LAPORAN PRAKTIKUM

KROMATOGRAFI

1. Jesika Kristella J3L117003

2. Indri April J3L117071
3. Prasticia Nanda S J3L117089
4. Srikanti J3L117115
5. Ayuning Sekar L A J3L117117
6. Nova Crystina J3L117134
7. Yusril Ihza O D J3L117142
8. Anne Paramita T J3L117164

SEKOLAH VOKASI
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2018/2019
 LAPORAN PRAKTIKUM
KROMATOGRAFI

INSTRUMENTASI KROMATOGRAFI
CAIR KINERJA TINGGI

1. Jesika Kristella J3L117003

2. Indri April J3L117071
3. Prasticia Nanda S J3L117089
4. Srikanti J3L117115
5. Ayuning Sekar L A J3L117117
6. Nova Crystina J3L117134
7. Yusril Ihza O D J3L117142
8. Anne Paramita T J3L117164

SEKOLAH VOKASI
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2018/2019
Pendahuluan

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan

perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Prinsip
pemisahan kromatografi yaitu pemisahan campuran yang didasarkan atas
perbedaan distribusi dari komponen cairan tersebut diantaranya dua fase yaitu
fase diam (stasionary) dan fase gerak (mobile). Fase diam yang berupa zat padat
atau zat cair, sedangkan fase gerak berupa zat cair atau gas (Yuneka 2012).
Pemisahan pada kromatografi terjadi adanya perbedaan daya adsopsi, kelarutan,
partisi, ukuran molekul,ukuran ion dan tekanan uap pada komponen yang
dibawa oleh fase gerak melalui fase diam (Aulia et al 2016).
High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan suatu
metode yang sensitif dan akurat untuk penentuan kuantitatif serta baik untuk
pemisahan senyawa yang tidak mudah menguap seperti asam amino, protein,
pestisida dan lain-lain. High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC)
merupakan salah satu metode kromatograsi cair yang pemakaiannya sangat
berkembang baik untuk analisis rutin maupun untuk preparatif di laboratoium
pada umumnya. Berbeda dengan kromatografi gas (KG), High Perfomance Liquid
Chromatography (HPLC) dapat dioperasikan pada suhu kamar, dimana senyawa
yang tidak tahan panas dapat ditentukan dengan mudah dan sifat fasa gerak
dapat diubah dengan merubah komposisi dari fasa gerak yang digunakan
(Nurhamidah 2005).

Pembahasan

High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan tinggi
dan efisiensi yang tinggi dengan didukung oleh kemajuan teknologi kolom,
sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensiti fdan beragam.
HPLC mampu menganalisis berbagai sampel secara kualitatif maupun kuantitatif
baik dalam komponen tunggal maupun campuran (Aulia et al 2016).
Kelebihan penggunaan KCKT yaitu dapat digunakan untuk menganalisis
sampel yang relatif tidak tahan dengan panas (non volatile ) atau memiliki titik
didih yang rendah, peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait
dengan peningkatan perfoma kolomnya yang menggunakan kolom dengan
ukuran dimensi dan partikel yang jauh lebih kecil daripada kolom yang lain
sehingga fase gerak mengalir pada kolom serta fase gerak dapat dipompa pada
tekanan yang tinggi, dapat digunakan untuk berbagai macam detektor,
membutuhkan jumlah sampel yang sangat sedikit, dan memiliki resolusi yang
baik (Djuetea et al 2017).
Komponen-komponen penting yang terdapat di KCKT yaitu eluen, pompa,
injektor, kolom, dan detektor (Gambar 1).
 Gambar 1 Bagan komponen KCKT
1. Eluen
Eluen merupakan fasa gerak atau larutan yang berfungsi untuk
membawa sampel masuk ke dalam kolom pemisah. Eluen dalam KCKT
biasanya berupa pelarut atau cairan. Eluen biasanya terdiri atas
campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan
berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi
ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam dan
sifat komponen-komponen sampel. Terdapat 2 jenis elusi pada KCKT
yaitu elusi isokratik yang memiliki komposisi dari fase gerak yang konstan
selama proses elusi, dan elusi gradien yang memiliki komposisi fase gerak
yang berubah-ubah selama proses elusi. Pada KCKT terdapat 2 fase yaitu
fase normal dan fase terbalik. Fase normal yaitu fase diam bersifat polar
dan fase gerak bersifat non polar dimana kemampuan elusi meningkat
dengan meningkatnya polaritas pelarut, sedangkan fase terbalik yaitu
fase diam bersifat non polar dan fase gerak bersifat polar dimana
kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Pemilihan fase gerak didasarkan pada beberapa kriteria yaitu viskositas,
transparasi terhadap detektor, pH, kelarutan dalam sampel, stabilitas,
indeks bias, titik didih, kemurnian, inert, dan toksisitas.
Eluen yang akan digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk
menghilangkan adanya partikel-partikel halus atau endapan atau kotoran
yang terkandung dalam eluen. Eluen yang mengandung endapan atau
partikel halus dapat menimbulkan kerusakan atau sumbatan pada sistem
injektor, pompa, dan kolom. Kemudian eluen dihilangkan dari gelembung
udara dengan menggunakan sonikator. Eluen yang mengandung
gelembung udara memiliki tekanan yang besar saat digunakan untuk
menganalisis sampel dalam KCKT. Sonikator merupakan alat yang
memiliki gelombang ultrasonik yang dapat menggetarkan eluen sehingga
udara yang terperangkap dapat keluar.
Perjalanan eluen dimulai dari reservoir. Reservoir merupakan
tempt penyimpanan eluen yang terdiri dari 4 buah yaing isinya berbeda –
beda. Reservoir harus dipastikan terisi penuh dan tidak mengandung
gelembung udara. Eluen dari reservoir dibawa menuju mixer, pada bagian
ini eluen dicampurkan secara otomatis dengan perbandingan tertentu
 sesuai perintah yang diinput melalui komputer. Setelah melalui mixer
eluan dialirkan menuju pompa, pada KCKT SHIMADZU LC-20D terdapat 2
buah pompa dikiri dan kanan yang bekerja seperti pompa peristaltik,
pompa ini akan bekerja secara bergantian untuk menarik dan mendorong
eluen yang seanjutnya dialirkan menuju injektor yang akan membawa
sampel ke dalam kolom untuk dilakukan pemisahan.

