Le but de la premiere partie de ce travail etait de mieux comprendre la tumorigenese thyroidienne... more Le but de la premiere partie de ce travail etait de mieux comprendre la tumorigenese thyroidienne apartir de modeles murins transgeniques developpant des tumeurs de la thyroide. Nous avons ainsianalyse par microarrays l’expression genique au sein de thyroides de souris Tg-RP3 exprimant lerearrangement RET/PTC3, responsable de cancers papillaires de la thyroide chez l’homme (PTC), etde souris Tg-E7 exprimant l’oncogene E7, responsable de cancers du col de l’uterus chez la femme.Ces deux genes etaient exprimes exclusivement dans la thyroide grâce a un promoteur thyroglobuline.Nous avons compare les profils d’expression entre les differents genotypes (sauvages, Tg-RP3 et Tg-E7) mais egalement entre differents âges (2, 6 et 10 mois). Sur le plan histologique, les souris Tg-E7developpaient d’enormes goitres avec une dysplasie de plus en plus marquee, mais n’ont pas demontrede reelles lesions de carcinomes aux differents âges etudies. Les thyroides de souris Tg-RP3demontraient quand a elle une proliferation cellulaire et une croissance plus moderees, mais desremaniements tissulaires plus importants, presents des 2 mois, avec apparition de lesions de carcinomechez de nombreux animaux essentiellement a 6 et 10 mois. Les resultats de l’analyse de l’expressiongenique par microarrays rejoignaient ces observations histologiques. Dans les thyroides E7, ce sontessentiellement les genes impliques dans le cycle cellulaire qui ont demontre une surexpressionsignificative. Dans les thyroides RP3, les processus cellulaires les mieux representes par les genessurexprimes etaient deja decrits comme des processus ayant un role important dans la tumorigenesethyroidienne humaine : l’inflammation, le remodelage du milieu extracellulaire et l’angiogenese. Deplus, plusieurs genes classiquement surexprimes dans les PTC humains, l’etaient egalement dans lesthyroides RP3. Parmi ceux-ci le recepteur de la vitamine D (VDR) et la 1-alpha-hydroxylase(CYP27B1), responsable de la conversion de la 25-hydroxyvitamine D3 en 1,25-dihydroxyvitamineD3, ont particulierement retenu notre attention etant donne une litterature croissante sur les effets antiproliferatifset immuno-modulateurs de la 1,25-dihydroxyvitamine D3 (calcitriol). Nous avons doncetudie dans la deuxieme partie de notre travail les effets anti-proliferatifs et transcripionnels ducalitriol sur plusieurs modeles thyroidiens in vitro et in vivo. Si nous n’avons pu demontrer d’effetsconcluants sur des lignees de cancers thyroidiens humains, nous avons par contre demontre un effetanti-proliferatif, le plus souvent dose-reponse, du calcitriol sur des cultures primaires de thyroides desouris sauvages, Tg-RP3, Tg-E7 et humaines. Seule la 24-hydroxylase, intervenant dans l’inactivationde la vitamine D, et le recepteur a la TSH ont demontre une surexpression significative en presence decalcitriol par RTQ-PCR. Une etude d’expression genique par microarrays sur des cultures primaires dethyroides RP3 et humaines traitees par ethanol (controle) ou calcitriol a permis de mettre en evidence3 genes significativement regules dans le meme sens, en l’occurrence sous-exprimes, en presence decalcitriol : la nebulette, la thymopoietine et la cycline E2. Le role exact joue par ces trois proteinesdans l’effet anti-proliferatif observe reste a determiner. Les etudes in vivo de carence alimentaire envitamine D de souris Tg-RP3 n’ont pas demontre de differences significatives entre le groupe carenceet non carence que ce soit en termes de croissance glandulaire ou d’expression genique, apres 2 ou 6mois de carence. Seule la 1-alpha-hydroxylase est apparue significativement surexprimee apres 2mois, surexpression disparaissant apres 6 mois. Cette regulation pourrait temoigner d’un mecanismed’adaptation de la thyroide qui tente de contrer la carence en vitamine D circulante en augmentant laconcentration locale de vitamine D active. Ce phenomene disparaissant a 6 mois, il serait interessantde prolonger la carence au-dela de 6 mois pour assurer une reelle carence locale en 1,25-dihydroxyvitamin D3. Nous avons ensuite traite des souris Tg-RP3 puis Tg-E7 par des doses variablesde CD578, un analogue « non calcimimetique » du calcitriol. Il est apparu que la dose ayant un effetsignificatif au niveau transcriptionnel (surexpression de la 24-hydroxylase) etait egalement la dose laplus toxique, entrainant une hypercalcemie parfois letale. Le protocole principal a du etre ecourte enraison d’un exces de mortalite. Le petit nombre d’animaux ayant survecu ne nous a pas permis deconclure a une difference d’expression significative du Ki67 dans les thyroides de souris traitees parCD578 par rapport aux souris controles. De nouvelles experiences devront donc etre realisees auxdoses les moins toxiques, administrees sur une plus longue periode et sur un plus grand nombred’animaux, afin d’augmenter la probabilite d’observer un effet sur la proliferation, voire ladifferenciation tissulaire.
