Kromatografi Eksklusi

Size-Exclusion Chromatography (SEC)

Molecular Sieve Chromatography
 Metode pemisahan dimana komponen-komponen
dalam sampel dipisahkan berdasarkan berat molekulnya

Pemisahan/pemurnian molekul-molekul besar

atau senyawa kompleks makromolekul (protein,
Kromatografi Eksklusi senyawa kompleks hasil sintesis, polimer
biologi: polisakarida, asam nukleat dll
Penentuan berat molekul pada karakterisasi
 Kromatografi
eksklusi

Filtrasi Gel Permeasi Gel

Fase diam hidrofilik Fase diam hidrofobik,
Fasa gerak berair Fasa gerak pelarut organik

Gel sebagai fasa diam :

• Poliakriamid, dextran atau agarose, saringan molekul
(Tekanan rendah)
• Silika , polimer (Tekanan tinggi)
Mekanisme Pemisahan Kromatografi Eksklusi

• Gel terdiri atas makromolekul ikatan silang, membentuk

jaringan tiga dimensi, dan tidak bermuatan.
• Gel mengembang dalam pelarut (fasa gerak) yang berperkolasi
melalui alas kromatografi (gel).
• Sampel yang terdiri atas campuran molekul kecil, sedang, dan
besar ditaruh di atas kolom.
• Molekul-molekul kecil dapat masuk ke dalam gel dan molekul-
molekul besar tak dapat masuk sehingga keluar dari kolom
paling dahulu.

Metode pemisahan non interaktif

Partikel pengisi Molekul solut Molekul besar
kolom ditahan tidak dapat
mempunyai berdasarkan masuk pori
berbagai ukuran volume molekul keluar pada
pori hidrodinamik volume mati,
(ukuran dan molekul kecil
bentuknya) masuk kedalam
bukan pori dan keluar
berdasarkan terakhir
berat molekul
Molekul-molekul berukuran sedang dapat menembus sebagian pori-pori
tapi tidak dapat menembus sebagain lagi. Akibatnya mengalami hambatan
dalam pergerakannya dalam kolom dan keluar pada waktu antara waktu
molekul besar dan molekul kecil.
 Gel setengah kaku
Gel Kaku (Rigid) (semi rigid) Gel Lunak
Volume pori seragam Permeabilitas tinggi Permeabilitas sedang
dan tetap Dapat dibasahi oleh atau tergantung
Permeabilitas tinggi pelarut air pengembangnnya
dalam pelarut
Dapat dibasahi oleh air air/organik
atau pelarut organik Contoh :
Contoh:
Polistiren berikatan
silang , polivinil Dekstran berikatan
Contoh: silica dan silang (Sephadex),
gelas berpori asetat
kanji, karet, polistiren
ikatan silang, gel
poliakrilamid
Keuntungan Kromatografi Eksklusi Faktor-faktor yang berpengaruh
- Pengerjaan mudah pada Kromatografi Eksklusi
- Tidak berinteraksi dengan fase - Molekul-molekul dalam larutan
gerak sampel tidak mempunyai ukuran
- Matriks gel tidak menyebabkan molekul yang pasti
denaturasi protein - Ketidaksesuaian ukuran pori fase
- Dapat digunakan untuk diam
memisahkan molekul dengan - Fase diam berinteraksi dengan

berat molekul 103-106 molekul-molekul sampel

 Selektivitas kromatografi eksklusi tergantung kepada ukuran pori dari gel
sebagai fasa diam

 Selektivitas tidak dapat diatur melalui fase gerak

 Fase gerak hanya sebagai fase pembawa

 Buffer dapat ditambahkan kedalam fasa gerak untuk mempertahankan

aktivitas biologi dari komponen-komponen yang dipisahkan
Tahapan Pengerjaan Kromatografi Ekslusi

 Kolom diisi dengan zat padat berpori dengan luas

permukaan yang tinggi sebagai fase diam, dan sudah
dikembangkan dalam pelarut organik atau air.

 Larutan sampel yang mengandung komponen-komponen

campuran dimasukkan melalui atas kolom.

 Komponen-komponen akan terpisah dengan melewatkan

gasa gerak ke dalam kolom, berdasarkan perbedaan
ukuran molekul, molekul kecil akan tertahan oleh fasa
diam, molekul besar keluar dari kolom.
Pemisahan pada kromatografi eksklusi karena adanya perbedaan ukuran pori pada
fase diam

Terjadi perbedaan eksklusi dan inklusi solut melewati fase diam yang terdiri dari
ukuran pori yang berbeda

Kecepatan permeasi yang berbeda dari komponen-komponen sampel sesuai dengan

ukuran molekul

Analisis penentuan berat molekul menggunakan kurva kalibrasi antara Log Mr

terhadap volume elusi
Penggunaan Kurva Kalibrasi SEC HPLC

Hubungan antara Volume

elusi dengan berat molekul

log M = b - c Ve
b dan c adalah
konstanta 
Limit Eksklusi : Larutan penanda berwarna yang mengandung
komponen dengan berat molekul sangat besar
Menentukan volume
elusi
Limit Penetrasi : Larutan penanda berwarna yang mengandung
komponen dengan berat molekul sangat kecil

Secara ideal : Molekul penanda sama

Bila tidak sama berat molekul dan
dengan molekul yang
distribusi berat molekul tidak dapat
berat molekulnya
dihitung secara akurat
ditentukan
  Gunakan penanda molekul yang
Bila tidak ada struktur molekul
strukturnya sangat mirip dengan
penanda yang sama dengan
struktur molekul yang dianalisis
struktur molekul yang dianalisis
 Gunakan faktor koreksi
 Total eksklusi

Log Mr
Selektif permeasi

Total permeasi

Resolusi spesifik

Volume elusi 0,58

R sp 
V0 V1 σ D2 L

σ  Simpang baku
Absorban

D2  Slope kurva baku

L  panjang kolom

Volume elusi
Nilai resolusi spesifik diperlukan untuk melihat kinerja kolom kromatografi eksklusi

Resolusi dapat diperbaiki dengan

Dalam KCKT dengan pemisahan Fasa
mengganti sistem kromatografi : jenis dan
terbalik, penukar ion, adsorpsi, partisi
komposisi fase gerak, laju alir, dll

Kinerja kolom kromatografi eksklusi,

tidak dapat diperbaiki, karena tidak ada
interaksi antara solut dengan fasa diam
dan fase gerak