter, respectively.
pGEM-4Z-Luc encoded the firefly Luciferase gene under the T7 RNA polymerase
promoter of -bacteriophage. pP38-57-RLuc and pP79-98-RLuc were pDNA encoding
P38-57 and P79-98 fused with Renilla luciferase (RLuc). E3-14.7K cDNA (NCBI
Reference Sequence: AP_000224.1) without stop codon synthesized by Genscript
(Piscataway, NJ) was fused with RLuc in pRLuc-N1 under the control of the CMV
promoter (Perkin Elmer, Waltham, MA). Single strand sense (s) and antisense (as)
oligonucleotides coding for P38-57 and P79-98 were synthesized by Eurogentec
(Anger, France): sP38-57:
atgggcgaattcATGGTTAACTTGCACCAGTGCAAAAGGGGTATCTTTTGTCTGGTAAGCA
GGCCAAAGTCACCttggatccatgggc; asP38-57: gcccatggatccaaGGTGACTTTGGCCTGCT
TTACCAGACAAAAGATACCCCTTTTGCACTGGTGCAAGTTAACCATgaattcgcccat;
sP79-98: atgggcgaattcATGGTGGTCATGGTGGGAGAAAAGCCCATTACCATAACTCAG
CACTCGGTAGAAACCGAAGGCttggatccatgggc; asP79-98: gcccatggatccaaGCCTTCGGT
152
TTCTACCGAGTGCTGAGTTATGGTAATGGGCTTTTCTCCCACCATGACCACCATgaatt
cgcccat. Oligonucleotides were annealed for 10 min at 95°C in 10mM Tris-HCl, 0.1M
NaCl and 1mM EDTA, pH 7.5. Double stranded oligonucleotides were digested by
EcoRI and BamHI and cloned in fusion with RLuc in pRLuc-N1. pFIP-1-eGFP was a
homemade pDNA constructed from pcDNA-T7-FIP-1 (kindly given by Prof M. S.
Horwitz, Albert Einstein College of Medicine of New York).[17] peGFP-N3 from
Clontech (Mountair View, CA) encoded eGFP under the CMV promoter. Supercoiled
DNA was isolated from E. Coli D( super competent bacteria by alkali lysis and
purification with QIAGEN Mega Kit Endotoxin free Plasmid. pTG11033 was labeled
with cyanine 3 (Cy3) or cyanine 5 (Cy5) using the respective Label IT nucleic acid
labeling kit (MIRUS, Madison, WI) at 1:3 reagent/pDNA weight ratio. pDNA was linked
with biotin using the Label-IT kit (MIRUS). The labeling density was estimated
between one to three biotin molecules per pDNA copy.
4.3. Cells. HeLa cells (CCL2, ATCC, Rockville, MD) were routinely grown at 37°C in a
humidified atmosphere of 5% CO2 in DMEM supplemented with 10% heat-inactivated
fetal bovine serum, 2mM L-glutamine, 1% non-essential amino acids and 100 U/mL
penicillin and 50 U/mL streptomycin. The HeLa cells line stably expressing GFP-
tubulin was prepared by transfecting 2.106 HeLa cells with 20 g of pGFP-tubulin
(Clontech) complexed with His-lPEI and stably transfected cells were selected with
G418 (800 g/mL . A GFP clone was isolated with a cell sorter FACSVantage, Becton
Dickinson), and cultured in the presence of 400 µg/mL G418.
4.4. Transfection. Polyplexes were prepared by mixing His-lPEI (15 µg in 15 µL of 10
mM HEPES buffer, pH 7.4) to pDNA (2.5 µg in 32.5 µL of 10 mM HEPES buffer, pH 7.4).
Upon 4 s mixing by vortex, the solution was kept for 30 min at 20°C before use. The
153
solution was then adjusted to 500 µL with complete culture medium. Two days prior to
transfection, cells were seeded at 5.104 cells/well in 500 µL of culture medium in a 24-
well plate. The cells were incubated with polyplexes (500 µL; 2.5 µg DNA) for 4 h at
37°C, the medium removed, replaced with complete medium without polyplexes and
the cells were cultured at 37°C.
4.5. Laser Scanning Confocal Microscopy. Cells seeded in a 4-well Lab-Tek
chambered cover glass were transfected with polyplexes made with fluorescent pDNA.
Upon 2 h to 4 h transfection, cells were observed either upon fixation or in real-time by
using a Zeiss Axiovert 200M microscope coupled with a Zeiss LSM 510 Meta scanning
device (Carl Zeiss Co. Ltd., Iena, Germany). The inverted microscope was equipped
with a Plan-Apochromat 63X objective (NA=1.4) and with a temperature controlled
stage. Images were recorded with LSM 510 Meta software and analyzed with the ImageJ
software.[33] When indicated, cells were fixed with 4% p-formaldehyde. Cover slips
were mounted on slides using Vectashield mounting medium.
4.6. Videomicroscopy. Cells were transfected with fluorescent pDNA as described
above. Videomicroscopy was performed using a Zeiss Axio OBSERVER Z1 microscope
(Carl Zeiss) equipped with a COLIBRI system Lamp allowing fluorescence analysis (4
LED ex 365 nm, 470 nm, 555 nm and 625 nm). The inverted microscope was equipped
with a Plan NEOFLUAR 40X objective (NA = 0.75) and a temperature controlled stage.
pDNA tracking was performed using the Imaris software (Bitplane AG, Zurich,
Switzerland).
4.7. BRET. Hela cells in 24-well plates were transfected with polyplexes containing 2.5
g pDNA (pE3-14.7K-RLuc plus pFIP-1-eGFP or pP38-57-RLuc plus pFIP-1-eGFP or
pP79-98-RLuc plus pFIP-1-eGFP). Cells were washed 24 h after transfection, harvested
154
by trypsin/EDTA treatment and transferred into 96-well white-optiplates containing
200 µL of complete culture medium. Upon 24 h, cells were washed twice with PBS and
µL Coelenterazine ( in PBS . M final concentration )nvitrogen was added.
BRET was measured after 15 min incubation. Signals were collected using a 450/58
filter (RLuc) and a 480/LP (cutoff at 480 nm) filter (GFP) with the Mithras LB 940
(Berthold Technologies). All experiments were repeated at least 2 times.