The specificity of binding of [3H]cGMP to purified bovine adrenal cGMP-stimulated phosphodiestera... more The specificity of binding of [3H]cGMP to purified bovine adrenal cGMP-stimulated phosphodiesterase was investigated by adding increasing concentrations of unlabelled analogs of cAMP and cGMP. The data show a perfect correlation between the potencies of stimulation of cAMP phosphodiesterase activity and displacement curves of [3H]cGMP binding. Since the Sp and Rp diastereomers of adenosine 3',5'-monophosphate behaved as a cAMP-dependent protein kinase agonist and antagonist, respectively, the possible biological activity of these compounds and the corresponding cGMP analogs (cGMPS Sp and Rp) on the cGMP-stimulated phosphodiesterase was investigated. The data show no regioselectivity in binding nor on activation of one of the two (Sp) or (Rp) isomers.
The intracellular concentration of cAMP results from the balance between its synthesis by adenyla... more The intracellular concentration of cAMP results from the balance between its synthesis by adenylate cyclase and its catabolism by the system of cyclic nucleotide phosphodiesterases. Positive regulation of the cAMP system by activation of adenylate cyclase has been the focus of most of the research on the regulation of the level of this nucleotide. With regard to negative controls, a direct inhibition of adenylate cyclase by a-adrenergic, cholinergic agonists and several peptides is now well characterized and accounts for multiple negative controls of cAMP generation (Jakobs et al., 1980). It is thus often assumed now that intracellular concentration of cAMP is only controlled at the level of its synthesis. Such a concept is an oversimplification as it neglects the potential of controls at the level of cAMP catabolism. Phosphodiesterases are rather complex enzymes consisting of multiple soluble and particulate forms (reviewed by Beavo et al., 1982). It has been demonstrated that they are distinct non-intercon-
Biochemical and Biophysical Research Communications, Aug 1, 1997
CREM (cAMP Response Element Modulator) transcription factors are involved in the cAMP-dependent t... more CREM (cAMP Response Element Modulator) transcription factors are involved in the cAMP-dependent transcriptional regulation of CRE-containing genes. Multiple CREM transactivators and repressors are generated from a single gene by alternative splicings and use of an alternative intronic promoter. Here we report the cloning and sequencing of the full-length dog CREM cDNA, corresponding to the CREMtau alpha splice variant. Amino acid sequence identity with mouse and human orthologs reached 94.5% and 91.0% respectively. Using the RNAse Protection Assay (RPA) method with three distinct probes, we analyzed the expression of the various CREM transcripts in several dog tissues. We showed that CREM transcription factors have a restricted tissue distribution and that the ratio between activators and repressors varies considerably from one tissue to another. Moreover, we amplified, by RT-PCR, a cDNA that corresponds to two new CREM isoforms and confirmed, by RPA experiments, the presence of these mRNAs in dog thyroid and in other tissues. These transcripts result from splicing of the gamma domain and encode potential CREM transactivators (CREMtau alphagamma and CREMtau2 alphagamma).
