Laporan Isolasi DNA Tanaman
Laporan Isolasi DNA Tanaman
Laporan Isolasi DNA Tanaman
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Penelitian keragaman genetik tanaman merupakan salah satu kegiatan
penting untuk mendukung pemuliaan tanaman. Perbedaan tanaman dapat
dideteksi melalui beberapa penanda, antara lain dengan pola pita DNA
(Lamadji, 1998), yang sering disebut sebagai penanda molekuler. Penanda
molekuler berperan penting dalam konservasi dan pengelolaan sumber daya
genetik tanaman (Karp, 1995).
Teknik molekuler bervariasi dalam cara pelaksanaan untuk mendapatkan
data, baik tekniknya maupun tingkatan target data yang diinginkan sesuai
kemudahan pelaksanaan, sumber daya manusia, fasilitas dan biaya. Salah satu
teknik molekuler yang telah dikembangkan untuk berbagai keperluan yakni
isolasi DNA. Langkah utama dalam isolasi DNA, yaitu perusakan dinding sel,
pemisahan DNA dari bahan padat, serta pemurnian DNA.
DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh
polisakarida dan metabolit sekunder. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari
tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel,
dikarenakan tanaman memiliki dinding sel yang kuat, dan pada beberapa
tanaman kontaminasi sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran
kontaminasi diatas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak
sensitive oleh enzim retriksi dan mengganggu proses amplifikasi DNA dengan
PCR.
Elektroforesis dengan gel agarosa merupakan metode standar
untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari
molekul DNA. Cara pemisahan dengan elektroforesisi ini merupakan alat
pendukung yang sangat pokok dalam teknologi DNA rekombinan, dengan
aplikasi yang begitu luas baik untuk pemisahan untai tunggal atau untai ganda
molekul DNA. Berdasarkan uraian tersebut, maka praktikum dengan judul
isolasi DNA menjadi penting untuk dilakukan.
B. Rumusan Masalah
Rumusan masalah pada praktikum ini adalah bagaimana cara
mengisolasi DNA dari tanaman ?
C. Tujuan Praktikum
Tujuan yang ingin dicapai pada praktikum ini adalah untuk mengetahui
cara mengisolasi DNA dari tanaman.
D. Manfaat Praktikum
Manfaat yang diperoleh pada praktikum ini adalah dapat mengetahui
cara mengisolasi DNA dari tanaman.
kloroform, proses ini diulang sebanyak dua kali agar pemisahan DNA dengan
komponen lainnya menjadi lebih baik (Mulyani, 2012).
Metode CTAB menggunakan isopropanol dingin Isopropanol lebih
efisien dalam persipitasi DNA dibandingkan etanol. Namun, isopropanol
kurang volatil sehingga membutuhkan waktu yang lebih lama untuk
mengeringkan pellet larutan tersebut tetap dapat memberikan hasil yang baik
dalam mengendapkan DNA. Selain itu, jumlah volume, suhu, dan lama
inkubasi berpengaruh terhadap hasil persipitasi DNA. Isolasi DNA yang
memiliki kualitas terbaik dan sedikit kontaminan diharapkan untuk kebutuhan
PCR sehingga diperoleh metode terbaik untuk metode SDS, yaitu variasi
metode menggunakan Proteinase K. Variasi metode menggunakan kalium
asetat 5M bukan metode terbaik disebabkan metode tersebut memiliki
ketebalan pita DNA yang lebih tipis dibandingkan dengan variasi
menggunakan Proteinase K (Utami, 2012).
