Fracionamento celular
O fracionamento celular é uma técnica utilizada para isolar ou purificar componentes celulares enquanto preserva as funções individuais de cada componente.[1] Este é um método que foi originalmente usado para demonstrar a localização celular de vários processos bioquímicos. O fracionamento celular permite aos pesquisadores preparar componentes celulares específicos em volume e identificar suas funções, tarefa bem mais difícil com células intactas.[2]
Homogeneização
editarA primeira etapa para o fracionamento corresponde à lise celular (rompimento da membrana plasmática), para que os componentes celulares sejam liberados.[2] Isto é feito em condições que minimizam os danos às organelas delimitadas por membrana.[3] Os mecanismos de homogeneização podem ser feitos de diversas maneiras, como exposição a sons de alta frequência (sonicação), tratamento com um misturador de alta velocidade, trituração em um homogeneizador mecânico, cavitação de nitrogênio,[3] alterações de pressão, choque osmótico, congelamento e descongelamento, etc. Geralmente, é necessário monitorar o processo via microscopia de contraste de fase, para evitar a ruptura das organelas ou desorganização das estruturas citoplasmáticas.[3]
A solução resultante (homogenato ou extrato) contém as moléculas grandes e pequenas circulantes no citosol, assim como todas as organelas delimitadas por membrana.[2] As amostras são então refrigeradas para evitar que suas enzimas sejam danificadas.
Filtração
editarA filtração não é sempre necessária, a depender da origem das células. Em alguns casos, como em tecidos animais, geralmente é necessário filtrar o homogenato, a fim de separar das organelas fragmentos grandes de célula ou tecido, como tecido conjuntivo.[4][5] Assim, a partir do homogenato bruto, os resíduos celulares e os fragmentos de tecido conjuntivo são removidos por filtração, com o uso de uma gaze ou filtro de sucção.
Purificação
editarUma vez que as células são quebradas, a suspensão pode ser separada em seus componentes principais usando dois métodos diferentes de purificação: a centrifugação diferencial e a centrifugação por gradiente de densidade.
Centrifugação diferencial
editarA centrifugação diferencial consiste em uma série de centrifugações em velocidades crescentes que separam os componentes com base em sua taxa de sedimentação. As partículas mais pesadas e mais densas se depositam no fundo do tubo, formando um pellet (pequenas partículas), a uma taxa em função de seu tamanho e densidade.[6] O sobrenadante é então coletado e submetido a uma centrifugação adicional, dessa vez em velocidade mais alta, e o processo pode ser repetido várias vezes dependendo do tipo de célula e as estruturas a serem isoladas.[3]
Em alguns casos, a centrifugação diferencial não produz material puro, sendo necessário realizar mais um procedimento de isolamento, dessa vez pela centrifugação em gradiente de densidade.[3]
Centrifugação em gradiente de densidade
editarA centrifugação em gradiente de densidade baseia-se na sedimentação dos componentes celulares em um gradiente de densidade,[2] composto de soluções de diferentes densidades (sacarose, ficoll, etc). O tubo é centrifugado por um período prolongado, permitindo que cada estrutura migre para uma posição de equilíbrio, onde a densidade da estrutura seja igual à do líquido circundante. Portanto, neste processo, a separação é baseada na densidade, e não no tamanho e na forma das partículas.[3] Após a centrifugação, as frações podem ser coletadas individualmente para posterior análise e determinação da eficiência da separação.
A centrifugação por gradiente de densidade pode ser subdividida em dois tipos principais, taxa zonal e isopícnica. A principal diferença entre os dois é que, na isopícnica, um gradiente de alta densidade é usado e as células são separadas apenas por diferenças de densidade. Na taxa zonal, um gradiente de densidade inferior é usado e as células são separadas principalmente por diferenças de tamanho.[7]
Ver também
editarReferências
editar- ↑ Alberts, B; Johnson, A. «Fractionation of Cells». Molecular Biology of the Cell. 4th edition.
- ↑ a b c d Alberts, B; et al. (2017). Fundamentos da Biologia Celular. [S.l.]: Artmed Editora. ISBN 978-85-8271-406-5
- ↑ a b c d e f Souza, Wanderley de; Cunha-e-Silva, Narcisa Leal da (março de 2003). «Cell fractionation of parasitic protozoa: a review». Memórias do Instituto Oswaldo Cruz (em inglês) (2): 151–170. ISSN 0074-0276. doi:10.1590/S0074-02762003000200001. Consultado em 14 de outubro de 2020
- ↑ Work, T. S.; Work, E., eds. (1 de janeiro de 1979). «Chapter 2 Methods of cell breakage: assessing their suitability and efficacy». Elsevier (em inglês): 11–44. Consultado em 14 de outubro de 2020
- ↑ Ramakrishnan, S. (outubro de 2004). Textbook of Medical Biochemistry (em inglês). [S.l.]: Orient Blackswan
- ↑ «FRACCIONAMENTO CELULAR». materiais.dbio.uevora.pt. Consultado em 14 de outubro de 2020
- ↑ Burdon, R. H.; Knippenberg, P. H. van; Sharpe, Paul T, eds. (1 de janeiro de 1988). «Chapter 3: Centrifugation». Elsevier. Methods of Cell Separation (em inglês): 18–69. doi:10.1016/s0075-7535(08)70628-4. Consultado em 14 de outubro de 2020
