DESCRIÇÃO

Os conceitos e os protocolos envolvidos no diagnóstico micológico para a detecção e identificação

dos fungos de importância médica.

PROPÓSITO
Apresentar as etapas da rotina laboratorial para o diagnóstico das infecções fúngicas a fim de
compreender o papel do analista na detecção e identificação dos microrganismos causadores das
micoses. Além disso, ser capaz de diferenciar as técnicas laboratoriais da micologia, das demais
áreas da microbiologia.

OBJETIVOS
MÓDULO 1
Definir os conceitos gerais da coleta, transporte e armazenamento das amostras clínicas para o
diagnóstico micológico

MÓDULO 2
Descrever os processamentos e as técnicas da rotina laboratorial na micologia médica

INTRODUÇÃO
As micoses são causadas por fungos filamentosos ou leveduriformes e podem provocar doenças com
manifestações clínicas leves, levando a incômodos estéticos ou ainda a situações mais graves que
levam o paciente ao óbito. Nas últimas décadas, as doenças causadas pelos fungos passaram a
desempenhar um papel importante na saúde pública, principalmente, por causa dos tratamentos
com antibacterianos de forma indiscriminada e o uso de imunossupressores. Por isso, indivíduos
com a microbiota alterada ou com o sistema imunológico comprometido são mais predispostos a
desenvolverem infecções fúngicas oportunistas.

A correta detecção e identificação do real agente etiológico é fundamental para traçar o curso do
tratamento e delimitar as abordagens a serem aplicadas para o paciente. Nesse aspecto, o
profissional da saúde qualificado fará toda diferença no sucesso diagnóstico realizado em um
laboratório clínico. Por isso, neste tema, aprenderemos sobre o diagnóstico micológico e as
principais etapas envolvidas para se conseguir uma correta identificação do agente etiológico das
micoses.

Foto: Shutterstock.com.

Foto: Shutterstock.com.
Foto: Shutterstock.com.

MÓDULO 1
Definir os conceitos gerais da coleta, transporte e armazenamento das amostras clínicas para o
diagnóstico micológico

INTRODUÇÃO AO DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO

Na micologia, busca-se utilizar metodologias específicas, sensíveis, simples, rápidas e econômicas,
que sejam capazes de cumprir com os objetivos que são o isolamento e a identificação do agente
etiológico. Como em qualquer rotina laboratorial, o diagnóstico micológico passa por três etapas
distintas, desde a coleta até a liberação do laudo, que compreendem as fases: pré-analítica,
analítica e pós-analítica.

FASE PRÉ-ANALÍTICA

A fase pré-analítica é o primeiro contato do paciente com o laboratório. Nessa fase, serão avaliadas
a requisição médica e a suspeita clínica, para então decidir a melhor forma de realizar a coleta, o
armazenamento e o transporte do espécime clínico. Na rotina da micologia clínica, essa etapa é
fundamental para o sucesso do diagnóstico e da identificação do real agente causador da micose,
pois será o norte do analista.

Foto: Shutterstock.com.Fase pré-analítica.

Foto: Shutterstock.com.A localização da lesão deverá ser confirmada de acordo com a requisição
médica.

O tipo de coleta realizada vai depender, principalmente, da localização das lesões, da manifestação
clínica e da hipótese diagnóstica. Para a execução adequada dessa fase, é necessário verificação da
suspeita clínica que consta na solicitação do exame, orientação do paciente, coleta precisa do
espécime clínico, identificação das amostras, armazenamento e transporte apropriados até o setor
onde os espécimes clínicos serão processados.

FASE ANALÍTICA

Após todo o procedimento pré-analítico, a amostra clínica chegará ao laboratório para então iniciar
a fase analítica. Nessa etapa, o espécime clínico será processado e analisado para a determinação do
agente causador da micose investigada. As técnicas empregadas dependerão da suspeita clínica e
das solicitações realizadas no requerimento médico. O diagnóstico micológico é, classicamente,
realizado pelo exame direto com observação do espécime clínico em microscópio óptico e a cultura
micológica, que é o padrão-ouro, pois isola o fungo no laboratório. Em alguns casos, é necessária a
execução de testes auxiliares, como investigações bioquímicas ou moleculares, que ajudarão na
identificação do microrganismo.

Foto: Shutterstock.com.Processamento da amostra de acordo com a suspeita clínica.

FASE PÓS-ANALÍTICA

A fase pós-analítica é a última fase do diagnóstico laboratorial. Todos os resultados obtidos nos
diferentes testes precisam ser analisados de forma criteriosa e estar de acordo entre si. Além disso,
é muito importante lembrar-se da suspeita clínica colocada no requerimento do exame que lhe dará
um norte do que pesquisar e se o laudo emitido responde à hipótese diagnóstica. Após a conclusão
por parte do analista, esse resultado pode ser liberado e o médico com posse dessas informações
decidirá qual a melhor conduta para o tratamento daquele paciente.
Foto: Shutterstock.com.Fase pós-analítica.

A coleta, o armazenamento e o processamento das amostras de maneira inadequada podem levar

ao diagnóstico incorreto com consequente atraso ou tratamento errado, que, em alguns casos,
podem ser fatais, além dos prejuízos econômicos associados.

RECOMENDAÇÕES GERAIS DA COLETA DE ESPÉCIMES CLÍNICOS

O espécime clínico que será coletado dependerá da suspeita clínica e de qual é o tipo da suposta
micose. Veja a seguir:

Foto: Shutterstock.com.

Para as micoses superficiais e cutâneas, recomenda-se a coleta das escamas de pele, unha, pelos
parasitados e, em caso de lesões, a coleta das bordas externas.

Foto: Shutterstock.com.
Para as micoses subcutâneas, a amostra coletada pode ser biopsia, secreção e o pus.

Foto: Shutterstock.com.

Para as micoses sistêmicas e oportunistas, podem ser coletados o escarro, a urina, as fezes, o liquor,
o sangue e até mesmo a biopsia, dependendo da manifestação clínica e localização das lesões.

Os procedimentos que envolvem a coleta da amostra influenciam diretamente na qualidade desse

material e, por consequência, o resultado que será obtido. Por isso, fatores como experiência
profissional, comunicação entre o corpo médico e o laboratório, cuidado com os procedimentos e
materiais utilizados na coleta, correta identificação das amostras são imprescindíveis para o sucesso
do diagnóstico micológico.

Para garantir a qualidade, algumas recomendações são sugeridas, como as da lista abaixo:

Preparação, esterilização ou desinfecção prévia do material a ser utilizado na coleta,

conforme os protocolos de cada teste.
A identificação das amostras deve conter o nome do paciente, tipo e data da amostra
coletada, registro hospitalar ou ambulatorial, além de outras informações que auxiliam a
equipe do laboratório no direcionamento dos exames.
A coleta deve ser realizada após a antissepsia do local, e o espécime clínico deve ser
acondicionado em um recipiente vedado e estéril, de acordo com o agente a ser
pesquisado, também é recomendado realizar em duplicata ou triplicata, dependendo de
quanto material for possível coletar.
Sempre que for possível, coletar as amostras clínicas antes de iniciar o tratamento,
principalmente para as lesões de pele, pelos e unhas. Caso o paciente já tenha iniciado o
tratamento tópico, é importante orientá-lo para que seja suspenso de 4 a 5 dias antes da
coleta.
A amostra clínica deve ser acompanhada da requisição médica do exame, sempre que for
possível com a hipótese diagnóstica. Essas informações auxiliarão o analista na escolha
dos métodos a serem empregados, quais colorações e meios de cultura utilizar para o
isolamento do real agente causador da micose.
Em alguns casos específicos de pacientes com algum imunocomprometimento, é
importante e necessário coleta consecutiva em 2 ou 3 dias para a interpretação correta
dos achados laboratoriais. Já que para esses pacientes fungos que são considerados
saprófitas, contaminantes ambientais ou que são constituintes da microbiota normal do
paciente podem se comportar como patógenos, causando as micoses oportunistas.
Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal
PROCEDIMENTOS DA COLETA DAS AMOSTRAS CLÍNICAS
Para a realização da coleta dos espécimes clínicos, a primeira medida a ser tomada é a leitura da
requisição do exame. Nesse documento, é preciso constar a suspeita clínica, qual material deve ser
coletado e a localização da lesão. Por exemplo, se a suspeita clínica for onicomicose, na requisição
do exame, é preciso constar em qual dedo da mão ou dedo do pé está a lesão.

Foto: Shutterstock.com.

