UNIVERSIDADE DE PERNAMBUCO

CURSO DE LICENCIATURA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

3º PERÍODO

PROTOCOLO DE AULAS PRÁTICAS DE BIOQUÍMICA

GARANHUNS – PE
2021
 Universidade de Pernambuco – Campus de Garanhuns
Protocolo de aulas práticas de Bioquímica

ÍNDICE

INTRODUÇÃO AO LABORATÓRIO

AULA PRÁTICA Nº 01
- Enzimas

AULA PRÁTICA Nº 02
- Carboidratos

AULA PRÁTICA Nº 03
- Dosagem de triglicerídeos e colesterol total

AULA PRÁTICA Nº 04
- Ação antioxidante da vitamina C
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Protocolo de aulas práticas de Bioquímica

INTRODUÇÃO AO LABORATÓRIO

A Bioquímica é a ciência que estuda as biomoléculas, isto é, moléculas

envolvidas com a formação e a viabilidade da menor unidade viva, a célula. Desta
forma, aspectos estruturais e funcionais, bem como as reações envolvidas no
metabolismo das biomoléculas, são fundamentais para o amplo conhecimento da vida.
As principias biomoléculas são carboidratos, lipídios, aminoácidos, proteínas e ácidos
nucleicos, as quais, juntamente com vitaminas e minerais, atuam nos mecanismos de
geração de energia, síntese e divisão celular.
Alguns experimentos são propostos para a caracterização e a quantificação de
biomoléculas, ajudando a compreender suas ações na célula. A Bioquímica enquanto
ciência aplicada permite observar como a versatilidade das biomoléculas é
determinante na formação da célula, considerando que esta compõe os tecidos, os
quais compõem os sistemas e, por último, compõem o organismo.
Este protocolo tem o objetivo de descrever o passo-a-passo de experimentos
úteis na determinação das características estruturais e funcionais das principias
biomoléculas, e, desta forma, facilitar o aprendizado da bioquímica.
É importante salientar que o laboratório é um lugar privilegiado para a
realização de experimentos, possuindo instalações de água, luz e gás de fácil acesso
em todas as bancadas. Além disso, há um grande número de substâncias que possuem
os mais variados níveis de toxicidade e periculosidade neste ambiente, por isso o
laboratório é considerado um local bastante vulnerável a acidentes, caso não se
trabalhe com as devidas precauções.
As regras gerais de segurança em laboratório resultam de vários anos de
esforços de pessoas preocupadas em tornar o trabalho no laboratório uma atividade
segura, minimizando os riscos de acidentes. Para tirar o máximo de proveito delas, é
necessário que todos os usuários as conheçam e as pratiquem desde o primeiro
instante em que pretenderem permanecer em um laboratório. São regras simples,
fáceis de memorizar e de seguir, e ajudarão na integridade física das pessoas que
atuam de forma permanente (professores, monitores e técnicos) ou eventual (pessoal
de limpeza, alunos etc.).

 Recomendações gerais
1. Tendo qualquer dúvida, solicite ao professor os devidos esclarecimentos;
2. Compareça às aulas nos dias e nos laboratórios designados para sua turma;
3. Lembre-se que o laboratório é um lugar para trabalhos sérios e não para
experimentos ao acaso; portanto, evite brincadeiras que dispersem a sua atenção e a
de seus colegas;
4. Realize somente os experimentos indicados na aula. Nada, além disso. Você não
sabe avaliar o perigo e a abrangência do procedimento “inocente” que pretende fazer.

 Vestuário Apropriado
1. Jaleco de mangas compridas, até os joelhos, com fios de algodão na composição do
tecido;
2. Calça comprida de tecido não inteiramente sintético;
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3. Sapato fechado;
4. Óculos de segurança (quando necessário);
5. Luvas;
6. Máscara.

 Vestuário NÃO RECOMENDADO

1. Bermuda ou short;
2. Sandália, Chinelo, Sapato aberto;
3. Uso de braceletes, correntes ou outros adereços;
4. Avental de naylon ou 100% poliéster.

 Hábitos individuais
1. Antes de entrar no laboratório, higienize as mãos com álcool 70%. Durante o
experimento, em caso de necessidade, lave as mãos com água e sabão e higienize com
álcool 70% sempre que precisar compartilhar algum instrumento de trabalho com
algum colega. Após seu trabalho, lave as mãos com água e sabão ou higienize com
álcool 70%;
2. Certifique-se da localização do chuveiro de emergência, lava-olhos e suas
operacionalizações;
3. Conheça a localização e os tipos de extintores de incêndio no laboratório;
4. Conheça a localização das saídas de emergências;
5. Não Fume, coma, corra, beba, ou sente-se debruçado na bancada ou no chão;
6. Prenda os cabelos;
7. Não modifique as posições das bancadas de trabalho, as quais estão separadas para
garantir o distanciamento seguro entre as pessoas;
8. Não manuseie sólidos e líquidos desconhecidos apenas por curiosidade;
9. Na utilização de bicos de gás, certifique-se sobre a válvula de regulagem da chama e
o registro bloqueador da linha de alimentação;
10. Evite aglomeração na entrada e na saída do laboratório.