2. Pompa
Pompa berfungsi untuk mendorong eluen dan sampel masuk
kedalam kolom. Biasanya pompa harus inert, laju alir 0,1-10 µm, keluaran
bebas pulsa, bahan yang tahan terhadap korosi dan memiliki tekanan
dengan kisaran 6000 psi. Kecepatan alir dapat dikontrol dan perbedaan
kecepatan dapat mengakibatkan perbedaan hasil. Pompa dibedakan
menjadi 2 tipe berdasarkan kegunaannya yaitu pompa reciprocating dan
pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang
berdenyut teratur (pulsating) sehingga membutuhkan peredam elektronik
untuk menghasilkan garis dasar detektor yang stabil serta ukuran
reservoirnya tidak terbatas. Sedangkan pompa syringe menghasilkan
aliran yang tidak berdenyut teratur serta reservoirnya terbatas.

3. Injektor
Injektor berfungsi sebagai tempat memasukkan sampel dan
mendistribusikan sampel kedalam fase gerak yang mengalir dibawah
tekanan menuju ke kolom. Penginjeksian sampel dilakukan dengan
menggunakan jarum suntikan yang bernama syring yang terbuat dari
tembaga tahan karat. Volume jarum suntikan sebesar 100 µL untuk
memudahkan dalam proses penginjeksian. Posisi injektor pada alat KCKT
ada 2 yaitu posisi load dan posisi injeksi. Pada posisi load yaitu sampel
berada di posisi terisolasi dari fase gerak dan terbuka terhadap atmosfer
sehingga sampel yang masuk langsung keluar ke limbah pembuangan
tanpa melalui kolom. Sedangkan posisi injeksi yaitu sampel akan dibawa
oleh fase gerak menuju kolom (Syenina 2011).
 Gambar 2 Posisi Load dan Injeksi pada KCKT

Injeksi sampel ke dalam KCKT dilakukan menggunakan syringe

khusus KCKT. Pastikan jarum syringe tajam dan tidak bengkok. Syringe
dimasukan ke dalam botol sampel lalu ditarik hingga batas yang
menujukan voume mencapai 20 μL dan dipastikan tidak ada gelembung
udara di dalam syringe. Selanjutnya jarum syringe dimasukan hingga
mentok secara horizontal ke dalam lubang rheodyne diinjection port. tuas
injektor ditarik berlawanan arah jarum jam ke posisi load, lalu sampel
diinjeksikan. Tuas diputar kembali searah jarum jam ke posisi injek.
Sampel akan otomatis dibawa ke dalam kolom.

4. Kolom
Kolom berfungsi untuk memisahkan ion-ion yang terdapat dalam
sampel. Keterpaduan antara kolom dan eluen dapat memberikan hasil
puncak yang maksimal, namun apabila tidak ada kecocokan maka tidak
akan memunculkan puncak. Kolom memiliki berbagai macam ukuran
tergantung penggunaannya yaitu kolom analitik dan kolom preparatif
(Gambar 3). Kolom terdiri dari 3 bagian yaitu guard colom, body colom,
dan post colom. Pada guard colom berfungsi sebagai penyaring kotoran
yang terdapat di sampel maupun eluen sehingga kotoran tidak ikut masuk
kedalam kolom, karena dapat merusak kolom itu sendiri. Body colom
berfungsi untuk memisahkan senyawa-senyawa yang akan dianalisis
berdasarkan tingkat kepolarannya. Post colom berfungsi sebagai pewarna
reagen sehingga memperjelas adanya reaksi dan senyawa yang dianalisis
dapat dideteksi oleh detektor (Syenina 2011).
 Gambar 3 Jenis-jenis kolom

5. Detektor
Detektor berfungsi untuk membaca ion yang lewat ke dalam
detektor. Detektor harus memiliki karakteristik respon terhadap senyawa
yang cepat dan reprodusibel, sensitifitas yang tinggi, stabil, mempunyai
volume sel yang tinggi sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita,
sinyal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut, tidak
peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak. Terdapat 3
macam detektor yaitu detektor umum, detektor spesifik dan deterktor
yang umum terhadap solut. Detektor umum yaitu detektor akan
memberikan respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi dengan adanya
solut. Detektor spesifik yaitu detektor yang memberikan respon terhadap
beberapa sifat solut yang tidak dimiliki oleh fasa gerak. Sedangkan
detektor yang bersifat umum terhadap solut yaitu setelah fasa gerak
dihilangkan dengan penguapan. Jenis-jenis detektor yaitu detektor UV-
VIS, detektor indeks refraksi, detektor elektrokimia, detektor IR, detektor
fluorometer, detektor konduktivitas dan detektor MS. Detektor UV-VIS
berdasarkan adanya penyerapan radiasi sinar ultraviolet (UV) dan sinar
tampak (VIS) pada kisaran panjang gelombang 190-800 nm oleh spesies
solut yang mempunyai gugus kromoforik (Rohman 2009).