Os dedos das mãos também são conhecidos como quirodáctilos e são contados a partir do polegar
(1º quirodáctilo) até o dedo mínimo (5º quirodáctilo).

Foto: Shutterstock.com.

Os dedos dos pés também são conhecidos como pododáctilos e são contados a partir do polegar (1º
pododáctilo) até o dedo mínimo (5º pododáctilo).

Alguns espécimes clínicos só poderão ser coletados pela equipe médica em ambiente hospitalar,
como é o caso do liquor, medula óssea, aspirado traqueal e secreção obtida por broncoscopia ou
aspirado gástrico.
Foto: Shutterstock.com.Coleta de liquor.

Foto: Shutterstock.com.A coleta da biopsia realizada no ambulatório, depende do lugar da lesão.

Ou ainda em ambiente ambulatorial, como é o caso de alguns tipos de biopsia. De modo geral,
nesses casos, a responsabilidade do laboratório será de transportar a amostra até o setor técnico,
que realizará o processamento e as análises necessárias para o diagnóstico.

Para evitar contaminações das amostras por bactérias ou outros fungos, recomenda-se que a coleta
seja realizada sob condições de assepsia. Isso porque a maioria das manifestações clínicas causadas
pelos fungos ocorre em sítios anatômicos altamente contaminados com a microbiota normal do
indivíduo ou até com fungos que estão dispersos no ambiente onde será realizada a coleta, como é o
caso de materiais cutâneos.

Abaixo conheça os procedimentos de coletas:

COLETA DO ESCARRO

Para a coleta de escarro, recomenda-se que seja realizado um gargarejo com água limpa ou fervida,
para posterior recolhimento da primeira expectoração da manhã, preferencialmente. O frasco
precisa ser estéril e de boca larga, e não deve conter saliva.
Foto: Shutterstock.com.

COLETA DE SANGUE PARA A HEMOCULTURA

Com a finalidade de se realizar uma coleta de sangue venoso para exames hematológicos ou
bioquímicos, há o protocolo de antissepsia. Porém, quando essa coleta for para a realização de
hemocultura, esse protocolo precisa ser ainda mais rigorosamente aplicado, de modo que evite
contaminações cruzadas. Após a antissepsia no local da punção, deve-se realizar a coleta de cerca de
5-6 mL do sangue, que será imediatamente transferido para o frasco, contendo meio de cultura
apropriado para hemocultura, seja líquido ou bifásico (líquido sobre sólido). Esse protocolo tem
como objetivo evitar a coagulação que diminui a sensibilidade do teste.

Foto: Shutterstock.com.
Foto: Shutterstock.com.

Além disso, uma pequena alíquota, a última gota, deve ser utilizada para a elaboração de um
esfregaço sanguíneo que será enviado ao laboratório juntamente com o frasco da hemocultura.

COLETA DE URINA

A coleta da urina é crítica, pois a região perineal é extremamente contaminada, dificultando o

diagnóstico do real agente causador da micose. Para isso, o recomendado é que a coleta seja feita
por cistoscopia ou sondagem. Entretanto, por serem procedimentos realizados em ambiente
hospitalar, nem sempre será de fácil acesso ao paciente. Desse modo, quando não for possível
realizar essas técnicas mais complexas, é necessário que haja limpeza prévia na região perineal com
água e sabão e que o paciente despreze o primeiro jato da manhã e, em seguida, colete de 3 a 5 mL
em um frasco estéril. Para o diagnóstico micológico, as coletas de urina de 24 horas não têm valor
diagnóstico.

Foto: Shutterstock.com.

CISTOSCOPIA
A cistoscopia, ou uretrocistoscopia, é um exame de imagem que é feito principalmente para
identificar qualquer alteração no sistema urinário, principalmente na bexiga, e pode ser utilizado
para a coleta de amostras.
COLETA DAS FEZES

As fezes podem ser coletadas após a lavagem com água e sabão da região anal. Pequenas porções
de fezes devem ser transferidas para um frasco estéril com tampa, ou então a coleta poderá ser feita
por um swab anal.

Foto: Shutterstock.com.

SWAB
Trata-se de um cotonete estéril que serve para coleta de exames microbiológicos com a finalidade
de estudos clínicos ou pesquisa.

COLETA DE SECREÇÃO DO CONDUTO AUDITIVO EXTERNO

O material do conduto auditivo pode ser coletado por curetagem da lesão ou com o auxílio de um
swab estéril.

Foto: Shutterstock.com.

COLETA DE AMOSTRAS DA MUCOSA ORAL E OROFARÍNGEA

Essa coleta deverá ser realizada com o auxílio de swab estéril diretamente da lesão presente na
mucosa jugal, região tonsilar ou papilas linguais.
Foto: Shutterstock.com.

PROCEDIMENTO PARA A COLETA DE SECREÇÃO VAGINAL

A secreção vaginal também será coletada com o auxílio do espéculo e do swab estéril diretamente
do fundo do saco vaginal ou do material da lesão.

Foto: Shutterstock.com.

COLETA DE PUS E MATERIAL DE ABSCESSO

O ideal para a coleta desse material é que seja realizada ainda nos abscessos fechados por aspiração
com o auxílio de seringa e agulha estéreis. Caso a lesão já esteja aberta, deve-se limpar com gaze e
salina estéreis para remover a crosta e o exsudato superficial, que é excessivamente contaminado
com bactérias. Somente após essa limpeza que a coleta com o swab deve ser realizada.

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PROCEDIMENTOS DE TRANSPORTE E ARMAZENAMENTO
Tão importante quanto a coleta em si, o transporte e o armazenamento do espécime clínico são
etapas críticas que definirão o sucesso ou o fracasso do diagnóstico micológico. Por isso, seguir
corretamente as orientações para cada tipo de material é fundamental para garantir a integridade
da amostra durante todo o tempo no transporte até o setor técnico, bem como seu armazenamento
até o processamento laboratorial.

A rapidez no envio das amostras clínicas tem por objetivo garantir a sobrevivência e o isolamento
dos fungos ou leveduras, já que é necessário que esses microrganismos estejam viáveis para crescer
no laboratório.

Veremos a seguir as orientações para alguns tipos de espécimes clínicos haja vista a melhor forma
de preservar os possíveis fungos presentes.

AMOSTRAS COLETADAS COM SWAB

Os materiais clínicos coletados com o swab devem ser processados imediatamente. Caso isso não
seja possível pela distância do local de coleta e o setor técnico do laboratório, é necessário que esse
swab seja alocado em tubos com solução salina estéril e fechamento hermético, de modo que
impeça vazamentos e evite a dessecação da amostra. Esse swab em tubo com salina deve ser
conservado a 4°C por, no máximo, 8 a 10 horas, pois tempos superiores podem comprometer a
integridade da amostra.

Foto: Shutterstock.com.

MATERIAIS DITOS CONTAMINADOS

Espécimes clínicos provenientes de sítios sabidamente contaminados ou de difícil descontaminação

(exemplos: urina, fezes, escarro, secreções de orofaringe, pus e secreção de feridas) devem ser
transportados com as precauções necessárias para a manutenção da proporção da microbiota
original. Por essa natureza contaminada, é importante que essas amostras permaneçam em frascos
estéreis, vedados e sejam imediatamente transportadas e processadas. Caso esse tempo seja
superior a 30 minutos, é necessário manter sob refrigeração (2°C a 8°C), inclusive, durante o
transporte em caixas térmicas. Essa amostra deverá ser enviada para o laboratório até 18 horas após
a coleta, desde que mantida sob refrigeração.
Foto: Shutterstock.com.

MATERIAIS DE SÍTIOS ESTÉREIS

O liquor e os líquidos cavitários são exemplos de amostras clínicas de sítios estéreis e devem ser
mantidos em tubo estéril hermeticamente fechado e transportado imediatamente para o
laboratório em temperatura ambiente.

Foto: Shutterstock.com.
Foto: Shutterstock.com.

O sangue e a amostra de punção de medula, que são coletados e acondicionados diretamente no

frasco com meio de cultura, serão enviados em temperatura ambiente e o processamento deve
ocorrer no máximo em 9 horas após a coleta.

AMOSTRAS DE LESÃO DE PELE, PELOS E UNHAS

O material clínico seco proveniente de raspado de pele, pelos ou unhas pode ser acondicionado
entre lâminas de vidro vedadas com fita adesiva ou parafilme, ou placas de Petri, e permanecem em
temperatura ambiente por até sete dias. No entanto, recomenda-se que seja enviado e processado
o mais breve possível.

