Chapitre 1 : Les grands groupes microbiens intéressant la microbiologie alimentaire

Introduction :
Les aliments que nous consommons ne sont pas stériles : ils contiennent de nombreux micro-
organismes tels que des bactéries, virus, parasites, levures et moisissures.
Il existe quatre catégories de microorganismes importants dans les aliments :
• les micro-organismes « utiles », qui vont apporter à la denrée des propriétés organoleptiques
(arômes, acidité, texture) ou une meilleure conservation ;
• les micro-organismes « d'altération » qui dégradent les propriétés organoleptiques de l'aliment ;
(Moisissures et Pseudomonas…)
• les micro-organismes « indicateurs d’hygiène », et Témoins de contamination fécale.
(Coliformes…) dont le faible niveau de concentration indique l’acceptabilité du procédé de
production ;
• les micro-organismes « pathogènes », susceptibles de provoquer une maladie chez le consommateur
(Salmonella, Listeria…..)
But de l’analyse microbiologique de l’aliment :
Rechercher et dénombrer les micro-organismes pour assurer :
La Qualité marchande : Germes qui provoquent l’altération de l’aliment. Saveur, odeur…
La Qualité hygiénique : Germes potentiellement pathogènes qui provoquent l'intoxication
alimentaire.
Chapitre І : Les grands groupes microbiens intéressants la microbiologie alimentaire
1- Entérobactéries ( famille des Enterobacteriaceae)
Les membres de la famille des Enterobacteriaceae regroupent de nombreuse espèces (commensale
ou parfois pathogène) dont la plupart sont des hôtes normaux (commensale dans l’intestin de
l’homme et les animaux), elles représentent 10% de la flore totale aero-anaerobie de l’intestin de
l’homme, se trouvent aussi dans la nature comme saprophytes dans le sol et les eaux. Ils sont très
répondus dans la nature en raison de la contamination de l'environnement par les matières fécales
animales. Ce sont des contaminants alimentaires très fréquents. Certains sont dangereux et peuvent
être à l'origine d'intoxications.
Ce sont des bactéries indicatrices, elles peuvent signifier un défaut d’hygiène lors des processus de
fabrication: une contamination fécale, environnementale, une insuffisance des procédés de
traitements, un défaut d’hygiène du matériel et de l’équipement utilisés,. Pour les produits prêts à
consommer et conservés sous réfrigération, les entérobactéries peuvent également signifier une
conservation à des températures trop élevées ou pendant une durée trop longue.
1-1- Caractères généraux :
Les Entérobactéries sont des bacilles ou coccobacille Gram négatif, non sporulants, aéro-anaérobies
facultatifs. Ils sont soit mobiles (ciliatures le plus souvent péritriche) ou immobiles (Klebsiella,
Shigella).
Les entérobactéries:
  fermentent le glucose avec ou sans production de gaz.
 nitrates réductase positive
 oxydase négative
 on rencontre certaines souches qui sont capsulées (Klebsiella)
 généralement catalase positive
Au sein des entérobactéries, on distingue de nombreux genres (Escherichia, Shigella, Salmonella,
Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Citrobacter, Hafnia,
Yersinia).La distinction entre les genres se fait par l'étude des proprétés culturales, biochimiques,
antigénique et moléculaire.
Caractères culturaux:
Les entérobactéries sont des germes non exigeants Poussant sur milieu ordinaire comme la gélose
nutritive. La résistance aux sels biliaires ainsi l’assimilation préférentielle de certaine substrat
(sucre…) est à la base des milieux séléctifs (liquide ou solide) utilisé pour la culture et l'isolement
des Entérobactéries, les plus courants sont:
• Le milieu glucosé bilié au cristal violet et au rouge neutre (VRBG ou VRBGA)
• Le milieu lactosé au pourpre de bromocrésol (BCP)
• Le milieu Mac Conkey, Hectoen
La température optimale de croissance est 37°C mais la culture est possible entre 20° et 40°C.
En milieu liquide : Les entérobactéries occasionnent un trouble homogène en bouillon.
Sur gélose : Les colonies sont généralement rondes, lisses, à contour régulier et leur diamètre est de 2
à 3 mm après 18 heures d'incubation à 35 - 37 °C.
Caractères antigénique :
Les entérobactéries possèdent une structure particulière donnant naissance à trois types d’antigène
(Ag O, Ag K, Ag H), l’Ag O est le seul constamment exprimé chez tous les bactéries de ce groupe
mais de structure différente d’une bactérie a une autre.
 Les coliformes
Groupe des coliformes totaux: se sont des entérobactéries qui possédent l’enzyme ß- galactosidase
permettant l’hydrolyse du lactose à 35°C, il regroupe les genres suivants : Escherichia,
Entrerobacter, Klebsiella, Citrobacter. En microbiologie alimentaire les coliformes sont une flore
indicatrice de contamination fécale et de bons marqueurs de la qualité hygiénique générale d'un
aliment.
Coliformes fécaux (coliformes thermotolérants) : (E.coli) : font partie du groupe des coliformes
totaux qui tolèrent la haute température 44°C, et qui constituent les seuls membres de ce groupe que
l'on trouve majoritairement dans les matières fécales des humains et des animaux. Leur présence
dans l'eau et les aliments indique non seulement une contamination récente par des matières fécales,
mais aussi la présence possible de bactéries, virus et protozoaires potentiellement pathogènes.
Escherichia coli: Il s’agit là de coliformes thermotolérants qui produisent , en outre , de l’indole à
partir du tryptophane à 44°C
• La bactérie E. coli représente toutefois 80 à 90 % des coliformes thermotolérants détectés
La colimétrie : désigne le dénombrement des coliformes dans un produit suivi (ou non) de leur
identification.