 Riscos relacionados a produtos químicos

Os produtos químicos mais agressivos ao homem e ao meio ambiente podem
ainda afetar pessoas que não têm conhecimentos de suas características, como é o
caso do pessoal da coleta de lixo, catadores de lixo etc. Estes, por serem leigos no
assunto, ficam sobremaneira expostos às consequências do seu manuseio inadequado.
Além do contato direto com a pele, os diversos agentes químicos manuseados em
laboratórios podem agredir o organismo humano por três vias:
a) Por inalação: constitui a principal via de intoxicação. A absorção de gases, vapores,
poeiras e aerossóis pelos pulmões e a sua distribuição pelo sangue, que os leva às
diversas partes do corpo, é extremamente facilitada pela elevada superfície dos
alvéolos pulmonares;
b) Por absorção cutânea: a pele e a gordura protetora são barreiras bastante efetivas,
sendo poucas as substâncias que podem ser absorvidas em quantidades perigosas. Os
efeitos mais comuns da ação de substâncias químicas sobre a pele são as irritações
superficiais e sensibilizações decorrentes da combinação do contaminante com as
proteínas. Como decorrência destes fatos, o agente químico pode penetrar pela pele,
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atingindo a corrente sanguínea. Neste sentido é necessário especial cuidado quando

houver danos à integridade da pele – feridas expostas devem ser devidamente
protegidas;
c) Por ingestão: pode ocorrer de forma acidental, ou ao ingerir partículas que estejam
retidas no trato respiratório, resultantes da inalação de pós ou fumos. Os riscos de
ingestão por contaminação das mãos e alimentos serão inexistentes se houver a
devida atenção e higiene no trabalho.

 Atitudes individuais com ácidos e soluções

1. Adicione sempre o ácido à água; nunca faça o inverso;
2. Não transporte soluções em recipientes de boca largas, se tiver que efetuá-lo por
certa distância, triplique sua atenção durante o percurso e solicite um colega que o
acompanhe;
3. Não leve a boca a qualquer reagente químico, nem mesmo o mais diluído;
4. Certifique-se da concentração e da data de preparação de uma solução antes de
usá-la;
5. Não pipete, aspirando com a boca, líquidos cáusticos, venenosos ou corantes, use
pêra de segurança ou pipetadores automáticos;
6. Não use o mesmo equipamento volumétrico para medir simultaneamente soluções
diferentes;
7. Volumes de soluções padronizadas, tiradas dos recipientes de origem e não
utilizadas, devem ser corretamente descartados e não retornados ao recipiente de
origem.

 Manuseio e cuidados com frasco de reagentes

1. Leia cuidadosamente o rótulo do frasco antes de utilizá-lo;
2. Ao utilizar uma substância sólida ou líquida dos frascos de reagentes, pegue-o de
modo que sua mão proteja o rótulo e incline-o de modo que o fluxo escoe do lado
oposto ao rótulo;
3. Muito cuidado com as tampas dos frascos, não permita que ele seja contaminada ou
contamine-se. Se necessário use o auxílio de vidros de relógio, placas de Petri, etc.;
4. Ao acondicionar um reagente, certifique-se antes da compatibilidade com o frasco,
por exemplo, substâncias sensíveis à luz, não podem ser acondicionadas em
embalagens translúcidas;
5. Não cheire diretamente frascos de nenhum produto químico, aprenda esta técnica e
passe a utilizá-la de início, mesmo que o frasco contenha perfume;
6. Para verificar o odor da substância, nunca leve o rosto diretamente sobre o frasco.
Os vapores devem ser abanados com uma das mãos em direção ao nariz, enquanto se
segura o frasco com a outra mão;
7. Os cuidados com o descarte de frascos vazios de reagentes não devem ser menores
que os cuidados com o descarte de soluções que eles dão origem.

 Descarte de sólidos e líquidos

1. Deverá ser efetuado em recipientes apropriados separando-se o descarte de
orgânicos de inorgânicos.
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 Cuidados com aquecimento de substâncias

1. Não aqueça bruscamente qualquer substância;
2. Nunca dirija a abertura de tubos de ensaio ou frascos para si ou para os colegas de
laboratório;
3. Sempre identifique equipamentos ou vidrarias que tenham sido aquecidas;
4. Não utilize "chama exposta" em locais onde esteja ocorrendo manuseio de
solventes voláteis, tais como éteres, acetona, metanol, etanol, etc.;
5. Não aqueça fora das capelas, substâncias que gerem vapores ou fumos tóxicos.

 Cuidados com aparelhos, equipamentos e vidrarias

1. Antes de iniciar a montagem, inspecione a aparelhagem, certifique-se de que ela
esteja completa, intacta e em condições de uso;
2. Não utilize material de vidro trincado, quebrado ou com arestas cortantes;
3. Não seque equipamentos volumétricos utilizando estufas aquecidas ou ar
comprimido;
4. Não utilizes tubos de vidro, termômetros em rolha, sem antes lubrificá-los com
vaselina e proteger as mãos com luvas apropriadas ou toalha de pano.