4.8. P79-98/pDNA interaction with isolated microtubules. Isolated microtubules
were formed using X-rhodamine labeled tubulin extracted from bovine brain
(Cytoskeleton Inc., Denver, CO). Microtubules were polymerized and stabilized in G-
PEM buffer (80 mM PIPES, 2 mM MgCl2, 0.5 mM EGTA, 1 mM GTP, 30% (w/v) glycerol
and 20 µM taxol, pH 6.9). Microtubules were incubated with fluorescent pDNA
coupled or not with bio-P79-98 in cytosolic extract from HeLa cells supplemented with
10 mM ATP. Cytosolic extracts were prepared as followed: cells were washed with ice-
cold PBS, scraped from the dish, suspended in Homogenization Buffer (250 mM
sucrose, 3 mM imidazole, 0.1% gelatin, pH 7.4) and lysed in the presence of 1µg/mL
antipain, 1µg/mL pepstatin, 1µg/mL leupeptin, 15 µg/mL benzamidine using a
disposable syringe size-22G needle.
4.9. In vitro translation and transcription. Experiments were performed using the
TNT Quick Coupled Transcription/Translation Systems Kit (Promega) following the
manufacturer instructions. In a 1.5 mL Eppendorf tube, 0.2 µg of pT7-Luc plasmid
(pGEM4Z-Luc) in 2.6 µL 10 mM Hepes buffer, pH 7.4 free or complexed with vectors at
various charge ratios was mixed with 40 µL of Quick Master Mix and 1µL of 1mM
Methionine. The solution was adjusted to 50 µL with H2O and the mixture was
incubated for 1 h and 30 min at 30°C. Then 0.5 µL of the mixture was added to 50 µL of
155
LAR (Luciferase Assay Reagent) and the luciferase activity was measured for 10 s two
times with a 2 s interval using a luminometer (LUMAT LB 9507).
Acknowledgements
The French Association Vaincre la Mucoviscidose VLM and Association Française
contre les Myopathies AFM are gratefully acknowledged for their financial support.
LP received a PhD fellowship from VLM. We also acknowledge Dr Corinne Laplace-
Builhé and Sophie Salomé-Desnoulez (Photon Imaging and Flow Cytometry, Institut
Gustave Roussy, Villejuif, France) for their help in image tracking analysis.
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Figure 1: P79-98 of E3-14.7K interacts with FIP-1. BRET monitoring macromolecular
interactions between FIP1-eGFP and Renilla luciferase fused either with () E3-14.7K
(E3-14.7K-Rluc), (○) P79-98 (P79-98-Rluc) or () P38-57 (P38-57-Rluc). A/D is the
acceptor and donor ratio.
Figure 2: Conjugation of P79-98 with plasmid DNA. (A) Scheme of assembly of
biotinylated and Cy5-pDNA with P79-98 peptide loaded streptavidin. (B) Conjugation
of biotinylated P79-98 to streptavidin (STR). Increasing amounts of bio-P79-98 were
mixed with STR for 1 h in PBS at room temperature. SDS-PAGE (12%): samples were
heat at 95°C to dissociate unloaded STR in 4 monomers of 14 kDa. (a) STR loaded with
peptide-bio (65 kDa); (b) streptavidin monomers (14 kDa). (C) Conjugation of pDNA
with P79-98-bio/STR. Six P79-98-bio/STR molecules were mixed per bio-pDNA
molecule for 1 h in PBS. SDS-PAGE (12%) Lane 1: P79-98-bio/STR/pDNA (P79-
98/pDNA) conjugate; lane 2: P79-98-bio/STR conjugate.
Figure 3: Interaction of P79-98/pDNA with isolated microtubules. In vitro
polymerized X-rhodamine microtubules were incubated with bio-Cy5-pDNA
conjugated either with (A) P79-98-STR or (B) STR. Scale bar: 5 µm.
Figure 4: P79-98 allows intracellular interaction of pDNA with microtubules.
LSCM images of live HeLa cells stably expressing GFP-tubulin upon transfection for 4
159
h with His-lPEI polyplexes made with bio-Cy3-pDNA conjugated with (A) P79-98-STR
or (B) STR. On the right are zoom of areas in square a, b and c. Scale bar: 5 µm.
Figure 5: P79-98 allows active movement of pDNA on microtubules. Tracking of
bio-Cy3-pDNA conjugated with P79-98-STR in HeLa cells stably expressing GFP-
tubulin transfected for 90 min with His-lPEI polyplexes. Time laps acquisitions were
performed by videomicroscopy and particles tracking analyzed using Imaris software.
Scale bar: 10 µm.
Figure 6: In vitro translation and transcription assays of pT7-Luc (pGEM4Z-Luc)
upon substitution with 3 biotin molecules (Bio) and upon association either with
streptavidin (STR), P38-57-bio-streptavidin (P38-57-STR), P79-98-bio-streptavidin
(P79-98-STR) or P79-98-SS-bio-streptavidin (P79-98(SS)-STR).
Figure 7: P79-98 increases the transfection efficiency of polyplexes. Hela cells
were transfected with His-lPEI polyplexes made with bio-peGFP conjugated either
with STR, P38-57-STR, P79-98-STR or P79-98(SS)-STR. The number of eGFP
transfected cells was measured by flow cytometry 48h after the transfection.
160
Figure 1
161
Figure 2
162
Figure 6
163
Figure 7
164
The table of contents entry
P79-98 peptide responsible of the E3-14.7K/FIP-1 interaction with microtubules is
linked to a plasmid DNA to favor its cytosolic migration during cell transfection with a
cationic polymer. P79-98 allows docking and transport of DNA along microtubules.
P79-98/peGFP polyplexes enhance drastically the number of transfected cells. This is a
real breakthrough in the non viral gene delivery field.
Transfection
80
Docking of Cy3-pDNA to X-rhodamine
Transfected cells (%)