 Les Salmonella
Entérobactérie, Bacilles à Gram négatif, Mobile (ciliature péritriche), Aéro-anaérobie facultatif,
Oxydase -, Fermentative du glucose, Lactose –, Responsable de toxi-infection alimentaire

Recherche des Salmonella

Cas de produit solide :
- Peser dans un sachet stérile 25 gr du produit à analyser aseptiquement
- Verser l’Eau Peptonée Tamponnée dans le sachet stérile contenant 25 gr de produit
- Broyer l’aliment.
- Verser le contenu dans le flacon d’eau Peptonéé Tamponnée.
Cas de produit liquide :
- Prélever 25 ml de la Suspension mère
- Introduire dans 225 ml d’Eau Peptonée Tamponnée
Étape de pré- enrichissement :
Incuber la solution ensemencée d’Eau Peptonée Tamponnée 18- 24h à 37°C
Etape d’enrichissement :
- Prélever 100 ml de bouillon de pré-enrichissement
- Introduire dans un bouillon au sélénite
- Incuber 18- 24h à 37°C
Etape d’isolement :
Ensemencer par stries une boite de gélose SS (Salmonella, Shigella) à partir du bouillon au sélénite
et incuber 18- 24h à 37°C
Identification
Repiquer 5 colonies typiques de Salmonella sur le milieu TSI
Incuber 24h à 37°C

Lecture

1-2- Tests d'identification biochimique permettant de distinguer les différents genres et espèces :

L'identification biochimique est un examen qui permet d'identifier une bactérie en s'appuyant sur ces
caractères biochimiques.

La galerie classique :

a) Le milieu TSI (Triple sugar iron) : est un milieu qui contient 3 sucre : glucosé saccharose, et lactose.
Contenant du citrate de fer ammoniacal. C'est un milieu que permet la recherche de plusieurs caractères
biochimiques (la fermentation de glucose, lactose, saccharose, la production de gaz et la production de
H2S). Il est très utilisé dans l'indentification des enterobacteriaceae.

b) Le mannitol mobilité : Ce milieu permet l’étude de : la fermentation du mannitol, la mobilité de la

souche.

c) Le citrate de Simmons : est un milieu de culture utilisant le citrate comme seule source de carbone.

d) Milieu d'ONPG :Ce test permet de rechercher la présence d'une enzyme intracellulaire c’est le β-
galactosidase qui permet l'hydrolyse du lactose en glucose et galactose.

Une bactérie lactose négatif peut l'être pour 2 raisons :

- Absence de β-galactosidase.

- Absence de β-galactoside perméase

Le test ONPG permet de recherche directement la présence de β-galactosidase en fournissant à la bactérie
un substrat de cette enzyme :

L'orthonitrophényl- β-D-galactopyranoside.

e) L’oxydase : Le test consiste à mettre en évidence la capacité que possède la bactérie à oxyder un réactif
incolore (la NN-diméthyl-paraphénylène diamine) en un dérivé rose violacé.

f) Catalase :

g) Réaction de VP (Voges-Proskauer) : Elle permet de mettre en évidence la production d’acétoine (acétyl

méthyl carbinol) à partir du glucose.
Cette voie fermentative définit le groupe des KES (Klebsiella, Enterobacter, Serratia).
On réalise une suspension bactérienne en bouillon Clark et Lubs, on incube à 37°C. Après 24-48H, on
prend 1ml de la suspension plus 0,5 ml de réactif de α nephtol (VP2) plus 1ml de soude (hydroxyl de
potasium), après 5 à 10 min la présence d’acétoine se manifeste par l’apparition d’une teinte rose ou
rouge.
En milieu alcalin, l’acétoine se transforme en butandione qui réagit avec l’α-naphtol et donne une
coloration rouge

h) Réaction de RM (Rouge de Methyl) : le test de rouge de méthyl permet de mettre en évidence l’autre
grande voie fermentative des entérobactéries : voie des acides mixtes .

Après incubation de milieu clark et lubs, on prend 1 ml avec quelque goute de réactif RM. Réaction positif
(le pH devient <4,5 et l’indicateur coloré vire au rouge)

Réaction négatif (couleur jaune)

La galerie Api 20 E:

La galerie API 20E compote 20 microtubes contenant des substrats sous forme déshydratée, Les tests sont
inoculés avec une suspension bactérienne qui reconstitue les milieux. Les réactions produites pendant la
période d'incubation se traduisent par des virages colorés spontanées ou révélés par l'addition de réactifs
2- les Pseudomonas
1- Caractères généraux :

Les Pseudomonas sont des bacilles Gram négatif, aérobies stricts, non sporulé, ne fermente pas le glucose,
se développe sur gélose ordinaire, mésophile ou psychrophile, se développe préférentiellement entre 20-
30°C, oxydase positif, catalase positif, mobiles par ciliature polaire, production d’Odeur caractéristique :
odeur de fleur de seringa (orthoaminoacétophénol), Production de deux pigments : Pyocyanine (Bleu vert) et
Pyoverdine (jaune vert).

L’espèce type est Pseudomonas aeroginosa.

2- Habitat :

Les Pseudomonas sont des bactéries ubiquitaires que l'on rencontre dans les sols, sur les végétaux et surtout
dans les eaux douces et marines. De nombreuses souches pouvant se développer à basse température
(souches psychrophiles) contaminent les denrées alimentaires conservées au réfrigérateur.