6. Pengecekan gelembung udara

Gelembung udara seringkali ditemukan pada saat analisis
walaupun eluen, standar, dan sampel sudah disonikator terlebih dahulu.
Gelembung ini dapat mengganggu proses analisis, oleh karena itu
gelembung yang berada pada alat ini perlu dihilangkan dengan proses
purge. Penghilangan gelembung udara dengan proses ini dilakukan
dengan pengecekan terlebih dahulu pada tiap selang, sambungan
reservoir, pompa, dan injector. Apabila terdapat gelembung, putar tombol
drain berlawanan arah jarum jam bersamaan dengen menekan tombol
purge pada display pompa. Eluen akan keluar pada pembuangan melalui
 selang yang sudah ditampung dengan botol buangan. Setelah gelembung
sudah tidak terlihat lagi tutup drain bersamaan dengan menekan tombol
purge pada display pompa.

7. Cara menyalakan HPLC

HPLC dinyalakan dengan memastikan eluen dalam reservoir sudah
terisi penuh dan tidak terdapat gelembung udara pada eluan, kolom sudah
dipasang, dan kabel power sudah terhubung ke sumber listrik. Selanjutnya
komputer dinyalakan lalu nyalakan pompa dan detector dengan menekan
tombol on pada alat. Saat pompa dan detektor dinyalakan, lampu pada
kedua bagian tersebut akan menyala berwarna merah, kemudian didiamkan
beberapa saat hingga lampu berwarna hijau. Klik LC solution pada desktop
lalu login pada software kemudian klik instrument parameters dikiri layar dan
isi sesuai dengan kebutuhan analisis. Selanjutnya klik download untuk
mengirim parameter yang telah diset ke sistem HPLC.

Daftar Pustaka

Aulia SS, Sopyan I, Muchtaridi. 2016. Penetapan kadar simvastatin menggunakan

kromatograf cair kinerja tinggi (KCKT) : review . Farmaka. Vol 14(4):70-79.
Djuetea MT, SabarudinA, Sulistyarti H. 2017. Optimasi metode analisis petisida
diazinon dan klorantraniliprol menggunakan komatografi cair kinerja tinggi
(KCKT). Jurnal Natural. Vol 4(2): 89-95.
Nurhamidah. 2005. Penentuan kondisi optimum HPLC untuk pemisahan residu
pestisida imidakloprid, profenofos dan deltametrin pada cabai (Capsium
annum). Jurnal Ilmu Pertanian Indonesia. Vol 7(2): 87-93.
Rohman A. 2009. Kromatografi Untuk Analisis Obat. Yogyakarta (ID): Graha
Ilmu.
Syenina A. 2011. Validasi metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase
terbalik pada penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun
tembakau [Skripsi]. Yogyakarta (ID): Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta.
Yuneka.2012. Teknik kromatografi. Jakarta (ID) : PT Kalman Pustaka.
 LAPORAN PRAKTIKUM
KROMATOGRAFI

STUDI PARAMETER KROMATOGRAFI

CAIR KINERJA TINGGI

1. Jesika Kristella J3L117003

2. Indri April J3L117071
3. Prasticia Nanda S J3L117089
4. Srikanti J3L117115
5. Ayuning Sekar L A J3L117117
6. Nova Crystina J3L117134
7. Yusril Ihza O D J3L117142
8. Anne Paramita T J3L117164

SEKOLAH VOKASI
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2018/2019
 LAPORAN PRAKTIKUM
KROMATOGRAFI

PENENTUAN KADAR VITAMIN B1 DALAM MINUMAN

DAN OBAT DENGAN KROMATOGRAFI
CAIR KINERJA TINGGI

1. Jesika Kristella J3L117003

2. Indri April J3L117071
3. Prasticia Nanda S J3L117089
4. Srikanti J3L117115
5. Ayuning Sekar L A J3L117117
6. Nova Crystina J3L117134
7. Yusril Ihza O D J3L117142
8. Anne Paramita T J3L117164

SEKOLAH VOKASI
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2018/2019
 LAPORAN PRAKTIKUM
KROMATOGRAFI

PENENTUAN KADAR KAFEIN DALAM MINUMAN

DAN OBAT DENGAN KROMATOGRAFI
CAIR KINERJA TINGGI

1. Jesika Kristella J3L117003

2. Indri April J3L117071
3. Prasticia Nanda S J3L117089
4. Srikanti J3L117115
5. Ayuning Sekar L A J3L117117
6. Nova Crystina J3L117134
7. Yusril Ihza O D J3L117142
8. Anne Paramita T J3L117164

SEKOLAH VOKASI
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2018/2019
Pendahuluan