Le but de la premiere partie de ce travail etait de mieux comprendre la tumorigenese thyroidienne... more Le but de la premiere partie de ce travail etait de mieux comprendre la tumorigenese thyroidienne apartir de modeles murins transgeniques developpant des tumeurs de la thyroide. Nous avons ainsianalyse par microarrays l’expression genique au sein de thyroides de souris Tg-RP3 exprimant lerearrangement RET/PTC3, responsable de cancers papillaires de la thyroide chez l’homme (PTC), etde souris Tg-E7 exprimant l’oncogene E7, responsable de cancers du col de l’uterus chez la femme.Ces deux genes etaient exprimes exclusivement dans la thyroide grâce a un promoteur thyroglobuline.Nous avons compare les profils d’expression entre les differents genotypes (sauvages, Tg-RP3 et Tg-E7) mais egalement entre differents âges (2, 6 et 10 mois). Sur le plan histologique, les souris Tg-E7developpaient d’enormes goitres avec une dysplasie de plus en plus marquee, mais n’ont pas demontrede reelles lesions de carcinomes aux differents âges etudies. Les thyroides de souris Tg-RP3demontraient quand a elle une proliferation cellulaire et une croissance plus moderees, mais desremaniements tissulaires plus importants, presents des 2 mois, avec apparition de lesions de carcinomechez de nombreux animaux essentiellement a 6 et 10 mois. Les resultats de l’analyse de l’expressiongenique par microarrays rejoignaient ces observations histologiques. Dans les thyroides E7, ce sontessentiellement les genes impliques dans le cycle cellulaire qui ont demontre une surexpressionsignificative. Dans les thyroides RP3, les processus cellulaires les mieux representes par les genessurexprimes etaient deja decrits comme des processus ayant un role important dans la tumorigenesethyroidienne humaine : l’inflammation, le remodelage du milieu extracellulaire et l’angiogenese. Deplus, plusieurs genes classiquement surexprimes dans les PTC humains, l’etaient egalement dans lesthyroides RP3. Parmi ceux-ci le recepteur de la vitamine D (VDR) et la 1-alpha-hydroxylase(CYP27B1), responsable de la conversion de la 25-hydroxyvitamine D3 en 1,25-dihydroxyvitamineD3, ont particulierement retenu notre attention etant donne une litterature croissante sur les effets antiproliferatifset immuno-modulateurs de la 1,25-dihydroxyvitamine D3 (calcitriol). Nous avons doncetudie dans la deuxieme partie de notre travail les effets anti-proliferatifs et transcripionnels ducalitriol sur plusieurs modeles thyroidiens in vitro et in vivo. Si nous n’avons pu demontrer d’effetsconcluants sur des lignees de cancers thyroidiens humains, nous avons par contre demontre un effetanti-proliferatif, le plus souvent dose-reponse, du calcitriol sur des cultures primaires de thyroides desouris sauvages, Tg-RP3, Tg-E7 et humaines. Seule la 24-hydroxylase, intervenant dans l’inactivationde la vitamine D, et le recepteur a la TSH ont demontre une surexpression significative en presence decalcitriol par RTQ-PCR. Une etude d’expression genique par microarrays sur des cultures primaires dethyroides RP3 et humaines traitees par ethanol (controle) ou calcitriol a permis de mettre en evidence3 genes significativement regules dans le meme sens, en l’occurrence sous-exprimes, en presence decalcitriol : la nebulette, la thymopoietine et la cycline E2. Le role exact joue par ces trois proteinesdans l’effet anti-proliferatif observe reste a determiner. Les etudes in vivo de carence alimentaire envitamine D de souris Tg-RP3 n’ont pas demontre de differences significatives entre le groupe carenceet non carence que ce soit en termes de croissance glandulaire ou d’expression genique, apres 2 ou 6mois de carence. Seule la 1-alpha-hydroxylase est apparue significativement surexprimee apres 2mois, surexpression disparaissant apres 6 mois. Cette regulation pourrait temoigner d’un mecanismed’adaptation de la thyroide qui tente de contrer la carence en vitamine D circulante en augmentant laconcentration locale de vitamine D active. Ce phenomene disparaissant a 6 mois, il serait interessantde prolonger la carence au-dela de 6 mois pour assurer une reelle carence locale en 1,25-dihydroxyvitamin D3. Nous avons ensuite traite des souris Tg-RP3 puis Tg-E7 par des doses variablesde CD578, un analogue « non calcimimetique » du calcitriol. Il est apparu que la dose ayant un effetsignificatif au niveau transcriptionnel (surexpression de la 24-hydroxylase) etait egalement la dose laplus toxique, entrainant une hypercalcemie parfois letale. Le protocole principal a du etre ecourte enraison d’un exces de mortalite. Le petit nombre d’animaux ayant survecu ne nous a pas permis deconclure a une difference d’expression significative du Ki67 dans les thyroides de souris traitees parCD578 par rapport aux souris controles. De nouvelles experiences devront donc etre realisees auxdoses les moins toxiques, administrees sur une plus longue periode et sur un plus grand nombred’animaux, afin d’augmenter la probabilite d’observer un effet sur la proliferation, voire ladifferenciation tissulaire.