On peut occasionnellement les isoler de la flore intestinale de l'homme ou de l'animal mais leur capacité à
résister à de nombreux antibiotiques et antiseptiques explique leur présence de plus en plus fréquente en
milieu hospitalier. Ils se comportent comme des pathogènes opportunistes souvent à l'origine d'infections
nosocomiales.

3- Culture :

La culture est facile sur milieux ordinaires. Elle se fait strictement en aérobiose. La température optimale de
croissance est 30°C. Une odeur caractéristique de fleur de seringa s'exhale des cultures.

Le milieu sélectif pour les Pseudomonas est le milieu CFC (Cétrimide Fucidine Céphalosporine)

Dominent dans la flore d'altération superficielle, surtout lorsque la surface des viandes demeure humide. Ils
se développent sur les carcasses des viandes, mais également sur des pièces plus petites ou sur la viande
hachée.

4- Dénombrement des Pseudomonas sur et dans les viandes et produits à base de viande

Préparation de l'échantillon pour un dénombrement sur une viande

- prélever sur une pièce de viande un lambeau superficiel de 2 à 3 mm d'épaisseur d'une surface délimitée (5
cm x 5 cm par exemple).

- Placer le lambeau dans un flacon de verre stérile ou un sac plastique stérile adaptables à l'appareil de
broyage-homogénéisation et contenant 100 mL d'eau peptonée tamponnée.

Réalisation des dilutions

Préparer, à partir de la dilution mère, les dilutions 1O-2, 10-3 , 10-4.

Ensemencement et incubation

- Transférer, dans des boîtes de Pétri stériles, 1 mL des dilutions

- Couler dans chaque boîte environ 15 mL du milieu CFC et bien mélanger.

- Incuber les boîtes retournées à 22°C pendant 48 heures. Si le développement des colonies est insuffisant
après ce délai, prolonger l'incubation pendant 24 heures.

Dénombrer les colonies pour chaque boîte contenant entre 15 et 300 colonies.

-identification

3- Les bactéries acétiques

Bactéries gram négatif, bacille, asporulés, généralement mobile, aérobie, transforme l'alcool (l’éthanol :
CH3-CH2OH) en acide acétique (CH3-COOH). Cette bactérie est utilisée en vinaigrerie pour obtenir les
différents vinaigres

Présentes naturellement sur les fruits, dans l'air, les bactéries acétiques appartiennent, en majorité, au
genre Acetobacter, Gluconobacter

Les caractères de ce groupe peuvent mise en évidence par les tests suivants :

- coloration de Gram ;

- étude des métabolismes de respiration sur gélose viande-foie, test de l’oxydase ;

- Production d’acide acétique a partir de l’éthanol : les bactéries acétiques sont des contaminent
fréquent des produits alcoolisés quel acidifié, dans les industries elles sont utilisé pour la fabrication de
vinaigre, les espèces les plus utilisé : Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurians
4- Les vibrions
1- Caractères généraux :

Gram négatif, Bacilles incurvée (forme de virgule), oxydase positif, catalase positif, mobile par cil polaire
monotriche ou lophotriche, possèdent un métabolisme fermentatif sans production de gaz, température de
croissance (20-30°C) et 37°C pour les espèces pathogènes, possèdent une caractéristique principale c’est le
développement a un pH alcalin (7-9).

Les différentes espèces :

Vibrio costicola : espèce saprophyte parfois pathogène pour les poissons

Vibrio cholerae : espèce pathogène pour l’homme

2- La recherche et l’isolement de Vibrio est particulièrement V.cholerae

Sont basé essentiellement sur leur alcalinophiles

Prélèvements : On peut rechercher VIBRIO dans les eaux et, les aliments tels que les poissons et les
crustacés. Pour le prélèvement de l’eau, l’on a la méthode par « filtration sur membrane » ayant un
diamètre de l’ordre de 0,2 um. L’on peut également prendre directement 500 ml d’eau pour les mélanger
avec de l’eau peptonée alcaline. (EPA)

Enrichissement : les bouillon les plus utilisé : l’eau peptonée alcaline, et l’eau peptonée alcaline hypersaline,
ces milieu sont incubé à 37°C pendant (3-6)h avec un éventuelle repiquage sur le même milieu

Isolement : est réalisé à partir de milieu d’enrichissement sur une gélose nutritive bilié alcaline ou gélose à
base de thiosulfate citrate sel bilié saccharose (TCBS) Ce milieu permet la croissance rapide V. cholerae
pendant une période de 15 à 24 heures à 37° C, sous forme de colonies jaune brun de 2 à 3 mm de diamètre

Identification :
a/- Caractères morphologiques :* Examen a l’état frais : mobilité polaire * Coloration de Gram : B. Gram (-)
incurvé en virgule

b/- Caractères biochimiques :* Aérobie –Anaérobie Facultative (AAF) * Oxydase positif (+) * Catalase (+ ) *
Réduction Nitrates *Fermentation du glucose * Lactose (-) *ONPG (+)

c/- Caractères antigéniques : * Ag O / * Ag H

Ag O : serotypage avec l’immuno-sérum anti-VIBRIO cholerea O : 1 qui induit une agglutination

3- Effet pathogène de V.cholerae :

La bactérie contamine les personnes saines par le biais des aliments contaminés (les poissons, les fruits de la
mer, les fruits et légumes).Le choléra peut aussi résulter d’une contamination de personne à personne. Les
germes qui y échappent, arrivent au niveau du l’intestin grêle et se fixent à la partie proximale. Ils colonisent
ainsi l’intestin grêle grâce à différents facteurs de pathogénicité. La toxine cholérique est produite lorsque la
bactérie adhère à l’épithélium intestinal par des pili. La conséquence est le passage de l’eau et des
électrolytes, des cellules vers la lumière intestinale, pouvant atteindre jusqu’à 15 litres par jour qui entraine
une déshydratation sévère et mortelle. Le choléra se manifeste ainsi par de fortes diarrhées, des
vomissements, des crampes
5- Les brucella

1- Caractère générale
Les Brucella se présentent sous la forme de petits cocco-bacilles immobiles, Gram (-), asporulés,
aérobies stricts, catalase et oxydase positives, RM et VP négatif.

