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^°_ Susana Daniela da Silva Martins
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Caracterização de Fumo Inalável de Cigarro

Quanto a Alguns Compostos Orgânicos
Voláteis e Muito Voláteis

PORTO
t FACULDADE DE CIÊNCIAS
UNIVERSIDADE DO PORTO

Departamento de Química
QD121
Porto, Fevereiro 2008
MARs C
2008
=o
SOI
= 0)
 Susana Daniela da Silva Martins

Caracterização de Fumo Inalável de Cigarro

Quanto a Alguns Compostos Orgânicos
Voláteis e Muito Voláteis

Tese submetida à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto

Para obtenção do grau de Mestre em Química

PORTO! » "
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■art.
- CFA ULDADE DE CIÊNCIAS L

[ * U NIVERSI DADE DO PORTO

Departamento de Química

Porto, Fevereiro 2008

À minha mãe
Ao meu pai

Ao meu irmão
 Agradecimentos

À Professora Doutora Maria Teresa Vasconcelos, minha orientadora, pela atenção

demonstrada, incentivo, ensinamentos e todo o apoio dispensados, sem os quais não teria
sido possível levar a cabo este trabalho.

Ao Professor Doutor Victor Freitas, meu co-orientador, pelo apoio dado na fase de
arranque do trabalho e pela disponibilidade sempre demonstrada.

A Professora Doutora Clara Basto pela troca de ideias e conhecimentos partilhados.

Ao Conselho de Prevenção do Tabagismo, presidido pelo Prof. Doutor M. Pais

Clemente, o apoio recebido no âmbito de um protocolo estabelecido com a Associação para
o Desenvolvimento da Faculdade de Ciências da Universidade do Porto.

À Dr3 Adelina Vieira o apoio concedido.

Um agradecimento muito especial à Gabriela e à Anabela por todo o interesse que

sempre demonstraram pelo meu trabalho, pela amizade, pela troca de conhecimentos e pela
enorme e importante ajuda dada na fase final de escrita da tese.
 A todos os colegas que passaram no laboratório principalmente ao António, ao
Joaquim e ao Rafael que tiveram um papel muito importante no arranque do trabalho e mais
recentemente à Ana Paula, à Cristina, ao Luiz Pinto, à Marisa, à Mafalda, à Nazaré, ao
Pedro Carvalho e ao Pedro Rodrigues que muito contribuem para o excelente ambiente que
se vive no laboratório.

Ao Moisés por estar sempre disponível a ajudar e por todo o apoio.

Aos meus amigos (Ana Isabel, Ana Luísa, Ana Margarida, Andreia, Cátia, Cláudia,
Débora, Fred, Gabriela, Isabel, Luís, João, Pedro, Rui, Sónia...) por serem quem são e por
todos os momentos que vivemos juntos.

A todos os meus familiares, principalmente à minha mãe, ao meu pai e ao meu irmão
por terem permitido que eu chegasse até aqui, pelo incentivo e por serem o meu suporte.

Ao Luís por estar sempre ao meu lado, por tudo...

 Resumo

O tabaco é a causa de um número muito elevado de mortes prematuras. Segundo a

Organização Mundial de Saúde no ano 2000, a nível mundial, morreram 5 milhões de
pessoas com doenças relacionadas como consumo de tabaco, a nível mundial. Em Portugal,
devido ao tabaco, morrem cerca de 5 mil pessoas por ano, correspondendo a uma morte a
cada duas horas. Durante a combustão do tabaco são produzidas milhares de substâncias,
muitas delas tóxicas, que são transportadas até aos pulmões do fumador.
Apesar de existirem métodos padrão para a geração e colheita de fumo inalável em
máquinas de fumar (Federal Trade Commission e Organização Internacional de
Normalização) e para a determinação de alcatrão, nicotina e monóxido de carbono, não
existem métodos padrão conhecidos para análise de outros constituintes do fumo. O
principal objectivo deste trabalho foi a implementação de metodologias para determinação
de compostos orgânicos gasosos presentes em fumo inalável de cigarro directamente a partir
da fase gasosa. De entre a mistura muito complexa existente no fumo de cigarro o estudo
incidiu em benzeno e em alguns dos seus derivados alquilados, designadamente tolueno e
m/p-xileno (por serem muito nocivos para o Homem e por se dispor de meios analíticos para
detecção de compostos orgânicos voláteis em amostras gasosas) e foi extensivo à acetona e
2-butanona.
Começou-se pelo estabelecimento de um método de amostragem a partir de uma
máquina de fumar, eficaz e compatível com o método de análise: o fumo era recolhido num
saco de gases e daí era amostrado por microextracção para fase sólida (SPME) (e também
tubos com Tenax-TA, para comparação) seguido de desadsorção térmica em cromatógrafo
gasoso com detecção por espectrometria de massa (GC-MS). Não se recorreu, portanto, a

vii
extracção por solvente, evitando-se a produção de resíduos. A fibra de SPME continha um
revestimento de polidimetilsiloxano (PDMS).
Uma comparação de declives das rectas obtidas por calibração externa e por adição
de padrão (usando SPME) mostrou que se estava na presença de efeito de matriz, o que
implicou que a quantificação dos diferentes compostos fosse realizada pelo método de
adição de padrão.
O estudo incidiu sobre cigarros comerciais, com filtro, de uma marca americana,
muito difundida na Europa, que será aqui designada por marca A e em cigarros de
referência, produzidos na Universidade de Kentucky (Kentucky Tobacco Research &
Development Center), designados na origem por 2R4F.
Os níveis de concentração dos compostos estudados obedeceram à seguinte ordem:
m/p-xileno < tolueno < benzeno < 2-butanona < acetona, quer nos cigarros de referência
2R4F quer nos de marca A. Nos cigarros de marca A os níveis (e respectivos desvios padrão)
foram, em ug/cigarro, de 155 ± 36 para acetona, 4 7 + 1 9 para 2-butanona, 44 + 8 para
benzeno, 26 + 8 para tolueno e 9 + 2 para m/p-xileno. No caso de cigarros de referência
2R4F, observaram-se níveis (ug/cigarro) de 172 + 45 para acetona, 4 1 + 4 para 2-butanona,
4 1 + 8 para benzeno, 40 + 4 para tolueno e 8 ± 2 para m/p-xileno.
Não se dispondo de materiais de referência com níveis certificados, procurou-se
averiguar a existência de erros sistemáticos recorrendo a um método alternativo de
amostragem de analitos que usa um processo de extracção bastante distinto: adsorção dos
analitos em Tenax-TA contido num tubo de aço, que é depois sujeito a desadsorção térmica
para análise por GC-MSD. Uma comparação dos métodos revelou que os dois
procedimentos conduziram a resultados que foram estatisticamente iguais assumindo um
nível de significância de 5%, para todos os compostos, com excepção dos níveis de tolueno
em cigarros de referência 2R4F cujos resultados foram estatisticamente iguais apenas para
um nível de significância de 1 % e dos níveis de benzeno em cigarros de marca A que foram
estatisticamente diferentes, embora da mesma ordem de grandeza. De referir ainda que as
variâncias associadas às médias não diferem estatisticamente em todos os casos estudados.
Uma comparação dos resultados com outros da literatura, mostrou que os níveis de
concentração dos compostos estudados foram da mesma ordem de grandeza em cigarros de
diferentes marcas.

