Relatório de Aula Prática: Extração de DNA.

Ministrio da Educao
Secretaria de Educao Mdia e Tecnolgica

Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia do Amazonas IFAM
Pr-reitoria de Ensino
Licenciatura em Cincias Biolgicas
Jaqueline Sampaio da Silva
Relatrio de aula prtica: Extrao de DNA.
Manaus
2015
Introduo
A extrao do DNA pode ser feita atravs de eletroforese em gel de
poliacrilamida posteriormente corado pela prata, ou em gel de agarose, corado por
brometo de etdio. Em qualquer uma delas, o material amplificado visualizado
como uma banda, a ser analisada de acordo com o seu peso molecular.
A eletroforese consiste na separao de molculas ionizadas, de acordo com
suas cargas eltricas e pesos moleculares em campo eltrico. Molculas orgnicas
como RNA, DNA e protenas so separadas pela migrao destas em um gel
durante a aplicao de um potencial eltrico. Molculas com carga negativa migram
para o plo positivo, a esse processo, chamamos de nodo, enquanto molculas
com carga positiva que migram para plos negativos chamamos de ctodo.
Uma molcula de DNA, quando exposta a um campo eltrico, migra para o
eletrodo na velocidade ou mobilidade eletrofortica, proporcional a fora do campo e
a carga lquida da molcula. A mobilidade eletrofortica tambm inversamente
proporcional ao coeficiente friccional da molcula, que, por sua vez, em funo do
tamanho e forma da molcula, e da viscosidade do meio.
Nessa tcnica utilizada uma cuba com dois compartimentos, eletrodos e
soluo salina para conduo de eletricidade. Entre os compartimentos da cuba
encaixado o gel que deve ficar submerso. Pequenos poos so feitos no gel durante
sua preparao com pentes. As amostras so pipetadas nesses poos. Essas
amostras devem ser previamente misturadas a um corante, chamado gel loading
buffer (GelRed). Esse corante uma soluo composta de azul de bromofenol (e/ou
xileno cianol) e glicerol e utilizado para aumentar a densidade das amostras,
impedindo que elas saiam dos poos, alm de dar a colorao que serve como
indicador do progresso eletrofortico. Para a migrao, aplica-se voltagem e
corrente eltrica ao sistema.
A distncia que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicao,
comparada com a distncia que outros fragmentos de tamanhos conhecidos
percorreram no mesmo gel. Esses fragmentos so os ladders (marcadores de peso
molecular), misturas de segmentos de DNA de tamanhos variveis e eqidistantes
entre si, e que so aplicados em um poo no gel no incio do processo.
A eletroforese pode ser conduzida em soluo com gradiente de densidade
ou em diferentes meios-suportes, tais como papel de filtro, slica gel, membranas de
acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida, entre outros. O suporte
deve ser qumica e fisicamente inerte, de modo a no interferir na mobilidade das
molculas. No caso de eletroforese em gis, como poliacrilamida e agarose, a
migrao das molculas profundamente influenciada pelas malhas porosas. Em
relao a gis de poliacrilamida ou agarose, a porosidade do gel determina o poder
de resoluo das bandas, sendo este geralmente decorrente do grau de
polimerizao entre os monmeros. Gis de poliacrilamida so freqentemente
usados para anlises de alta resoluo (seqenciamento de DNA/RNA) em anlises

proticas e isoenzimticas que requeiram maior definio das bandas. Gis de
agarose tambm so amplamente usados na separao de DNA/RNA,
especialmente para fragmentos maiores.
A eletroforese em gel de agarose o mtodo padro usado para separar,
identificar, analisar, caracterizar e purificar fragmentos de DNA. A tcnica capaz de
separar misturas de fragmentos de DNA que no podem ser separados por outros
meios, tais como centrifugao com densidade de gradiente ou por velocidade de
sedimentao. A localizao do DNA no gel pode ser determinada diretamente.
Os gis de agarose so, geralmente, corados com solues de brometo de
etdio (EtBr), uma substncia intercalante que revela os cidos nuclicos ao emitir
fluorescncia sob luz ultravioleta. Concentraes de at 1ng de DNA podem ser
visualizadas por exame direto do gel na luz ultravioleta.
A segunda aula prtica tem por objetivo separar, identificar, analisar,
caracterizar e purificar fragmentos de DNA, atravs da tcnica conhecida como
eletroforese.
Objetivo geral
Preparar a amostra para que seja possvel realizar anlise de DNA.
Objetivo Especfico
Analisar o DNA, atravs da eletroforese.
Materiais
01 cuba de eletroforese;
01 fonte de fora;
Bandejas de gel, em diferentes tamanhos de plstico transparente UV. As
extremidades so abertas para montar o gel, e depois removidas na
eletroforese;
Pentes para fazer poos onde as amostras sero aplicadas;
Tampo de eletroforese (corrida), Tris-borato-EDTA (TBE);
Tampo de amostra;
Migrao: azul de bromofenol (300bp), e xileno cianol (4000pb);
Brometo de etdeo, corante fluorescente usado para corar cidos nuclicos;
Transluminador (caixa de luz UV), usado para visualizar o DNA corado com
EtBr.
Procedimento
1- Preparo do gel de agarose: 0,5g;
2- Preparo da TEB: 50ml de teb;
3- Colocar no micro-ondas por 01min., homogeneizando a cada 20 segundos,

at ficar translcido;
4- Preparo da cama, coloca-se um pente com 16 dentes antes de solidificar o
gel de agarose, adiciona-se o brometo de etlico (5l), deixar a cama
solidificando.
Obs: enquanto a cama solidifica (passo 04), preparamos as amostras (06): 03
amostras (DNA pinto), 03 amostras de bactria.
Preparo das amostras: foi adicionado 03l de TBE SX a 05l de DNA (amostra da
primeira aula prtica pintinho), ressuspendendo o DNA.
Imagem 01: cama solidificada de gel de agarose, com os 16 furos.
Concluso
A prtica possibilitou a visualizao do DNA, pode-se observar que as molculas
foram separadas quando aplicadas no gel e submetidas eletroforese, a utilizao
de brometo de etdeo facilitou a deteco das bandas de DNA atravs da
fluorescncia.

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usados para anlises de alta resoluo (seqenciamento de DNA/RNA) em anlises

Analisar o DNA, atravs da eletroforese.

3- Colocar no micro-ondas por 01min., homogeneizando a cada 20 segundos,

Imagem 01: cama solidificada de gel de agarose, com os 16 furos.

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