Elles se multiplient lentement sur milieu ordinaire (bactérie exigente). Ce sont des parasites
intracellulaires pathogènes pour un grand nombre d’animaux et pouvant être transmis à l’homme. On
les rencontre fréquemment au niveau du tractus génito-urinaire de nombreux animaux, sauvages et
domestiques (moutons, chèvre, vache, cochon, chien, etc...). L'infection se transmet à l'homme par
contact direct au niveau d'une lésion cutanée ou bien d'une muqueuse, par ingestion de produits
contaminés et enfin par inhalation (aérosolisation).

3 espèces principales

- B. melitensis (caprins, ovins)

- B. abortus (bovins)
- B. suis (porcs)

2- Isolement et identification des Brucella :

La culture se fait sur milieu riche, car se sont des bactéries exigente nécessite la présence des facteurs
de croissance, en utilisant comme milieu :

- Milieu trypticase soja

- Gélose ou bouillon Brucella
Parmi les test d’identification

Test de l’annau (ring-test):

Objectif : Le test de l'anneau ou ring-test est un test immunologique de précipitation en milieu

liquide utilisé classiquement pour la détection de présence de Brucella dans le lait.
Principe : Consiste à ajouter une goutte d’antigène coloré à l’hématoxyline, à 1ml de lait versé dans
un tube étroit, puis mélanger le tout avant de laisser reposer ce mélange jusqu’à ce que la crème soit
remontée à la surface.
-Dans le cas d’un prélèvement positif, l’antigène s’est agglutiné et, adhérant aux globules graisseux
du lait, s’est regroupé en surface dans l’anneau de crème qu’il colore en bleu. La colonne de lait sans
crème située au-dessous retrouve, totalement ou partiellement, sa couleur blanche d’origine.
-Dans le cas d’un prélèvement négatif, l’antigène reste dispersé dans la colonne de lait écrémé qu’il
colore en bleu, et l’anneau de crème reste blanc

3- Effet de Brucella :
Agent de la Brucelloses (Fièvre ondulante), (Fièvre de Malte), -Fièvre méditerranéen).
C’est un parasite intracellulaire qui se déplace vars les organes par l’intermédiaire de circulation
sanguine et lymphatique/
Chez les humaine la brucellose débute par des frisson, des douleurs, de la fièvre et un malaise
générale due à la libération d’un endotoxine, les cas les plus grave se traduit généralement par des
sueurs abondante et des fièvre vespérale (ondulante) et provoqué par B.melitensis cause souvent la
mort.
7- Les microcoques

Genre Staphylococcus Les membres de ce genre sont des coques Gram+, souvent en amas. Certaines
espèces contiennent des pigments caroténoïdes orange ou jaune. Non mobiles, anaérobies facultatifs.
Leurs sources de carbone incluent divers sucres, halophiles c'est-à-dire cultivent en présence de 5 %
de NaCl, catalase+. Les staphylocoques sont répartis en souches coagulase+ et souches coagulase- .
S. aureus, S. epidermidis. Ils sont commensaux et pathogènes chez l'homme et chez d'autres
animaux. Les milieux habituellement utilisées pour leur culture sont : le milieu Chapman et le milieu
Baird-Parker.

S. aureus coagulase+ est pathogène, il produit des entérotoxines thermostables libérées dans
l'aliment lors de la croissance, il s'agit d'une protéine qui agit sur les récepteurs intestinaux et
gastriques. L'intoxination est caractérisée par une incubation de courte durée (1 à 6 heures en
moyenne 3 heures), puis par des symptômes variés : nausée, vomissement, douleurs abdominales,
diarrhée, céphalée, chute de la tension artérielle, quelque fois fièvre. La DMI (Dose Minimale
Infectieuse) est de l'ordre de 105 à 106 germe/g, la quantité de toxine dangereuse pour l'homme est de
0,1 à 10 µg/Kg.
Les aliments dangereux sont nombreux : (viandes, plats cuisinés, produits à base de lait ou d'œufs,
pâtisserie, crèmes glacées, etc). Les entérotoxines ne sont pas hydrolysables par les protéases
digestives (pepsine, trypsine), très résistantes aux traitements thermiques, résistent à la pasteurisation
(60°C/30 min), elles résistent jusqu'à 30 min/100°C. Les aliments à haute concentration en sels et en
sucres constituent un bon milieu de croissance pour S. aureus.

Recherche et dénombrement de Staphylococcus aureus dans les denrées alimentaires

- Préparation du milieu Baird Parker: Ajouter au milieu de base Baird Parker 15 ml de la solution
jaune d’œuf au tellurite de potassium
- Couler la gélose dans des boites de pétri et conserver à +4°C.
- Inoculer les boites avec 0,1 ml des différentes dilutions
- Étaler les gouttes à l’aide d’une pipette râteau
- Incuber les boites de Baird Parker couvercle en haut 48h ±2 à 37°C

1ére lecture 24h ±2

Dénombrer les colonies caractéristiques et non caractéristiques et noter les dilutions correspondantes
 - Réincuber les boites 48 h

Lecture et identification des staphylocoques pathogènes

- 2ème lecture 48h

- tests de confirmation

Dénombrer les colonies caractéristiques et non caractéristiques et noter les dilutions correspondantes

Recherche de la catalase puis de la coagulase

Réaction de la coagulase:

Le test mettant en évidence l’aptitude des bactéries à coaguler le plasma est le principal test
caractérisant S. aureus. Le test de détection consiste à incuber pendant 4 heures à 37°C un mélange
de plasma de lapin et de la souche à tester. L’apparition d’un caillot est observée en inclinant le tube
à 90°C.

