Abstrak

Gen yang mengkode kitinase dari B. subtilis telah diisolasi setelah optimasi kondisi PCR. Itu
diklon dengan dua prometer yang berbeda, promotor T7 dari vektor kloning pJET1.2/tumpul dan
promotor SP6 dari vektor pGEM -T Easy. Setelah mentransformasi E. coli DH5a, dua transforman
dipilih, CHI-NRC-4 dari vektor pertama dan T-CHI-NRC-6 dari vektor kedua, dan digunakan untuk studi
lebih lanjut. Urutan CDS lengkap gen kitinase ditentukan dan diserahkan ke GenBank dengan nomor
akses KX268692.1. Kultur supernatan E. coli(CHI-NRC-4) dan E. coli(T-CHI-NRC-6) diteliti efek
penghambatannya terhadap penetasan telur M. javanica di bawah kondisi laboratorium. Hasil
menunjukkan penghambatan hingga 96% dalam penetasan telur karena kedua transforman E. coli
dibandingkan dengan kontrol yang mencerminkan efisiensi ekspresi yang sama dari kedua prometer yang
digunakan. Percobaan rumah kaca dilakukan untuk mengevaluasi efek nematisida supernatan kultur dari
dua transformasi E. coli (CHI-NRC-4) dan E. coli (T-CHI NRC-6) terhadap terong yang terinfeksi M.
javanica. Hasil yang diperoleh menunjukkan penurunan populasi nematoda yang signifikan di tanah dan
akar dan peningkatan parameter pertumbuhan terong dibandingkan dengan kontrol.

Pendahuluan

Tanaman solanaceous mewakili kepentingan ekonomi yang besar di seluruh dunia. Diantaranya,
terong (Solanum melongena L.), merupakan salah satu tanaman sayuran yang memiliki khasiat nutrisi dan
obat serta merupakan sumber vitamin A dan C yang baik, selain unsur gizi lainnya yaitu zat besi, fosfor,
kalium dan kalsium. Nematoda parasit tanaman adalah salah satu hama umum yang paling berbahaya
yang menyebabkan penurunan kualitas dan kuantitas produksi terong. Selain itu, nematoda berfungsi
sebagai agen predisposisi perkembangan penyakit kompleks dengan jamur, bakteri dan virus.

Nematoda parasit tanaman dapat dikelola secara efektif dengan nematisida kimia tetapi banyak
dari bahan kimia ini tidak hanya menjadi semakin mahal tetapi juga sumber risiko manusia dan
lingkungan, meskipun hanya digunakan jika diperlukan. Akibatnya, kontrol kimia mungkin tidak lagi
menjadi pilihan yang baik. Dorongan baru-baru ini untuk menghasilkan sayuran yang bebas dari residu
kimia dan meningkatnya kepedulian terhadap lingkungan dan kesehatan manusia menyebabkan inovasi
dan mengembangkan pendekatan pengendalian alternatif yang aman bagi lingkungan.

Salah satu alternatif yang masuk akal adalah penggunaan biokontrol yang melibatkan aplikasi
mikroba antagonis terhadap nematoda. Temuan tersebut membuka pintu untuk menggunakan teknologi
DNA rekombinasi dalam konstruksi strain yang menggabungkan ikatan yang diinginkan. Manipulasi
genetik dapat menghasilkan agen biokontrol baru yang mampu meningkatkan produksi senyawa toksik
atau enzim litik. Kedua dosis gen untuk enzim, dan molekul represor dan regulator dapat diubah untuk
mencapai konsentrasi enzim yang tinggi dengan produk sampingan yang sedikit merugikan.