viii
 Abstract

Tobacco is responsible for a very high number of premature deaths. According the
World Health Organization (WHO) tobacco is currently responsible for 5 million deaths per
year. In Portugal it causes about 5 thousand deaths per year (one death in each two hours).
During the smoking of cigarettes thousands of substances are produced that go to the
smoker lung.
There is a lack of standardized analytical methods for smoke components except for
the analysis of tar, nicotine and carbon monoxide and for smoke collection on smoking
machines (FTC, ISO). The aim of this work was to implement a method for analysis of
organic compounds on mainstream cigarette smoke vapour phase. From the complex
cigarette smoke matrix, this work focused fundamentally on benzene, toluene and m/p-
xylene because of their harmful potential for Humans and because analytical conditions
were available to detect this kind of compounds on gas samples. The method was used
afterwards to determine acetone and 2-butanone.
This work started by establishing an effective and compatible sampling method to
couple with the analytical method: the mainstream smoke was collected on a gas sample
bags. Solid phase microextraction (SPME) and gas chromatography-mass spectrometry
(GC-MS) were the analytical techniques used, without employing solvent extraction. SPME
fibers with poly(dimethylsiloxane) (PDMS) were chosen.
The slopes obtained on the external calibration and on the method of standard
addition were compared, indicating matrix effects. Therefore, the method of standard
addition was used to quantify the different compounds.

ix
 The study focused commercial cigarettes, with filter, from one american brand, here
defined by brand A. Reference cigarettes 2R4F obtained from the university of Kentucky
(Kentucky Tobacco Research & Development Center) were also used.
The results obtained with 2R4F and brand A cigarettes, ranked the compounds
concentrations in the follow order: m/p-xylene < toluene < benzene < 2-butanone < acetone.
The quantified levels (and standard deviations) in ug/cigarette units were for acetone 155 +
36, for 2-butanone 47 + 19, for benzene 44 + 8, for toluene 26 + 8 and for m/p-xylene 9 + 2,
for brand A smoke cigarettes and were for acetone 172 ± 45, for 2-butanone 4 1 + 4 , for
benzene 41 + 8, for toluene 40 + 4 and for m/p-xylene 8 + 2 for 2R4F smoke cigarettes.
As there is no reference material with certificated levels, the existence of systematic
error was investigated using an alternative method with a different extraction process:
adsorption on Tenax-TA following by thermal desorption and GC-MSD analyse.
The analysis of the results obtained by the two different methods shows that there is
no significant different at 5% significance level, to all compounds, except for toluene on
reference cigarettes 2R4F where the means were no statistical different to 1 % significance
level, and for benzene on cigarettes from brand A that were statistical different for which
level (5% or 1%). The variances of all results showed no significant differences.
The obtained results are in the same order of magnitude of the ones supported in
literature.

x
 Résumé

Le tabac est responsable d'un nombre très élevé de décès prématures. Selon
l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS), le tabac est actuellement responsable pour 5
millions de décès par an. Au Portugal, il cause environ 5 mille décès par an (un mort dans
chaque deux heures). Au cours de la fumée de cigarettes sont produites des millions des
substances qui sont transporter au poumon du fumer.
Il manque des méthodes analytiques normalisées pour la fumée, sauf pour l'analyse
de la teneur en tar, en nicotine et en monoxyde de carbone et de fumée de tabac sur la
collecte des machines (FTC, ISO). L'objectif de ce travail a été d'appliquer une méthode
d'analyse des composés organiques dans la fumme inhalé de cigarette a partir de la phase
vapeur. Parmi les mélanges très complexes qu'existe dans la fumme du cigarette, ce travail
a porté essentiellement sur le benzène, toluène et m/p-xylène en raison de leur potentiel
nocif pour l'Homme et parce que les conditions analytiques étaient disponibles pour détecter
ce genre de composés sur des échantillons de gaz. La méthode a été utilisée ensuite pour
déterminer l'acétone et 2-butanone.
Ce travail a commencé par la mise au point dune méthode d'échantillonnage efficace
et compatible avec la méthode d'analyse: les composés de la fumme ont été recueillies sur
un sac à gaz et extraits por microextraction en phase solide (SPME), sans employer
extraction par solvant, et finallment analysé por chromatographic en phase gazeuse-
spectrométrie de masse (CG-MS). Pour le SPME ont été choisis des fibres de
poly(dimethylsiloxane) (PDMS).

xi
 La comparaison des pents de les charts de calibration externe et pour addition
d'étalon on montre un effet matrice. Par conséquent, l'addition d'étalon a été utilisée pour
quantifier les différents composés.
L'étude a été porté des cigarettes commerciales, avec filtre, d'une marque américaine,
ici définie par référence les cigarettes de marque A, et sur cigarettes fourni pour l'université
du Kentucky (Kentucky Tobacco Research & Development Center), défini comme 2R4F.
Les niveaux de concentrations obtenus pour le composés étudies sont classées dans
ordre suivant: m/p-xylène < toluène < benzène < 2-butanone < acétone, pour les deux
marque de cigarettes. Les niveaux déterminés (et écart type) en unités de ug/cigarette ont été
de 155 + 36 pour l'acétone, 47 + 19 pour le 2-butanone, 44 ± 8 pour le benzène, 26 + 8 pour
le toluène et 9 ± 2 pour le m/p-xylène pour la marque A; et 172 ± 45 pour l'acétone, 4 1 + 4
pour le 2-butanone, 4 1 + 8 pour le benzène, 40 + 4 pour le toluène et 8 + 2 pour le m/p-
xylène pour 2R4F cigarettes.
Comme il n'ya pas de matériaux de référence certifiés avec les niveaux connue,
l'existence d'une erreur systématique a été étudiée en utilisant une méthode alternative
différent d'un processus d'extraction: l'adsorption sur Tenax TA suivant par désorption
thermique et GC-MS analyser.
L'analyse des résultats obtenus par les deux méthodes différentes montre qu'il n'ya
pas de différence significative pour un niveau de signification de 5%, pour tous les
composés, à l'exception de toluène référence sur les cigarettes 2R4F lorsque les moyens
n'étaient statistique différente que por un niveau de signification de 1%, et pour benzène sur
les cigarettes de marque A qui ont été statistiquement different. Les écarts de l'ensemble des
résultats ne montre pas des différences significatives.
Les résultats obtenus sont dans le même ordre de grandeur de ceux décrit dans la
littérature.