Lecture

Le coagulum occupe plus des ¾ du volume du liquide initial.

La recherche de l’entérotoxine devrait être effectuée dans des produits où la production de toxines est
suivie de la mort des staphylocoques. On estime à l’heure actuelle qu’il faut au moins 5.105
staphylocoques par g ou ml de produit pour engendrer une maladie. Pour déceler les entérotoxines on
utilise les techniques de diffusion en milieu gélosé (sur lame) ; il faut dans une première étape
concentrer la toxine de plus de 100 fois. Les épreuves radioimmunologiques peuvent être utilisées
dans les analyses de routine (méthode coûteuse), de même que la technique ELISA. Ces méthodes
sont spécifiques des diverses toxines et il est possible que certaines entérotoxines n’aient pas encore
été identifiées. Toute norme devrait donc préciser les toxines à rechercher. La recherche d’une
ADNase thermostable pourrait constituer une indication de la présence de staphylocoques
entérotoxinogènes.
7- Les streptocoques
1- Généralités
La famille des Streptococcaceae comprend sept genres. Parmi eux, Streptococcus et Enterococcus
regroupent la plupart des espèces responsables d'infections humaines. Les caractéristiques communes
à toutes ces espèces sont : cocci, groupés en chainettes à Gram positif, non sporulés, immobiles,
dépourvus de catalase et d'oxydase, asporulés
- Exigeants (pas de croissance sur gélose ordinaire)
- Anaérobies - Aerotolerants (mise en évidence sur milieu VF (viande-foie)
- Température optimale : 37°C (limites 20 - 40°C)
- pH optimal 7 (pH acide mal toléré)
2- Classification des streptocoques
Leur classification se fonde sur plusieurs critères :
D’après leur pouvoir hémolytique
· hémolyse incomplète : streptocoques α hémolytiques
· hémolyse complète : streptocoques β hémolytiques
· pas d'hémolyse : streptocoques non hémolytiques

D’après leur équipement antigénique (Lancefield)

· un antigène de la paroi, le polyoside C permet de définir plusieurs groupes : A, B, C, D, E, F, G, H,
K, L, M, N, O, P, R, S, T, U, V.
Certains streptocoques, dépourvus de polyoside C, sont dits "non groupables".
On peut mettre en évidence le polyoside C :
· par la technique de Lancefield qui comprend une extraction du polyoside C à partir d'une
suspension de la souche par l'acide chlorhydrique à chaud ou par l'acide nitreux suivie d'une réaction
de précipitation en tube en présence des antisérums spécifiques.
Streptocoques fecaux (les streptocoques du groupe D)

8- Les streptocoques
I/ - Caractéristiques

Les Streptocoques fécaux sont des bactéries ubiquitaires, commensales du tube digestif de l’homme
et des animaux, saprophytes de l’environnement (eau usée, eau douce, eau de mer, dans le sol, sur les
végétaux). Ce sont des indicateurs de contamination fécale. En effet, la présence des streptocoques
fécaux (S. feacalis ) dans les eaux de boissons est considérée comme un signe de contamination
fécale.

Les entérocoques sont susceptibles de contaminer les aliments comme le lait et les produits laitiers,
les viandes et produits de pêche. Notons que Enterococcus feacalis participe à la maturation du
fromage, et est considéré comme un ferment d’arôme.

Certaines souches de Enterococcus sont utilisées comme levain ou ferment

II - dénombrement des streptocoques « D »

Les Streptocoques du groupe D ou Streptocoques fécaux sont recherchés et dénombrés en milieu

liquide par la technique du NPP (nombre le plus probable).

La technique en milieu liquide fait appel à deux tests consécutifs à savoir :

- le test de présomption : réservé à la recherche des Streptocoques sur milieu de Rothe,

- le test de confirmation : réservé à la confirmation proprement dite sur milieu EVA, des tubes
trouvés positifs au niveau des tests de présomption.

 Test de présomption.
Préparer dans un portoir une série de tubes contenant le milieu sélectif de Rothe à raison de trois
tubes par dilution.

A partir des dilutions décimales 10-3 à 10-1, porter aseptiquement 1 ml dans chacun des trois tubes
correspondant à une dilution donnée.

Bien mélanger le milieu et l’inoculum.

Incubation :

L’incubation se fait à 37°C pendant 24 à 48 heures.

Lecture :

Sont considérés comme positifs les tubes présentant un trouble microbien.

Mais attention il n’y a aucun dénombrement à faire à se niveau.

 Test de confirmation ou test de Mac Kenzie.

Chaque tube de Rothe trouvé positif lors du test de présomption fera l’objet d’un repiquage à l’aide
d’une öse bouclée dans un tube de milieu EVA Lytski.
Bien mélanger le milieu et l’inoculum.

Incubation :

L’incubation se fait à 37°C, pendant 24 heures.

Lecture :

Sont considérés comme positifs, les tubes présentant à la fois :

- un trouble microbien,

- une pastille blanchâtre ou violette au fond du tube.

La lecture finale s’effectue également selon les prescriptions de la table de Mac Grady en tenant
compte uniquement des tubes d’EVA positifs ou négatifs.