Pada proses pembuatan minuman berenergi penambahan zat-zat

stimulan mutlak diperlukan, salah satunya adalah kafein. Selain dapat
menghilangkan rasa kantuk, kafein juga dapat memberikan kebugaran dan
kesegaran pada tubuh. Kafein juga berfungsi sebagai zat penenang sehingga
kafein dijadikan sebagai pelengkap obat-obat penawar rasa sakit. Kafein dalam
tubuh dapat dengan mudah diserap oleh usus dan menyebar dalam beberapa
menit melalui darah ke semua organ dan jaringan tubuh. Kafein dapat
mengelabui tubuh untuk dapat tetap beraktivitas tinggi meningkatkan tekanan
darah,dan peningkatan pengeluaran urin. Kafein merupakan jenis alkaloid yang
secara alamiah terdapat dalam biji kopi, daun teh, daun mete, biji kola, biji coklat
(Hasnawati 2005).
Sediaan obat sakit kepala yang beredar di pasaran sebagian besar berupa
campuran dari berbagai zat berkhasiat. Sebagian besar campuran tersebut
bertujuan untuk meningkatkan efek terapi dan kemudahan dalam pemakaian
sediaan obat tersebut. Salah satu campuran zat aktif yang paling sering dijumpai
dalam sediaan obat sakit kepala adalah parasetamol dan kafein (Damayanti
2003).
Kafein merupakan stimulansia system saraf pusat dan metabolik. Kefein
menghambat phosphodiesterase dan mempunyai efek antagonis pada reseptor
adenosine sentral. Pengaruh pada sistem syaraf pusat terutama pada pusat-
pusat yang lebih tinggi, yang menghasilkan peningkatan aktivitas mental dan
tetap terjaga atau bangun.