 Depois do experimento
1. Descartar os reagentes conforme recomendado em cada aula;
2. Ajude os professores e monitores a organizar os materiais utilizados durante a
prática;
3. Lave as mãos com água e sabão ou higienize com álcool 70%;
4. Revise o conteúdo aprendido em prática e associe os resultados com a teoria.
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Aula 01: Enzimas

1. Urease
As enzimas possuem, em geral, estrutura proteica, mas algumas foram descritas como sendo
moléculas de RNA com atividade catalítica. As enzimas, como todas as proteínas, são sintetizadas pelas
células e constituem catalizadores biológicos muito mais eficientes do que os catalizadores inorgânicos.
A urease é uma enzima encontrada nas sementes das leguminosas, especialmente no feijão de
porco (Canavalia ensiformis), mas também nas sementes da melancia (Citrullus vuldaris). Atua
especificamente sobre a ureia, transformando-a em CO2 e amônia.

2. Determinação da atividade
A atividade da enzima pode ser demonstrada fazendo-a reagir com uma solução de ureia a pH
7, muito fracamente tamponada. A solução contém um indicador vermelho de fenol (vermelho neutro),
que muda de amarelo para rosa (pH 6,8 a 8,4). Estando a enzima ativa, ocorrerá liberação de NH3 em
quantidade suficiente para sobrepujar a ação do tampão tornando o meio da reação alcalino. Como
consequência da subida do pH, a solução, originalmente amarela, passa à cor rósea.

Ureia + indicador  2NH3 + CO2 + indicador

(Substrato) (cor amarela) (produtos) (cor rósea)

Resumindo: Se a enzima estiver com atividade, ocorrerá mudança de cor de amarela para rósea. Por
quê?

2.1 Teste da atividade

Marcar 2 tubos e distribuir neles as substâncias nas quantidades indicadas na tabela e cor observada:

Tubos Ureia tamponada com indicador Urease Água Mudança de cor

1 1mL 10µL Agitação
2 1mL 3 gotas

2.2 Especificidade
A urease é altamente específica para a ureia. Isto pode ser demonstrado fazendo a enzima
reagir com um composto com estrutura semelhante à do substrato, a tiouréia H 2N – CS – NH2, e verificar
se houve mudança de cor.
Marcar 2 tubos e distribuir neles as substâncias nas quantidades indicadas na tabela a seguir.
Na última coluna, marque com um + ou um – a mudança de cor observada:

Tubos Ureia tamponada Tioureia tamponada Urease Mudança de cor

com indicador com indicador
Agitação
1 1mL 10µL
2 1mL 10µL

2.3 Desnaturação pelo calor

Devido à sua natureza proteica, as enzimas são sensíveis à ação de temperaturas elevadas, que
podem destruir a função catalítica de seu centro ativo.
Colocar em um tubo 3 ml de água destilada e 3 gotas de uréase. Agitar. Colocar em banho
Maria fervente pó 3 minutos. Esfriar em água corrente.
Em outro tubo pipetar 2 ml de ureia tamponada e juntar 1 ml de urease fervida (tubo anterior).
Agitar. Verificar se houve modificação de cor da solução nos próximos 5 minutos. Explicar porque a
urease foi diluída antes de esquentar e porque a elevação da temperatura desnatura as proteínas.

3.4 Inibição
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Grupos sulfidrila (SH) próximos ao centro ativo da urease são essenciais para a manutenção da
conformação ativa. Compostos como sais de metais pesados (Hg, Pb, Ag), ao se combinarem com grupos
SH, causam modificações permanentes na conformação da enzima, provocando diminuição e perda de
sua atividade:
Enzima – SH + Hg2+  Enzima – S – Hg + H+
(ativa) (inativa)

Marcar 2 tubos e distribuir neles as substâncias nas quantidades indicadas na tabela a seguir.
Na última coluna, marque com um + ou – a mudança de cor observada, após 5 minutos de observação:

Tubos Urease Água HgCl2 Ureia tamponada com Mudança de

indicador cor
Agitação
1 10µL 1mL 5 gotas 1mL
2 10µL 1mL 1mL
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Aula 02: Carboidratos

I. Introdução
Carboidratos, açúcares ou sacarídeos, são mais simplesmente definidos como
poliidroxialdeídos, poliidroxicetonas ou seus derivados. Muitos possuem a fórmula empírica [CH2O]n
que originalmente sugere “hidratos” de carbono. Os monossacarídeos, também chamados de açúcares
simples, consistem numa só unidade poliidroxialdeídica ou cetônica, de fórmula empírica [CH2O]n, onde
n = 3 ou um número maior. O esqueleto de carbono dos monossacarídeos comuns é não-ramificado e
cada átomo de carbono, exceto um, possui um grupo hidroxílico no átomo de carbono remanescente,
há um oxigênio carbonílico. Se o grupo carbonílico estiver na extremidade da cadeia, o monossacarídeo
é um aldeído derivado, denominado aldose; se estiver em qualquer outra posição, o monossacarídeo é
uma cetona derivada, denominada cetose (vide Figura 1).