Si, sur milieu de Rothe :

* à la dilution 10-1 : 2 tubes sur 3 sont positifs, donc à repiquer,

* à la dilution 10-2 : 2 tubes sur 3 sont positifs, donc à repiquer,

* à la dilution 10-3 : 1 tube sur 3 est positif, donc à repiquer.

Cela signifie, qu’on a 5 tubes à repiquer sur milieu EVA.

Après repiquage et incubation, si :

* à la dilution 10-1 : 1 tube sur 2 est positif,

* à la dilution 10-2 : les 2 tubes sont négatifs,

* à la dilution 10-3 : le tube repiqué est positif,

Le nombre caractéristique sera de « 101 », ce qui correspond à 0,7 sur la table de Mac Grady.

On considère donc qu’il y a 0,7 Streptocoques fécaux à la dilution 10-1. Mais tenant compte du
facteur de dilution et pour revenir à 1, il faut multiplier ce nombre par
9- Les bactéries lactiques
Les bactéries lactiques sont des bactéries Gram +, généralement immobiles, asporulées et ont des
exigences nutritionnelles, catalase -. Elles synthétisent leur ATP grâce à la fermentation lactique des
glucides. Les bactéries lactiques sont en général aérotolérantes. Cependant certaines espèces,
habitants le tube digestif des animaux sont anaérobies strictes. Même en présence d'O2 elles sont
incapables de réaliser la phosphorylation oxydative.

1.1. Métabolisme général des bactéries lactiques

1.1.1. Définition du métabolisme

Le métabolisme d'une cellule vivante est l'ensemble des réactions de dégradation (catabolisme) et de
synthèse (anabolisme). Les réactions cataboliques sont exergoniques, c'est-à-dire qu'elles libèrent de
l'énergie, alors que les réactions anaboliques sont endergonique c'est-à-dire qu'elles consomment de
l'énergie.

Le métabolisme énergétique des bactéries lactiques s'effectue donc par un enchaînement de réactions
couplées de déshydrogénation et d'hydrogénation, faisant intervenir un donneur initial qui est
généralement un sucre, un accepteur final qui est le plus souvent le pyruvate, est des intermédiaires
de transport d'électrons qui sont des coenzymes associés à des déshydrogénases. La biosynthèse (ou
anabolisme) est une suite de réactions de polymérisation donnant naissance à de longues chaînes
moléculaires linéaires et ramifiées (polynucléotides, polysaccharides, polypeptides, etc.) qu'on
appelle macromolécules et qui entrent dans la composition des structures essentielles des cellules
bactériennes (appareil nucléaire, paroi, membrane, cytoplasme).

1.1.2 Enzymes et métabolisme

Les bactéries lactiques sont équipées d'un grand nombre d'enzymes différentes qui peuvent être
classées selon les critères suivants :

- Leur localisation dans la bactérie : certaines enzymes sont disposées à la surface des cellules, elles
y restent fixées ou diffusent dans le milieu pour y dégrader les grosses molécules incapables de
traverser la membrane bactérienne ; tandis que d'autres restent dans le cytoplasme ou elles participent
à de nombreuses réactions métaboliques.

- Le type de réaction qu'elles catalysent : 1.oxydoréductases; 2.Transférases; 3. Hydrolases; 4.

Lyases ; 5. Isomérases ; 6. ligases.

- Le substrat qu'elles dégradent: lactase, citratase, protéinases, peptidases, etc. qui fractionnent
spécifiquement le lactose, les citrates, les protéines, les peptides, etc.

1.1.3. Voies du catabolisme des sucres

Selon l'espèce bactérienne et les conditions de culture, le catabolisme du glucose peut suivre une voie
homofermentaire ou une voie hétérofermentaire (Figure 2).

• Les bactéries lactiques homofermentaires transforment une molécule de glucose en deux molécules
de lactate par la voie des hexoses-diphosphates (encore appelée la glycolyse d'EMBDEN-
MEYERHOFF-PARNAS) et génèrent parallèlement deux molécules d'ATP et du NADH2 qui est
réoxydé en NAD pour assurer la poursuite du processus fermentaire (Figure 2) .
C6 H12 O6 2 C3 H6 O3

• Les bactéries lactiques hétérofermentaires transforment une molécule de glucose par la voie des
pentoses-phosphates en une molécule de CO2 et une molécule d'éthanol ou d'acétate et génèrent
parallèlement deux molécules d'ATP et du NADH2 qui est réoxydé en NAD pour assurer la
poursuite du processus fermentaire (Figure 2).

C6 H12 O6 C3 H6 O3 + CO2 + C2 H5 OH (ou C2H4O2 + H2O)

Figure 2 : Transport et catabolisme du glucose par les bactéries lactiques

1.3. Taxonomie

Le groupe des bactéries lactiques inclut les agents de fermentations produisant de l'acide lactique :
bacilles (Lactobacillaceae) et coques (Streptococcaceae).

1.3.1. Les cocci

Les Enterococcus, Streptococcus, Lactococcus, Pediococcus et Leuconostoc sont des cocci, en
paires, en chaînettes ou en tétrades, en général immobiles. Le métabolisme est fermentaire et peut
donner à partir des glucides, de l'acide lactique ou un mélange d'acide lactique, acétique, éthanol et
du CO2 (Leuconostoc). Les besoins nutritionnels sont souvent complexes, la catalase est absente
(parfois variable chez Pediococcus).

