Aula P1: CONSTITUIÇÃO E FUNCIONAMENTO DO MICROSCÓPIO ÓPTICO

COMPOSTO

Objetivos
• Conhecer as partes constituintes de um microscópio óptico composto e as regras básicas de
funcionamento.
• Visualização de células de Tetraselmis chuii.

Introdução
A utilização de lentes é conhecida desde o século XII. A partir desta data as lentes são usadas com várias
aplicações; aparecem as verdadeiras lupas e inicia-se a sua utilização para corrigir problemas de visão.
No século XVI, inicia-se a aplicação das lupas na investigação científica, tendo alguns naturalistas desta
época, construído e aperfeiçoado microscópios simples. No século XVII, a construção e o
aperfeiçoamento do microscópio, particularmente do sistema de lentes, sofreu uma grande expansão. O
holandês A. van Leeuwenhoek constrói o primeiro microscópio óptico simples. A luz refletida pelo objeto
fortemente iluminado atravessava um conjunto de lentes produzindo uma imagem ampliada.
Posteriormente desenvolveram-se os primeiros microscópios compostos associando dois conjuntos de
lentes e com dispositivos que permitiam a observação do objeto por transparência.

Até ao século XIX, os fabricantes não conseguiam obter lentes que não decompusessem a luz (aberração
cromática) o que originava imagens coloridas e imprecisas. Só em 1830 foram construídas as primeiras
lentes acromáticas, que corrigiam esta aberração. O outro defeito comum das lentes, a aberração
esférica, que provocava distorções na forma das imagens, foi corrigido por Abbe e Zeiss em 1886 que
criaram as primeiras lentes capazes de eliminar, simultaneamente, os dois tipos de aberrações.

Com o tempo, os microscópios sofreram inúmeros aperfeiçoamentos e atualmente dispomos de

microscópios muito sofisticados que nos oferecem ampliações consideráveis dos objetos que
pretendemos observar e imagens com um mínimo de deformações e aberrações.

Uma das principais características de um microscópio é o poder de resolução de que dispõe, isto é, a
possibilidade de dois pontos que se encontram muito próximos poderem ser vistos separados ou distintos
um do outro. No caso do olho humano e em condições ótimas de visão à distância de 25 cm, o limite de
resolução é de cerca de 0.1 a 0.3 mm, ou seja 100 a 300 µm. Na prática, se dois pontos estão
distanciados um do outro a menos de 0.1 mm, eles apresentam-se à nossa vista, como constituindo um
único ponto. O microscópio óptico tem, de um modo geral, um limite de resolução da ordem de 0.2 a 0.3
µm, enquanto para um microscópio eletrónico o limite de resolução é de cerca de 2 a 3 Å (0.0002 a
0.0003 µm).

Existem basicamente dois tipos de microscópios, os que utilizam os fotões e são denominados
microscópios fotónicos ou de luz, os que utilizam os eletrões e são designados microscópios eletrónicos.
Os microscópios utilizados nas aulas práticas são microscópios de luz, normalmente denominados
microscópios ópticos compostos.

O microscópio óptico composto é constituído por duas partes: uma parte mecânica e uma parte óptica
(Figura 1).

Aulas práticas de Biologia Celular | 1/10

 I - PARTE MECÂNICA OU SISTEMA MECÂNICO
- Pé (ou base) - suporte do microscópio, assenta sobre a mesa de trabalho permitindo estabilidade a
todas as outras peças. Contém um encaixe para o suporte da lâmina de iluminação.

Figura 1 - Esquema de um microscópio óptico composto.

Aulas práticas de Biologia Celular | 2/10

- Braço ou coluna - peça fixa à base que suporta as restantes partes constitutivas do microscópio.

- Tubo (ou canhão) - peça que serve de suporte ao sistema de ampliação. Contém numa das
extremidades as oculares e na outra, o revólver que suporta as objetivas. É constituída por
duas partes, uma vertical e outra, superior, inclinada.

- Revólver ou porta-objetivas - peça giratória que suporta as objetivas. Ao imprimir-lhe um movimento

circular, coloca-se cada uma das objetivas no prolongamento do tubo.

- Platina - é uma plataforma quadrada ou retangular sobre a qual se coloca a preparação microscópica e
tem ao centro uma abertura circular destinada à passagem dos raios luminosos.
Aposta à platina existe a sobreplatina, onde duas pinças imobilizam a preparação.

- Parafusos de deslocamento da sobreplatina - estes parafusos deslocam horizontalmente a

preparação.