microtubules 70
60
50
40
30
20
- E3-14.7K peptide +
10
- +
E3-14.7K peptide
165
Cover proposition
A breakthrough in the field of gene transfer by non viral vectors is described on page --
by L. Pigeon and co-workers. For the first time, it is shown that improved cytosolic
migration of plasmid DNA along microtubule greatly enhances the transfection
efficiency. The proposed design consists of a plasmid DNA conjugated with a peptide
(P79-98) from adenoviral early protein E3-14.7K. This peptide mediates plasmid DNA
binding on microtubules via FIP-1 and the TCTEL1 light chain of dynein. Large
amplitude linear transport of the plasmid DNA along microtubules toward the nuclear
envelop is evidenced by video-microscopy experiments. This facilitating microtubule
transport improves remarkably the number of cells expressing transgene. Cover
illustration by Benjamin Laurent.
166
Conclusion
Perspectives
167
Conclusion-Perspectives
Les résultats obtenus au cours de mon travail de thèse se divisent en deux parties :
- Tout d abord une étude des interactions in cellulo entre les protéines E3-14.7K, FIP-1,
TCTEL1 et les microtubules.
- Ensuite une exploitation des connaissances obtenues pour l amélioration du trafic
cytosolique d ADNp dans le cadre du transfert non viral de gènes.
I- ETUDE DES INTERACTIONS E3-14.7K / FIP-1 ET LES MICROTUBULES
Nous avons étudié les interactions in cellulo entre la protéine anti-apoptotique E3-
. K d Adénovirus, la protéine cytosolique F)P-1, la chaîne légère de la dynéine TCTEL1 et
les microtubules. Ces études d interaction nous ont permis d identifier un peptide d E -
14.7K de 20 acides aminés, nommé P79-98, responsable de son interaction directe avec la
protéine cytosolique FIP-1. Par cette interaction directe, le peptide P79-98 seul est capable
d interagir avec les microtubules in vitro et in cellulo par l intermédiaire de la chaîne légère
de la dynéine. De façon intéressante, P79-98 provoque une perturbation du cycle cellulaire
avec une perte des cellules en G2/M au profit des cellules en phase S. Cette nouvelle
propriété permet d attribuer une spécificité au peptide P79- d E -14.7K dans son
interaction avec FIP-1, protéine impliquée dans le transport de macromolécules au noyau
et dans le contrôle du cycle cellulaire.
En s intéressant au rôle de F)P-1 dans le trafic de macromolécules, nous proposons