Les genres Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus ont été anciennement regroupés en un genre
unique Streptococcus. Ce sont des germes anaérobies facultatifs, généralement microaérophiles. Ils
se développent bien à 37 C°. La plus part des espèces ne sont pas capsulées. Ils ont fréquemment un
pouvoir hémolytique et peuvent être regroupés par des tests sérologiques. Certaines espèces sont
pathogènes en dehors du cadre alimentaire ; elles peuvent cependant se trouver dans les aliments
(Streptocoques des mammites dans le lait) et provoquer des infections. De nombreuses espèces sont
saprophytes, en particulier dans les produits laitiers. Certaines espèces sont abondamment utilisées
dans les industries de fermentation lactique. Ce sont les agents d'acidification et de coagulation
lactiques en fromagerie. Les Streptocoques ont été classés au départ en quatre groupes d'espèces de
Streptococcus selon les critères de Shermann:

• Le groupe pyogenes contient des streptocoques pathogènes, hémolytiques (hémolyse β) et

appartenant aux groupes sérologiques de Lancfield A B C E F G H. L'espèce type est S. pyogenes
(groupe A). Après 1 à 3 jours d'incubation, les troubles se manifestent par des maux de gorge,
céphalées, vomissement et fièvre. Les aliments incriminés sont le lait, les oeufs et crèmes glacées, les
pâtisseries.

• Le groupe viridans comprend les streptocoques à hémolyse α ou γ (groupe K). L'espèce S.

thermophilus est un agent d'acidification fréquent dans certains fromages et surtout les yaourts.

• Le groupe lactique comprend les streptocoques non hémolytique (γ), appartenant au groupe
sérologique N et contient des espèces très importantes en fromagerie, S. lactis et S. cremoris
désormais appelé Lactococcus lactis, Lc. cremoris.

• Le groupe des entérocoques est le groupe des streptocoques fécaux appartenant au groupe
sérologique D. Ce sont des commensaux de l'intestin à hémolyse α, β ou γ. Les germes les plus
rencontrés en alimentation sont essentiellement S. faecalis, S. durans et S. bovis, ils sont maintenant
classés comme Enterococcus. Ce sont des germes test de contamination fécale, ils ne sont
qu'exceptionnellement pathogènes, ce sont alors des pathogènes opportunistes avec des doses
infectantes fortes (108 à 1010 cellules). Enterococcus faecalis résiste à 6.5 % de NaCl et 30 minutes
à 60 C°.

Le genre Leuconostoc

Les Leuconostoc sont des cellules Gram-positives : coccoïdes, par paires ou par chaînettes. Non
mobiles, asporulées, anaérobies facultatives. Leurs métabolisme est fermentatif et respiratoire. En
anaérobiose, elles fermentent le glucose principalement en acide lactique, éthanol et CO2
(fermentation hétérolactique). Elles sont généralement capsulées ce qui entraîne l'apparition d'une
viscosité dans le milieu. Elles ne sont pas hémolytiques ni pathogènes. Elles produisent des accidents
de fabrication dans les produits acides et sucrés (piqûre lactique gazogène, viscosité), dans certains
fromages (bleus) elles facilitent l'ouverture par la production de CO2. Elles interviennent aussi dans
les ensilages (L. mesenteroides) et les végétaux fermentés : les olives, la choucroute, etc., mais aussi
le cacao et le café. Elles se trouvent notamment sur divers produits laitiers et boissons fermentées. Le
pourcentage G+C est environ 38 à 44. L’espèce type est : L. mesenteroides.

1.3.2 Les bacilli

Les Lactobacillus et les Carnobacterium sont des bactéries Gram+, pléomorphes, asporogènes,
immobiles (sauf Lb. agilis). Oxydase et catalase-, pour la plupart aérotolérants, saccharoclastiques,
nitrate-, gélatine-, caséine-, indole-, H2S-, pigmentation-. Certaines souches possèdent une
pseudocatalase. Leur GC % varie de 32 à 53 % (Tableau 3) [1, 8].

Le genre Lactobacillus

Ce genre contient de nombreuses espèces qui sont des agents de fermentation lactique intervenant
dans de nombreuses industries ou qui sont rencontrées comme contaminants. Il s'agit de bacilles
souvent allongés ou coccobacilles, Gram+, asporulés, parfois groupés en paires ou en chaînes,
généralement immobiles. Anaérobies, microaérophiles ou aérobies facultatifs. Habituellement
catalase- (certains ont une pseudocatalase). Certains sont homofermentaire obligés (Lactobacillus
delbrueckii), d'autres sont hétérofermentaires (Lb. brevis) et d'autres sont hétérofermentaires
facultatifs (Lb. casei). Ils sont acidophiles, peut protéolytiques et peut lypolytiques. Se trouvent sur la
végétation, dans la microflore naturelle de l'homme et dans divers produits alimentaires fermentés.
Le pourcentage de G+C est d’environ 32 à 53. L’espèce type est : Lb. delbrueckii [1, 8].

Le genre Bifidobacterium

Chez l'homme, les Bifidobacterium sont des commensaux de la bouche, de l'oesophage, de l'estomac,
de l'intestin, des branches et du vagin. Chez l'animal, ils sont surtout mis en évidence dans la flore
intestinale. Ces bactéries sont des bâtonnets de morphologie variées, cellules courtes, coccoidales,
cellules ramifiées, bifurquées, spatulées, isolées ou en chaînes, disposition en V ou en palissade. Ces
bactéries sont Gram+, non acido-alcoolo-résistantes, non sporulées, immobiles, anaérobies, bien que
quelques espèces tolèrent l'O2 en présence de CO2. Le genre est caractérisé par la présence d'une
enzyme : la fructose-6-phosphate phosphocétolase. La température optimale de croissance ne
dépasse pas 39 °C pour les espèces d'origine humaine, alors que les espèces d'origine animale
préfèrent 43-45°C. Bifidobacterium bifidus meurtà 60 °C. La croissance des Bifidobacterium n'est
pas possible à pH 4,5-5 et pH 8-8,5. Ces bactéries sont glucidolytiques et donnent de l'acide acétique
et lactique; elles produisent de petites quantités d'acide formique, d'éthanol et d'acide succinique.
L'acide butyrique et propionique ne sont pas produits. Les espèces en général sont catalase-. La
présence d'α- galactosidase différencie rapidement les Bifidobacterium des Lactobacillus. Le GC %
est de 57,2-64,5 %.