Figura 1. Exemplos de aldose (D-glucose) e cetose (D-frutose) com seis átomos de carbono mostradas
em fórmulas estruturais de cadeia aberta

A partir de várias considerações químicas, deduziu-se que os monossacarídeos (aldoses e

cetoses) com cinco ou mais átomos de carbono não são estruturas de cadeia aberta, mas estruturas
cíclicas. No caso da D-glucose, formam-se estruturas cíclicas, semelhantes ao pirano, de seis elementos
pela reação do grupo hidroxílico alcoólico do átomo de carbono 5 com o átomo de carbono aldeídico 1;
já para a frutose, formam-se estruturas cíclicas semelhantes ao furano (vide Figura 2).

Figura 2. Estruturas cíclicas da glicose e da frutose

As formas isoméricas dos monossacarídeos, que diferem entre si apenas na configuração ao

redor do átomo de carbono carbonílico, são denominadas anômeras ou anoméricas, e o átomo de
carbono carbonílico é denominado carbono anomérico. O monossacarídeo mais abundante é o açúcar
de seis carbonos D-glucose, de onde muitos outros são derivados. A D-glucose é o principal combustível
para a maioria dos organismos, e faz parte da composição de dissacarídeos comuns, como maltose,
lactose e sacarose, e de polissacarídeos abundantes na natureza, tais como o amido e a celulose.
As unidades de monossacarídeos são unidas por ligações glicosídicas, as quais são formadas
pela reação do carbono anomérico de um monossacarídeo com um grupamento hidroxílico de outro
monossacarídeo (figura 3). Dessa forma, os dissacarídeos consistem em dois monossacarídeos unidos
por uma ligação glicosídica, e os oligossacarídeos e polissacarídeos são cadeias de monossacarídeos
unidos por ligações glicosídicas.
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Figura 3. Exemplo da formação de uma ligação glicosídica entre duas moléculas de glucose, produzindo
maltose. A ligação glicosídica é formada pela reação do carbono anomérico de um monossacarídeo com
um grupamento hidroxílico de outro monossacarídeo.

2. Técnicas
2.1 Teste de Molisch
Há um grande número de reações colorimétricas para caracterização de carboidratos. A
maioria delas emprega soluções de ácidos fortes, as quais hidrolisam os polissacarídeos produzindo
monossacarídeos, e causam a desidratação dos açúcares, produzindo furfurais. Esses compostos são
aldeídos derivados do furano, que têm a capacidade de reagir com fenóis como orcinol e α-naftol,
produzindo compostos coloridos característicos. Assim, o Teste de Molisch detecta a presença de
açúcares de um modo geral, sejam eles monossacarídeos, dissacarídeos ou polissacarídeos,
glicoproteínas, glicolipídeos e outros, que são hidrolisados pelo ácido sulfúrico concentrado.

2.1.1 Reação geral para carboidratos:

A ação desidratante de ácidos concentrados sobre monossacarídeos leva à formação de
furfural e derivados (como o hidroximetilfurfural). As aldopentoses formam o furfural e as hexoses
produzem o hidroximetilfurfural (HMF). Os aldeídos de furano podem se condensar com fenóis e aminas
dando compostos coloridos do tipo trifenilmetano. Este é o fundamento da reação que é considerada
geral para carboidratos e é conhecida como teste de Molisch. Tanto o furfural quanto o HMF são
substâncias incolores, impedindo que a reação seja visualizada. Para resolver esse problema, adiciona-se
o composto fenólico ao meio (alfa-naftol, conhecido como reativo de Molisch), o qual reage com os
produtos incolores e provoca o aparecimento de um anel de coloração lilás (vide Figura 4).

HMF
Figura 4. Reação que evidencia a presença de monossacarídeos do tipo pentose ou hexose

2.1.2 Técnica
Marcar 3 tubos e distribuir neles:
Tubo 1 – 2 ml de solução de glicose 1%
Tubo 2 – 2 ml de solução de amido 1%
Tubo 3 – 2 ml de água destilada (tubo controle)

Aos 3 tubos adicionar 5 gotas de solução de alfa naftol. Misturar por leve agitação e pipetar com muito
cuidado cerca de 2 ml de ácido sulfúrico (extremamente corrosivo, usar pipeta de 10 ml) e deixar o
ácido escoar lentamente pela parede do tubo sem agitar, a fim de se formar uma camada de ácido por
debaixo da solução teste. Sem agitar, colocar o tubo na estante. A reação é positiva quando aparece um
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anel violeta na interfase. O surgimento de coloração esverdeada na camada inferior é devido a

impurezas do naftol. Anotar os resultados em forma de tabela.