un mécanisme nouveau permettant de relier l interaction d E -14.7K et FIP-1 dans le rôle
anti-apoptotique d E -14.7K (Figure 31). Par son interaction avec FIP-1, le peptide P79-98
bloquerait l internalisation des récepteurs TNF- TNFR au sein des vésicules clathrine
appelées TNF réceptosomes qui nécessiteraient un transport exploitant les microtubules
au cours de leur trafic intracellulaire pour permettre l activation de l apoptose. Ce nouveau
mécanisme place l interaction entre E -14.7K et FIP- dans la stratégie mise en œuvre par
l Adénovirus pour contrecarrer l apoptose des cellules infectées.Ainsi, en interagissant avec
ses partenaires intracellulaires (FIPs), E3-14.7K agirait comme un leurre (Decoy) protéique
permettant d inhiber l apoptose figure .
Cependant, cette hypothèse doit être validée en vérifiant l intervention de F)P1-dans ce

trafic intracellulaire des TNF receptosomes, non décrit jusqu à présent. Pour cela, nous
envisageons :
168
-de mettre en évidence la locatisation de FIP-1 au niveau des vésicules recouvertes de

clathrine, des endosomes précoces ou simplement les TNF réceptosomes pour répondre à
la question suivante : l intervention de F)P-1 en tant que petites GTPases est elle spécifique
des TNF réceptosomes ou des vésicules à clathrine en général ?
-quel est l effet de l interaction de E . K avec F)P-1 sur cette supposée intervention de
FIP-1 dans le trafic des TNF receptosomes;
-une évaluation de l effet de la déstabilisation des microtubules sur l induction de

l apoptose par TNF-a
Si cette hypothèse est vérifiée, le P79_98 ou des analogues pourrait être proposé comme
un agent permettant de lutter contre les infections par les adénovirus.
TNFα
internalisation
TNFR1
TRADD
TRAF TNF receptosome
RIP
FIP-2
E3-
14.7K TNFR1
caspases E3-
Interaction
14.7K
FIP-2 NIK
FIP-1
FIP-3
E3-
14.7K Voie NFκB MT
C
TNFR1
Interaction
FIP-3 E3- Apoptose
14.7K
FIP-4
D
Interaction
FIP-4
Figure 31 : Nouveau schéma d interaction de E3-14.7K avec ses partenaires intracellulaires