Xll
 índice Geral
Agradecimentos v

Resumo vii

Abstract ix

Résumé xi

índice Geral xiii

índice de Figuras xvii

índice de Tabelas xxi

Símbolos e Abreviaturas xxii

1. Introdução 1

1.1. Evolução do conhecimento científico sobre o tabaco 2

1.2. Malefícios do tabaco 3

1.3. O cigarro e seus constituintes 5

1.4. Caracterização do fumo do cigarro 6

1.5. Ingredientes adicionados ao tabaco 8

1.6. Processo de queima do cigarro 9

1.7. Métodos de amostragem e análise defumo de cigarro 11

1.7.1. Padronização do "acto de fumar" para estudar o fumo 14
1.7.2. Importância do uso de cigarros de referência 17

1.8. Métodos de recolha e análise usados neste trabalho 18

xiii
 1.8.1. Microextracção para fase sólida (SPME) 18
1.8.1.1. Descrição da técnica 19
1.8.1.2. Processo de absorção/adsorção 23
1.8.1.3. Termodinâmica do processo de partição/adsorção 26
1.8.1.4. Cinética 30
1.8.1.5. A escolha da fibra 32
1.8.1.6. Aplicação de SPME à análise de tabaco 34
3
1.8.2. Tubos com adsorvente 36
1.8.2.1. Valores do Branco 37
1.8.2.2. Volume de amostragem seguro 37
3
1.8.2.3. Armazenamento de amostras recolhidas 38

1.9. Breve descrição da cromatografia gasosa com detector por espectrometria de massa

(GC-MS) 39

Bibliografia 43

2. Parte Experimental 49
2.1. Geração do fumo de cigarro 50

2.1.1. Interferências da própria máquina de fumar cigarros 54

2.2. Padrões e cigarros utilizados 55

2.3. Amostragem 56
2.3.1. Recolha da fase de vapor do fumo inalável de cigarro 56
2.3.2. Adsorção / Absorção para fase sólida dos compostos recolhidos 57
2.3.2.1. Microextracção para fase sólida (SPME) 57
2.3.2.2. Tubos com adsorvente 57
2.4. Descontaminação do material utilizado 58
2.4.1. Máquina de fumar 58
2.4.2. Sacos de gases 58
2.4.3. Fibras de SPME 59
2.4.4. Tubos com enchimentos 59
2.4.5. Coluna do cromatógrafo gasoso 59

2.5. Calibração 59
2.5.1. Obtenção de padrões gasosos para calibração 59
2.5.2. Calibração usando fibras de SPME 60
2.5.2.1. Adição de padrão 60
2.5.2.2. Calibração externa 61
2.5.3. Calibração usando tubos com adsorvente 61

2.6. Análise química 62

2.6.1. SPME-GC/MS 62

XIV
 2.6.2. Tubos com adsorvente - GC/MSD 63

2.7. Cálculos 64
21 A. Concentrações de padrão adicionadas 64
2.7.2. Parâmetros das rectas de calibração" 12 66
12
2.7.3. Tratamento dos resultados" 67
2.7.4. Comparação de médias através da aplicação do teste t ' 68

Bibliografia 70

3. Resultados e Discussão 71

3.1. Implementação do método analítico 72

3.1.1. Estabelecimento da quantidade de fumo a recolher 72
3.1.2. Estabilidade do fumo no interior do saco de gases 75
3.1.3. Tempo de exposição necessário para extracção por SPME 77

3.2. Comparação de fibras de SPME com revestimentos de PDMS-DVB e de PDMS 78

3.2.1. Avaliação das características de resposta do método SPME/GC-MS 79
3.2.1.1. Fibra com revestimento de PDMS-DVB 79
3.2.1.2. Fibra com revestimento de PDMS 82
3.2.1.3. Calibração externa vs. adição de padrão 84
3.2.1.4. Repetibilidade dos resultados 87

3.3. Determinação dos níveis de alguns compostos no fumo inalável de cigarro por
SPME/GC-MS 87
3.3.1. Cigarros comerciais 87
3.3.2. Cigarros de referência 88

3.4. Utilização de um método de amostragem alternativo 89

3.4.1. Resultados obtidos usando Tenax TA / GC-MSD 90
3.4.2. Comparação dos níveis determinados usando dois métodos de amostragem diferentes.91

3.5. Comparação dos resultados obtidos neste trabalho com outros da literatura 94

Bibliografia 98

Conclusões 101

Anexos 103

XV
 índice de Figuras
Figura 1.1. Representação da formação do fumo inalável (mainstream) e do fumo sidestream num cigarro.14.6

Figura 1.2. Representação esquemática de um dispositivo de SPME. (A) Posição com a fibra retraída na
agulha; (B) Posição com a fibra exposta. O detalhe mostra as dimensões típicas da secção com revestimento
de 100 pm de espessura 20

Figura 1.3. (A) Vista interna com a fibra exposta e (B) vista com a fibra exposta e o êmbolo travado pelo pino
no centro da fenda em "Z" 20

Figura 1.4. Modo de usar o dispositivo SPME para o processo de extracção e desadsorção do material
extraído para analise cromatográfica 21

Figura 1.5. Forma de operar com SME: (a) extracção directa, (b) extracção a partir do headspace e(c) SPME
usando membrana protectora 22

Figura 1.6. Comparação dos mecanismos de extracção: absorção e adsorção 25

Figura 1.7. Perfis de extracção, usando uma fibra PDMS, de 1 ppm de benzeno em água (A) segundo o
teoricamente esperado e sob quatro condições de agitação: (B) 100% de agitação magnética; (C) 75% de
agitação magnética; (D) 50% de agitação magnética e (E) sem agitação.32 31