As biopsias devem ser acondicionadas em frascos estéreis contendo solução salina estéril protegidas
da luz. Se o tempo entre coleta e processamento for inferior a 2 horas, esse material pode ficar em
temperatura ambiente; caso o tempo seja superior, é recomendado manter sob refrigeração (2°C a
8°C).

Foto: Shutterstock.com.

No vídeo a seguir, veja a especialista explicando o procedimento de coleta de espécimes clínicos

para o diagnóstico micológico.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. O DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO, ASSIM COMO QUALQUER OUTRO DIAGNÓSTICO
LABORATORIAL, PODE SER DIVIDIDO EM TRÊS ETAPAS. A COLETA DO ESPÉCIME CLÍNICO
COMPREENDE QUAL FASE DO DIAGNÓSTICO?
Analítica

Pré-analítica

Processamento

Pós-analítica

Inicial

2. A COLETA DO ESPÉCIME CLÍNICO DEVE SER CRITERIOSA, POIS O SUCESSO DO DIAGNÓSTICO

MICOLÓGICO TAMBÉM DEPENDE DISSO. PARA QUE A COLETA SEJA FEITA CORRETAMENTE, QUAL
É O PRIMEIRO CRITÉRIO QUE DEVE SER OBSERVADO?
Identificação do frasco de transporte

Aspecto da lesão e a localização

Separação do material para a coleta

Leitura da requisição do exame

Antissepsia do local da lesão

GABARITO

1. O diagnóstico micológico, assim como qualquer outro diagnóstico laboratorial, pode ser
dividido em três etapas. A coleta do espécime clínico compreende qual fase do diagnóstico?

A alternativa "B " está correta.

A coleta do espécime clínico pertence à fase pré-analítica, pois é a primeira fase antes do
processamento da amostra e desempenha papel importante no sucesso do diagnóstico.

2. A coleta do espécime clínico deve ser criteriosa, pois o sucesso do diagnóstico micológico
também depende disso. Para que a coleta seja feita corretamente, qual é o primeiro critério que
deve ser observado?

A alternativa "D " está correta.

A leitura da requisição do exame é importante, pois é onde haverá as informações que direcionarão
o tipo de coleta, material e a forma de ser transportada.

MÓDULO 2

Descrever os processamentos e as técnicas da rotina laboratorial na micologia médica

INTRODUÇÃO ÀS ROTINAS NO LABORATÓRIO DE MICOLOGIA

Após todos os processamentos pré-analíticos vistos anteriormente, chegamos à fase analítica do
diagnóstico micológico. Essa etapa corresponde à execução propriamente dita das técnicas
laboratoriais, com o objetivo de evidenciar as estruturas fúngicas ou o isolamento do agente
infeccioso. Essa busca pela definição do diagnóstico pode ocorrer pela pesquisa direta de estruturas
fúngicas nas amostras clínicas, pela semeadura desse material com posterior crescimento do fungo
no laboratório, ou então pelas investigações indiretas que procuram por antígenos ou anticorpos
circulantes, os quais sugerem a presença do fungo ou levedura no organismo do paciente.

RECEBIMENTO E TRIAGEM DAS AMOSTRAS

Antes de processar os espécimes clínicos, o setor técnico necessita realizar uma verificação criteriosa
acerca das amostras estarem ou não adequadas, como, por exemplo, em relação ao seu volume, à
presença de vazamentos ou contaminações, se estavam sob refrigeração, entre outros aspectos,
para então dar prosseguimento à análise laboratorial.

Foto: Shutterstock.com.Recebimento da amostra clínica.

Para garantir o sucesso do diagnóstico e uma correlação clínico laboratorial melhor, alguns critérios
são utilizados para a rejeição das amostras clínicas recebidas pelo laboratório. Veremos a seguir 2
tipos de problemas:

AMOSTRAS CLÍNICAS

AMOSTRAS INADEQUADAS
PROBLEMAS COM A IDENTIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS CLÍNICAS
Discrepância entre o pedido médico e a identificação da amostra.
Falta de identificação, como nome do paciente, data, hora e local da coleta.
Falta de informações, como tipo ou origem da amostra, teste a ser realizado.

Foto: Shutterstock.com.

PROBLEMAS COM AMOSTRAS INADEQUADAS

Material com sinais de vazamento e contaminação.
Amostras com horário de coleta superior ao armazenamento recomendado.
Falta de refrigeração em amostras que deveriam ser refrigeradas.
Frascos não estéreis.
Biopsias ou outros materiais clínicos enviados em solução de fixação (formalina).
Swab seco.
Um único swab coletado para requisições que solicitam mais de um tipo de teste.

Foto: Shutterstock.com.

Caso ocorra algum desses problemas ou outros que inviabilizem o processamento laboratorial da
amostra clínica, é imprescindível que o setor responsável pela coleta e o médico solicitante sejam
comunicados. Em algumas situações, como as descritas acima, será necessário realizar nova coleta;
por isso, é extremamente importante que todo o processo pré-analítico seja realizado com a máxima
cautela para que esses problemas sejam a exceção e não a regra.

DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO CLÁSSICO

Classicamente, o diagnóstico micológico é realizado pela verificação do fungo ou levedura no
espécime clínico, seja por técnicas de microscopia chamadas de exame direto seja pelos cultivos em
meio de cultura. Por muitos anos, essas técnicas foram as únicas utilizadas para auxiliar no
diagnóstico das micoses, entretanto, com o avanço tecnológico, outros testes também puderam ser
realizados para complementar as informações obtidas, como a pesquisa de anticorpos e antígenos,
ou a investigação molecular.

Para realizar a análise micológica, alguns espécimes clínicos precisam ser previamente preparados
com a finalidade de aumentar a sensibilidade das técnicas, abaixo veremos as diferentes
preparações e suas especificidades.

PREPARAÇÃO DAS ESCAMAS DE UNHA E PELE, PELOS E CABELOS

Esses materiais clínicos secos devem ser separados em porções para que sejam realizados o exame
direto e a cultura micológica.

Foto: Shutterstock.com
Foto: Shutterstock.com

PREPARAÇÃO DE SECREÇÕES, LIQUOR E FLUÍDOS CORPORAIS(LÍQUIDO ASCÉTICO, PERICÁRDICO,

SINOVIAL, ENTRE OUTROS.)
Esses líquidos deverão ser centrifugados por 10 minutos a 1500-2000 rpm. As amostras coletadas
com auxílio de swab devem transferidas para solução salina por agitação no líquido, de modo que o
material se desprenda e permaneça com posterior centrifugação da solução salina. O material
adequado para realização, tanto do exame direto quanto da cultura, é o sedimento que ficará no
fundo do tubo após a centrifugação.

PREPARAÇÃO DA URINA
A recomendação é que se utilize a alça calibrada para semear uma alíquota por esgotamento no
meio de cultura em placa de Petri, para o teste quantitativo pela verificação das unidades
formadoras de colônias (UFC). Uma outra alíquota deverá ser centrifugada (10 minutos a 1500-2000
rpm) e o sedimento será utilizado para a verificação microscópica e para a avaliação qualitativa,
sendo semeado em tubo com meio de cultura específico.
Foto: Shutterstock.com

Foto: Shutterstock.com
PREPARAÇÃO DO ESCARRO
Essa amostra pode ser digerida com a enzima N-acetil-L-cisteína, com a finalidade de fluidificar e
facilitar a manipulação do escarro e a obtenção do sedimento após a centrifugação. Deve-se utilizar
as porções purulentas da amostra, as porções liquefeitas não são apropriadas para o isolamento do
fungo. Também é possível realizar a fluidificação com hidróxido de potássio (KOH 20%), porém essa
alíquota somente será viável para o exame direto, já que essa solução destrói as estruturas fúngicas
em algumas horas, inviabilizando o isolamento do fungo a partir da cultura.

PREPARO DE BIOPSIAS DE TECIDO

As biopsias precisam ser fragmentadas por maceração com pistilo em almofariz (ambos estéreis), ou
então com o auxílio de um bisturi estéril e placa de Petri também estéril. Esse procedimento tem por
objetivo aumentar a sensibilidade do teste, pois aumenta a superfície de contato do tecido, o que
expõe o microrganismo e favorece o contato com o meio de cultura, permitindo, assim, seu
isolamento e posterior identificação.

Foto: Shutterstock.com

EXAME MICOLÓGICO DIRETO

O exame micológico direto é amplamente utilizado para auxiliar no diagnóstico das micoses por ser
um teste rápido, de baixo custo, eficaz, reprodutível, sensível e, em algumas situações, por permitir
evidenciar e até identificar o agente etiológico. Entretanto, a sensibilidade e a especificidade dessa
metodologia dependerão, principalmente, do tipo da micose e da experiência do analista. Por essas
limitações, um exame micológico negativo não anula a possibilidade de haver infecção fúngica.