F)Ps en incluant l implication d E - . K sur l inhibition de l internalisation du TNFR. (A)
E3- . K bloque l internalisation du récepteur TNF via F)P-1 (B) E3- . K active la voie NF B protectrice
de l apoptose par son interaction avec FIP-3 (ou NEMO), (C) FIP-2 et (D) E3-14.7K interagit avec FIP-4
(aussi appelé AIF)
169
Outre son grand intérêt pour cibler les microtubules et induire un transport rétrograde
vers le noyau de molécules cargo incluant des ADN plasmidiques, le peptide P79- dE -
14.7K présente la particularité intéressante de perturber le cycle cellulaire en inhibant le
passage des cellules de la phase S à G2/M. Sachant que FIP-1 est impliqué dans la
réorganisation du cytosquelette lors de la division cellulaire, le
peptide P79-98 pourrait être une molécule intéressante pour développer de nouveaux
agents capables d inhiber la croissance tumorale. Une étude mécanistique serait mener
pour mieux définir cette hypothèse.
II- UTILISATION DU PEPTIDE P79-98 DANS LE TRANSFERT DE GENES
Après avoir identifié le peptide P79-98, nous avons mis au point une méthode
standardisée de greffage ce peptide sur l ADNp grâce à un pont streptavidine-biotine.
Après couplage avec le peptide P79- , les particules d ADNp sont capables d interagir
avec les microtubules in vitro et in cellulo. Des expériences de vidéomicroscopie, nous ont
permis d étudier l influence du peptide P - sur le trafic de l ADNp au cours du
processus de transfection. Les particules d ADNp couplées au peptide P -98 montre un
transport linéaire de grande amplitude le long des microtubules après transfection des
cellules avec les polyplexes. De façon remarquable, le couplage du peptide P79-98 sur
l ADNp augmente drastiquement, jusqu à %, l efficacité transfection des cellules (eLa
par des polyplexes. Ce résultat ouvre de nouvelles perspectives pour l élaboration de virus
artificiels.
Une recherche de la taille minimale efficace de ce peptide de 20 acides aminés sera

effectuée afin de réduire la taille de celui-ci. Un peptide plus court pourrait également
prévenir une éventuelle immunogénicité.
L amélioration du trafic cytosolique d ADNp grâce à son couplage avec le peptide

P79-98 apparaît très prometteuse pour le transfert de gènes. Ces résultats représentent une
très grande avancée dans le domaine du transfert non viral de gènes et nous incitent à
poursuivre le développement de cette stratégie. Pour cela plusieurs voies de
développement peuvent être envisagées.
170
Optimisation de la méthode de couplage ADNp/peptide
Dans un premier temps, il sera nécessaire de changer la méthode de greffage entre

l ADNp et le peptide P79- . En effet, la streptavidine n est pas utilisable en thérapie
humaine. Pour cela, il est envisagé d utiliser le plasmide Genegrip Gene Therapy Systems ,
qui présente un site GeneGrip composé de huit séquences oligopurine et oligopyrimidine
répétées en tandem sur lesquelles pourront se fixer des bis-PNA couplés au peptide P79-98
après formation de triple-hélices (Figure 32) [Zelphati et al., 1999]. Les PNA (pour Peptide
Nucleic Acids sont des analogues peptidiques d oligonucléotides [Nielsen et al. 1991].
L avantage de cette stratégie est que le greffage peptidique ne sera plus aléatoire et se fera
uniquement au niveau de cette séquence placée à distance des séquences indispensables à
la transcription.
Figure 32 : Plasmide pGeneGrip™. Le plasmide Genegrip

contient un site constitué de séquences oligopurine et oligopyrimidine
de 8bp répétées en tandem, chacune est capable de lier un bis-PNA
couplé à un peptide. (d'après GeneTherapy Systems).
171
Synergie avec signal d importation nucléaire NF
Il est envisagé de combiner le signal de transport cytosolique P79-98 avec le signal

