TECHNIQUE ELISA

I- Definition et principe

ELISA: abréviation de Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay

ELISA: C’est une technique d’analyse biochimique utilisée pour détecter la
présence d’un anticorps (Ac) ou d’un antigène (Ag) dans un échantillon.
C’est un outil très simple et très sensible, utilisé en médecine, phytopathologie, et
le control de qualité dans plusieurs industries.

L’élément à analyser est souvent fixé à un support solide dit plaque de titration ELISA. il
s’agit d’une plaque renfermant plusieurs puits où se déroule l’ensemble de réactions

Plaque de titration ELISA

1
 TECHNIQUE ELISA

I- Définition et principe (suite)

déposer les échantillons dans les Ajouter l’Ac. conjugué à un

puits de la plaque de titration enzyme

incubation pendant un durée bien Laver les plaques de titration par

déterminé à température ambiante de l’eau deionisée

Ajouter un substrat Ajouter une solution d’acide

chromogène est incuber le tout dilué pour stopper la réaction et
pendant une période bien lire au spectrophotomètre
précise 2
 TECHNIQUE ELISA

I- Définition et principe (fin)

3
 TECHNIQUE ELISA

II- Etapes et composantes générales d’une ELISA

Micropipettes

Etuve
Plaques de Titration

Lecteur ELISA 4
 TECHNIQUE ELISA

II- Etapes et composantes générales d’une ELISA

Les principales étapes et composantes nécessaires pour la réalisation de cette
technique sont:

1- la plaque de titration qui doit répondre à certaines caractéristiques comme un

haut niveau d’adsorption des protéines, et avoir un fond plate.
2- l’étape de tapissage des puits par l’Ac ou L’Ag.
3- Temps d’incubation pour permettre aux réactions (Ac_Ag, Enzyme_substrat) de se
faire correctement.
- moins de temps implique des réactions incomplètes
- plus de temps pourrait affecter la sensibilité des anticorps
4- Les lavages pour éliminer les Ac ou les Ag en excès et qui ne se sont pas
agglutinés.
- un lavage doux: les Ac ou Ag en excès reste dans le puits et on obtient de faux
résultats.
- un lavage agressive: affecte l’interaction entre Ac et Ag.
5
 TECHNIQUE ELISA
II- Etapes et composantes générales d’une ELISA (suite)
5- Concentration en Ac et en Ag.
6- L’Ac conjugué ou l’Ag conjugué: on les appelle ainsi du fait qu’ils sont marqués par un
enzyme (liés de manière covalente) qui permettrai par la suite de nous donner un idée
sur la concentration de l’analyte.
parmi les enzymes utilisé pour le marquage des Ac ou de Ag:
Peroxydase du radis (OPD: Ortho-phénylènediamine ou OBTS: 2,2', azinodi(3-
éthyl) benzothiazolinéi-6- sulfonique acide)
Phosphatase alcaline (PNPP:  para-nitrophényl phosphate)
β-galoctosidase (ONPG : ortho-Nitrophenyl-β-galactoside)
Urease (uree + indicateur de pH)
7- Substrat chromogène, c’est composé chimique qui après transformation par
l’enzyme de marquage donne naissance à un produit coloré qui peut être quantifié par
spectrophotométrie.
8- Solution d’arrêt de la réaction entre enzyme lié à l’Ac ou à L’Ag et le substrat
chromogène.

9- un tampon de lavage et un tampon de dilution des extraits.

6
 TECHNIQUE ELISA

II- Etapes et composantes générales d’une ELISA (Fin)

enzyme de
marquage control négatif
control positif
Ac. conjugué control des solutions
4
Substrat
3 5
Ac. de détection

2 Ag.

1 Ac de capture

INTERMEDIAIRE
NEGATIVE POSITIVE
Etat du complexe moléculaire dans un
type d’ELISA (ELISA en sandwich le quel des trois patients a une ELISA positive?
indirecte) 7
• Nous allons détecter la présence d’anticorps
anti-BSA ( Bovine sérum albumine) dans le
sérum d’un lapin
 La première étape : le
« cotting » a été réalisée
par le fournisseur; il s’agit
de tapisser le fond des puits
avec la BSA par effet
électrostatique
 Deuxième étape:on verse
ensuite deux gouttes du
sérum à tester dans le puits
 On verse ensuite deux
gouttes du sérum à tester
dans le puits
 On verse ensuite deux
gouttes du sérum à tester
dans le puits
 Si le lapin est
« contaminé », son sérum
possède des anticorps anti-
BSA
 Si le lapin est
« contaminé », son sérum
possède des anticorps anti-
BSA
 Ces anticorps anti-BSA
viennent se fixer sur la BSA
qui tapisse le fond du puits.
 Ces anticorps anti-BSA
viennent se fixer sur la BSA
qui tapisse le fond du
puits. On vide ensuite le
puits d’un geste rapide.
Puis le puits est lavé avec
une solution tampon
twin pour enlever les
quelques anticorps non
fixés.
 Troisième étape: on
verse l’anticorps de
détection. Il est
couplé à une enzyme:
la péroxydase.
 Troisième étape: on
verse l’anticorps de
détection. Il est
couplé à une enzyme:
la péroxydase.
 Les anticorps de
détection se fixent aux
anticorps anti-BSA.
 Les anticorps de
détection se fixent aux
anticorps anti-BSA.
Le puits est vidé et lavé
deux fois avec le
tampon twin
Le puits est vidé et lavé
deux fois avec le
tampon twin
 Quatrième étape:
On verse dans le puits la solution
révélatrice contenant le substrat
de la péroxydase: le TMB ( tétra-
méthyl-benzidine).
Le TMB se colore en
bleu en présence de
l’enzyme
 Le TMB se colore en bleu en présence de l’enzyme
La coloration bleue indique donc la présence d’anticorps anti BSA.
L’intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration
d’anticorps anti-BSA ; cette méthode permet donc un dosage par
colorimétrie
 TECHNIQUE ELISA