Outro ponto crítico está relacionado à quantidade da amostra enviada para o laboratório. Alguns
espécimes clínicos são de difícil coleta ou então não apresentam uma quantidade de amostra
suficiente para o diagnóstico. Assim, quando a amostra é insuficiente para a realização do exame
direto e da cultura micológica, a cultura, na maioria dos casos, tem prioridade, por ser mais
específica e sensível quando comparada ao exame direto.
Para a realização do exame direto com a observação em microscópio, várias técnicas e colorações
podem ser empregadas, dependendo da suspeita clínica e do tipo de amostra, como veremos a
seguir:

EXAME MICROSCÓPICO DIRETO COM HIDRÓXIDO DE POTÁSSIO (KOH 20-40%)

Esta técnica pode ser utilizada para exames de pele, unha, pelos, biopsias de tecido, secreções
espessas e outros materiais densos. Após colocar uma gota do KOH 20-40% (aquoso) em uma lâmina
de vidro, deve-se transferir uma alíquota da amostra que será examinada.

Foto: Shutterstock.com.

Foto: Shutterstock.com.

Em seguida, deve-se cobrir a preparação com uma lamínula de vidro e aguardar cerca de 20 minutos
para que ocorra a clarificação da amostra. Essa clarificação consiste na digestão do tecido do
hospedeiro a fim de facilitar a visualização, já que a célula fúngica permanece íntegra. Depois da
amostra clarificada, examinar em microscópio óptico comum, primeiro, com a objetiva de 10x para
localizar a amostra mais facilmente, seguida da objetiva de 40x onde será possível visualizar as
estruturas fúngicas presentes.
EXAME DIRETO COM TINTA NANQUIM (TINTA DA CHINA)

Essa preparação é utilizada para verificar a presença da levedura do gênero Cryptococcus no

espécime clínico, pois ela possui uma cápsula polissacarídica que facilita sua identificação. A tinta
nanquim é a base de água e tem cor preta, então, em contato com a levedura, sua cápsula faz um
halo ao redor da célula, que é facilmente visualizado pelo contraste do corante com o
microrganismo. Para a preparação da lâmina, deve-se colocar uma gota do sedimento da amostra
após centrifugação e uma gota da tinta nanquim, depois, cobrir com lamínula e observar no
microscópio óptico, primeiro, com a objetiva de 10x e, depois, com a de 40x.

Um erro comum nessa técnica é confundir linfócitos com as leveduras. Para que isso não ocorra, é
importante verificar a refringência da parede celular, as inclusões no citoplasma e os brotamentos
das leveduras.

Foto: Shutterstock.com.

COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM

Ao contrário das bactérias que podem ser classificadas como Gram-positivas e Gram-negativas,
todos os fungos são Gram-positivos (coloram-se de roxo). Portanto, essa coloração não é utilizada
para diferenciar os fungos, mas permite distinguir as estruturas fúngicas de artefatos presentes nas
fezes, urina e secreções. Para a coloração de Gram, a amostra é espalhada homogeneamente com
movimentos circulares em uma lâmina de vidro e, depois, fixada com calor e seguido do protocolo
da coloração de Gram.
Foto: Shutterstock.com.

COLORAÇÃO PANÓTICA, LEISHMAN, GIEMSA OU WRIGHT

As colorações (Giemsa e panótico, por exemplo) podem ser utilizadas nas investigações em vários
espécimes clínicos, como sangue, medula óssea, secreção cutânea e aspirados. Para essas
colorações, a amostra precisa ser preparada como para o Gram e, depois, fixada com metanol e
coradas, seguindo o método escolhido.

Foto: Shutterstock.com.

EXAME HISTOPATOLÓGICO

Amostras de tecidos coletadas por biopsias podem ser coradas pelos métodos específicos e
habituais do exame histopatológico, porém a confirmação do agente etiológico somente será
possível após o isolamento e a identificação do microrganismo. Geralmente, essas técnicas são mais
utilizadas para as micoses subcutâneas, sistêmicas e oportunistas, pois evidenciam a invasão
tecidual. Apesar de serem técnicas rápidas e relativamente baratas, podem resultar em diagnósticos
presuntivos, uma vez que evidenciam as características morfológicas e as propriedades tintoriais.

A Hematoxilina-eosina (HE), utilizada rotineiramente nos laboratórios de patologia, não é indicada

para detectar estruturas fúngicas, pois muitos desses microrganismos não coram ou coram
fracamente, exceto para os fungos demáceos, que mantêm sua coloração escura facilitando a
visualização. No caso das micoses, essa coloração pode auxiliar na visualização da resposta tecidual.

Foto: VHAOKLSAWHR/ Wikimedia commons/ licença (CC BY-SA 4.0).Coloração de Hematoxilina-

eosina mostrando Aspergillus niger com conídios de pigmentação marrom (centro) e cristais de
oxalato de cálcio (parte superior esquerda).
Foto: Shutterstock.com.Histoplasma capsulatum aparecem como esférulas marrom-escura dentro
do citoplasma dos macrófagos. Coloração Grocott-Gomori.

Ao contrário da HE, as colorações como Gomori (impregnação pela prata), Gridley e PAS (ácido
periódico de Schiff) são mais indicadas para a detecção e a análise da morfologia tecidual e presença
de elementos fúngicos. Dentre essas, a mais indicada é a Gomori, porque permite um bom contraste
entre as estruturas fúngicas e as células do tecido do hospedeiro. Nessa coloração pela impregnação
da prata, as células fúngicas, independentemente da viabilidade, serão coradas em marrom-escuro,
e o resto poderá ser corado com o contracorante (corante de fundo) verde ou amarelo brilhante que
conferirá ao tecido uma coloração azulada.

Na coloração PAS, os fungos pigmentam-se de vermelho, facilitando a identificação. Outras técnicas,

como mucicarmim de Mayer e azul de alcian, podem ser utilizadas para suspeita de criptococose, já
que a cápsula dessa levedura será corada de vermelho ou azul.

Foto: Shutterstock.com.Na coloração PAS, os fungos pigmentam-se de vermelho.

CULTURA MICOLÓGICA
O cultivo do espécime clínico para o isolamento e a identificação do agente etiológico da micose é,
na maioria dos casos, a única forma de definir o diagnóstico. Essa técnica é considerada o padrão-
ouro para o diagnóstico das micoses, o que significa que essa metodologia é o melhor exame
disponível para determinar qual agente fúngico está causando a doença. Apesar de ser considerada
o padrão-ouro, ainda existem algumas limitações, como o crescimento lento que, para alguns
fungos, pode passar de quatro semanas, a contaminação por outros microrganismos e a
dependência de um analista experiente para a identificação dos fungos isolados.

Foto: Shutterstock.com.Tubos com meio de cultura.

A escolha do meio de cultura a ser utilizado depende do tipo de amostra e o suposto agente
etiológico, baseado na suspeita clínica. Outro parâmetro que auxilia na escolha do meio de cultura é
baseado na observação do exame microscópico direto da amostra. De modo geral, recomenda-se
sempre dois tubos contendo meio de cultura para a semeadura, que devem ser incubados em
temperatura ambiente (25 °C a 35 °C), independentemente do tipo da amostra.

Se a suspeita clínica estiver relacionada a fungos dimórficos, sugere-se que um dos tubos seja
incubado a 35°C. Ao contrário do que é visto na bacteriologia, onde existem vários meios de culturas
indicados para inúmeros tipos de bactérias, na micologia, não existem tantos meios seletivos que
auxiliem no isolamento apenas de um agente fúngico. Por isso, essa área da microbiologia depende
tanto da experiência do analista.

Para o isolamento dos fungos, independentemente do tipo de amostra clínica, devem ser utilizados
meios de cultura não seletivos, que permitirão o crescimento, tanto dos fungos patogênicos quanto
dos contaminantes de crescimento rápido (menor que sete dias). Apesar de os fungos
contaminantes serem encontrados facilmente nos ambientes, em alguns pacientes susceptíveis, eles
assumem o papel de agente etiológico das micoses oportunistas.

O meio de cultura mais utilizado na micologia é o ágar Sabouraud dextrose, que tem baixo custo. A
maioria dos fungos cresce nele, pois possui pH ácido (5,8) e elevado teor de glicose, tornando-o mais
seletivo para esses microrganismos. No entanto, esse meio não impede totalmente o crescimento
de bactérias.