Tubo Reação
1
2
3

3. Teste de Benedict
Os sacarídeos cujo grupo hidroxila ligado ao carbono anomérico está livre (ou seja, não está
envolvido em ligações químicas), possuem a capacidade de reduzir íons metálicos, tais com: Cu 2+, Ag+ ou
ferricianeto, em meio alcalino. Os açúcares capazes de reduzir tais agentes são denominados açúcares
redutores. De modo geral, os monossacarídeos são açúcares redutores, enquanto que os sacarídeos de
cadeia maior nem sempre apresentam essa propriedade.
O dissacarídeo lactose é encontrado no leite, não tendo outra ocorrência na natureza e sua
hidrólise produz galactose e glucose. A lactose é um dissacarídeo redutor, uma vez que possui um
carbono anomérico livre na unidade de glucose.
A sacarose, ou açúcar de cana, é um dissacarídeo de glucose e frutose, sendo extremamente
abundante no reino vegetal e é conhecida como açúcar de mesa. Em contraste com a maioria dos
dissacarídeos e oligossacarídeos, a sacarose não possui átomos de carbono anomérico livres, uma vez
que os átomos de carbono anoméricos de ambos os monossacarídeos estão ligados entre si e não
podem sofrer oxidação. Por esta razão, a sacarose não age como açúcar redutor (vide Figura 5).

Figura 5. Sacarídeos redutores e não-redutores

3.1 Reação de Benedict

A ação redutora de açúcares em meio alcalino é bastante utilizada para a determinação
quantitativa e qualitativa de açúcares. Nesta aula, utilizaremos o Reagente de Benedict que contém
sulfato cúprico, carbonato de sódio e citrato de sódio. Este último composto produz um complexo azul
com cobre bivalente e isto evita a formação de hidróxido cúprico insolúvel no meio alcalino.
Com o aquecimento do açúcar com grupamento redutor em presença dos íons Cu 2+ e OH-, o
Cu é reduzido a Cu+ e o açúcar é oxidado. O Cu+ não pode formar um complexo solúvel com o citrato,
2+

consequentemente, o cobre precipita sob a forma de hidróxido cuproso de cor amarela: por
aquecimento, o hidróxido cuproso passa a óxido cuproso de cor vermelha.

Redutor Calor
Cuprocitrato (Cu2+)  Hidróxido cuproso (Cu+)  Óxido cuproso (CuO)
(solúvel, azul) (insolúvel, amarelo) (insolúvel, vermelho)

3.1.1 Técnica
Marcar 4 tubos e colocar em cada um, 3 ml do reativo de Benedict.
Ao tubo 1 adicionar 1 ml de solução de glicose;
Ao tubo 2 adicionar 1 ml de solução de frutose;
Ao tubo 3 adicionar 1 ml de solução de sacarose;
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Ao tubo 4 adicionar 1 ml de água destilada (tubo controle);

Colocar todos os tubos no banho-maria fervente por 3 minutos. Retirar os tubos e anotar os resultados
em forma de tabela. O que concluiu?

Tubo Reação
1
2
3
4

4. Teste do iodo
O amido é um polissacarídeo constituído por unidades de D-glucose. É uma forma de reserva
glicosídica nos vegetais e é composto por amilose e por amilopectina. A amilose é constituída por uma
cadeia linear de glucose em ligação α(1,4). A amilopectina é, tal como a amilose, constituída por uma
cadeia de glucose em ligação α(1,4), mas também tem ramificações que se ligam à cadeia principal por
ligações α(1,6). A estrutura da amilopectina é semelhante à do glicogénio (ver introdução) contudo o
comprimento da cadeia é normalmente maior e o grau de ramificação é menor. A amilose não é solúvel
em água, mas forma micelas hidratadas de forma helicoidal, as quais, na presença de iodo, dão uma cor
azul, por este se alojar no interior das hélices segundo determinada ordem. A amilopectina forma
soluções coloidais ou micelares que, na presença de iodo, dão uma coloração vermelho-violeta. Uma vez
que se trata de um composto ramificado, o iodo aloja-se de maneira diferente na sua estrutura
originando uma cor diferente. Desta forma o desenvolvimento de cor nas soluções, na presença de iodo,
não é devido a reações químicas. Quando há aquecimento, há aumento da instabilidade da estrutura
(maior agitação molecular) e o iodo volta a dissolver-se desaparecendo a cor azul da solução.

4.1 Técnica
Marcar 3 tubos e distribuir neles:
Tubo 1 – 2 ml de amido 1%;
Tubo 2 – 2 ml de glicose 1%;
Tubo 3 – 2 ml de água destilada (tubo controle);
Aos três tubos adicionar duas gotas da solução de lugol (solução de poli-iodetos produzidos por
dissolução de iodo metálico numa solução de iodeto de potássio, e ele reage como se fosse iodo
elementar). Anotar os resultados em forma de tabela.