Gambar 1. Struktur Kimia Kafein

Kafein merupakan alkaloid putih dengan rumus senyawa kimia C8H10N4O2,

dan rumus bangun 1,3,7-trimethylxanthine. Kafein mempunyai kemiripan
struktur kimia dengan 3 senyawa alkaloid yaitu xanthin, theophylline, dan
theobromine. C8H10N4O (Buysse D.J Reynolds, 1989). Kafein adalah senyawa
kimia yang dijumpai secara alami di dalam makanan contohnya biji kopi, teh, biji
kelapa, buah kola (cola nitide) guarana, dan mate. Teh adalah sumber kafein
yang lain, dan mengandung setengah dari kafein yang dikandung kopi. Beberapa
tipe teh yaitu teh hitam mengandung lebih banyak kafein dibandingkan jenis teh
yang lain. Kafein juga merupakan bahan yang dipakai untuk ramuan minuman
non alkohol seperti cola, yang semula dibuat dari kacang kola. Soft drinks
khususnya terdiri dari 10-50 mg kafein. Coklat terbuat dari kokoa mengandung
sedikit kafein. Efek stimulan yang lemah dari coklat dapat merupakan kombinasi
dari teobromin dan teofilin sebagai kafein. Indonesia sendiri dikenal sebagai
negara penghasil kopi terbesar ke empat di dunia dengan tingkat produksi
sebesar 350.000 ton dengan nilai USD 376 juta. Mengutip beberapa hasil
penelitian, dosis 100-150 mg kafein merupakan batas amam konsumsi manusia,
dan efek yang diberikan pada takaran ini adalah dapat meningkatkan aktivitas
mental yang membuat orang selalu terjaga, sehingga dosis anjuran konsumsi
dari produsen minuman berenergi adalah 2-3 kali atau setara dengan 100-150
mg kafein seharinya. Hal ini sebenarnya beresiko terutama bila konsumsi dari
minuman berenergi masih disertai dengan minum kopi
Pemerintah telah menetapkan standar kafein pada minuman berenergi
yaitu SNI No 01-6684-2002 tentang minuman berenergi. Tujuan dari SNI
tersebut adalah untuk melindungi konsumen dari efek negatif kafein yang
berlebih. Namun disisi lain, konsentrasi kafein yang telah ditentukan tersebut
tidak memberikan efek stamina yang instan bagi konsumen, sehingga
dimungkinkan ada produsen yang meningkatkan kadar kafeinnya untuk
menghasilkan efek yang cepat bagi pengkonsumsinya. Kadar maksimum pada
minuman berenergi berdasarkan peraturan menurut SK Dirjen POM
No.PO.04.02.3.01510 dan SNI No 016684-2002 yaitu 50 mg persaji (BPOM RI,
2004). Kafein adalah suatu senyawa organik yang mempunyai nama lain yaitu
kafein, tein, atau 1,3,7-trimetilxantin. Kristal kafein dalam air berupa jarum-jarum
bercahaya. Bila tidak mengandung air, kafein meleleh pada suhu 234oC – 239oC
dan menyublim pada suhu yang lebih rendah. Kafein mudah larut dalam air
panas dan kloroform, tetapi sedikit larut dalam air dingin dan alkohol.
Kafein yang dikonsumsi dalam dosis kecil mempunyai efek positif.
Penelitian secara radiologi oleh Innsbruck Medical University (2005) menemukan
bahwa kafein pada dosis 100 mg dapat menigkatkan kinerja otak depan dimana
jaringan memori berada ( Clarke, R. dan R. Macrae 1989). Berbagai penelitian
telah dilakukan untuk meneliti pengaruh kafein terhadap berbagai aspek
psikologis, ada banyak metode yang dilakukan untuk menentukan kadar kafein
yaitu dengan metode HPLC, metode spektrofotometri UV-VIS, metode titrasi
iodometri secara tidak langsung. Berdasarkan uraian diatas tersebut maka
penulis tertarik untuk menentukan kadar kafein dalam minuman berenergi
kemasan sachet. Dalam penelitian ini adapun metode yang dilakukan untuk
menentukan kadar kafein dalam minuman berenergi kemasan sachet adalah
dengan metode titrasi iodometri secara tidak langsung, alasan memilih metode
ini karena praktis dan sederhana (Hasnawati 2005).
Untuk mengetahui apakah kadar kafein pada minuman berenergi sediaan
sachet sudah sesuai dengan yang tertera pada etiket. Penelitian ini bermanfaat
untuk memberikan informasi bagi masyarakat terhadap bahaya efek samping
mengkomsumsi kafein secara berlebihan dapat menyebabkan penyakit, sebagai
refrensi bagi peneliti untuk menganalisa kafein dengan metode yang lain, serta
sebagai bahan referensi dan acuan bagi akademik untuk meningkatkan kualitas
pendidikan.
Pemeriksaan mutu sediaan obat sakit kepala diperlukan agar kadar
komposisi obat sesuai dengan jumlah yang ditetapkan dan mengikuti prosedur
analisis standar serta dapat menunjang efek terapeutik yang diharapkan (Naid et
al 2011). Penetapan kadar kafein dan parasetamol sediaan obat multikomponen
dapat dilakukan dengan metode titrimetri dan metode kromatografi cair kinerja
tinggi. Kelebihan menggunakan metode titrimetri yakni biaya yang digunakan
relatif murah, namun kekurangannya memerlukan waktu analisis yang lama dan
kurang sensitif untuk penentuan zat yang kadarnya kecil. Sedangkan metode
kromatografi cair kinerja tinggi yang memiliki sensitifitas analisis yang tinggi
namun memerlukan biaya yang relatif mahal (Levent 2002).
Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas
perbedaan distribusi dari komponen campuran tersebut diantaranya dua fase,
yaitu fase diam (stationary) dan fasebergerak (mobile). Fase diam dapat berupa
zat padat atau zat cair,sedangkan fase bergerak dapat berupa zat cair atau gas.
Dalam kromatografi fase bergerak dapat berupa gas atau zat cair dan fase diam
dapat berupa zat padat atau zat cair (Acun 2010). Kromatografi adalah metode
suatu proses fisik yang digunakan untuk memisahkan komponen-komponen dari
suatu campuransenyawa kimia. Dalam kromatografi, campuran tersebut dibuat
sebagizona yang sempit (kecil) pada salah satu ujung media porus
sepertiadsorben, yang disebut alas atau landasan kromatografi (Hendayana
2006).
HPLC yang modern telah mucul akibat pertemuan dari kebutuhan,
keinginan manusia untuk meminimalis pekerjaan,kemampuan teknologi, dan
teori untuk memandu pengembangan pada jalur yang rasional. Jelas sebelum era
peralatan yang modern bahwa LC (Liquid Chromatography) memiliki kekuatan
pemisahan yang sangat ampuh, bahkan untuk komponen-komponen yang
berhubungan sangat erat. LC harus ditingkatkan kecepatannya,diotomasasi, dan
harus disesuaikan dengan sampel-sampel yang lebih kecil, waktu elusi yang
beberapa jam (Day,Underwood 2002).Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT
atau biasa juga disebut dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatograhy)
dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini KCKT
merupakan tekhnik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan
pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel dalam sebidang, antara lain :
farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer dan industri-industri makanan.
Beberapa perkembangan KCKT terbaru antra lain : miniaturisasi`sistem KCKT,
penggunaan KCKT untuk analisis asam-asam nukleat, analisis protein, analisis
karbohidrat dan analisisi senyawa-senyawa kiral (Rohmah 2013).
Prinsip dasar HPLC adalah fase gerak air dialirkan dengan pompa melalui
kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fase gerak dengan cara
penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen cairan
karena perbedaan kekuatan interaksi antara salut-salut terhadap fase diam akan
keluar dari kolom lebih dahulu dan sebaliknya. Setiap komponen campuran yang
keluar dari kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk
kromatogram (Lestari 2014). Zona campuran kemudian digerakan dengan
larutan suatu cairan atau gas yang bergerak sebagai pembawa, melaui media
porus tersebut, yang berupa partikel-partikel yang ”diam“ (tidak bergerak,
statisiones). Sehingga akibatnya masing-masing komponen dari campuran
tersebut akan terbagi (terdistribusi) secara tidak merata antara alas yang “diam”
dan cairan atau gas yang membawanya. Akibat selanjutnya, masing-masing
komponen akan bergerak (bermigrasi) pada kecepatan yang berbeda (differential
migration) dan dengan demikian, akan sampai pada ujung lain dari alas tersebut
pada waktu yang berlainan, dan dengan demikian terjadilah pemisahan diantara
komponen-komponen yang ada (Hendayana 2006).

Tujuan

Praktikum ini bertujuan untuk menentukan kadar kafein pada sampel

minuman berenergi dan obat dengan metode HLPC (High Liquid Perfomance
Chromatography).

Alat dan bahan

Alat-alat yang digunakan dalam percobaan adalah gelas piala, labu takar,
mortar, alu, neraca analitik, sudip, pipet mohr, neraca analitik, kaca arloji, pipet
tetes, corong, suntikan, kertas saring, instrumen HPLC(high liquid perfomance
chromatography).
Bahan yang digunakan dalam praktikum adalah sampel minuman
kratingdaeng, M-150, coca cola, obat bintang 7, akuabides.