ATIVIDADE DE REFLEXÃO
VOCÊ IMAGINA O QUE PODEMOS FAZER OU ADICIONAR AO MEIO DE CULTURA PARA DIMINUIR O
CRESCIMENTO BACTERIANO E, ASSIM, DIMINUIR A INTERFERÊNCIA CAUSADA PELAS BACTÉRIAS?
RESPOSTA

Em alguns casos, são acrescidos antibióticos. O cloranfenicol é o antibiótico mais usado pelo seu
amplo espectro de ação e por sua característica de suportar a esterilização por calor úmido da
autoclave. Além das bactérias, em alguns casos, também é necessário impedir o crescimento de
fungos contaminantes, por essa razão, adiciona-se cicloheximida (actidione).

O ágar Sabouraud acrescido de antibióticos é indicado para o cultivo de espécimes clínicos de lesões
suspeitas de dermatofitose. Todavia, a cicloheximida pode inibir o crescimento de fungos
oportunistas como o gênero Aspergillus, leveduras de Histoplasma capsulatum, além das leveduras
patogênicas dos gêneros Cryptococcus e Candida. Por isso, a correlação com a suspeita clínica deve
nortear a escolha do meio utilizado.

Existem ainda meios de cultura que auxiliam indicando a presença de determinados gêneros ou
alguns grupos fúngicos, porém esses meios são a exceção na micologia. Um exemplo é a detecção de
leveduras do gênero Cryptoccocus por meios de cultura, contendo compostos fenólicos, como o ágar
semente de Niger, onde a cultura dessa levedura crescerá com coloração marrom.

Foto: Djspring / Wikimedia commons/ licença (CC BY-SA 3.0).A levedura do gênero Cryptococcus.
Foto: Shutterstock.com.A partir do metabolismo dos dermatófitos, o meio de cultura mudará de
coloração.

Outro caso em que se pode usar esse tipo de meio é para os dermatófitos (Dermatophyte Test
Medium), que mudarão de coloração em virtude do metabolismo desses fungos.

Já para as leveduras do gênero Candida, existe um ágar que funciona por meio de reação enzimática
e colorimétrica (ChromoAgar, Cândida médium, Biggy Ágar entre outras marcas comerciais), que,
dependendo da espécie que crescer, a colônia apresentará uma coloração diferente.

Foto: Shutterstock.com.As espécies de Candida mudam de cor no meio cromogênico.

EXEMPLO
C. albicans crescerá de verde-claro a médio, C. krusei cor-de-rosa com bordas esbranquiçadas, C.
tropicalis colorirá de azul-esverdeado a azul-metalizado. Apesar desses meios estarem disponíveis,
eles são mais caros do que o ágar Sabouraud e são mais utilizados para o isolamento primário das
leveduras, principalmente a partir de espécimes clínicos muito contaminados, como urina, fezes e
secreção vaginal. Por auxiliar e ser apenas presuntivo, a identificação do fungo será realizada
somente por meio da análise fisiológica e morfológica.

O isolamento primário é o primeiro crescimento a partir da amostra clínica que, geralmente, é feito
em um meio nutritivo e, muitas vezes, pode não apresentar somente um microrganismo. Por isso, é
necessário um novo isolamento com repique na colônia suspeita para um novo meio de cultura.

Nesse subcultivo, será utilizado o meio de cultura mais adequado para o fungo que cresceu no
isolamento primário; para os dermatófitos, recomenda-se o uso de ágar batata, pois é um meio de
cultura mais pobre que irá estimular a produção dos conídios, que são importantes aliados na
identificação dos fungos filamentosos.
Foto: Shutterstock.com.O isolamento primário apresenta inúmeros microrganismos que se
multiplicam.

Já para os fungos dimórficos que têm um crescimento mais lento (maior que 15 dias), é aconselhado
um meio mais nutritivo, como o ágar infusão de cérebro e coração bovinos (BHI – Brain Heart
Infusion) para estimular o crescimento in vitro.

Foto: Shutterstock.com.Processamento micológico realizado com o auxílio do bico de Bunsen.

Os meios de cultura podem ser acondicionados em tubos, com uma taxa de desidratação mais lenta
e menor chance de contaminação ambiental durante a incubação, ou em placas de Petri. A
semeadura deverá ser realizada sempre em condições assépticas dentro de uma cabine de
segurança biológica classe II ou então ao redor da área de segurança do bico de Bunsen. A incubação
dos meios semeados, geralmente, é realizada em temperatura ambiente (aproximadamente 25°C a
30°C), porém alguns fungos podem se multiplicar mais lentamente nessa temperatura.
Agora que já conhecemos os meios de cultura, vamos entender como devemos realizar a cultura
micológica.

PROCEDIMENTOS PARA A CULTURA MICOLÓGICA

Foto: Shutterstock.com.

Após a preparação dos espécimes clínicos e a escolha adequada do meio de cultura a ser utilizado,
as amostras deverão ser semeadas na superfície do meio de cultura com o auxílio de uma pipeta
Pasteur, alça de níquel-cromo ou descartável.

A metodologia de semeadura por esgotamento é a mais indicada, pois proporciona um melhor

espalhamento da amostra e, consequentemente, a separação das colônias, facilitando a distinção
dos fungos contaminantes dos patogênicos.

Foto: Shutterstock.com.
Imagem: Pamella Sales.

Essa técnica por esgotamento consiste em fazer movimentos em zigue-zague em toda a superfície
do meio, como ilustra a imagem.

No momento da semeadura, deve-se ter cuidado, pois o material não pode ser colocado em
profundidade no meio sólido, sendo apenas depositado na superfície do ágar.

A temperatura de incubação do isolamento primário é recomendada que seja em temperatura

ambiente (25°C a 30°C), pois esta permite o crescimento inclusive de microrganismos oportunistas e
é fácil de ser conseguida em muitas regiões do Brasil, sem a necessidade de utilizar estufas do tipo
BOD (Biochemical Oxygen Demand) para controlá-la. Se amostras ditas contaminadas, como urina,
secreções respiratórias ou vaginais e fezes, forem incubadas a 37°C, poderão diminuir
consideravelmente a sensibilidade da cultura, pois essa temperatura estimula a proliferação
bacteriana que interferirá diretamente no sucesso do isolamento.

O tempo de crescimento das colônias dependerá da espécie fúngica, do tipo e da qualidade do meio
de cultivo, do processamento prévio da amostra clínica, da temperatura de incubação e da presença
de contaminantes ou inibidores no material. O isolamento primário de leveduras pode apresentar
crescimento rápido em torno de 24 horas, por outro lado, fungos dimórficos podem demorar até 4
semanas para começarem um crescimento visível no ágar. Por isso, para minimizar o risco da
liberação de falsos-negativos, é necessário esperar até 30 dias, dependendo da suspeita clínica, para
liberar o resultado definitivo das culturas.

Como já vimos em todo o processo do diagnóstico micológico, o êxito do isolamento primário

também depende de inúmeros fatores. A qualidade do espécime clínico é influenciada diretamente
pela coleta adequada, de acordo com a suspeita clínica.

EXEMPLO
A coleta equivocada de líquido de vesículas em caso de suspeita de dermatofitose ou crostas em
lesões suspeitas de esporotricose diminui muito a chance de isolamento do agente etiológico.
Outro fator a ser considerado é a quantidade de material coletado, pois, em algumas micoses, a
carga fúngica na lesão é muito pequena, o que dificulta ainda mais o isolamento do fungo,
aumentando os riscos dos falsos-negativos.

IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS

Após o processamento da amostra, os tubos ou placas onde foram semeados deverão ficar em
incubação com verificação periódica, sendo realizada no mínimo três vezes por semana ou
diariamente, o que é mais recomendado. Essa verificação periódica é extremamente importante,
pois, assim que for observado o crescimento de uma colônia com características sugestivas da
suspeita clínica, ela poderá ser transferida para um cultivo secundário, evitando que contaminantes
impeçam a viabilidade desse fungo e sua correta identificação.

Foto: Shutterstock.com.Durante a incubação, deve-se realizar a verificação periódica dos cultivos.

Em alguns cultivos, pode ser difícil identificar e decidir qual será o possível fungo patogênico, já que,
em espécimes clínicos contaminados, é comum o crescimento de muitos tipos diferentes de
microrganismos. Por isso, nesses casos em que não se sabe exatamente qual colônia poderá ser
descartada e qual seguirá sendo analisada, recomenda-se que todas as colônias suspeitas sejam
isoladas e identificadas até a definição do provável agente etiológico baseado na suspeita clínica.
Foto: Shutterstock.com.Verificação de uma colônia ao microscópio com uso do corante na lâmina.

