Praktikum Virologi

Dosen:
Eem Hayati, SPd.,MKes
 Virologi adalah ilmu yang mempelajari virus dan penyakit – penyakit
yang ditimbulkannya. Untuk menegakkan diagnose virus, biasanya
ditunjang dari hasil pemeriksaan Laboratorium.

Cara pemeriksaan virus di Laboratorium meliputi :

1. Tes Mikroskopis
2. Isolasi dan identifikasi
3. Tes Serologi
A. Alat – alat yang diperlukan Laboratorium virologi.
1. Centrifuge biasa, centrifuge suhu dingin dan centrifuge kecepatan tinggi.
2. Tabung serologi, rak tabung serologi.
3. Plastic Plate.
4. Lemari es biasa, deepfreezer suhu -20oC dan -70oC.
5. Penangas air 37oC dan 56oC – 65oC.
6. Lemari pengeram 35oC dan 37oC.
7. Timbangan.
8. Lampu sorot telur.
9. Bor telur.
10. Mikroskop biasa, mikroskop phase kontras dan mikroskop fluorescent.
11. Spuit.
12. Sterilisator kering dan basah.
A. Bahan pemeriksaan untuk mendiagnosa penyakit virus.

 Bahan pemeriksaan yang diterima di Laboratorium terutama untuk isolasi

virus adalah air cucian tenggorok, air ludah, faeces, nanah, keropeng,
darah, serum dan otak.Bahan – bahan pemeriksaan ini harus diolah dahulu
sesuai dengan bahan pemeriksaan sebelum disuntikan pada hewan
percobaan, telur berembrio atau di tanam pada biakan jaringan.

Pengambilan bahan pemeriksaan.

1) Makula dan Papula

 - Kerok makula atau papula dengan pisau.
 - Hasil kerokan dikumpulkan dalam tabung steril.
 - Kemudian dibuat preparat.
2). Vesikula dan Pustula
 - Tusuk vesikula atau pustula dengan pipet pasteur.
 - Masukkan isi vesikula atau pustula kedalam tabung
kapiler.
 -Tutup kedua ujungnya.
 - Dasar vesikula atau pustula dikerok.
 - Hasil kerokan dikumpulkan dalam tabung.
 -Kemudian buat preparat.
3). Keropeng
 - Ambil keropeng dengan pinset.
 - Kumpulkan dalam tabung steril.
4). Sekret mata
 - Ambil sekret mata dengan swabs.
 -Masukkan ke dalam tabung yang berisi bouillon.
5). Sputum
 - Masukkan sputum dalam botol steril yang ditutup rapat.
6). Faeces
 - Masukkan sekitar 5 gram faeces dalam steril yang bertutup rapat.
Pengiriman bahan pemeriksaan.
Semua bahan pemeriksaan harus diterima dalam botol atau tabung yang
steril. Pada umumnya bahan pemeriksaan harus dikirim cepat dan dalam
keadaan yang dingin

. Darah untuk pemeriksaan serologi tidak boleh dikirim dalam keadaan

beku dan sebaiknya tiba di Laboratorium dalam waktu 24 jam setelah
pengambilan bahan atau serumnya dipisahkan terlebih dahulu

Pengiriman bahan pemeriksaan biasanya harus disertai keterangan klinis

yaitu dari permulaan sakit, penyakit yang diduga, gejala-gejala penyakit, nama
penderita, tempat tinggal dan tanggal pengambilan bahan.
Tes Mikroskopis
Tujuan : Melihat kelainan sel yang diinfeksi virus

Pemeriksaan mikroskopis mempunyai nilai paling rendah, karena :

belum semua i.b dan e.b ditemukan

belum semua pewarnaan diketahui

bila hasil negatif belum tentu diagnosa negative

sulit membedakan virus yg mempunyai i.b dan e.b yg sama

 tetapi mempunyai nilai paling tinggi untuk pemeriksaan virus Rabies karena
virus Rabies mempunyai Inclusion bodies (Negri Bodies) dalam sel otak.
 Pewarnaan yang paling banyak digunakan dalam
diagnosa virus antara lain :

1. Pewarnaan Giemsa.
2. Pewarnaan Gispen.
3. Pewarnaan Seller.
4. Pewarnaan Machiavello.
5. Pewarnaan Gastaneda.
 Pewarnaan Seller
Alat –alat :
- Gelas sediaan., Pinset, Ose.
 