Les Bifidobacterium ainsi que les espèces de Lactobacillus peuvent avoir une fonction préventive
contre la colonisation par les entéropathogènes. Bifidobacterium anciennement Lactobacillus bifidus
est utilisé dans certains yaourts «probiotiques». Sa présence entraînerait un effet anti-infectieux au
niveau intestinal à cause de la présence d'un facteur bifidogène.

1.4. Rôle des bactéries lactiques dans l'alimentation

Le pH normal du lait est de 6,6, la croissance des bactéries lactiques se traduit par une acidification
du milieu entraînant la coagulation de la caséine, à partir du pH 4,6 on obtient ainsi le caillé. La
viscosité du lait peut être modifiée par les capsules mucilagineuses de quelques bactéries telles que
Leuconostoc spp. Les bactéries lactiques produisent une variété de substances impliquées dans la
flaveur : acétoine, acétaldéhyde, acétone, éthanol, diacétyl. Ces substances contribuent aux caractères
organoleptiques des produits laitiers.

On a également une lipolyse qui hydrolyse les acides gras libres avec formation d'acides cétoniques
et de méthyle cétone, une protéolyse donnant : des peptides, des acides aminés jusqu'à l'ammoniac;
cette succession d'opérations enzymatiques contribue à l'affinage des fromages.

Les potentialités inhibitrices des bactéries lactiques sont importantes. Le phénomène d'inhibition peut
inclure un ou plusieurs mécanismes : compétition nutritionnelle, changement physico-chimique du
milieu (pH, formation d'agents réducteurs), formation de produits antimicrobiens à large spectre
(acides organiques, peroxyde d'hydrogène) et production de bactériocines.

Les bactéries lactiques interviennent aussi par l'amélioration de la digestibilité et des qualités
sensorielles des produits de fermentations, en libérant des enzymes exocellulaires et, après leur lyse,
des enzymes endocellulaires.

1.5. Culture

Vue les exigences nutritionnelles variées et multiples des bactéries lactiques elles sont cultivées sur
des milieux spécifiques enrichis par des digestions enzymatiques de divers d'origines animale ou
végétale (extrait de viande, peptone, hydrolysat de caséine, urée, liqueur de mais, extrait de soja,
etc.), cependant le meilleur substrat reste l'extrait de levure.

Il est possible de les classer les bactéries lactiques suivant la nature des produits du métabolisme
bactérien obtenus à partir des glucides en 2 classes :

- les bactéries homolactiques strictes : produisent uniquement de l’acide lactique,

- les bactéries hétérolactiques peuvent produire de l’acide acétique, de l’éthanol et du CO2 en

plus de l’acide lactique.

Onze genres bctériens figurent dans la catégorie des bactéries lactiques :

Aerococcus , Alloicoccus , Carnobacterium , Enterococcus , Lactobacillus , Lactococcus , Leuconos
toc , Pediococcus , Streptococcus , Tetragenococcus et Vagococcus . Les bactéries du
genre Bifidobacterium ne sont pas considérées comme des bactéries lactiques typiques, mais leur
usage se répand en industrie laitière.

Les bactéries lactiques sont utilisées pour la fermentation d’un grand nombre de produits d’origine
animale ou végétale. Seuls les cinq genres Bifidobacterium , Lactobacillus , Lactococcus,
Leuconostoc et Streptococcus sont communément propagés dans les salles à ferments des industries
laitières ou employés dans la fermentation lactique des produits laitiers.

Le rôle principal des bactéries lactiques est la production d’acide lactique qui influence la texture, le
goût et la qualité microbiologique du fromage. En effet, la production d’acide facilite la coagulation
des protéines. L’abaissement du pH limite aussi la croissance des bactéries indésirables. Enfin, la
production d’acide lactique intervient également sur le goût des produits fermentés, soit directement
dans les produits frais, soit indirectement en agissant sur les activités enzymatiques pendant
l’affinage.
 Les bactéries lactiques tolèrent de petites quantités d’oxygène, mais de trop grandes teneurs
peuvent leurs êtres néfastes. Ceci peut probablement être relié au peroxyde d’hydrogène (H2O2)
qui est produit dans les cellules en présence d’air. Le H2O2 doit être éliminé sinon son
accumulation devient toxique. Le système le plus efficace d’élimination du H2O2 est une enzyme
nommée catalase dont les bactéries lactiques sont déficientes. Les bactéries lactiques possèdent
plutôt une peroxydase, moins efficace que la catalase. Ainsi, comme les bactéries lactiques
n’éliminent pas facilement le peroxyde, elles sont considérées comme micro-aérophiles.

Les bactéries lactiques aromatisantes : comme Lactococcus lactis produisent des composés
aromatisants qui contribuent au goût des produits frais et à la production de CO2 responsable
d’ouvertures dans le fromage.

Enfin, certaines bactéries lactiques produisent des exopolysaccharides qui influencent l’aspect et la
texture des produits fermentés, ainsi que du peroxyde d’hydrogène et des bactériocines inhibant la
croissance de bactéries indésirables