Tão pronto quando observado o crescimento sugestivo do agente etiológico, pode-se realizar uma
verificação prévia em microscópio óptico. Uma porção da colônia suspeita deve ser removida em
ambiente estéril, com o auxílio de uma alça de níquel-cromo em “L”, e colocada em uma lâmina de
vidro com lactofenol azul de algodão, para fungos hialinos e, ou somente, lactofenol, para fungos
demáceos. O ácido lático dessa solução preserva as estruturas do fungo, enquanto o fenol inviabiliza
os microrganismos vivos e o azul de algodão cora a quitina, abundante na parede celular fúngica.

FUNGOS HIALINOS
São aqueles que não são pigmentados, apresentando suas hifas transparentes ou com colorações
que não apresentam contraste ao serem observadas em microscópio óptico. É necessária a
utilização de um corante que contrastará, facilitando a sua observação.

FUNGOS DEMÁCEOS
São fungos pigmentados com muita melanina em suas estruturas e apresentam colocação que varia
do marrom ao negro. Não é necessário corantes para sua observação em microscópio.

Esta verificação auxilia na escolha dos posteriores métodos de identificação que serão empregados.
Após essa verificação prévia, a colônia pode ser transferida com o auxílio de uma alça para um novo
meio de cultura visando a um crescimento puro. Essa nova semeadura será o cultivo secundário.

Foto: Shutterstock.com.Transferência de colônia suspeita para um novo ágar.

Nesse cultivo secundário, além de se obter um único tipo de fungo, também é possível uma melhor
observação macroscópica, pois o fungo tem uma maior superfície para o crescimento não
competindo com os possíveis contaminantes presentes no cultivo primários.

Você imagina como é feita a identificação dos fungos? Será que é da mesma forma que a
identificação das bactérias, utilizando provas bioquímicas?

A identificação da maior parte dos fungos filamentosos ocorre pela observação da morfologia de
suas estruturas de reprodução, por isso é importante ter uma cultura secundária pura para que não
ocorra confusão nesse momento da verificação das estruturas de reprodução. Além disso, a escolha
correta do meio de cultura também terá influência direta na produção dos esporos, pois muitos
fungos quando crescem em meios ricos deixam de criar estruturas de reprodução. Logo, nesses
casos, é importante ofertar um meio mais pobre, como o ágar batata dextrose, que favorecerá a
formação dos esporos.

Alguns analistas mais experientes conseguem identificar o gênero de alguns fungos já no isolamento
primário, principalmente se for um fungo filamentoso e apresentar as estruturas de reprodução
nesse primeiro cultivo. Por isso, a observação macro e microscópica é tão relevante. Entretanto, a
identificação da maioria dos fungos necessita de uma avaliação mais completa da macro e
micromorfologia a partir dos cultivos secundários puros e, no caso das leveduras, há a necessidade
de testes fisiológicos, já que, muitas vezes, sua morfologia não difere de uma espécie para outra.

IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS FILAMENTOSOS

A maioria dos fungos filamentosos são identificados com base em suas características macro e
micromorfológicas. Para tanto, é necessário observar algumas estruturas que podem definir os
gêneros, ou até mesmos as espécies, em alguns casos. Muitas vezes, as colônias não apresentam
características morfológicas de uma determinada espécie ou gênero, porém essa observação
acrescenta informações importantes quando associadas a outros aspectos para completar a
identificação.

Vamos saber mais sobre essas características abaixo:

TEXTURA

Foto: Shutterstock.com.

Algodonosa ou cotonosa: o micélio aéreo é proeminente e volumoso. As colônias algodonosas

lembram pelos e tufos.
Foto: Shutterstock.com.

Velutínea ou aveludada: o micélio aéreo está bem aderido à superfície do ágar com aspecto
aveludado.

Foto: Shutterstock.com.

Pulverulenta ou granular: a superfície da colônia é plana, friável com aspecto de poeira e se

fragmenta facilmente por causa da alta produção de conídios. Os fungos com aparência pulverulenta
lembram uma poeira em sua superfície.

Foto: Shutterstock.com.

Cérea ou glabrosa: micélio aéreo escasso e com superfície lisa.

TOPOGRAFIA
Foto: Shutterstock.com.

A topografia da colônia dos fungos filamentosos na maioria das vezes está encoberta pelo micélio
aéreo, então, para observá-la, é indicado o reverso da colônia.

O reverso da colônia pode ser plano sem rugosidades ou sulcos, ou então apresentar uma das
características abaixo:

Rugosa: apresentando sulcos profundos, ranhuras ou estrias que são distribuídas

irregularmente a partir do centro da colônia.
Umbilicada: elevação central que pode conter estrias.
Verrucosa: apresenta superfície ondulada com dobras.

REVERSO DA COLÔNIA
O reverso da colônia é a parte de trás, seja embaixo da placa de Petri seja atrás do tubo.

COR

Foto: Shutterstock.com.

Os aspectos referentes à coloração devem ser observados no verso (frente da colônia) e no anverso
(atrás da colônia), além da presença de padrões como anéis concêntricos. Importante salientar que a
coloração da cultura pode variar de acordo com a idade da colônia. Alguns fungos apresentam
colônias jovens com coloração clara que tendem a escurecer com o amadurecimento do cultivo, por
isso deve-se atentar à idade do cultivo quando fizer esse tipo de observação.

TERMOCONVERSÃO

O dimorfismo térmico é a capacidade de um fungo assumir, tanto a forma filamentosa quanto a de

levedura. Essa mudança ocorre por múltiplos fatores e o principal deles é a temperatura, por isso é
possível estimular essa mudança em laboratório. Caso a hipótese clínica seja de uma micose causada
por fungo dimórfico, as colônias suspeitas em sua fase filamentosa devem ser semeadas em meios
ricos como BHI e incubadas a 37°C, com a finalidade de verificar se começarão a crescer como
leveduras.

MICROMORFOLOGIA

A identificação dos fungos filamentosos é baseada, majoritariamente, pela observação de tamanho,

formato, disposição e coloração dos conídios ou esporos. Caso esses sejam ausentes, é necessário o
uso de técnicas mais complexas baseadas no estudo do DNA ou exoantígenos do fungo, já que a
mera observação das hifas vegetativas não agrega muita informação ou distinção entre os gêneros
fúngicos.

Inúmeros fatores podem causar a ausência de esporulação, como fungos provenientes de pacientes
que estavam sobre tratamento prévio com antifúngico ou subcultivos frequentes. Em alguns casos
que o isolamento primário não apresente esporulação, é preciso mudar o meio no cultivo
secundário para um meio mais pobre, como o ágar batata ou ágar fubá.

Foto: Shutterstock.com.

Algumas vezes, uma alíquota diretamente do cultivo primário ou secundário é suficiente para
observar em microscópio as estruturas de reprodução dos fungos filamentosos. No entanto, a
maioria perderá seu arranjo original, que dificultará sua identificação, por isso a técnica de
microcultivo é indicada. Essa técnica consiste em semear porção de uma colônia pura para que ela
cresça sem interferência no seu arranjo facilitando a identificação. A fim de conhecer melhor a
técnica do microcultivo, não deixe de visitar o Explore +, lá você conhecerá com mais detalhes como
executá-la.

Foto: Shutterstock.com.
Com a lâmina pronta após o processamento do microcultivo, alguns aspectos precisam ser
observados em microscópio óptico, primeiramente, com a objetiva de 10x e, depois, com a de 40x,
como:

Coloração das hifas, se são hialinas ou demáceas.

Estrutura das hifas, se são septadas ou sem septos aparentes (asseptadas ou cenocíticas).
Arranjo e forma dos conídios no conidióforo.
Presença ou ausência de macro- ou microconídios.
Outras estruturas ou projeções típicas, como rizoides (Rhizopus sp.), células podais
(Aspergillus spp.) ou hifas em forma de gavinha (Trichophyton mentagrophytes).
Forma e inserção dos conidióforos nas hifas vegetativas.

De posse dessas informações, mais as características macroscópicas e a suspeita clínica, o analista

consegue, na maioria das vezes, sugerir o gênero e, em alguns casos, a espécie do agente etiológico
da micose.