Figura 1.8. Esquema de um cromatógrafo gasoso 39

Figura 1.9. Representação esquemática do funcionamento de um detector de massa. ' 40

Figura 2.1. (A) Vista geral da máquina Borgwaldt, modelo RM 1/Plus, usada para gerar o fumo do tabaco' e
(B) respectivo esquema 50

Figura 2.2. Imagem do interior da máquina onde é possível observar o êmbolo e a cavidade cilíndrica onde
ele se desloca em movimento de vai e vem, imitando o funcionamento do pulmão humano 51

Figura 2.3. Fotografias onde se vê o anemómetro que permite controlar a velocidade do ar junto da ponta do
cigarro 52

Figura 2.4. Vista parcial da máquina, com o cigarro colocado 53

Figura 2.5. Imagem dos porta filtros existentes na máquina de fumar, (A) sem o filtro colocado, (B) com o
filtro colocado e (C) ligados por um tubo de teflon (tal como acontece no interior da máquina defumar) 53

Figura 2.6. Saco na posição de recolha defumo a partir da máquina defumar 56

XV11
Figura 2.7. Representação gráfica da pressão vapor em função da temperatura para cada um dos compostos
utilizados 65

Figura 3.1. Cromatograma referente ao fumo de 6 cigarros recolhido num saco de gases de 2 L onde uma
fibra de SPME foi exposta durante 15 minutos e espectro de massa da zona correspondente ao tempo de
retenção do tolueno 73

Figura 3.2. Cromatograma referente ao fumo de 1 cigarro recolhido num saco de gases de 0,6 L onde uma
fibra de SPME foi exposta durante 10 minutos, e o espectro de massa da zona correspondente ao tempo de
retenção do tolueno 74

Figura 3.3. Cromatograma referente ao fumo de 1 cigarro recolhido num saco de gases de 2 L, que foi de
seguida enchido com diazoto e onde a fibra de SPME foi exposta 10 minutos e espectro de massa da zona
correspondente ao tempo de retenção do tolueno 74

Figura 3.4. Cromatograma referente ao fumo de 1 cigarro recolhido num saco de gases de 1 L, onde foi
exposta uma fibra de SPME durante 10 minutos. Na análise cromatográfica, foi usado split com uma razão de
repartição de 5 75

Figura 3.5. Variação das áreas dos picos obtidos por GC/MS em função do tempo, partir defumo de cigarro
armazenado um saco de gases (usando a fibra PDMS) 76

Figura 3.6. Variação das áreas dos picos obtidos por GC/MS em função do tempo de exposição de uma fibra
de PDMS ao fumo de um cigarro (diluído em azoto) armazenado um saco de gases, para (A) acetona, 2-
butanona, benzeno e tolueno e (B) numa escala diferente para m/p-xileno 77

Figura 3.7. Comparação dos sinais obtidos na análise do fumo de um cigarro usando duas fibras de SPME
diferentes: PDMS-DVB (a verde) e PDMS (a vermelho) 78

Figura 3.8. Curvas obtidas para (A) benzeno e (B) tolueno, usando uma fibra de PDMS-DVB, por adição de
padrão à mistura contida num saco de gases de 1 L constituída pelo fumo de um cigarro 80

Figura 3.9. Curvas obtidas para (A) benzeno e (B) tolueno, usando uma fibra de PDMS-DVB, por adição de
padrão à mistura gasosa, contida num saco de gases 2 L, constituída pelo fumo de um cigarro diluído em 1 L
de diazoto 81

Figura 3.10. Curvas obtidas para (A) benzeno e (B) tolueno, usando uma fibra de PDMS-DVB, por adição de
padrão à mistura gasosa contida num saco de gases de 5 L, constituída pelo fumo de um cigarro e diluído em
3 L de diazoto 82

Figura 3.11. Rectas obtidas, usando uma fibra de PDMS, por adição de padrão à mistura gasosa contida num
saco de gases de 5 L, constituída pelo fumo de um cigarro, diluído em 3 L de diazoto, para (A) benzeno, (B)
tolueno, (C) m/p-xileno, (D) acetona e (E) 2-butanona 83

XV111
Figura 3.12. Rectas obtidas com a fibra de PDMS por calibração externa, usando um saco de gases de 5 L
com 1,8 L de diazoto, para (A) benzeno, (B) tolueno, (C) m/p-xileno, (D) acetona e (E) 2-butanona.
Apresentam-se também os desvios médios associados a cada medição 85

Figura 3.13. Comparação dos níveis observados no fumo inalável de (A) cigarros da marca A e (B) cigarros
de referência Kentucky 2R4F, usando as diferentes técnicas de extracção (Tenax TA e SPME). lncluíram-se os
respectivos desvios padrão 93

xix
 índice de Tabelas
Tabela 1.1. Efeitos de alguns dos componentes presentes no fumo inalável dos cigarros, na saúde 5

Tabela 1.2. Alguns dos compostos carcinogénicos presentes no fumo do cigarro 8

Tabela 1.3. Parâmetros utilizados na máquina de fumar, referentes às puxadas de ar. ' 16

Tabela 1.4. Revestimentos de SPME comercializados: modo de uso, algumas propriedades e aplicações. ...33

Tabela 2.1. Padrões utilizados, qualidade e marca 56

Tabela 2.2. Características do método usado no GC/MS 62

Tabela 2.3. Parâmetros usados no sistema analítico, para amostras recolhidas em tubos com adsorvente 64

Tabela 3.1. Parâmetros das rectas de calibração obtidas por adição de padrão ao fumo de um cigarro para os
diferentes compostos 84

Tabela 3.2. Parâmetros das rectas de calibração externa obtidos para os diferentes compostos 86

Tabela 3.3. Resultados (média e intervalo de confiança) observados em fumo inalável de cigarros de marca A,
após extracção por SPME. Apresentam-se também os valores do desvio padrão (DP) e do desvio padrão
relativo (DPR) 88

Tabela 3.4. Resultados (média e intervalo de confiança) observados em fumo inalável de cigarros 2R4F, após
extracção por SPME. Apresentam-se também os valores do desvio padrão (DP) e do desvio padrão relativo
(DPR) 89

Tabela 3.5. Resultados (média e intervalo de confiança) observados em fumo inalável de cigarros de marca A,
após adsorção em tubos com Tenax TA. Apresentam-se também os valores do desvio padrão (DP) e do desvio
padrão relativo (DPR) 90