III- Les différents types d’ELISA

les principales type de la technique ELISA sont:

1- ELISA direct
2- ELISA indirect
3- ELISA en sandwich
4- ELISA compétitive

28
TECHNIQUE ELISA III- Les différents types d’ELISA: 1- ELISA direct

1- l’Ag. est ajouté à la phase solide sur la quelle

il s’adsorbe de manière passive durant
l’incubation

2- l’excès d’Ag. est éliminé par une succession de

lavage, laissant la phase solide tapissée par l’Ag.

3- L’Ac. conjugué a l’enzyme est ajouté au milieu

réactionnel et incubé

4- L’Ac. conjugué se lie aux Ag. adsorbés sur la

phase solide. l’excès d’Ac conjugué est éliminé
par lavage.

5- Une solution de substrat chromogène est alors

ajoutée. L’enzyme porté par l’Ac. conjugué sert à
catalysé la transformation du substrat en produit
coloré.
29
TECHNIQUE ELISA III- Les différents types d’ELISA

2- ELISA indirect

1- l’Ag. est ajouté à la phase solide sur la quelle il s’adsorbe de

manière passive durant l’incubation

2- l’Ac. est ajouté à la phase solide sur la quelle il s’est

adsorbé l’Ag. Les Ac spécifiques vont s’associer à L’Ag.
L’excès d’Ac. et les autres molécules est éliminé par lavage

3- Des anti-Ac. marqués dirigé contre les premiers Ac.

fixés sur les Ag. sont ajoutés au milieu réactionnel

4- Ces Anti-Ac. se lient à chaque Ac. déjà lié au Ag. L’excès

d’Anti-Ac. conjugué à l’enzyme sera éliminé par une
succession de lavage

5- un substrat chromogène est ajouté. il se développe alors

une coloration du a la présence de l’enzyme. Après une
période d’incubation la réaction enzyme-substrat est
stoppée puis lu par spectrophotométrie.
30
TECHNIQUE ELISA III- Les différents types d’ELISA

3- ELISA sandwich direct

1- Ac. fixé sur le support par 2- Excès d’Ac. éliminé par lavage
incubation dans un tampon et l’Ag. est ajouté.

3- L’Ag. est capturé par l’Ac. de tapissage durant

l’incubation. les Ag. non associés au Ac. seront éliminés
par lavage

4- un autre Ac. marqué par l’enzyme est versé dans les puits.
il peut être le même que le premier Ac. ou totalement
différent.

5- La fixation du conjugué sur l’Ag. complète le sandwich.

L’excès est éliminé par plusieurs lavage.

6- addition du substrat chromogène est quantification au

spectrophotomètre après avoir stopper la reaction
31
TECHNIQUE ELISA III- Les différents types d’ELISA

4- ELISA sandwich indirect

Etape 3

les étapes d’une ELISA sandwich indirect sont

presque les même que celles de L’ELISA
Etape 4 sandwich direct.
seulement l’anticorps marqué (le conjugué) par
l’enzyme sera dirigé contre un autre anticorps
qui reconnais l’Ag. fixé sur l’Ac. de tapissage.
Etape 5 La détection ou la quantification se fera de la
même manière que la précédente technique

Etape 6

32
33
 TECHNIQUE ELISA III- Les différents types d’ELISA
5- ELISA compétitive

1- même Ag. que celui du 1- Ag. différent de celui du

tapissage tapissage

2- L’Ac. conjugué se fixe à l’Ag dans la phase 2- L’Ac. conjugué se fixe a l’Ag de tapissage.
liquide. le complexe formé (Ag-Ac. conjugué) le complexe formé ne sera pas éliminer par
sera éliminer par le lavage le lavage

3- La liaison de Ac. conjugué à l’Ag. de tapissage

3- Aucun Ac. conjugué n’est fixé sur l’Ag. de n’est pas affectée. Après addition du substrat
tapissage. Aucune coloration ne sera développée chromogène il y aura développement d’une
après addition du substrat chromogène car il n’y coloration. (0% compétition)
a pas d’enzyme (100% de compétition)

34
35
 Les ELISA en phase homogène

E
E
Anticorps Antigène

Antigène absent de l’échantillon

Antigène présent dans l’échantillon

E
 Les ELISA en phase hétérogène
ELISA direct
Anticorps marqué Antigène marqué

S
S
E
E
P
P
ELISA indirect

S
E

P
Recherche d’anticorps dans le plasma
 Les ELISA en phase hétérogène
ELISA sandwich
Sandwich (direct)
S
E

Double Sandwich (indirect)

S
E

P
 Les ELISA en phase hétérogène
ELISA par compétition
Compétition au niveau de l’anticorps
S
E P
S
Anticorps à doser E
P
Compétition au niveau de l’antigène

S
E E
P
S
P
Antigène à doser
 Exemple d’application
Détection d’anticorps au virus de l’immunodéficience humaine (VIH)
par ÉLISA

40
Exemple d’application
Test de grossesse

la gonadotrophine chorionique humaine

(hCG), une glycoprotéine sa concentration
augmente dans l’urine les premières semaines
de grossesse

41
Exemple d’application

Test de grossesse

42