IDENTIFICAÇÃO MORFOLÓGICA E BIOQUÍMICA DE LEVEDURAS

As leveduras fazem parte da microbiota normal da pele, mucosa vaginal, oral e trato intestinal, por
isso o isolamento desses microrganismos deve ser criterioso, já que podem não ter qualquer
significado clínico. Entretanto, em pacientes com fatores predisponentes ou debilitados, as
leveduras podem assumir o papel de patógenos oportunistas. Quando as leveduras são isoladas de
determinadas amostras clínicas, tal como liquor, biopsias, hemoculturas, líquidos biológicos,
normalmente, estéreis ou de isolamentos consecutivos de pacientes imunocomprometidos, são
significantes e devem ser adequadamente identificadas.

Ao contrário do observado para os fungos filamentosos, as leveduras não apresentam características

morfológicas marcantes de modo que os gêneros sejam facilmente diferenciados. Logo, a simples
observação macro e microscópica pode não trazer tanta informação diagnóstica.

Nos casos suspeitos de doenças causadas por leveduras, assim como para os fungos filamentosos, a
identificação deve ser realizada a partir de uma cultura pura isenta de bactérias, ou outros fungos
contaminantes, de forma que não haja interferência e dúvidas na determinação do agente
etiológico. A escolha do teste que será realizado para a identificação da levedura depende da
suspeita clínica, dos resultados obtidos nos exames direto e de algumas características
macromorfológicas que podem dar algum indício do agente etiológico.
Foto: Shutterstock.com.As espécies de leveduras apresentam características macro e microscópica
muito parecidas.

Como já aprendemos, para as colônias suspeitas de leveduras do gênero Cryptococcus, a pesquisa da

cápsula com tinta nanquim evidencia o halo formado por essa estrutura juntamente com os
brotamentos.

Foto: Shutterstock.com.Formação de um tubo germinativo a partir da célula leveduriforme.

A prova morfofisiológica mais comum para o gênero Candida é a produção de tubo germinativo que
é característico da espécie C. albicans e que as outras espécies de Candida (C. não-albicans) não
produzem.

Outro teste que pode ser realizado para diferenciar as leveduras é o cultivo em lâmina, que
evidenciará a produção de hifas verdadeiras ou pseudohifas.
Foto: Jojoe Wang / Shutterstock.com.O cultivo em lâmina.

Foto: Shutterstock.com.Hifas fragmentadas formando artroconídios.

Caso esse teste apresente hifas hialinas, sem fragmentação e ramificadas, sugere o gênero Candida;
porém, se apresentar clamidoconídios, é indicativo da espécie Candida albicans. Se as hifas
ramificadas verificadas no cultivo em lâmina se fragmentarem em artroconídios, sugerem os gêneros
Trichosporon e Geotrichum.

A maioria da identificação a nível de espécie ocorre por meio de provas bioquímicas, que são
necessárias para identificar espécies intrinsicamente resistentes a algum antifúngico. Por exemplo, a
levedura Candida krusei é resistente ao fluconazol, antifúngico normalmente prescrito para
candidíase.

A prova da urease, comumente empregada na rotina da bacteriologia, também pode ser utilizada
para auxiliar na identificação das leveduras. Leveduras do gênero Cryptococcus, Trichosporon,
Rhodotorula e algumas espécies de Candida são urease positivas, mas, quando associadas a outras
informações morfológicas, é possível diferenciar as duas, já que a colônia da Rhodotorula tem
coloração laranja ou avermelhada.
Foto: Shutterstock.com.Prova da urease.

As provas de assimilação de fontes de nitrogênio e carbono (auxanograma) e de fermentação de

carboidratos (zimograma) devem ser aplicadas para auxiliar na identificação das leveduras, caso
técnicas mais simples, como a verificação morfológica, não conduzam a um diagnóstico presuntivo.
Nesses testes, as leveduras são semeadas em meios contendo apenas um tipo de fonte de carbono
ou nitrogênio, e será verificada a capacidade dessa levedura de crescer ou produzir gás a partir da
fermentação realizada na ausência de oxigênio. Já existem kits comerciais e alguns automatizados
que auxiliam na identificação das leveduras, fornecendo um diagnóstico prático e rápido para uma
liberação mais ágil do laudo, que orientará o tipo de tratamento que o paciente receberá.

METODOLOGIAS AUXILIARES
Para a maioria das micoses, os métodos convencionais de diagnóstico baseados no exame direto e
na cultura micológica apresentam boa sensibilidade e vantagens econômicas. No entanto, existem
alguns casos que essas técnicas clássicas demoram muito para liberar o resultado, não conseguem a
definição do diagnóstico ou identificação do patógeno sozinhas. Isso acontece principalmente em
microrganismos emergentes ou oportunistas. Por esse motivo, algumas doenças fúngicas necessitam
de testes que realizam a observação indireta da presença do fungo utilizando métodos imunológicos
ou moleculares.

TESTES IMUNOLÓGICOS
A pesquisa de antígenos e anticorpos no soro dos pacientes tem servido de grande auxílio para o
diagnóstico, prognóstico e para o monitoramento do tratamento. Os testes que buscam determinar
a titulação de anticorpos presentes seja no soro seja no liquor são úteis, principalmente, nas micoses
sistêmicas, mas não são tão eficazes para outras infecções fúngicas. Por isso, a pesquisa de
anticorpos no soro, no liquor e na urina é importante para o diagnóstico de micoses como
coccidioidomicose, paracoccidioidomicose, criptococose e histoplasmose.

Várias técnicas podem ser empregadas para a pesquisa dos anticorpos séricos, as mais comuns são
as técnicas de imunodifusão e de fixação do complemento. Mesmo que o valor diagnóstico baseado
nessas técnicas seja limitado, são indicadas, principalmente, quando não é possível evidenciar o
fungo no exame direto ou cultura micológica. A imunodifusão em gel de ágar é sensível, prática e
específica no diagnóstico das micoses sistêmicas, bem como no acompanhamento da evolução e
conduta terapêutica. Além da imunodifusão, também é possível utilizar testes ELISA e Western-blot
devido à sua sensibilidade.
Foto: Darreenvt / Wikimedia commons/licença (CC BY-SA 4.0)Imunodifusão.

Foto: Shutterstock.com.Testes intradérmicos.

É possível realizar também testes intradérmicos (o famoso PPD) com a injeção de antígeno na face
anterior do antebraço com a finalidade de pesquisar o grau de sensibilidade do paciente aos
antígenos do fungo. Esse exame é, geralmente, aplicado no diagnóstico de manifestações alérgicas,
por exemplo, nos casos de broncopneumonia por Aspergillus sp. Além disso, pode ser empregado
para investigações epidemiológicas para delimitação de áreas endêmicas de determinado fungo,
porém sem grande valor diagnóstico, uma vez que não é possível diferenciar infecções presentes e
passadas.

A investigação de antígenos fúngicos circulantes é uma metodologia estudada mais recentemente e

tem se mostrado satisfatória no diagnóstico de meningites causadas por Cryptococcus neoformans e
algumas infecções por Candida albicans. A detecção no soro ou liquor do antígeno polissacarídico do
C. neoformans é um método rápido para o diagnóstico baseado na aglutinação de partículas de
látex. Atualmente, diversos kits comerciais estão disponíveis, porém, ocasionalmente, alguns
resultados falso-negativos ou falso-positivos podem ocorrer.
Foto: Neha Shrestha, Mahesh Adhikari, Vivek Pant, Suman Baral, Anjan Shrestha, Buddha Basnyat,
Sangita Sharma e Jeevan Bahadur Sherchand / Wikimedia commons/ licença (CC BY 4.0).A
aglutinação em látex.

MÉTODOS MOLECULARES
As técnicas moleculares que são empregadas em muitas outras áreas também podem ser utilizadas
na micologia. Embora sejam técnicas caras, necessitem de pessoal especializado e, muitas vezes,
sejam restritas aos laboratórios de pesquisa, apresentam alta sensibilidade e especificidade.

Foto: Shutterstock.com.Técnicas moleculares, apesar de sensíveis e específicas, ainda possuem alto

custo.

O sequenciamento do DNA baseado a partir da Reação em Cadeia de Polimerase (PCR - Polymerase

Chain Reaction) é ferramenta útil na identificação depois do isolamento e crescimento em cultivo.

Atualmente, existem vários protocolos para a preparação da amostra, mas ainda não existe um
método universal ideal para a extração, purificação e concentração do DNA do fungo a partir dos
espécimes clínicos. As limitações relacionadas à análise realizada diretamente das amostras clínicas
ocorrem, pois, muitas vezes, o número de células fúngicas na lesão é limitado ou possui populações
mistas. Além disso, podem conter RNases ou DNases que degradam o material genético fúngico, ou
outros inibidores que podem interferir nos passos da amplificação.
A utilização a partir do espécime clínico ainda é muito limitada, sendo necessário o cultivo e
isolamento do agente etiológico. Outra dificuldade na pesquisa molecular de fungos é a extração do
DNA, que necessita de protocolos complexos e que utilizam reagentes tóxicos e nocivos.