- Parafusos de comando dos movimentos da platina: a platina é deslocável verticalmente por meio
destes parafusos.

Parafuso macrométrico - possibilita movimentos verticais de grande amplitude,
provocando a aproximação ou o afastamento entre a platina e as objetivas.

Parafuso micrométrico - permite movimentos verticais de pequena amplitude.

II - PARTE ÓPTICA OU SISTEMA ÓPTICO

A. Sistema de iluminação

- Fonte luminosa - os microscópios possuem como fonte luminosa uma lâmpada de incandescência de
tungsténio, em geral de 25 W. A intensidade de iluminação pode ser regulada por meio de
uma resistência variável.

- Diafragma de campo ou diafragma íris - localizado imediatamente a seguir à lâmpada de iluminação

limita o campo luminoso.

- Filtro de luz - aumenta a visibilidade ou reduz o contraste conforme a cor do filtro e conforme o objeto.

- Condensador - sistema de 2 ou 3 lentes cuja finalidade é concentrar os raios luminosos emitidos pela
fonte luminosa, fazendo-os incidir na preparação como um cone de luz uniforme.

- Diafragma do condensador - associado ao condensador controla a abertura do cone de luz que atinge
a objetiva eliminando os raios luminosos marginais, proporcionando uma melhor iluminação.
Este diafragma é constituído por um conjunto de palhetas, as quais, através de uma
alavanca ou de um parafuso se aproximam ou afastam do centro, permitindo variar o
diâmetro de abertura do cone de luz (Figura 2).

Aulas práticas de Biologia Celular | 3/10

Figura 2 - Relação entre a ampliação da objetiva, a distância de trabalho e a abertura do diafragma.

B. Sistema de ampliação

O microscópio óptico composto apresenta uma associação de dois sistemas de lentes, constituindo um
sistema óptico centrado (combinação de lentes que têm o mesmo eixo óptico).
Objetivas - associação de lentes colocada na extremidade do tubo mais próxima do objeto e que
fornecem à ocular uma imagem intermediária, real, ampliada e invertida. Cada objetiva é
constituída por várias lentes: lente frontal e as lentes corretoras. A lente frontal é a que fica
mais próxima da platina. O diâmetro da lente frontal é inversamente proporcional ao grau de
ampliação. A capacidade de ampliação de uma objetiva encontra-se assinalado no seu
exterior e é dependente apenas da lente frontal, pois as restantes lentes são apenas de
correção.
As objetivas podem ser secas ou de imersão. As primeiras utilizam o ar como meio entre a
lamela e a lente frontal da objetiva enquanto as segundas utilizam um meio líquido (óleo).

Figura 3 - Perda de luz devida à refração dos raios luminosos e redução da mesma devido à utilização
de óleo de imersão.

Objetivas de imersão - são utilizadas com a lente frontal imersa numa substância (óleo de imersão - óleo
de cedro) cujo índice de refração é idêntico ao do vidroi. Os raios luminosos, concentrados
pelas lentes do condensador, são refratados quando passam de um meio para outro com
diferente densidade. Quando uma objetiva possui uma lente frontal de pequenas dimensões

i
Índice de refracção do ar = 1
Índice de refracção do vidro = 1,52
Índice de refracção do óleo de imersão = 1,51

Aulas práticas de Biologia Celular | 4/10

 e elevado poder de ampliação, a quantidade total de luz que pode atravessá-la é muito
inferior à que atravessaria a lente frontal de uma objetiva de menor poder de ampliação. Por
outro lado, se os raios luminosos são refratados ao passar na camada de ar intermédia entre
a lâmina e a objetiva, há perda de grande quantidade de luz. Desta forma, ocorre uma
redução enorme de luminosidade quando passamos de uma objetiva de 40X para uma
objetiva de 100X. Se intercalarmos uma substância transparente, com um índice de refração
idêntico ao do vidro das lâminas, há uma diminuição da refração dos raios luminosos e
perde-se menos luz (Figura 3).

Objetivas parafocais - quando um microscópio está equipado com este tipo de objetivas, a focagem é
feita com a objetiva de menor ampliação. A mudança de objetiva, por exemplo de 10X para
40X implica apenas um pequeno ajuste no parafuso micrométrico para que a imagem continue
focada.

Objetivas apocromátricas - objetivas capazes de reduzir as aberrações cromáticas e esféricas.

Oculares - associação de lentes, que é colocada na extremidade do tubo mais próxima do olho do
observador e que amplia a imagem intermediária e desta fornece uma imagem virtual,
ampliada e direita.