Tabela 3.6. Resultados (média e intervalo de confiança) observados em fumo inalável de cigarros 2R4F, após
adsorção em tubos com Tenax TA. Apresentam-se também os valores do desvio padrão (DP), do desvio
padrão relativo (DPR) 91

Tabela 3.7. Comparação dos resultados obtidos por dois métodos de extracção diferentes 92

Tabela 3.8. Níveis de benzeno, tolueno, m/p-xileno, acetona e 2-butanona medidos por diferentes autores no
fumo inalável de cigarros de diferentes marcas 95

XXI
 Símbolos e Abreviaturas

Símbolos
[A] Concentração do analito na matriz
Aad Concentração de A na fase sólida por unidade de área
b Ordenada na origem
Co Concentração inicial do analito na amostra (antes da extracção)
Ca" Concentração na amostra
C° Concentração do analito na fase orgânica
Ca Concentração de analito na matriz, em equilíbrio

Cf Concentração de analito na fase extractora (fibra), em equilíbrio

^-f max Concentração máxima de sítios activos existentes no revestimento
Oh Concentração de analito no headspace, em equilíbrio
Da Coeficiente de difusão do analito na amostra
Df Coeficiente de difusão do analito na fibra extractora
Dh Coeficiente de difusão do analito no headspace
K Coeficiente de partição
Kad Constante de equilíbrio de adsorção do analito
Kd Constante de equilíbrio de desadsorção do analito
Kfa Constante de distribuição fibra/matriz
KJh Constante de distribuição fibra/'headspace
Kha Constante de distribuição headspacelmaïûz
Lf Espessura do revestimento
Lh Espessura do headspace
Ls Espessura da fase aquosa (amostra)
m Declive da recta
N Velocidade de revolução da barra magnética

XXII
 Número de moles inicial de analito na amostra (antes da extracção)
"A Número de moles do composto A
" a Número de moles em equilíbrio na amostra aquosa
n\ Número de moles em equilíbrio no headspace
nef Número de moles em equilíbrio na fibra
p Pressão parcial do composto A
1
parcialA
p Pressão vapor do composto A
1
vapor A

r Coeficiente de correlação
ro Raio externo do revestimento da fibra
fad Taxa de adorção
>\l Taxa de desadsorção
n Raio interno do revestimento da fibra
R Constante dos gases perfeitos (0,082057 atm dm3 mol"1 K"')
Rb Raio da barra magnética
[SI Concentração de locais não ocupados na superfície da fase sólida
Si, Desvio padrão da ordenada na origem
Desvio padrão do declive
Erro associado ao resultado da concentração na amostra
Desvio padrão residual da curva de calibração
T Temperatura absoluta
te Tempo requerido para extrair 95% do quantidade de analito em
equilíbrio
Volume da amostra
Volume da fase extractora (fibra)
Vh Volume do headspace
vs Volume de saturação
v
seringa Volume medido na seringa
Resultado da concentração na amostra

Acrónimos
BTEX Benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno
COMVs Compostos orgânicos muito voláteis
CORESTA Centre de Cooperation pour les Recherches Scientifiques Relative
au Tabac
COVs Compostos orgânicos voláteis
CW-DVB Carbowax-divinilbenzeno
D.P. Desvio padrão

XXlll
 D.P.R. Desvio padrão relativo
FTC Federal Trade Commission
GC Cromatógrafo gasoso
GC-MS Cromatografia gasosa acoplada com um espectrómetro de massa
GL Graus de liberdade
HC Health Canada
IARC International Agency for Research on Cancer
Int. Conf. Intervalo de confiança
ISO Organização Internacional de Normalização
L.D. Limite de detecção
L.Q. Limite de quantificação
MDPH Massachusetts Department of Public Health
MPT Matéria particulada total
MSD Detector selectivo de massa
PAHs Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos
PDMS Polidimetilsiloxano
PDSM-DVB Polidimetilsiloxano - divinilbenzeno
SDT Sistema de desadsorção térmica
SIM Monotorização do ião seleccionado
SPE Solid-phase extraction (extracção em fase sólida)
SPME Solid-phase microextraction (microextracção em fase sólida)
VAS Volume de amostragem seguro

Alfabeto grego
5 Espessura de uma camada fronteira hipotética sem agitação (durante
o processo de SPME)
¥ Constante de equilíbrio em fase adsorvente

XXIV
 1. Introdução

1. Introdução

7.7. Evolução do conhecimento científico sobre o tabaco

1.2. Malefícios do tabaco

1.3. O cigarro e seus constituintes

1.4. Caracterização do fumo do cigarro

1.5. Ingredientes adicionados ao tabaco

1.6. Processo de queima do cigarro

1.7. Métodos de amostragem e análise defumo de cigarro

1.8. Métodos de recolha e análise usados neste trabalho

1.9. Breve descrição da cromatografia gasosa com detector por espectrometria de massa
(GC-MS)

Bibliografia
Introdução

1.1. Evolução do conhecimento científico sobre o tabaco

O tabaco é uma planta, originária da América do Sul e pertencente à família das
solanáceas das quais existem mais de 50 espécies diferentes. De entre estas, a Nicotina
tabacum é a que suscita maior interesse.
As primeiras publicações científicas sobre o tabaco começaram a aparecer no século
XVI. Nessa época, Jean Nicot (1530 - 1600), então embaixador da França em Portugal,
estudou e atribuiu propriedades medicinais à planta, que acabou sendo baptizada com o seu
nome (Nicotiana).
Apesar disso, o tabaco tornou-se paulatinamente, ao longo do século XVIII, uma
planta de consumo profano, visando o prazer e a diversão. Converteu-se então num grande
investimento comercial. Nos Estados Unidos, as plantações da Carolina do Norte tornaram-
se referência mundial para todos aqueles que se interessavam pela produção e
comercialização do produto. A vocação comercial da planta apareceu associada ao glamour,
à sensualidade.
No século XVIII surgiram na Europa as primeiras publicações que associam o
tabaco ao cancro do lábio, boca e mucosa nasal. A Inglaterra e a Alemanha foram os países
que mais estudaram o assunto. Ainda no século XIX começou a haver consciência de
problemas de saúde crónicos associados ao consumo do tabaco. As primeiras vozes que se
manifestavam contra o consumo livre do tabaco foram do movimento proibicionista norte-
americano. Com base em estudos epidemiológicos realizados em Inglaterra e nos Estados
Unidos da América (EUA) a partir dos anos 50 do século XX, a relação entre o cancro do
pulmão e tabagismo foi definitivamente estabelecida. Em 1962, o Governo Britânico
decretou que os produtos derivados do tabaco deveriam ter avisos sobre os riscos potenciais.
Os EUA tomaram atitude semelhante em 1964. Seguiram-se duas décadas de constatações.
O combate frontal ao hábito só arrancou em meados dos anos 80 do século passado. Nessa
altura já não havia dúvidas acerca dos malefícios causados pelo tabaco, tendo-se
intensificado as políticas públicas de prevenção e combate ao fumo. Nos EUA o consumo
foi banido de locais fechados, transportes públicos e lojas. Muitos países proibiram a
publicidade incentivando a venda de cigarros.
A Organização Mundial da Saúde (OMS) criou em 1987 o Dia Mundial sem Tabaco
(31 de Maio). Em 2003 aprovou um tratado mundial para a prevenção e controlo do
tabagismo (Convenção Quadro) que foi assinado por Portugal em Janeiro de 2004. No
âmbito desta Convenção Quadro têm vindo a ser desenvolvidas e implementadas diversas