Taktik pengendalian biologis telah menjadi bidang yang menarik bagi banyak peneliti karena
memainkan peran yang luar biasa dalam mengendalikan penyakit yang disebabkan oleh nematoda parasit
tanaman. Tikhonov dkk. melaporkan bahwa, enzim kitinase dan protease dari beberapa rhizobakteri
pemacu pertumbuhan tanaman bertanggung jawab dalam mendegradasi dinding nematoda dan aksi enzim
kitinase lebih merusak kulit telur nematoda. Woo-Jin dkk. mendeteksi bahwa, P. illinoisensis memiliki
aktivitas kitinolitik yang kuat pada penetasan telur M. incognita bahwa dalam 7 hari inkubasi dengan P.
illinoisensis, tidak ada telur yang menetas, sedangkan (39,8%) tingkat penetasan telur diamati pada
kontrol air. Gen kitinase telah diklon dan dikarakterisasi dari berbagai mikroorganisme. Beberapa di
antaranya dikloning ke tanaman dan galur bakteri untuk meningkatkan kemampuannya mengendalikan
patogen tanaman; yang lain sangat diekspresikan dalam E. coli untuk meningkatkan aktivitas mereka.
Penelitian ini berkaitan dengan peningkatan potensi nematisida melalui kloning dan ekspresi gen kitinase
dari Bacillus subtilis subsp. subtilis BTN7A strain

Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Strain bakteri

Bacillus subtilis BTN7a digunakan untuk isolasi gen kitinase. E. coli DH5a digunakan dalam jalur
transformasi.

2.2. Kondisi sedang dan pertumbuhan

Media Lauria-Bartani (LB) digunakan untuk pertumbuhan bakteri. Suhu pertumbuhan strain bakteri yang
digunakan adalah 37 C.

2.3. Ekstraksi telur M. javanica

Ekstraksi telur M. javanica dilakukan seperti pada [10] menggunakan akar tomat yang terinfeksi.
Telur kemudian dipindahkan ke dalam gelas kimia yang bersih dengan air yang telah disterilkan.

2.4. Evaluasi in vitro nematotoksisitas

Supernatan dari transformasi E. coli (NRC-CHI-4) dan E. coli (T-CHI-NRC-6) dievaluasi efek
penghambatannya terhadap penetasan telur M. javanica di bawah kondisi laboratorium dibandingkan
dengan B. subtilis. Empat ml suspensi telur yang mengandung sekitar 100 telur M. javanica dipindahkan
ke dalam cawan Petri berdiameter 6 cm. dimana satu ml supernatan dari dua trans membentuk E. coli atau
B. subtilis kultur ditambahkan secara terpisah. Satu ml media LB dipindahkan ke cawan Petri yang
dilengkapi dengan empat ml suspensi telur sebagai kontrol. Semua hidangan disimpan pada suhu kamar.
Setiap preparat dan kontrol dilakukan ulangan sebanyak lima kali. Remaja yang muncul dihitung dengan
bantuan mikroskop stereoskopik setiap 24 jam selama tiga hari. Semua perlakuan kemudian dipindahkan
ke air suling selama 24 jam untuk memastikan apakah telur telah dinonaktifkan secara permanen atau
sementara.

2.5. Evaluasi in vivo nematotoksisitastoxic

Uji coba rumah kaca dilakukan untuk mengevaluasi efisiensi nematisida supernatan E. coli (NRC
CHI 4) dan E. coli (T-CHI-NRC-6) dan B. subtilis yang ditransformasikan terhadap M. javanica. Bibit
terong berumur satu bulan ditransplantasikan dengan diameter 25 cm. pot diisi dengan tanah campuran
yang diautoklaf dari pasir lempung: tanah liat (1:1 v/v). Pot diperlakukan dengan 10 ml/pot dari masing-
masing supernatan sebelumnya sebagai tanah basah kuyup dan menerima 2000 telur M. javanica dalam
10 ml air suling. Pot yang ditransplantasikan dengan bibit terong berumur satu bulan menerima 2000 telur
M. javanica dalam 10 ml air suling sebagai kontrol. Setiap perlakuan diulang delapan kali, pot disusun
dalam rancangan acak kelompok lengkap di rumah kaca pada suhu 27 ± 3 C. Percobaan dihentikan 60
hari setelah infeksi nematoda. Data reproduksi nematoda, parameter pertumbuhan tanaman dan analisis
statistik dilakukan.
2.6. manipulasi DNA

Kecuali ditentukan, semua manipulasi biologi molekuler dilakukan sesuai dengan protokol
standar dan instruksi pemasok kit. DNA genom bakteri diekstraksi menggunakan metode ekstrak kasar
segar dan digunakan sebagai template DNA dalam amplifikasi PCR.