Prosedur

Penentuan kadar kafein dalam sampel dilkukan dengan dipipet larutan 1

ml sampel kedalam labu takar 50 mL. Sampel soda (coca-cola) dilakukan
sonikator terlebih dahulu sampai tidak terdapat gelembung. Sampel di tera
dengan akuabides. Untuk sampel padatan, ditimbang terlebih dahulu sebanyak
0.5 gram dan dilarutkan dengan akuabides. Sampel disaring dengan kertas
saring didalam labu takar 50 ml kemudian di tera sampai garis dengan
akuabides. Larutan di homogenkan dan diambil dengan suntikan. Suntikan
dihilangkan gelembungkan dengan cara diketuk dengan jari hingga gelembung
hilang. Sampel dituang kedalam botol vial, sebelum dituang disaring dengan
milipore. Sampel disimpan pada lemari es selama 1 minggu
Analisis kadar kafein dengan HPLC, dengan menggunakan pelarut
methanol ; air (35 ; 65), diatur laju alir 1 mL/menit. Dengan panjang gelombang
275 nm, dan waktu analisis 6 menit. Siring dibilas dengan larutan standar kafein
100 ppm sebanyak 10x. standar di ambil 20 µL, dan di injek ke HPLC. Analisis
ditunggu hingga selesai dan dicatat waktu retensi dan luas area. Analisis sampel
kafein dilakukan sama seperti standar.

Hasil dan pembahasan

Pada penelitian ini digunakan tiga sampel minuman energi dan obat
sakit kepala pemilihan sampel ini dikarenakan banyak dikonsumsi oleh
masyarakat, dan dikatakan juga memiliki kadar kafein yang tinggi. Sampel yang
digunakan dalam praktikum yakni kratingdaeng, coca cola, m-150, dan obat
bintang tujuh.
Kafein adalah salah satu jenis alkaloid yang banyak terdapat dalam biji
kopi, daun teh, dan biji coklat. Kafein memiliki efek farmakologis yang
bermanfaat secara klinis, seperti menstimulasi susunan syaraf pusat, relaksasi
otot polos terutama otot polos bronkus dan stimulasi otot jantung. Berdasarkan
efek farmakologis tersebut, kafein ditambahkan dalam jumlah tertentu ke
minuman. Efek berlebihan (over dosis) mengkonsumsi kafein dapat
menyebabkan gugup, gelisah, tremor, insomnia, hipertensi, mual dan kejang.
Berdasarkan FDA (Food Drug Administration) dosis kafein yang diizinkan 100-
200 mg/hari, sedangkan menurut SNI 01- 7152-2006 batas maksimum kafein
dalam makanan dan minuman adalah 150 mg/hari dan 50 mg/sajian. Kafein
sebagai stimulan tingkat sedang (mild stimulant) memang seringkali diduga
sebagai penyebab kecanduan. Kafein hanya dapat menimbulkan kecanduan jika
dikonsumsi dalam jumlah yang banyak dan rutin. Namun kecanduan kafein
berbeda dengan kecanduan obat psikotropika, karena gejalanya akan hilang
hanya dalam satu dua hari setelah konsumsi (Kesia 2013). Berikut data sampel
kafein pada percobaan.
Tabel 1 Data sampel kafein
No Sampel Kemasan Volume / Warna Rasa Bau Massa
massa kafein
(perkemas dalam
an) kemasan
1. Kratingdae Botol 150 mL Kuning Asam Jeru 50 mg
ng kaca Muda k
2. Coca-cola Botol 250 mL Coklat Manis Cola 24 mg
plastik tua
3. Puyer obat Sachet 1 gram Putih Pahit Obat 50 mg
bintang (karton)
tujuh
4. M-150 Botol 150 mL Kuning Asam Per 50 mg
kaca men
kare
t
 Berikut hasil penentuan kafein dalam sampel. Sampel yang telah di
diamkan di lemari es, selanjutnya dianalisis dengan HPLC dengan pelarut
methanol-air. Kafein bersifat polar oleh karena itu digunakan pelarut methanol-
air. Panjang gelombang digunakan dalam detektor yakni 276nm, hasil penentuan
kafein disajikan dalam bentuk tabel sebagai berikut.
Tabel 2. Hasil penentuan kafein dalam sampel
No Sampel Watu Luas area Bobot/volume [kafein]
retensi sampel (ppm)
1. Standar 5,152 3286747 - 100
2. Ratingdaeng 5,033 158798 5 mL 241,57
3. Coca-cola 5,089 21774 5 mL 32,129
4. Bintang 5,015 1027665 0,5 gram 3126,69
Toedjoeh
5. m-150 5,061 193937 5 mL 295,03