Alguns conceitos importantes:

Distância frontal - distância entre a lente frontal da objetiva e a superfície do objeto quando o objeto está
focado. A distância entre lente frontal da objetiva e a face superior da lamela é a distância de
trabalho e é ligeiramente mais pequena que a distância frontal.

Poder de ampliação ou ampliação - número de vezes que a imagem aparece maior que o objeto.
Calcula-se multiplicando o aumento fornecido pela objetiva pelo aumento fornecido pela
ocular. No caso de uma objetiva 4X e de uma ocular 10X, 1mm do objeto é observado pelo
olho humano com um tamanho de 40mm.

Poder de resolução - o poder de resolução do microscópio define-se como a capacidade desse

instrumento fornecer imagens separadas de dois pontos situados muito próximo um do outro.
O limite mínimo de distância a que devem estar esses dois pontos para que sejam
observados separadamente designa-se por limite de resolução do microscópio (LR). Assim,
quanto maior for a ampliação utilizada, maior é o poder de resolução e, consequentemente,
menor o limite de resolução. Conclui-se que o poder de resolução e o limite de resolução de
um microscópio variam na razão inversa.
O limite de resolução depende do comprimento de onda da radiação utilizada e da abertura
numérica da objetiva, sendo traduzido pela seguinte expressão:

K×λ
LR = AN

LR = Limite de resolução
K = constante (0,61)
λ = comprimento de onda da radiação utilizada na iluminação do objeto
AN = abertura numérica, calculada pela expressão "n × senα" em que "n" é o índice de refração do meio
entre a preparação e a objetiva e "α" o valor do semiângulo de abertura da objetiva (Figura 4).

Aulas práticas de Biologia Celular | 5/10

Figura 4 - Esquema do cone luminoso que penetra na objetiva, mostrando o semiângulo de abertura (α).

Profundidade de campo - o microscópio só foca um plano de cada vez. O parafuso micrométrico

destina-se a explorar em profundidade o campo do microscópio e só deve ser manipulado
depois de aparecer a imagem. O material biológico, uma célula, por exemplo, por mais fino
que nos pareça, possui pontos em planos diferentes e, por isso, deve ser sempre observada
em planos diferentes.

Diâmetro do campo óptico ou campo visual - A seguir à ampliação da ocular encontra-se um número
que corresponde ao diâmetro em mm do diafragma do campo visual, ao que se chama
índice do campo visual. O diafragma limita a imagem intermédia originada pela objetiva. O
índice do campo visual a dividir pela ampliação da objetiva é igual ao diâmetro do campo
iluminado no qual está a imagem do objeto. Quanto maior é a ampliação da objetiva menor é
o diâmetro do campo do microscópio.

Objetivas Oculares Ampliações Diâmetro do

totais campo
4X 10X/18 40X 18/4 = 4,5 mm
10X 10X/18 100X 18/10 = 1,8 mm
40X 10X/18 400X 18/40 = 0,45 mm
100X 10X/18 1000X 18/100 = 0,18 mm

Aulas práticas de Biologia Celular | 6/10

P1.1. Regras de funcionamento do microscópio

Objetivos
Regras para observação ao microscópio. Modo de focar e utilizar um microscópio

• Posição do microscópio - em frente do observador.

• Posição do observador - sentado de forma a manter uma posição confortável (costas direitas,
não torcido) em frente do microscópio. Com a mão esquerda no parafuso de deslocamento
vertical da platina e tendo a mão direita livre para escrever/desenhar ou para mover os parafusos
de deslocamento da sobreplatina (deslocar a preparação).

Material

• Microscópio
• Lâmina
• Marcador de acetato

Método - Modo de focar o microscópio

1. Ligue o microscópio à corrente elétrica.
2. Ligue a fonte luminosa de forma a iluminar o campo do microscópio.
3. Certifique-se que a objetiva de menor ampliação (4X) está no prolongamento do tubo do
microscópio. Se tal não acontecer, rode o revólver e coloque-a em posição de utilização.
4. Escreva com marcador de acetato as letras H, A e F segundo esta ordem numa lâmina.
5. Coloque a lâmina apoiada sobre a platina do microscópio e imobilizada pela pinça da
sobreplatina. O objeto deve estar aproximadamente no centro da abertura da platina, posição que
se obtém movendo os parafusos de deslocamento da sobreplatina.
6. Aproxime cuidadosamente a platina da objetiva rodando o parafuso de deslocamentos verticais
(cremalheira).
7. Observando através das oculares (ajustar distância interpupilar), afaste lentamente a platina da
objetiva até atingir o ponto de focagem.
8. Logo que obtenha uma imagem suficientemente nítida, retifique a focagem com o parafuso
micrométrico.
9. Alinhe o microscópio:
a) Feche o diafragma da fonte luminosa de modo a observar ao centro do campo um
pequeno círculo de luz.
b) Verifique se essa imagem se encontra no centro do campo.
c) Se tal não acontecer, utilize os dois parafusos laterais do condensador (deslocações
horizontais do condensador) para colocar o feixe de luz no centro do campo.
d) Desloque o condensador na vertical (utilizando o parafuso do condensador) até conseguir
distinguir as palhetas do diafragma.
e) Abra o diafragma da fonte luminosa.
f) O microscópio está alinhado. Não altere a posição do condensador durante a
observação.