2.7. Reaksi berantai polimerase (PCR)

Amplifikasi gen kitinase dilakukan dalam siklus termal AmplitronyxTM (NYXTECHNIK, USA)
yang diprogram untuk satu siklus denaturasi DNA pada 94 C (5 menit), 35 siklus 94 C (2 menit), 45 C (1
menit) dan 72 C (1,5 menit), ditambah satu siklus tambahan perpanjangan rantai akhir pada 72 C (10
menit). Pada akhir program PCR sampel campuran reaksi dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa dan
sisa campuran reaksi ditahan pada suhu -20 C sampai digunakan untuk kloning dan untuk sekuensing.
Sequencing dilakukan di Macrogen Co., Korea.

2.8. Bioinformatika dan desain primer

Situs internet yang berbeda telah digunakan melalui penelitian ini. Mereka termasuk: Pusat
Informasi Bioteknologi Nasional (NCBI), perangkat lunak Webcutter 2.0, desain primer (Primer3),
Pemetaan Plasmid dan program SnapGene Viewer. Basis data sekuens DNA GenBank B. subtilis diakses
(NCBI Reference Sequence: NC_016047.1) dan 1216 bp dari CDS kitinase lengkap dan basa sekitarnya,
dianalisis menggunakan perangkat lunak Webcutter 2.0 dan perangkat lunak Primer3 untuk memilih yang
sesuai primer yang memperkuat CDS lengkap Chi. Primer yang dipilih adalah Chi-bs-F (GGT TAT GAG
ATG TTT CAA ATG AGC) dan chi-bs-R (GGA TTT TGC TTA GAA CTA TAA ATC CTT). Ukuran
amplikon kitinase yang diharapkan adalah 970 bp.

2.9. Amplifikasi gen kitinase

Beberapa upaya telah dilakukan untuk mengisolasi gen kitinase B. subtilis BTN7a; mereka
termasuk konsentrasi DNA yang berbeda, program PCR yang berbeda dan konsentrasi MgCl2 yang
berbeda. Setelah program selesai, 10 ml DNA hasil amplifikasi dianalisis dengan elektroforesis gel dan
dibandingkan dengan DNA ladder 100 bp sebagai penanda DNA. Gen kitinase (Chi) dimurnikan dari gel
menggunakan kit pemurnian DNA MEGAquick spinTM Total Fragment DNA (iNtRON Biotechnology).

2.10. Kloning kitinase

Dua protokol berbeda digunakan untuk mengkloning gen kitinase menggunakan dua vektor yaitu
vektor kloning pJET1.2/tumpul dan vektor pGEM -T Easy. Gen kitinase diklon ke dalam vektor Kloning
pJET1.2/tumpul menggunakan CloneJETTM PCR Cloning Kit (Thermo scientific, USA). Gen kitinase
hasil amplifikasi diubah menjadi ujung tumpul dengan menggunakan enzim DNA tumpul kemudian
diligasi dengan pJET1.2/tumpul Cloning Vector. Gen kitinase juga diklon dengan vektor pGEM -T Easy
(Promega Co. Madison, USA).
2.11. Transformasi E.coli DH5a

E. coli DH5a diubah menjadi sel kompeten dan ditransformasikan dengan plasmid rekombinan.
Transforman dipilih berdasarkan kemampuannya untuk tumbuh dengan adanya ampisilin dan dengan
penyaringan putih/biru (yaitu, metode Xgal dan IPTG).