Tubo Reação
1
2
3

5. Reversão da reação do iodo pelo calor

Colocar o tubo 1 do ensaio anterior no banho-maria fervente por alguns minutos até o
desaparecimento da cor azul. Resfriar em água corrente. O que observou? Como esta resultado é
possível?
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Aula 03: Dosagem de triglicerídeos e colesterol

1. Dosagem de triglicerídeos (TG)
O perfil lipídico é definido pelas determinações do colesterol total (CT), colesterol HDL (HDL-C),
triglicerídeos (TG) e, quando possível, do colesterol LDL (LDL-C) após jejum das 12 às 14h. Para análise
do perfil lipídico será utilizado o método enzimático para a determinação dos triglicerídeos em amostras
de soro ou plasma (EDTA).

A lipase lipoprotéica promove a hidrólise dos triglicerídeos liberando o glicerol, que é

convertido, pela ação da glicerolquinase, em glicerol-3-fosfato e ADP. Esse, na presença de glicerol-3-P-
oxidase, é oxidado a dihidroxiacetona e peróxido de hidrogênio. Em seguida, ocorre uma reação de
acoplamento entre o peróxido de hidrogênio, a 4-aminoantipirina e o 4-clorofenol, catalisada pela
peroxidase, produzindo uma quinoneimina, a antipirilquinonimina, que tem máximo de absorbância em
505nm. A intensidade da cor vermelha formada é diretamente proporcional à concentração dos
triglicerídeos na amostra.

1.1 Técnica
Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:

Tubos
Técnica
Branco Teste Padrão
Amostra (plasma/soro) - 0,01mL -
Padrão 200mg/mL - - 0,01mL
Reagente enzimático 1mL 1mL 1mL

Homogeneizar as soluções dos tubos e levar ao banho-maria a 37ºC durante 10 min. O nível da
água do banho-maria deve ser superior ao nível dos tubos de ensaio. Realizar a leitura das absorbâncias
do teste e do padrão em 505nm ou filtro verde (490 a 520nm), acertando o zero com o tubo branco. A
cor é estável durante 60 minutos. Fazer tubos padrão e teste em duplicata.

 Reagente enzimático (tonalidade rósea) = tampão; pH 6,9; acetato de magnésio; 4-clorofenol;

4-aminoantipirina; ATP; lípase da lipoproteína; glicerolquinase; glicerolfosfato-oxidase;
peroxidase e azida sódica. Deve-se evitar exposição à luz solar direta;
 Padrão = triglicerídeos a 200mg/dL e azida sódica. Durante o manuseio, o padrão está sujeito a
contaminações químicas e biológicas, que podem provocas redução da sua estabilidade.

CÁLCULO:
Abs. T -------- [TG] t
Abs. P -------- [TG] P
*Onde: Abs. T = absorbância do teste; Abs. P = absorbância do padrão; [TG] t = concentração de
triglicerídeos do teste; [TG] P = concentração de triglicerídeos do padrão.

Observação 1: O resultado da medição é linear até 1100mg/dL. Para valores maiores, diluir a amostra
com NaCl 150mmol/L (0,85%), realizar nova medição e multiplicar o resultado obtido pelo fator de
diluição. Deve-se diluir a amostra de tal modo que o valor encontrado se situe entre 100 e 250mg/dL.

1.2 Significado clínico (interpretação):

1.2.1 Influências pré-analíticas:
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 O paciente deve estar com peso e dieta estável por 3 semanas e em jejum de 12 a 14 horas;
 A abstinência alcoólica é desejável nas 72 horas que antecedem o teste;
 Nenhuma atividade física vigorosa nas 24 horas que antecedem o exame;
 Como a concentração de triglicerídeos é influenciada por hábitos dietéticos recentes, como consumo
de álcool e por variações do peso corporal e exercício físico, seus valores em um mesmo indivíduo são
bastante variáveis (elevada variação biológica, podendo ser maior que 90%). Mesmo em jejum, ocorre
considerável variação biológica em medições repetidas num mesmo indivíduo, podendo atingir 21%.
Portanto, ao comparar resultados repetidos de triglicerídeos com intervalos de semanas ou meses,
deve-se considerar o efeito da variação biológica;
 Na ausência de jejum, a concentração plasmática pode modificar-se em até 1000%;
 Amostras colhidas com heparina podem fornecer resultados falsamente diminuídos porque promove
a ativação, in vivo e in vitro, da lipase da lipoproteína;
 A contaminação do material utilizado com glicerol fornece valores falsamente elevados;
 As repetições de dosagem devem ser feitas no mesmo laboratório.

1.2.2 Interferências:
 Valores de bilirrubina maiores que 10 mg/dL produzem resultados falsamente diminuídos;
 Níveis elevados de ácido ascórbico (vitamina C) produzem interferências negativas por competição
com o cromogênio na reação da peroxidase. Se houver suspeita de presença de ascorbato, deixar o soro
em repouso durante 90 minutos antes de iniciar a dosagem.