Aulas práticas de Biologia Celular | 7/10

 10. Regule a iluminação do objeto, controlando a abertura do diafragma de campo (intensidade de
luz) ou do diafragma do condensador (contraste).
11. Desloque a preparação na platina, para a direita e para a esquerda, para a frente e para trás e
registe os sentidos de descolamento da imagem (Figura 5).
12. Observe e registre as letras ao microscópio.
13. Desça a platina totalmente e retire a preparação.

Figura 5 - Modo de explorar uma preparação.

Tópicos de discussão
A - Compare as posições reais de cada letra com as da respetiva imagem no microscópio. Que conclui
sobre as características da imagem formada pelo microscópio óptico composto?

B - Que conclui quanto ao sentido de deslocação da imagem, relativamente ao sentido de deslocação

do objeto?

C – Realize um esquema do que observou no passo 11. Registe também a ampliação que utilizou.

Aulas práticas de Biologia Celular | 8/10

P1.2. Visualização de células motéis e flageladas por microscopia óptica

Objetivos
Visualização de células de Tetraselmis chuii.

Material
• Microscópio
• Lâmina e lamela
• Pipeta de Pasteur
• Cultura de células

Método
1. Coloque uma gota de cultura de células (Figura 6) sobre uma lâmina.
2. Coloque a lamela de modo a formar um ângulo de 45° com a lâmina e, (com a ajuda de uma
agulha de dissecção) deixe-a cair lentamente de modo a evitar a formação de bolhas de ar.
3. Se necessário, use o procedimento descrito no protocolo anterior (P1.1.) para focar o
microscópio.
4. Coloque a preparação sobre a platina do microscópio e observe-a com a objetiva de menor
ampliação.
5. Observe as células ao microscópio. Faça um esquema do que observou, devidamente legendado
e com indicação da ampliação usada.
6. Aumente a ampliação e repita o passo 5.

Como proceder para terminar a utilização do microscópio

1. Desça a platina totalmente e retire a preparação.
2. Coloque a objetiva de menor ampliação no prolongamento do tubo.
3. Se utilizou a objetiva de imersão, limpe-a cuidadosamente com um papel suave e depois com a
solução que tem na sua bancada para limpeza de material óptico (cuidado com a utilização do xilol
para limpeza das objetivas, pois este produto prejudica o sistema de fixação das lentes nas objetivas!).
4. Proceda de igual modo para limpar a preparação definitiva.
5. Certifique-se de que todo o microscópio fica convenientemente limpo (platina, lentes).
6. Desligue a fonte luminosa.
7. Tape o microscópio com a proteção de plástico e arrume-o (o microscópio é um instrumento
delicado e pesado, por isso desloque-o sempre com uma mão a segurar no braço e outra por
baixo da base).

Atenção!
• Não toque com os dedos nas lentes das objetivas e das oculares
• Não utilize a objetiva de maior ampliação sem usar o óleo de imersão.
• Limpe as lentes com um papel muito macio e em movimentos circulares.
• Não retire as objetivas dos seus encaixes.
• Não force os parafusos de deslocamento.

Aulas práticas de Biologia Celular | 9/10

A B

Figura 6 – Células a observar na aula P1. A. Tetraselmis chuii. B. Organização interna de uma célula de
Tetraselmis: c – cloroplasto, e – estigma (eyespot ou fotorreceptor eventualmente envolvido em fototaxia),
f – flagelo, g – dictiossoma (erradamente designado por complexo de Golgi em alguns livros), m – mitocôndria,
n – núcleo, s – amido.

Tópicos de discussão
A - Desenhe o que observou devidamente legendado e referindo a ampliação.

B – Faça um pequeno resumo do que aprendeu na aula.

C – Proponha 3 questões que poderão ser usadas no exame prático na última semana de aulas.

Aulas práticas de Biologia Celular | 10/10