Larutan - Marchaptoetanol
4
5
6
7
8
9
10
Etanol 100%
Etanol 70%
Akuades (dH2O)
Bubuk agarosa
TAE 1 x
11
12
Loading dye
13 Akuades
C. Alat Praktikum
Satuan
3
g
uL
uL
uL
uL
uL
uL
uL
g
mL
uL
uL
mL
Kegunaan
4
Sebagai objek pengamatan sampel
DNA
Sebagai larutan pelisis membran sel,
mendenaturasi protein, membentuk
kompleks dengan DNA dan
menghambat aktivitas nuklease
Sebagai larutan penghambat radikal
bebas
Sebagai larutan ekstraksi DNA
Sebagai larutan pengikat DNA
(presipitasi DNA)
Sebagai larutan pengendap DNA
Sebagai larutan pencuci DNA
Sebagai larutan pelarut DNA
Sebagai bahan pembuatan gel agarosa
Sebagai bahan campuran pembuatan
gel agarosa dan larutan elektrolit
Sebagai bahan mengendarkan pita
DNA pada gel agarose
Sebagai larutan pewarna, pemberat
dan penanda migrasi DNA
Sebagai larutan blanko
Spatula
4
5
Tabung eppendorff
Mikropipet
Yellow tip
Water bath
8
9
Freezer
Sentrifuga
10
11
Handscun
Kuvet
12
Spectrophotometer
13
14
Erlenmeyer
Hot plate
15
16
Sumuran + Sisir
Set elektroforesis
17
Photophoresis/
doc
Alat tulis
18
1
4
1
~
1
1
1
1
gel
Kegunaan
4
Untuk menimbang sampel
Untuk menggerus atau menghaluskan
sampel
Untuk mengambil sampel hasil
gerusan
Untuk menyimpan sampel DNA
Untuk memindahkan larutan dalam
volume kecil (uL) secara akurat
Untuk mengambil larutan dengan
volume 0,1 mL
Untuk menginkubasi sampel dalam
kondisi basah
Untuk menginkubasi sampel
Untuk memisahkan sampel
berdasarkan berat jenis molekul
Untuk melapisi tangan saat bekerja
Untuk menyimpan sampel yang akan
diabsorbansi
Untuk mengetahui nilai absorbansi
sampel
Untuk wadah pembuatan gel agarosa
Untuk memanaskan bahan pembuatan
gel agarosa
Untuk wadah pencetak gel agarosa
Untuk migrasi DNA berdasarkan berat
molekul
D. Prosedur Kerja
Prosedur kerja yang dilakukan pada praktikum ini adalah sebagai berikut :
1. Isolasi DNA Genom Tumbuhan
- Menimbang sampel pucuk daun cokelat (Theobroma cacaoL.)
danDioscore sp. sebanyak 0,1-0,2 gram.
sampel tersebut.
Menginkubasi sampel dalam water bath pada suhu 65oC selama 30
selama 5 menit.
Mengeluarkan sampel dari freezer, kemudian melakukan sentrifugasi
sampel dalam tabung eppendorff pada kecepatan 10.000 rpm selama
pada
sampel tersebut.
Menginkubasi sampel dalam freezer (lemari es) selama 24 jam.
Melakukan sentifugasi sampel dalam tabung eppendorff
pada
yang terbentuk.
- Menambahkan 20-50 uL akuades (dH2O).
- Melakukan pengujian kualitas dan kuantitas sampel DNA.
2. Spektrofotometer
- Menyalakan terlebih dahulu alat spektrofometer dan menyediakan 3
-
tombol
read
sample
untuk
menghitung
nilai
absorbansinya.
- Mengulangi poin di atas untuk kuvet ketiga.
- Menekan print untuk mencetak hasil perhitungan nilai absorbansi.
3. Elektroforesis
- Membuat gel agarosa 1% (g/v), dengan cara menimbang bubuk
agarosa 0,3 gram dan memasukkan bubuk agarosa tersebut ke dalam
-
erlenmeyer.
Menambahkan 30 mL TAE 1 x ke dalam erlenmeyer berisi bubuk
agarosa.
Memanaskan bahan hingga larut sempurna di atas hot plate.
Mendinginkan bahan hingga hangat-hangat kuku
Menuangkan bahan ke wadah pencetak yang telah dilengkapi sisir
agarosa).
Memasukkan
gel
agarosa
ke
dalam
bak
elektroforesis
dan
DNA.
Setelah 30 menit, merendam gel agarosa berisi sampel DNApada
larutan EtBr (Ethidium Bromide) selama 5 menit, lalu merendamnya ke
berpendar.
Mencatat dan mendokumentasikan hasil pengamatan.
dibersihkan.
menggunakan
Pembersihan
larutan
PCI
DNA
dilakukan
dengan
(Phenol-Chloroform-Isoamyl
ekstraksi
Alcohol)
dan
Ekstraksi dengan cara bertahap juga merupakan cara ekstraksi yang terbaik
karena akan menghasilkan jumlah ekstrak yang lebih banyak dibandingkan
ekstraksi secara langsung. Perbedaan kelarutan akan mengakibatkan organelorganel kecil dan pengotor terekstrak, sedangkan inti sel atau nucleus
diasumsikan tidak ikut terekstrak sebab memiliki ukuran yang besar sehingga
di dalam larutan hanya terdapat inti sel yang mengandung DNA.