2
 Introdução

directivas europeias pelos vários estados membro da União Europeia. À semelhança do que
alguns países já fizeram, a partir de Janeiro de 2008 foi introduzida em Portugal uma nova
legislação para a prevenção e controlo do tabagismo donde se salientam as normas de
proibição ou limitação de fumar nos locais públicos e/ou nos locais de trabalho fechados.

1.2. Malefícios do tabaco

O tabaco é a segunda maior causa de morte no mundo. Segundo OMS o tabaco é
responsável pela morte de um em cada 10 adultos (cerca de 5 milhões de mortes cada ano) a
nível mundial. Prevê-se que cause cerca de 10 milhões de mortes por ano em 2030.2
Na Europa, o fumo do tabaco é responsável por um milhão e 200 mil mortes anuais,
prevendo-se que, em 2020, este número ascenda a dois milhões. Em Portugal, calcula-se que
20 a 26% da população fuma e, entre 1970 e 1995, o consumo do tabaco aumentou mais de
150%, tendo sido o país da União Europeia, onde mais se tinha elevado a percentagem de
fumadores.3
Nos países desenvolvidos 25 a 30% da totalidade dos cancros relacionam-se com o
tabaco, contribuindo para o desenvolvimento de doenças respiratórias que podem ser graves
e mortais, tal como 80% das situações clínicas de doença pulmonar crónica obstrutiva. O
tabaco constitui ainda um factor de risco importante de doenças vasculares arteriais, sendo
que 20% da mortalidade, por doença coronária, se deve ao tabaco. Os fumadores de mais de
um maço de cigarros por dia têm quatro vezes mais enfartes do miocárdio que os não
fumadores e estes, quando têm enfartes, têm-nos dez anos mais tarde que os consumidores
de tabaco. Devido ao tabaco nascem bebés de baixo peso (filhos de mães fumadoras).3 Um
grande número de estudos epidemiológicos liga o fumo de cigarro a doenças
cardiovasculares, cancro do pulmão, bronquite crónica, obstrução pulmonar crónica e
efisema.5 Para além disso, um aumento do risco de vir a sofrer de cancro no estômago, na
laringe, no esófago, no pâncreas e no trato urinário foi associado a fumadores.6'7
A Nicotina, além de provocar dependência, tem também vários efeitos hormonais,
dependendo do número e frequência de cigarros fumados e dos fumadores criarem ou não
tolerância à nicotina. O tabagismo associa-se também à menopausa precoce e a um aumento
da osteoporose nas mulheres. Os fumadores têm normalmente um peso corporal em média
de 2,7 a 4,5 kg inferior ao dos não fumadores. Isto é consequência da associação do
tabagismo a um consumo mais reduzido de alimentos e um gasto energético superior. O

3
Introdução.

aumento de peso que se produz ao deixar de fumar constitui um problema para muitos ex-
fumadores.
No caso dos fumadores passivos, expostos a uma combinação do fumo proveniente
da extremidade acesa dos cigarros com o fumo exalado por fumadores, a exposição ao fumo
causa doenças, incluindo o cancro do pulmão e doenças cardíacas, podendo agravar a asma
nos adultos e provocar irritações na vista, garganta e nariz. Nas crianças origina problemas
tais como asma, infecções respiratórias, tosse, pieira, otites médias (infecção do ouvido
médio) e síndroma de morte súbita infantil.
Uma pesquisa na literatura existente revela que dos 227 compostos químicos
classificados pala International Agency for Research on Cancer (IARC) como pertencentes
ao Grupo 2B, ou seja "possíveis carcinogénicos", 48 estão presente no fumo do cigarro
inalado por um fumador durante o processo de queima do mesmo cigarro.
Durante a combustão do tabaco são produzidas milhares de substâncias que são
transportadas até aos pulmões do fumador. Muitas dessas substâncias vão actuar
principalmente sobre o aparelho respiratório, sendo algumas delas absorvidas, passando
assim para a corrente sanguínea, a partir da qual actuam sobre o restante organismo. Os
compostos do tabaco são classificados pela sua actividade biológica como asfixiantes,
irritantes, mutagénicos, carcinogénicos, inibidores de enzimas e farmacologicamente
activos. Quem fuma um maço de tabaco diariamente inala cerca de 840 centímetros cúbicos
de alcatrão por ano, contém benzopireno. Esta é uma substância que lesiona o material
genético das células e produz cancro nos órgãos com quem tem contacto.
Focando constituintes do fumo do tabaco que foram objecto de estudo do presente
trabalho, e as suas consequências na saúde, tem-se o benzeno que afecta o desenvolvimento
do feto, o sistema cardiovascular, o sistema nervoso e o sistema imunológico, provocando
ainda leucemia; o tolueno que afecta o sistema nervoso e o sistema digestivo, os xilenos que
além do sistema nervoso, afectam também o sistema respiratório, a acetona que provoca
irritação ocular e do tracto respiratório superior, assim como afecção do sistema nervoso
central, e a 2-butanona que provoca irritação da pele, olhos e sistema respiratório. São
apresentados na Tabela 1.1 efeitos conhecidos na saúde de alguns dos componentes tóxicos
do fumo inalável dos cigarros.