1.2.3 Patologias:
 A determinação dos triglicerídeos ocupa lugar de destaque porque é um dado importante e
necessário para a classificação de fenotipagem das hiperlipoproteinemias. Nessas, sejam de causa
primária ou secundária, ocorre elevação dos triglicerídeos nos tipos I, IIb, III, IV e V;
 As hiperlipidemias podem estar associadas a: doenças cardiovasculares, diabetes, alcoolismo,
pancreatite aguda, obesidade, estresse emocional, síndrome nefrótica, hipotireoidismo;
 Mulheres em uso de anticoncepcionais orais ou de estrógenos apresentam aumento nos níveis de
triglicérides;
 As lipoproteínas ricas em triglicerídeos são aterogênicas (principalmente as VLDL remanescentes **
VLDL = TG / 5);
 O uso de alguns medicamentos também pode interferir na concentração sanguínea do triglicerídeo.

2. Dosagem do colesterol total (CT)

Será realizado o método enzimático para a determinação do colesterol total em amostras de
soro. Os éteres de colesterol são hidrolisados pela colesterol esterase a colesterol livre e ácidos graxos.
O colesterol livre é oxidado pela colesterol oxidase a 4-colesterona e peróxido de hidrogênio. Na
presença de peroxidase e peróxido de hidrogênio, o fenol e a 4 aminoantipirina são oxidados formando
antipirilquinonimina que tem absortividade máxima em 500 nm. A intensidade da cor vermelha formada
na reação final é diretamente proporcional à concentração do colesterol na amostra.

2.1 Técnica
Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:

Tubos
Técnica
Branco Teste Padrão
Amostra (soro) - 0,01mL -
Padrão 200mg/mL - - 0,01mL
Reagente de cor 1mL 1mL 1mL
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Homogeneizar e colocar em banho-maria a 37°C durante 10 minutos. O nível de água do

banho-maria deve ser superior ao nível de reagentes nos tubos de ensaio. Determinar as absorbâncias
do teste e padrão em 500nm ou filtro verde (490 a 510), acertando o zero com o branco. A reação é
estável por 60 minutos. Fazer tubos padrão e teste em duplicata.

 Reagente = tampão pH 7,0; fenol; colato de sódio; azida sódica; 4-aminoantipirina; colesterol
esterase; colesterol oxidase e peroxidase. Deve-se evitar exposição à luz solar direta.
 Padrão = colesterol a 200mg/dL e azida sódica. Durante o manuseio, o padrão está sujeito a
contaminações químicas e biológicas, que podem provocas redução da sua estabilidade.

CÁLCULO:
Abs. T -------- [C] t
Abs. P1-------- [C] P1 Abs. T = absorbância do teste; Abs. P1 = absorbância do padrão;
[C] t = concentração de colesterol total do teste; [C] P1 = Concentração de colesterol total do padrão.

ou

Colesterol ( mgdL )= absorbância do teste x 200

absorbânciado padrão

Observação 1: O resultado da medição é linear até 500mg/dL. Para valores maiores ou iguais, diluir a
amostra com NaCl 150mmol/L (0,85%), realizar nova medição e multiplicar o resultado obtido pelo fator
de diluição. Deve-se diluir a amostra de tal modo que o valor encontrado se situe entre 150 e 300mg/dL.

2.2 Significado clínico (interpretação)

2.2.1 Influências pré-analíticas
 De um modo geral, a amostra pode ser obtida com ou sem jejum. No entanto, recomenda-se que
todos os ensaios dos lipídeos sanguíneos, incluindo o colesterol, sejam realizados em amostras colhidas
em jejum. As vantagens de amostras colhidas em jejum são decorrentes da padronização da colheita,
pois permitem a realização da determinação de outros lipídeos que requerem o jejum e minimizam a
interferência da lipemia pós-prandial que está frequentemente presente em amostras obtidas sem
jejum;
 A abstinência alcoólica é desejável nas 72 horas que antecedem o teste;
 Usa-se soro porque anticoagulantes como o citrato, o oxalato e o EDTA produzem resultados
falsamente diminuídos;
 Um garroteamento maior que 1 minuto produz hemoconcentração, o que pode aumentar os valores
do colesterol em 5%, após 2 minutos, e 10 a 15%, após 5 minutos. Portanto, é muito importante obter
amostra de sangue após a liberação do torniquete;
 A variação biológica do colesterol, decorrente da variação também biológica das lipoproteínas
transportadoras do colesterol, é observada quando a dosagem do colesterol é repetida em um mesmo
laboratório no espaço mínimo de 1 semana. Ela ocorre independentemente do erro analítico e pode
variar entre 1,7 e 11,6% com uma média de 6,1% devido, principalmente, à variação biológica da LDL,
que é a principal lipoproteína transportadora de colesterol.

2.2.2 Interferências
 Níveis elevados de ácido ascórbico (vitamina C) produzem interferências negativas por competição
com o cromogênio na reação da peroxidase. Se houver suspeita de presença de ascorbato, deixar o soro
em repouso durante 90 minutos antes de iniciar a dosagem;
 O uso de alguns medicamentos também pode interferir na concentração sanguínea do colesterol.