Bahan :
- Larutan A  Basic fuchsin 1% dalam alcohol.
- Larutan B  Methylen Blue 1% dalam alcohol.
Campurkan larutan A dan larutan B (1 bagian larutan A dan 2 bagian
larutan B lalu disaring).

Atau Campuran lain :

- Larutan A  Methylen Blue 2% dalam alcohol.
- Larutan B  Basic Fuchsin 4% dalam alcohol.
- Campurkan larutan A dan larutan B (3 bagian larutan A dan 1 bagian larutan B lalu
disaring).
 Cara Kerja
1. Buat preparat sentuh atau preparat tekan
(dep preparat)
2. Keringkan di udara
3. Fiksasi dengan methanol absolut
4. Celupkan pada zat warna Sellers selama 7
detik
5. Lihat di bawah mikroskop dengan
pembesaran objektif 100x dengan
menggunakan minyak imersi
6. Cari Negri bodies pada sitoplasma sel syaraf otak,
Negri bodies berwarna merah, sitoplasma sel
berwarna biru dan inti sel berwarna biru tua
Hasil pemeriksaan
Tes Isolasi
Tujuan : 1. memperbanyak virus
2. memperoleh virus

Isolasi dapat dilakukan dengan cara :

1. Menggunakan hewan percobaan (tikus, marmut, kelinci, kera).

2. Penanaman pada telur berembrio:
a. Intra yalk sac umur 5 – 7 hari :
b. Intra allantois umur 9 – 11 hari
c. Dropping Chorio Allantois Membrane (CAM) umur 11 – 13 hari.
3. Menggunakan biakan jaringan ginjal kera, ginjal kelinci dan amnion manusia
dari berbagai cell lines.
Penyuntikan pada hewan percobaan
Cara intracerebral.

 Sediakan stoples dengan alas dari seng dan kayu.

 Simpan kapas yang dibasahi dengan ether di bawah alas.
 Masukkan tikus, bila tikus sudah tertidur angkat keluar.
 Letakkan tikus dengan posisi tidur miring.
 Pegang kepala tikus dekat batang lehernya dengan telunjuk dan
ibu jari yang menahan rahang bawah tikus. Ekor tikus, tubuh dan
kakinya dijepit dengan jari yang lain, hingga tikus tidak dapat
bergerak.
 Suntik tikus di antara mata dan telinga sebanyak 0,03 mL.
Cara penyuntikan intracerebral tikus dewasa
Penyuntikan telur berembrio secara intra allantois
 Sediakan :
 - telur berembrio yang berumur 9-11 hari.
 - bor telur
 - disposible syringe 1 mL.
 - cellotipe
 - gunting steril
 - pipet Pasteur

 Lihat telur dalam ruangan gelap, beri tanda ruang udara dan daerah
tampaknya mata embrio.
 Bor pada tempat 1-2 mm di atas batas ruang udara.
 Suntikan bahan sebanyak 0,1 – 0,2 mL.
 Tutup bekas penyuntikkan dengan cellotipe.

 Eram pada incubator suhu 37oC selama 3x24 jam dengan posisi telur berdiri
Penyuntikan telur berembrio secara intra allantois
Cara pembongkaran telur 

- Buat lubang pada rung udara dengan diameter 1-2 cm.

- Tusukkan pipet pasteur melalui lubang tersebut.
- Isap cairan allantoisnya melalui selaput kulit telur.
- Kumpulkan pada tabung yang steril.
- A B C
Tes Serologi
Tujuan : 1. Melihat kenaikkan titer antibodi
2. Menentukan tipe virus