4
 Jntrodução

Tabela 1.1. Efeitos de alguns dos componentes presentes no fumo inalável dos
10
cigarros, na saúde.
Composto Toxicidade
Monóxido de carbono Liga-se á hemoglobina inibindo a respiração
Amoníaco Irritação das vias respiratórias
Óxidos de azoto (NOx) Inflamação do pulmão
Cianeto de hidrogénio Inibe o funcionamento normal do pulmão
Sulfureto de hidrogénio Irritação das vias respiratórias
Acrolina Inibe o funcionamento normal do pulmão
Metanol Tóxico quando inalado e ingerido
Piridina Irritação das vias respiratórias
Nicotina Provoca dependência, afecta os sistemas
cardiovascular e endócrino
Fenol Promotor de tumor em animais de laboratório
Catecol Carcinogénico em animais de laboratório
Anilina Dificulta a respiração
Hidrazina maleica Agente mutagénico

1.3. O cigarro e seus constituintes

O componente principal dos cigarros de todas as marcas é, naturalmente, o tabaco.
Segundo os dados da Philip Morris (empresa americana responsável pelo fabrico de cigarros
de várias marcas distribuídas por todo o mundo), o cigarro típico de mistura americana
contém, pelo menos, 90% de tabaco no enchimento. Mas os cigarros contêm, para além do
tabaco, uma série de componentes adicionais, tais como o papel de cigarro e filtros, nos
quais também são adicionados ingredientes. Os governos de vários países aprovaram
normas relacionadas com os ingredientes dos cigarros.
Existem muitas diferenças na composição de cigarros produzidos por diferentes
fabricantes. Para essas diferenças contribuem os tipos e quantidades de tabaco utilizados, o
ano de colheita desse tabaco, a quantidade e tipo de ingredientes adicionados e materiais
não-tabaco utilizados (por exemplo o papel e filtros) e a forma física do cigarro. '
O tabaco é uma planta que inclui cerca de 3800 constituintes, desde pequenas
moléculas orgânicas e inorgânicas até biopolímeros. As moléculas mais pequenas

5
Introdução,

distribuem-se por numerosas classes diferentes de compostos, tais como hidrocarbonetos,

terpenos, álcoois, fenóis, ácidos, aldeídos, cetonas, quinonas, nitrilos, compostos sulfúricos,
carbohidratos, aminoácidos, alcalóides, esteróis, isoprenois, etc. Os biopolímeros consistem
em celulose, hemicelulose, pectina, proteínas e péptidos, ácidos nucleicos, etc. Durante o
processo de queima de um cigarro, todos os constituintes do tabaco são sujeitos a
temperaturas que podem chegar aos 950°C na presença de diferentes concentrações de
oxigénio na zona de queima. '

1.4. Caracterização do fumo do cigarro

O fumo resultante da queima do cigarro é uma complexa mistura química. Estima-se
que 4800 constituintes químicos tenham sido já identificados no fumo do cigarro, entre eles
encontram-se mais de 100 alcanos, 150 alcenos e 55 hidrocarbonetos alicíclicos.
O fumo do tabaco possui uma composição complexa. Durante a aspiração de ar é
gerado um vapor muito concentrado, provavelmente sobressaturado que é puxado ao longo
do cigarro, formando o fumo que é aspirado pelo fumador, designado por fumo inalável ou
mainstream em inglês. Por outro lado, o fumo que sai da ponta do cigarro directamente para
a atmosfera é denominado em inglês por sidestream (Figura 1.1).

mainstream

ar

Figura 1.1. Representação da formação do fumo inalável (mainstream) e do fumo sidestream num
14
cigarro.

6
 Introdução

A composição qualitativa do fumo sidestream e do fumo inalável é muito

semelhante na medida em que são constituídos essencialmente pelos mesmos constituintes,
no entanto em termos de composição quantitativa são diferentes. De facto, o fumo
sidestream é gerado segundo condições diferentes do fumo inalável. O fumo sidestream é
gerado a temperaturas que variam entre 200°C e 600°C enquanto que o fumo inalável é
gerado a 600-950°C. Além das diferentes temperaturas a que são gerados também diferem
no pH, tendo o fumo inalável um pH mais baixo (6,0 - 6,7) do que o fumo sidestream (6,7 -
7,5). Os índices de oxigénio também eles são diferentes, sendo de 16% para o fumo inalável
e de 2% para o fumo sidestream} '
Do ponto de vista físico, o fumo do cigarro é constituído por uma fase particulada
(ou fase descontínua), constituída por componentes de massa molecular relativamente
elevada e pressão de vapor baixa e agregados de moléculas, e por uma fase de vapor (ou
fase contínua), constituída por compostos mais voláteis de menor massa molecular. No
entanto muitos dos constituintes mais voláteis também aparecem adsorvidos a partículas.
A fase particulada fica em grande parte retida, à temperatura ambiente, pelos
chamados "filtros de Cambridge".14'15 Estes filtros são formados por fibras de vidro ligadas
entre si por um aglomerado poliacrílico, que retém 99,9% de todas as partículas que tenham
um diâmetro superior a 0,1 um. Geralmente substâncias com massa molecular relativa
inferior a 60 tendem a estar, predominantemente, presentes na fase de vapor enquanto que,
substâncias com massa molecular relativa superiores a 200 tendem a estar apenas na fase
particulada.14 A quantidade de matéria particulada (presente no fumo inalável) que fica nos
filtros de Cambridge, menos água e menos nicotina é definida por alcatrão (tar em inglês).
O alcatrão é um composto não muito bem definido porque tem na sua constituição centenas
de compostos diferentes. A nicotina, os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos e
nitrosaminas específicas do tabaco são exemplos de constituintes associados principalmente
à fase particulada.
A fase gasosa do fumo é a que passa através dos filtros de Cambridge, podendo ser
recolhida, por exemplo, em sacos de gases. Esta fase é constituída por pequenas quantidades
de hidrogénio, monóxido de carbono, dióxido de carbono, metano e outros hidrocarbonetos
assim como certos vapores incluindo vapor de água e cianeto de hidrogénio. Os compostos
de massa molecular pequena, como o amoníaco16 e o formaldeído encontram-se
preferencialmente na fase de vapor embora também tenham sido encontrados na fase
particulada do fumo.17 É principalmente na fase gasosa que são emitidos os compostos
orgânicos voláteis (COV's) e compostos orgânicos muito voláteis (COMVs) estudados