3NF d importation nucléaire d ADNp développé au laboratoire Gonçalves et al., 2009. Il a
en effet été montré que l utilisation de deux séquences NF contenant des motifs B
encadrant la cassette d expression permet l interaction avec le facteur de transcription
NF B dans le cytosol. Ceci favorise l importation nucléaire du plasmide par un mécanisme
faisant intervenir des importines pour le passage au travers du pore nucléaire (Généralités
– Chapitre I- ))). . Comme il est montré dans la figure , l insertion de deux séquences
NF dans d un plasmide NF-CMV-Luc3NF) induit une augmentation de plus de 80 fois
de l expression du transgène in vitro en présence de TNF- cytokine activatrice de la voie
NF B comparativement au même plasmide dépourvu de ces séquences NF.
Par l action combinée des séquences NF avec le peptide P -98, il peut être
attendu un effet synergique et par conséquent une augmentation de l efficacité de transfert
de gènes. Sachant que Mesika et al. ont évoqué la possibilité que NF B se déplace le long
des microtubules en empruntant la dynéine (Généralités – Chapitre II –III.2), la
combinaison des deux signaux pourrait n avoir aucun effet bénéfique supplémentaire sur
la transfection Mesika et al., 2001. Pour évaluer cet effet synergique, j ai réalisé les
constructions plasmidiques suivantes : p3NF-CMV-luc-3NF-Genegrip et p3NF-CMV-eGFP-
3NF-Genegrip. Dans ces deux plasmides les cassettes d expression luciférase luc ou eGFP,
sous le contrôle d un promoteur CMV, sont encadrées par deux séquences NF. Un site
Genegrip, en dehors de la cassette d expression permet l accrochage du peptide P -98.
172
Figure 33 : Comparaison de l expression des plasmides PTG et

3NF-CMV-luc-3NF. Les cellules HeLa sont transfectées avec le plasmide
PTG11033 (blanc) ou le plasmide 3NF-CMV-luc-3NF (noir) en présence ou en
absence de TNF- . Quarante-huit heures après transfection activité luciférase est
mesurée.
Applications dans les méthodes physiques de transfert de gènes
Outre l utilisation avec des vecteurs chimiques de transfert de gènes, le P79-98

pourrait être utilisé dans le cadre du transfert de gènes par des méthodes physiques. Il faut
toutefois noter que pour cela, la méthode de transfert de gènes utilisée ne déstabilise pas le
réseau de microtubules. Des expériences préliminaires réalisées sur des cellules HeLa en
utilisant la technique de sonoporation, montrent un effet bénéfique du peptide P79-98 sur
la transfection (Figure 34).
173
Figure 34 : Utilisation du P79- pour l amélioration du trafic cytosolique d ADNp

dans le cadre de la sonoporation. Les cellules HeLa sont transfectées par sonoporation avec
le plasmide 3NF-CMV-eGFP-3NF couplé à la streptavidine (STR), au peptide contrôle P38-57-
STR, au peptide P79-98-STR. ( après l efficacité de transfection est contrôlé par cytométrie en
flux (A) et par microscopie à fluorescence (B).
Cellules différenciées – Taille des plasmides
Certains paramètres déterminants restent à renseigner :

- )l sera important de vérifier l effet du peptide P79-98 sur des cellules primaires ou
quiescentes. Lorsque les cellules procèdent à leur division par la mitose, l enveloppe
nucléaire est rompue, les plasmides présents dans le cytoplasme peuvent donc entrer dans
le noyau à ce stade du cycle cellulaire. En absence de division cellulaire, les particules
d ADNp doivent pénétrer le noyau par le pore nucléaire Dowty et al., 1995. L amélioration
trafic cytosolique et du passage nucléaire de l ADNp trouve ainsi tout son sens dans la
transfection des cellules primaires ou quiescentes.
- L effet le peptide P79-98 devrait fortement augmenter le transport de plasmides de

très grande taille, immobiles dans le cytosol, et en particulier devrait permettre
174
d augmenter de façon remarquable la transfection de plasmides codant de grands gènes tel

ceux codant pour le gène CFTR, dans le cas de la mucoviscidose et pour le gène de la
dystrophine dans le cas de la DMD.
175
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206
Lucie PIGEON
Interactions moléculaires et cellulaires entre les protéines E3-14.7K

FIP-1 et les microtubules : Application dans le transfert de gènes
L’objectif de la thérapie génique est de guérir des déficiences génétiques et de nombreuses