Pemeriksaan serologi paling banyak digunakan dalam diagnose

penyakit virus karena murah dan mudah dilakukan.
Dalam pemeriksaan serologi ini biasanya diperiksa sepasang serum
dari penderita yaitu serum yang di ambil pada masa sakit dan yang di
ambil pada 2 minggu kemudian yaitu pada masa konvalescens.
Bila titer serum naik sekurang – kurangnya 4 kali maka mungkin sekali
penderita diserang oleh virus sejenis dengan antigen yang digunakan
dalam tes serologi itu.
 Pemeriksaan serologis yang sering digunakan
dalam diagnose penyakit virus adalah :

a) Tes penghambatan hemaglutinasi.

b) Tes Presipitasi.
c) Tes Netralisasi.
d) Tes Fluorescensi Antibodi Test (FAT).
e) Enzym Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA).
Tes Hemaglutinasi (HA)

Tujuan : Menentukan titer antigen = Titer 1 UHA

Prinsip : Antigen + Eritrosit  Hemaglutinasi

Makin tinggi pengenceran virus makin
berkurang kekuatan virus untuk
menyebabkan terjadinya hemaglutinasi
secara total.

Titer 1 UHA : pengenceran antigen tertinggi

yang masih mampu menyebabkan
hemaglutinasi secara total
Tes penghambatan Aglutinasi
Tes ini berguna untuk :
1). Menentukan kenaikan titer serum I (akut) terhadap titer serum II (Konvalescens).

2). Menentukan tipe virus yang menyebabkan sakit.

Prinsip pemeriksaan :

1. Tes hemaglutinasi
Virus (antigen) + eritrosit  terjadi hemaglutinasi. Makin tinggi pengenceran virus, makin berkurang
daya virus untuk menyebabkan terjadinya hemaglutinasi.

2. Tes penghambatan hemaglutinasi

Virus (antigen) + anti serum spesifik + eritrosit akan terjadi penghambatan hemaglutinasi. Makin tinggi
pengenceran serum, makin berkurang daya anti serum untuk menghambat terjadinya hemaglutinasi.
Contoh pemeriksaan :

Menentukan kenaikan titer serum terhadap virus Influenza.

Bahan – bahan :

- NaCl 0,85%

- Eritrosit ayam 0,5%

- Antigen Influenza
- Serum I (akut)
- Serum II (konvalescens)

Alat – alat :

- Tabung serologi

- Rak tabung serologi

- Mat pipet
Cara kerja :

1. Membuat eritrosit ayam 0,5%

2. Menentukan titer antigen
3. Menentukan kenaikan titer serum
Cara membuat eritrosit ayam 0,5%
- Masukkan 2 mL Natrium sitrat3,8% ke dalam spuit.
- Isap darah vena ayam ( di bawah sayap) sampai 10 mL.
- Masukkan dalam tabung cetrifuge.
- Putar 2000 rpm selama 10 menit.
- Buang plasmanya, kemudian endapan eritrositnya dicuci
dengan NaCl 0,85% sebanyak 3 kali.
- Endapan eritrosit dibuat konsetrasi 10%.
- Kemudian buat eritrosit dengan konsetrasi 5%.
Menentukan titer antigen dengan tes hemaglutinasi.
- Buat pengenceran antigen 2 kali lipat dengan NaCl 0,85% (1/2, 1/4,
1/8, 1/6, 1/32..........dst)
- Masukkan masing – masing pengenceran sebanyak 0,2 mL ke
dalam tabung.
- Tambahkan pada tiap tabung 0,4 mL eritrosit ayam 0,5%.
- Kocok, diamkan selama 1 jam pada suhu kamar.
- Lakukan pula kontrol eritrosit sebagai berikut :Pada sebuah tabung
isi dengan 0,4 mL NaCl 0,85% dan 0,4 mL eritrosit ayam 0,5%.
Pengamatan :
Setelah di diamkan selama 1 jam, baca pada pengenceran berapa terjadinya
aglutinasi total.
- Bila terjadi hemaglutinasi (+)  Eritrosit menyebar pada dasar tabung

- Bila terjadi hemaglutinasi (-)  Eritrosit berkumpul di tengah dasar tabung

dan bergerak bila digoyang
Kontrol eritrosit harus negatif (-), berarti tidak terjadi hemaglutinasi sendiri.

Bila eritrosit hasilnya negatif, kemudian baca hasilnya pada deret

pemeriksaan.