Metode analisis KCKT dapat digunakan untuk analisis secara kualitatif

maupun kuantitatif senyawa-senyawa yang terdapat dalam sampel. Penelitian
yang menggunakan metode KCKT dilakukan oleh Ree, M dan Stoa, E (2011)
untuk menetapkan kandungan aspartam, asam benzoat, kafein, dan sakarin
dalam minuman ringan bebas gula. Fase gerak yang digunakan adalah campuran
metanol dengan air, kolom XB-C18 (50 L x 4,6 mm), dengan panjang gelombang
220 nm dan 270 nm. Penelitian lain juga dilakukan oleh Techakriengkrai, I dan
Surakarntul, R (2007) menggunakan metode KCKT untuk menganalisis asam
benzoat dan asam sorbat pada minuman ringan menggunakan fase gerak
metanol dengan air (35:65)
Penentuan Kafein seharusnya menggunakan ekstraksi sampel agar
didapatkan senyawa murni. Seharunya minuman atau obat yang digunakan
sebagai sampel dilakukan ekstraksi pelarut sebelum dianalisis menggunakan
HPLC. Ekstraksi pelarut merupakan metode pemisahan yang sering digunakan
dalam laboratorium untuk mengisolasi satu atau lebih komponen dari suatu
campuran (Khopkar 1990). Prinsip metode ekstraksi pelarut didasarkan pada
distribusi zat terlarut dalam dua pelarut yang tidak saling bercampur. Ekstraksi
terhadap kopi kemasan dilakukan untuk menghilangkan unsur lain yang mungkin
akan mengganggu proses analisis. Oleh karena itu dilakukan penelitian tentang
pengaruh komposisi fase gerak pada penentuan kadar asam benzoat dan kafein
yang terdapat pada kopi kemasan dengan metode HPLC menggunakan fase
gerak campuran metanol dan buffer ammonium asetat.
Ekstraksi kafein dilakukan dengan metode soxhlet dengan pelarut yang
berfungsi untuk melarutkan kafein yang terkandung dalam sampel. Kafein
bersifat polar sehingga digunakan pelarut polar juga yaitu metanol agar kafein
yang terdapat dalam sampel terlarut dalam pelarut tersebut. Ekstrak kopi hasil
soxhlet ditambah dengan MgO dan air kemudian diaduk konstan selama ± 10
menit agar pencampuran merata sehingga zat selain kafein yang terkandung
dalam ekstrak kopi tersebut berikatan dengan MgO, sehingga diperoleh larutan
berwarna coklat orange. Saat pencampuran selesai, campuran disaring untuk
memisahkan antara residu dan dan filtrat. Residu hasil penyaringan dibilas
menggunakan air sebelum dibuang, tujuannya agar filtrat yang masih terdapat
dalam residu tersebut ikut terbawa air dan bercampur dengan filtrat hasil
penyaringan yang awal. Filtrat yang terkumpul ditambah dengan H2SO4 10%
untuk membuat larutan menjadi bersifat asam karena larutan tersebut bersifat
basa akibat adanya Mg(OH)2 yang terbentuk dari pelarutan MgO dalam air pada
tahap sebelumnya, kemudian diuapkan sampai tersisa 1/3 dari volume awal
untuk menghilangkan kandungan air dan asam berlebih. Sisa larutan yang
diuapkan kemudian diekstraksi menggunakan kloroform sehingga akan diperoleh
fase organik yang akan mendapat perlakuan selanjutnya. Fase organik hasil
ekstraksi ditambah dengan larutan NaOH 1% sampai warnanya memudar dan
ditambah air sebanyak volume NaOH 1% yang ditambahkan, setelah itu larutan
didestilasi pada suhu ± 30oC untuk menghilangkan fase organik (kloroform) dari
campuran sehingga hanya tersisa fase air. Suhu destilasi merupakan setengah
dari titik didih kloroform, hal tersebut dilakukan agar penguapan terjadi secara
perlahan sehingga kloroform terpisah dari fase air dengan baik. Fase air inilah
yang dianalisis menggunakan KCKT.
Akibat mengkonsumsi kafein berlebih, gangguan sistem transportasi
karbondioksida, oksigen dan hasil metabolism lainnya akan terjadi jika sirkulasi
darah tidak memadai. Tekanan darah tinggi dipengaruhi oleh beberapa faktor,
yaitu faktor lingkungan yang meliputi alkohol, stress, merokok, obesitas,
konsumsi garam, kafein seperti mengkonsumsi kopi serta ciri individu seperti
faktor genetik, suku, jenis kelamin, dan usia. Senyawa kafein pada seseorang
yang minum kopi bisa menyebabkan tekanan darah meningkat tajam sehingga
sangat berbahaya bagi penderita hipertensi (Hamer 2006). Kafein di dalam tubuh
manusia bekerja dengan cara memicu produksi hormon adrenalin yang berasal
dari reseptor adinosa di dalam sel saraf yang mengakibatkan peningkatan
tekanan darah, pengaruh dari konsumsi kafein dapat dirasakan dalam waktu 5-
30 menit dan bertahan hingga 12 jam. Efeknya akan berlanjut dalam darah
selama sekitar 12 jam. Konsumsi satu atau dua cangkir kopi dalam sehari dapat
membuat seseorang merasa lebih terjaga dan waspada untuk sementara
(Indriyani 2009). Peningkatan resistensi pembuluh darah tepi dan vasokonstriksi
di sebabkan oleh kafein yang memiliki sifat antagonis endogenus adenosin.
Peningkatan tekanan darah dipengaruhi oleh dosis kafein yang dikonsumsi. Dosis
kecil kafein yang biasa dikonsumsi oleh Seseorang mempunyai adaptasi/efek
yang rendah (Wahyuni 2013). Pencegahan hipertensi dapat dilakukan dengan
berbagai cara. Adapun kunci utamanya adalah dengan merubah pola makan dan
membiasakan diri melakukan olahraga. Gizi seimbang diharapkan dikonsumsi
Setiap orang dengan cara mengurangi makanan yang mengandung lemak jenuh
dan memperbanyak konsumsi sayuran dan buah. Selain itu, pembatasan
konsumsi garam sebaiknya dibatasi sejumlah 5 gram/hari, mengurangi
penggunaan alkohol akan mencegah terhambatnya aliran darah, dan mengurangi
kebiasaan merokok akan mencegah rusaknya lapisan dinding arteri (Ningrat
2012).
Perlu adanya metode lain yang mampu menutupi kelemahan yang dimiliki
oleh metode spektrofotometri UV dan GC-MS. Salah satu metode yang dapat
digunakan yaitu metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi yang selanjutnya
disingkat dengan KCKT. Metode KCKT termasuk suatu teknik kromatografi kolom
dengan fase gerak berupa cairan dan fase diam berupa padatan yang terdapat
pada kolom. Kelebihan yang dimiliki oleh KCKT antara lain mampu memisahkan
molekul-molekul dari suatu campuran dengan baik, memiliki kecepatan analisis
dan kepekaan yang tinggi, dapat menggunakan berbagai detektor, kolom dapat
digunakan kembali, memisahkan zat yang labil dan tidak mudah menguap,
dilakukan pada suhu kamar, serta ideal untuk pemisahan ion dan molekul besar
(Johnson dan Stevenson 1991).