Hasil larutan yang disentrifugasi akan menghasilkan campuran larutan
yang terpisah menjadi tiga fase. Larutan PCI memiliki densitas yang tinggi
sehingga terletak di bagian bawah (fase organik) tabung eppendorf. Bagian
tengah larutan terdapat protein yang dilarutkan oleh larutan PCI. Larutan DNA
yang terletak di bagian atas (fase air) dipipet dengan hati-hati agar bagian
proteinnya tidak ikut terambil. Larutan DNA yang diambil dimasukkan dalam
tabung eppendorf baru dan diekstraksi kembali dengan larutan PCI. Pemurnian
DNA dilakukan dengan etanol dan isopropanol. Larutan-larutan tersebut dapat
mengendapkan DNA sedangkan kontaminan yang lain tetap larut (Sambrook,
et al., 1989). Penambahan NaOAC (natrium asetat) berfungsi untuk membantu
memekatkan dan mengendapkan DNA. Pencucian endapan DNA dengan
etanol 70% bertujuan memisahkan senyawa-senyawa yang masih menempel
pada DNA. DNA akan lebih stabil dalam bentuk larutan oleh karena itu DNA
yang diperoleh dilarutkan dalam dH2O. Pemurnian DNA dari kontaminan RNA
dilakukan menggunakan enzim RNAse yang berfungsi mendegradasi RNA
sehingga dihasilkan DNA murni yang terbebas dari RNA dan siap digunakan
sebagai cetakan DNA saat PCR. DNA hasil isolasi dilakukan uji kualitas dan
kuantitas dengan metode spektrofotometer dan elektroforesis.
V. PENUTUP
A. Kesimpulan
Kesimpulan pada praktikum ini adalah isolasi DNA dari genom tanaman
dilakukan melalui proses pelisisan dengan menggunakan larutan CTAB,
pemisahan DNA dari materi organik dengan menggunakan larutan (PhenolChloroform-Isoamyl Alcohol) PCI, presipitasi DNA dengan penambahan
NaOAC (natrium asetat), dan pemurnian DNA dengan menggunakan etanol
70%. Pengujian kualitas dan kuantitas DNA hasil isolasi dilakukan dengan
metode spektrofotometer dan elektroforesis.
B. Saran
Saran yang dapat diajukan pada praktikum ini adalah agar praktikan dapat
lebih aktif lagi mengikuti praktikum.
DAFTAR PUSTAKA
Ardiana, Dewi, W., 2009, Teknik Isolasi Dna Genom Tanaman Pepaya dan Jeruk
dengan Mneggunakan Modifikasi Buffer CTAB, Jurnal Buletin Teknik
Pertanian, 4(1): 12-16
Campbell, N. A., et al., 2002, Biologi, Erlangga, Jakarta.
Karp A. 1995. On the current somaclonal variation as a tool for crop
improvement. Euphitica. 85.:295-302.
Mulyani, Y., Purwanto, A., dan Nurrahwati, I., 2012, Perbandingan beberapa
Metode Isolasi DNA untuk Deteksi DNA Koi Herpes Varus (KHV) pada
Ikan Mas (Cypirus carpio L.), Universitas Padjajaran, Jatinangor.
Murray. R.K., 2003, Biokimia Harper, edisi ke-22. Penerbit Buku Kedokteran.
Jakarta.
Restu, M., Mukrimin, dan Gusmiaty, 2012, Optimalisasi Teknik Ekstraksi dan
Isolasi DNA Tanaman Surem (Toona sureni Merr.) untuk Analisis
Keragaman Genetik Berdasarkan Random Amplified Polymorphic DNA
(RADP), Jurnal Natural Indonesia, 14(2): 138-142
Sambrook, J., Fritsch, E, F., and Maniatis, T., 1989,Molecular Clonning : A
laboratory Manual, second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
New York.
Utami, A., Meryalita, R., Prihatin, N. A., Ambarsari, L., dan Asri, P., 2012, Variasi
Metode Isolasi DNA Daun Temulawak (Curcuma xenthorrhiza Roxb.),
Seminar Nasional Kimia Unesa, IPB, Bogor.