Contoh pembacaan :
Pengenceran : 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 CE
+ + + + + - - -

Maka titer antigen (titer 1 U HA) = 1/32

Menentukan kenaikan titer serum dengan tes penghambatan
hemaglutinasi.
 Sebelum melakukan tes penghambatan hemaglutinasi, serum diolah terlebih dahulu untuk
menghilangkan zat non spesifik inhibitor. Adapun pengolahan serum untuk penghambatan
hemaglutinasi terhadap virus influenza adalah sbb :

- Masukkan 0,2 mL serum ke dalam tabung.

- Tambah 0,1 mL tripsin 0,25%
- Simpan pada penangas air 56oC selama 30 menit.
- Tambah 0,3 KIO3 (50 mg KIO3 dalam 20 mL aquadest panas).
- Simpan pada temperatur kamar selama 15 menit.
- Tambah 0,3 mL glyserin NaCl 1%.
- Simpan pada temperatur kamar selama 15 menit.
- Tambah 1,1 mL NaCl 0,85%, sehingga didapat cairan serum dengan konsentrasi 1/10.
Cara kerja tes penghambatan hemaglutinasi
- Buat pengenceran serum masing – masing 2 kali lipat dengan NaCl 0,85%
(1/10, 1/20, 1/40,........dst).
- Tambahkan antigen 4 U HA pada tiap tabung sebanyak 0,2 mL yang dibuat
dari antigen yang kekuatannya 1 U HA.
Contoh pembuatan antigen 4 UHA:
titer antigen 1 U HA = 1/32, jadi titer antigen 4 U HA adalah 1/8.
Pembuatannya : 1 bagian antigen stock + 7 bagian NaCl 0,85%.
- Kocok.
- Diamkan pada suhu kamar selama 1 jam.
- Tambahkan eritrosit ayam sebanyak 0,4 mL pada tiap – tiap tabung.
Lakukan pula untuk kontrol.

Kontrol serum : Pada sebuah tabung isi dengan 0,2 mL serum 1/10 + 0,2
mL NaCl 0,85% + 0,4 mL eritrosit ayam 0,5%.

Kontrol eritrosit : Isi tabung dengan 0,4 mL NaCl 0,85 % dan eritrosit ayam
0,5%.

Kontrol antigen : Buat pengenceran antigen 2 kali lipat dari antigen 4 U HA

dengan NaCl 0,85% (4 U HA, 2 U HA, 1 U HA, 0,5 U HA),

masukkan masing – masing sebanyak 0,2 mL. Tambah 0,2

mL NaCl 0,85% pada tiap tabung, tambah eritrosit ayam

0,5 sebanyak 0,4 mL.

Pengamatan :
1. Setelah didiamkan selama 1 jam, baca pada pengenceran berapa
terjadi penghambatan hemaglutinasi secara total pada serum I dan
serum II.
2. Tentukan kenaikkan titer serum II terhadap serum I.
3. Apabila kenaikan titer serum II terhadap serum I sama atau lebih
besar dari 4 kali, maka serum tersebut mengandung zat anti virus
influenza.
4. Dapat disimpulkan penderita tersebut oleh virus influenza.
Contoh pembacaan :
Kontrol eritrosit : negative (-)
Kontrol serum I, II : negative (-)
Kontrol antigen : negative (-) atau ± pada pengenceran 0,5 UHA
Pembacaan serum I: 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320

- - + + + +

Pembacaan serum II: 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320

- - - - - +

Jadi titer serum I : 1/20

Titer serum II : 1/160

Kenaikan titer serum II terhadap serum I = 8 kali (>4 kali)

Kesimpulan : Serum tersebut mengandung zat anti terhadap virus influenza

Dengan kata lain Influenza positif.

Catatan:

- Titer 1 U HA atau titer antigen adalah pengenceran antigen

tertinggi yang masih mampu menyebabkan hemaglutinasi
secara total.
- Titer 4 U HA antigen adalah pengenceran antigen 4 kali
lebih pekat dari cairan antigen yang menyebabkan
hemaglutinasi secara total.
- Titer serum adalah pengenceran serum tertinggi yang masih
mampu menghambat terjadinya hemaglutinasi secara total.