2.2.3 Patologias
 Dieta rica em gorduras, tabagismo e sedentarismo são as maiores causas de elevação das taxas de
colesterol, além do fator genético;
 Hipotireoidismo, doenças colestáticas do fígado, diabetes mal controlado e nas
hiperlipoproteinemias dos tipos IIa, IIb e III determinam elevação do CT;
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 Hipertireoidismo, desnutrição crônica e doenças hepáticas graves estão associadas a baixos níveis de
CT;
 Aterosclerose;
 A redução de 1% no valor de CT diminui a prevalência de doenças coronarianas isquêmicas em
aproximadamente 2%.

3. Valores de referência

Tabela 1. Valores de referência para adultos em mg/dL

Tabela 2. Valores de referência entre 2 e 19 anos de idade em mg/dL

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Aula 04: Atividade antioxidante da vitamina C

1. Objetivos
• Avaliar a propriedade redutora em vitamina C (acido ascórbico) utilizando comprimido comercial;
• Determinar o teor de vitamina C em sucos de frutos frescos, sucos industrializados e/ou concentrados.

2. Princípios
A vitamina C e um nutriente essencial porque não pode ser sintetizada pelo nosso organismo,
tendo de ser fornecida por ingestão de alimentos ou medicamentos. Participa ativamente em muitas
reações químicas que acontecem em nosso organismo (formação do colágeno, por exemplo), sendo
imprescindível em algumas delas. Vitamina C é o nome vulgar atribuído ao ácido ascórbico (Figura 1),
uma substancia que tem como uma de suas propriedades um poder redutor.

Figura 1-Estrutura da molécula de ácido ascórbico

A vitamina C reduzirá o lodo (I2) de cor escura a íon iodeto (I-), que é incolor. O iodeto será
reoxidado em presença de hipoclorito de sódio, pela redução dos íons de cloro.

3. Materiais
 Comprimido de vitamina C
 Suco de frutas (laranja, limão, acerola, etc.)
 lodo na forma molecular (I2)
 Hipoclorito de sódio – NaClO
 Tintura de iodo comercial
 Béqueres
 Álcool etílico comum (1L)
 Água destilada ou filtrada
 Conta gotas

4. Técnica
4.1. Reação de oxidação e redução do iodo em presença de vitamina C e hipoclorito de sódio
Em um erlenmeyer contendo vitamina C solubilizada, adiciona-se 10 a 12 gotas de iodo
molecular
(escuro). Haverá formação de iodo reduzido 2I- (incolor). Em seguida, adiciona-se de 7 a 10 gotas de
NaClO4 a 2,5% (v/v), havendo formação de iodo na forma oxidada, forma molecular (I2), escuro (vide
Figura 2).

Figura 2.- Esquema da reação de oxidação e redução do iodo em presença de vitamina C e

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hipoclorito de sódio

4.2 Determinação do teor de vitamina C em sucos de frutos frescos, sucos industrializados

e/ou concentrados
a) Preparação da suspensão de amido:
Aquecer 250 ml (1 copo) de água destilada (ou filtrada) ate 70-80 °C, retirar do aquecimento e
adicionar uma colher cheia de amido de milho (Maizena). Agite a suspensão enquanto estiver resfriando
até atingir a temperatura ambiente (em banho de água corrente).

b) Preparação da solução de vitamina C padrão

Em um balão volumétrico de 1 litro, coloque água destilada (ou filtrada) até a metade. Quebre
um comprimido de vitamina C de 1 g em 4 partes e coloque-as para dissolver dentro do balão. Depois de
dissolvido, complete o volume do balão ate 1 litro com mais água.

c) Preparação dos sucos a serem testados

Processe o fruto que fornece suco (laranja, limão, acerola, etc.), use o espremedor para obter o
suco e depois a peneira para coar o suco obtido.

Béquer Suspensão de amido Solução de vitamina C Nº de gotas de solução

de iodo comercial (2%)
1 20mL 5mL de água destilada
(controle)
2 20mL 5mL de solução de
vitamina C padrão
3 20mL 5mL do suco A
4 20mL 5mL do suco B
5 20mL 5mL do suco C

* Utilizando um conta gotas de plástico, adicione uma gota de uma solução de iodo comercial (2%) no
béquer 1 e agite. Se a coloração azul/roxa desaparecer, adicione mais uma gota e agite. Repita o
procedimento para os copos de 2 a 4, interrompendo a adição quando a coloração azul não mais
desaparecer com a agitação (agite por mais ou menos 30 segundos). Anote o número de gotas de
solução de iodo gastas em cada copo.

Cálculos para transformar os valores para mg de vitamina C por 100 g de suco (como indicado abaixo):

5 mg x número de gotas gastas nos copos 3 , 4 ou 5

X mg de Vitamina C em5 mL=
número de gotas gastas no copo 2

Multiplicando X por 20 obteremos então o teor de vitamina C em mg de vitamina C / 100g.