maladies acquises par l'introduction d'acides nucléiques dans les cellules mammifères. Les vecteurs
chimiques sont une alternative aux vecteurs viraux pour le transfert de gène, leur immunogénicité est
réduite, en plus de leur faible coût et de la facilité de leur production. Jusqu'à présent, les liposomes et les
polymères cationiques sont les vecteurs chimiques les plus étudiés et utilisés pour le transfert d'ADN
plasmidique (ADNp) thérapeutique. Parmi les multiples barrières biologiques, la diffusion cytosolique limitée
de l’ADNp est critique pour le niveau d'expression du transgène. Le but de ce travail de thèse était
d'identifier un peptide de liaison à la dynéine, qui serait capable de recruter la protéine motrice dynéine et
de faciliter le transport d’ADNp vers le noyau le long des microtubules. Nous avons donc étudié le réseau
d'interaction de la protéine adénovirale E3-14.7K. E3-14.7K est indirectement en interaction avec la chaîne
légère de la dynéine TCTEL1 par l’intermédiaire de FIP-1. Différentes techniques ont été utilisées pour
analyser les interactions de ces différentes protéines telles que Bioluminescence Resonance Energy
Transfer (BRET), Förster Resonance Energy Transfer (FRET), Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM),
immunoprécipitation et Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM). La technique de BRET nous a
permis d'identifier un peptide de 20 acides aminés d'E3-14.7K (P79-98) responsable de son interaction
avec FIP-1. Associé à des Quantum Dots P79-98 (P79-98-Qdot) colocalise avec les microtubules isolés et
dans les cellules HeLa. Nous avons mis au point une méthode de greffage du peptide directement sur
l’ADNp. Une fois greffé avec P79-98 l’ADNp est capable d'interagir avec les microtubules dans les cellules
HeLa et de migrer activement jusqu’au noyau. P79-98 améliore l'efficacité de la transfection des HeLa
jusqu’à 77%.
Mots clés : Thérapie génique – trafic – microtubule – dynéine – E3-14.7K
Molecular and cellular interactions between proteins E3-14.7K, FIP-1 and

microtubules: Application in gene transfer
Gene therapy aims to cure genetic deficiencies and a large variety of acquired diseases by the
introduction of nucleic acids into mammalian cells. As an alternative to viral gene delivery vectors, chemical
vectors have been developed with reduced immunogenicity, in addition to low cost and ease of production. So
far, cationic liposomes and cationic polymers are the most studied and used chemical vectors to transfer
therapeutic plasmid DNA (pDNA). Among multiple biological barriers, the limited cytosolic diffusion of pDNA is
critical for level of transgene expression. The goal of this work was to identify a dynein-binding peptide which
would facilitate the transport of pDNA to the nucleus along microtubules. To this end, we have investigated
interaction network of adenoviral protein E3 14.7K. E314.7K is indirectly interacting with Dynein Light Chain
TCTEL1 through FIP-1. Different techniques have been used to analyze the protein interactions such as
Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), Förster Resonance Energy Transfer (FRET),
Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), immunoprecipitation and Laser Scanning Confocal Microscopy
(LSCM). BRET technique allow us to identify a 20 amino acids peptide of E3 14.7K (P79-98) responsible for
its interaction with FIP-1. Associated with Quantum Dots P79-98 (P79-98-Qdot) gave colocalizations with
isolated microtubules and microtubules in HeLa cells. We have developed the grafting of the peptide directly
on the pDNA. Once grafted with P79-98 pDNA is able to interact with microtubules in HeLa cells and traffick
along them toward nucleus. Remarkably transfection efficiency of polyplexes is increased up to 77% in HeLa
cells.
Keywords: gene therapy – traffic – microtubule – dynein – E3-14.7K
Centre de Biophysique Moléculaire

Rue Charles Sadron
45071 Orléans Cedex 02

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Interactions moléculaires et cellulaires entre les

protéines E3-14.7K, FIP-1 et les microtubules :

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HAL is a multi-disciplinary open access L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est

ÉCOLE DOCTORALE SCIENCES ET TECHNOLOGIES

Centre de Biophysique Moléculaire

THÈSE présentée par :

pour obtenir le grade de : Docteur de l’université d’Orléans

Interactions moléculaires et cellulaires entre

THÈSE dirigée par :

CHAPITRE II : AMELIORATION DU TRAFIC CYTOSOLIQUE ............................ 43

CHAPITRE III : LA PROTEINE D’ADENOVIRUS E3-14.7K, FIP-1 ET LES

Résultats Partie I Etude des interactions entre E3-14.7K, FIP-1

Résultats Partie II Utilisation du peptide P79-98 dans le

Conclusion Perspectives ................................................................................ 167

Références bibliographiques ....................................................................... 176

- « Interaction of adenoviral E3-14.7K with microtubules network: identification of P79-98

I.1 : Principe et définition

La thérapie génique est le transfert, véhiculé ou non par un vecteur, de molécules

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