Daftar Pustaka

[BPOM]. Tentang Hasil Sampling dan Pengujian Laboratorium Produk Minuman

Suplemen yang Mengandung Kafein. Badan Pengawas Obat dan Makanan
Republik Indonesia.
Buysse D.J, Reynolds C.F, Monk T.H, Berman S.R, Kupfer D.J. 1989. The
Pittsburgh Sleep Quality Index: A New Instrument For Psychiatric Practice
And Research. Psychiatry Research 28(2):193–213.
Clarke, R.J. & R. Macrae. 1989. Coffee Chmestry. London and New York :
Elsevier Applied Science. Vol. I, II.
Damayanti S, Ibrahim S, Firman K, Tjahjono, D. H. 2003. Simultaneous
determination of paracetamol and ibuprofen mixtures by high performance
liquid chromatography. IJC . vol 3 (1) : 9-13
Day RA, Underwood AL. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta(ID): Erlangga.
Sopyan I, penerjemah. Terjemahan dari: Quantitative Analysis.
Hamer, M. 2006. Coffe and health: explaining conflicting results in hypertension.
Journal of Human Hypertension. Vol 20(1): 909-912.
Hasnawati. 2005. Analisis Kuantitatif Kafein Dalam Minuman Suplemen
Menggunakan Spektrofotometer UV-Vis. Kendari (ID) : UNHALU
Hendayana, Sumar. 2006. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan
Elektroforensis Modern. Bandung (ID) : PT. Remaja Rosdakarya.
Johnson, E., dan Stenvenson, R. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Padmawinata,
penerjemah. Bandung: Penerbit ITB. Terjemahan dari : Basic Liquid
Chromatography.
Kesia, Maramis R, Citraningtyas G, Wehantouw F. 2013. Analisis kafein dalam
kopi bubuk di Kota Manado menggunakan spektrofotometri uv-vis.
Pharmacon Jurnal Ilmiah Farmasi . vol 2 (04) : 2302 – 2493.
Lestari, Wahyuni S. 2014.Validasi Metode Penetapan Kadar Aliskiren dalam
Plasma darah secara In Vitro Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi (KCKT). Jakarta (ID) : UIN Syarif Hidayatullah.
Levent M. 2002. HPLC method for the analysis of paracetamol, caffeine, and
dipyrone. TJC. Vol 3 (1): 521-528.
Naid, Tajuddin, Syahruddin K, Mieke P. 2011. Penetapan kadar parasetamol
dalam tablet kombinasi parasetamol dengan kafein secara spektrofotometri
ultraviolet- sinar tampak. Majalah Farmasi dan Farmakologi . vol 15 : 77-
82.
Ningrat, Ranny W, Budi S. 2012. Pemilihan Diet Nutrien Bagi Penderita Hipertensi
Menggunakan Metode Kalsifikasi Decisieon Tree (RSUD Syarifah Ambami
Rato Ebu Bangkalan). [Sripsi]. Surabaya(ID) : ITS.
Rohman, Abdul. 2013. Kimia Analisis Farmasi. Jakarta (ID): Pustaka Pelajar.
Techakriengkrai, I., & Surakarnkul, R. 2007. Analysis of benzoic acid and sorbic
acid in thai rice wines and distillates by solid-extraction and high
performance liquid chromatography. Journal of Food Composition and
Analysis. vol 20 : 220-225.
Wahyuni, Tri. 2013. Hubungan Konsumsi Kopi Dengan Tekanan Darah Pada
Pasien Rawat Jalan Puskesmas Bogor Tengah. Bogor(ID): Departemen Gizi
Masyarakat Fakultas Ekologi Manusia
Lampiran
Lampiran 1. . Hasil penentuan kafein dalam sampel
No Sampel Watu Luas area Bobot/volume [kafein]
retensi sampel (ppm)
1. Standar 5,152 3286747 - 100
2. Ratingdaeng 5,033 158798 5 mL 241,57
3. Coca-cola 5,089 21774 5 mL 32,129
4. Bintang 5,015 1027665 0,5 gram 3126,69
Toedjoeh
5. m-150 5,061 193937 5 mL 295,03

Contoh perhitungan sampel Kratingdaeng

𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
[kafein] = 𝑥 [𝑠𝑡𝑑 kafein] x fp
𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟
158798
= 𝑥 100 x 100
3286747
= 241,57 mg/L