The specificity of binding of [3H]cGMP to purified bovine adrenal cGMP-stimulated phosphodiestera... more The specificity of binding of [3H]cGMP to purified bovine adrenal cGMP-stimulated phosphodiesterase was investigated by adding increasing concentrations of unlabelled analogs of cAMP and cGMP. The data show a perfect correlation between the potencies of stimulation of cAMP phosphodiesterase activity and displacement curves of [3H]cGMP binding. Since the Sp and Rp diastereomers of adenosine 3',5'-monophosphate behaved as a cAMP-dependent protein kinase agonist and antagonist, respectively, the possible biological activity of these compounds and the corresponding cGMP analogs (cGMPS Sp and Rp) on the cGMP-stimulated phosphodiesterase was investigated. The data show no regioselectivity in binding nor on activation of one of the two (Sp) or (Rp) isomers.
The intracellular concentration of cAMP results from the balance between its synthesis by adenyla... more The intracellular concentration of cAMP results from the balance between its synthesis by adenylate cyclase and its catabolism by the system of cyclic nucleotide phosphodiesterases. Positive regulation of the cAMP system by activation of adenylate cyclase has been the focus of most of the research on the regulation of the level of this nucleotide. With regard to negative controls, a direct inhibition of adenylate cyclase by a-adrenergic, cholinergic agonists and several peptides is now well characterized and accounts for multiple negative controls of cAMP generation (Jakobs et al., 1980). It is thus often assumed now that intracellular concentration of cAMP is only controlled at the level of its synthesis. Such a concept is an oversimplification as it neglects the potential of controls at the level of cAMP catabolism. Phosphodiesterases are rather complex enzymes consisting of multiple soluble and particulate forms (reviewed by Beavo et al., 1982). It has been demonstrated that they are distinct non-intercon-
Biochemical and Biophysical Research Communications, Aug 1, 1997
CREM (cAMP Response Element Modulator) transcription factors are involved in the cAMP-dependent t... more CREM (cAMP Response Element Modulator) transcription factors are involved in the cAMP-dependent transcriptional regulation of CRE-containing genes. Multiple CREM transactivators and repressors are generated from a single gene by alternative splicings and use of an alternative intronic promoter. Here we report the cloning and sequencing of the full-length dog CREM cDNA, corresponding to the CREMtau alpha splice variant. Amino acid sequence identity with mouse and human orthologs reached 94.5% and 91.0% respectively. Using the RNAse Protection Assay (RPA) method with three distinct probes, we analyzed the expression of the various CREM transcripts in several dog tissues. We showed that CREM transcription factors have a restricted tissue distribution and that the ratio between activators and repressors varies considerably from one tissue to another. Moreover, we amplified, by RT-PCR, a cDNA that corresponds to two new CREM isoforms and confirmed, by RPA experiments, the presence of these mRNAs in dog thyroid and in other tissues. These transcripts result from splicing of the gamma domain and encode potential CREM transactivators (CREMtau alphagamma and CREMtau2 alphagamma).
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