Um dos marcadores moleculares usados é o sequenciamento da região ITS (Internal Transcribed

Spacer), que pode ser amplificado utilizando primers específicos. Essa região é amplamente
estudada por ser uma região muito conservada entre os gêneros fúngicos, mas são variáveis nas
espécies, proporcionando a distinção intraespecífica. Para aumentar a confiabilidade, outras regiões
também podem ser analisadas com o sequenciamento dos genes da β-tubulina, calmodulina e fator
de elongação.

TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIFÚNGICOS (ANTIFUNGIGRAMA)

Para o tratamento das doenças fúngicas, existem alguns fármacos com atividade antifúngica,
diferentes espectros de ação e alvos terapêuticos. Dentre eles, podemos citar algumas classes como
os azólicos (itraconazol, cetoconazol, voriconazol, entre outros), as equinocandinas (micafungina,
caspofungina e anidulafungina), as alilaminas (terbinafina) e os polienos (anfotericina B e nistatina).

Os testes de sensibilidade aos antifúngicos podem ser realizados por discodifusão ou por
microdiluição em caldo, dependendo do protocolo a ser seguido ou do microrganismo estudado. No
teste de discodifusão, pode-se utilizar placas de Petri com o ágar Muller-Hinton (suplementado com
2% de dextrose e 0,5 µg/mL de azul de metileno). Para tanto, uma determinada concentração do
fungo é semeada em toda superfície desse meio de forma homogênea. Imediatamente após, é
acrescido um disco de papel filtro contendo o antifúngico a ser pesquisado. Depois da incubação, é
verificado o halo de inibição ao redor do disco que indicará a ação do antifúngico.

Foto: Shutterstock.com.Discodifusão.
Foto: Shutterstock.com.Microdiluição em caldo

Já na microdiluição em caldo, o antifúngico é acrescido do meio RPMI (Roswell Park Memorial

Institute) e, em placa de 96 poços, é realizada a diluição seriada. Posterior à diluição do antifúngico,
o fungo é adicionado a todos os poços. A leitura feita após o período de incubação marcará o CIM
(Concentração Mínima Inibitória, ou em inglês MIC), que será a primeira concentração capaz de
inibir o crescimento do microrganismo.

Ao longo dos anos, após complexas análises, os testes de sensibilidade aos antifúngicos foram
padronizados e atualmente dois institutos elaboraram protocolos aceitos internacionalmente, são
eles o CLSI (Clinical Laboratory Standard Institute – Estados Unidos) e o EUCAST (European
Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing – Europeu). Mais recentemente, criou-se o
BrCAST, que é o comitê brasileiro que organiza todas as informações sobre os testes de sensibilidade
dos microrganismos. Para conhecer mais sobre o BrCAST e os protocolos que estão disponíveis
gratuitamente, não deixe de visitar o Explore +.

Além da padronização das técnicas para os diferentes agentes fúngicos, essas entidades também
delimitam o breakpoint, que é o ponto de corte para a interpretação do resultado se o fungo será
resistente ou sensível ao antifúngico. A determinação do breakpoint é extremamente complexa, por
isso, atualmente, os mais conhecidos são para leveduras do gênero Candida e para os fungos do
gênero Aspergillus. Outra limitação é que não existe um protocolo padronizado para avaliar o perfil
de sensibilidade dos fungos dimórficos.

Ao contrário do que é visto com as bactérias, em que, rotineiramente, são realizados antibiogramas
para verificar os perfis de resistência; para os fungos, essa técnica não é tão empregada na rotina
clínica. Geralmente, o antifungigrama é utilizado para determinação do perfil de sensibilidade das
leveduras do gênero Candida, enquanto importante agente das micoses nosocomiais. Ou ainda, nos
casos em que o paciente não responde bem ao tratamento proposto e é necessário verificar o
aparecimento de cepas resistentes ou então uma possível alternativa terapêutica.

SAIBA MAIS
Infecções nosocomiais são as infecções adquiridas durante a internação hospitalar (infecção
hospitalar), normalmente causadas por fungos e bactérias.

No vídeo a seguir, veja a especialista explicando o processamento dos espécimes clínicos e

identificação de possível agente etiológico da micose.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. O DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO PODE SER FEITO UTILIZANDO INÚMERAS METODOLOGIAS, A FIM
DE DESCOBRIR QUAL É O AGENTE ETIOLÓGICO DA MICOSE. DENTRE OS TESTES REALIZADOS,
QUAIS SÃO OS TESTES CONSIDERADOS CLÁSSICOS?
Exame direto e cultura micológica

Teste sorológico e cultura micológica

Análise molecular e exame direto

Histopatológico e cultivo secundário

Teste sorológico e análise molecular

2. ATUALMENTE, AS MICOSES SÃO DOENÇAS QUE VÊM DESPONTANDO COMO GRAVE PROBLEMA
DE SAÚDE PÚBLICA. OS FUNGOS FILAMENTOSOS SÃO AGENTES ETIOLÓGICOS DE MUITAS DESSAS
MICOSES. QUAIS CARACTERÍSTICAS PRECISAM SER OBSERVADAS PARA IDENTIFICAR ESSES
MICRORGANISMOS?
Topografia das hifas e a macromorfologia das colônias

Coloração das colônias e a micromorfologia das hifas

Micromorfologia dos micélios vegetativos e macromorfologia das hifas

Textura da superfície da colônia e micromorfologia da colônia

Macromorfologia das colônias e micromorfologia das estruturas de reprodução

GABARITO

1. O diagnóstico micológico pode ser feito utilizando inúmeras metodologias, a fim de descobrir
qual é o agente etiológico da micose. Dentre os testes realizados, quais são os testes considerados
clássicos?

A alternativa "A " está correta.

O exame direto e a cultura micológica são as metodologias clássicas dentro da micologia, sendo
utilizadas há anos e, na maioria dos casos, conseguem definir o diagnóstico.

2. Atualmente, as micoses são doenças que vêm despontando como grave problema de saúde
pública. Os fungos filamentosos são agentes etiológicos de muitas dessas micoses. Quais
características precisam ser observadas para identificar esses microrganismos?
A alternativa "E " está correta.

A identificação dos fungos filamentosos é baseada nas características observadas na colônia e nas
estruturas de reprodução, já que as hifas vegetativas não agregam tanta informação.

CONCLUSÃO

CONSIDERAÇÕES FINAIS
Com o avanço da Medicina, prolongando a expectativa de vida e os tratamentos que interferem
diretamente na imunidade dos indivíduos, as doenças fúngicas começaram a despontar como um
grave problema de saúde pública. Por isso, para o melhor manejo dos pacientes acometidos por
micoses dos mais variados tipos, o diagnóstico laboratorial adequado é primordial.

Como vimos neste tema, o diagnóstico micológico depende de muitas etapas, que compreendem
desde a correta requisição do exame, passando pela escolha adequada do tipo de exame direto,
meio de cultura e técnicas auxiliares de identificação, caso necessário, até chegar à liberação do
laudo. Na micologia, ainda não existem tantos protocolos automatizados e, por isso, depende-se
muito de um analista experiente e dedicado para que o diagnóstico seja um sucesso.

AVALIAÇÃO DO TEMA:

REFERÊNCIAS
ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Detecção e identificação de fungos de
importância médica. In: Microbiologia Clínica para o controle de infecção relacionada à assistência à
saúde. Brasília: Anvisa, 2013.

FERREIRA, A. W.; MORAES, S. DO L. Diagnóstico laboratorial das principais doenças infecciosas e

autoimunes. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013.

TRABULSI, L. R.; ALTERTHUM, F. Microbiologia. 6. ed. São Paulo: Atheneu, 2015.

EXPLORE+
Para saber mais sobre os assuntos explorados neste tema:

Assista ao I Minicurso LIMIP/UFF online: Identificação de fungos e a técnica de microcultivo.

Nele, conseguimos aprender tudo sobre a técnica de microcultivo. Vale pena a visita!
Procure no Google pelo “BrCAST”, veja os protocolos disponíveis e clique em “Subcomitê de
antifúngicos”, para acessar todo o material sobre os testes com antifúngicos.
Leia o artigo Brazil is so far free from Candida auris. Are we missing something?, disponível
na biblioteca virtual em saúde do Ministério da Saúde, e saiba mais sobre o caso de Candida
auris no Brasil, um fungo emergente que representa uma grande ameaça à saúde global.