7
lntrodução_

neste trabalho. De referir que a OMS em 1989 introduziu uma classificação dos compostos
orgânicos com base no valor do respectivo ponto de ebulição.18 Segundo essa definição a
designação de COVs aplica-se aos compostos orgânicos com ponto de ebulição entre 50 e
240 °C, no caso de compostos apoiares, e entre 100 e 260 °C, no caso de compostos polares.
Por sua vez, COMVs são todos os compostos orgânicos com ponto e ebulição inferior a 50
°C, no caso de compostos apoiares, e inferior a 100°C, no caso de compostos polares.
Nos anexos 1 e 2 apresentam-se os constituintes principais dos conteúdos da fase
gasosa e os principais constituintes da fase particulada do fumo, respectivamente. Em
ambos os casos, apresentam-se também as suas concentrações que foram observadas no
fumo inalável de cigarros sem filtro.
O desenvolvimento de métodos analíticos cada vez mais sensíveis e reprodutíveis
permitiram a Hoffman e Hoffman,19 identificarem 66 compostos com efeitos carcinogénicos
no fumo de cigarro. Desses compostos, 11 são conhecidos como carcinogénicos para o
Homem (Grupo 1), 8 são provavelmente carcinogénicos para o Homem (grupo 2A) e os
restantes 47 são carcinogénicos para animais que são possivelmente também carcinogénicos
em humanos (grupo 2B).9 A Tabela 1.2 apresenta uma selecção desses compostos.

Tabela 1.2. Alguns dos compostos carcinogénicos presentes no fumo do cigarro.

Composto Grupo Composto Grupo
Benzo [ajpireno l NNAL+ 2B
4-Aminobifenil 1,3-Butadieno 2B
2-Naftilamina Acetaldeído 2B
Formaldeído Isopreno 2B
Benzeno Estireno 2B
Oxido de etileno Catecol 2B
Cádmio Níquel 2B
NNK** l Cobalto 2B
NNN" Chumbo 2B
'NNAL = 4-(metilnitrosamina)-l-(3-piridil)-l-butanol
"NNK = 4-(metilnitrosamina)-l-(3-piridil)-l-butanona
*NNN = N-nitrosonornicotina

1.5. Ingredientes adicionados ao tabaco

Os cigarros comercializados são fabricados a partir de uma mistura de vários tipos de
tabaco e são sujeitos a diferentes processamentos. Durante a mistura e processamento do
tabaco são adicionados humidificantes, tais como o glicerol e o propilenoglicol, que
minimizam a troca de humidade do produto com o ambiente, além de facilitarem o

8
 Introdução

processamento do fumo. São também adicionados ingredientes aromáticos para melhorar as

características do fumo em termos de sabor e aromas específicos."
Enquanto que o termo "constituinte do tabaco" se refere a uma substância que está
naturalmente presente no tabaco, o termo "ingrediente do tabaco" refere-se a uma
substância, que foi adicionado ao tabaco durante o processo de fabrico do cigarro."
Quando o cigarro é fumado, quer os constituintes quer os ingredientes podem ser
parcialmente destilados, transferindo-se intactos para o fumo ou sofrerem reacções de
pirólise. Os produtos da pirólise, por sua vez, podem ser transferidos intactos para o fumo
ou reagirem com outros constituintes do fumo, originando compostos secundários.
Consequentemente, quando se pretende saber qual a influência dos ingredientes adicionados
à composição química do próprio tabaco é necessário saber se são ou não pirolisados
durante a queima do cigarro e que produtos de pirólise se formam.13
Ensaios químicos e biológicos têm sido realizados com o objectivo de estudar o
efeito dos ingredientes do tabaco.21"24 Estes estudos indicaram que os ingredientes
normalmente usados nos cigarros não alteram a toxicidade do fumo. Para além disso, esses
mesmos ingredientes não produzem efeito nos níveis da maior parte dos constituintes do
fumo que são conhecidos por provocarem doenças. A única excepção foi o formaldeído,
cujos níveis aumentaram na presença de alguns ingredientes. Isto dever-se-á ao facto do
formaldeído ter origem em pirólises de açúcares, celulose e outras substâncias
polissacáridas (ingredientes adicionados aos cigarros). No entanto, no âmbito da
sensibilidade e da especificidade dos bioensaios utilizados (dois ensaios genotóxicos e um
ensaio citotóxico), a actividade específica da matéria particulada do fumo do cigarro não foi
alterada pela adição dos ingredientes.

1.6. Processo de queima do cigarro

A queima do cigarro é um processo complexo onde muitos tipos de reacções
químicas ocorrem em paralelo. Existem duas regiões principais dentro da zona da queima
do cigarro: uma zona exotérmica chamada de zona de combustão e uma zona endotérmica
chamada de zona de pirólise/destilação. Na zona de combustão, o oxigénio é consumido
originando os produtos típicos da combustão (dióxido carbono, monóxido de carbono e
água) e libertando o calor que sustenta a queima. Enquanto dura a aspiração de ar através do
cigarro ocorrem temperaturas entre os 600 e 950 °C. Imediatamente a jusante da zona de
combustão tem lugar a zona de pirólise/destilação onde as temperaturas são da ordem dos

9
Introdução -

200 a 600 °C e os níveis de oxigénio são relativamente baixos. Aproximadamente um terço

dos constituintes do fumo, incluindo nicotina, libertam-se nessa zona. '
O tempo de residência dos compostos na região onde se dá a sua formação é de
apenas alguns milissegundos. Enquanto dura a aspiração de ar, o vapor gerado é puxado
para fora da região de pirólise/destilação e arrefece muito rapidamente na presença do ar
diluído que entra pela linha de queima do papel. Isto leva a que os vapores dos compostos
menos voláteis atinjam rapidamente o seu ponto de saturação, ocorrendo condensação
quando o vapor arrefece para temperaturas inferiores a 350°C. Forma-se, assim, um aerossol
denso, que constitui a fracção particulada.13 Depois de formadas, as partículas passam, em
fracções de segundos, desta temperatura inicial para uma temperatura próxima do ambiente,
sendo que, esta queda de temperatura abrupta facilita a formação das partículas. Os núcleos
que promovem a condensação (e que se encontram em grande número) podem ser
fragmentos microscópicos de matéria orgânica queimada incompletamente, como cinzas,
moléculas de elevada massa molecular, moléculas carregadas electricamente, etc. No
entanto, nem sempre é necessária a existência destes núcleos de condensação para a
formação das partículas. Existem partículas que se formam simplesmente a partir dos
vapores em estado de saturação que arrefecem bruscamente.
Os hidrocarbonetos de massa molecular baixa são gerados na região de
pirólise/destilação da zona de queima e encontram-se, tal como já foi mencionado, em
grande quantidade na fase gasosa do fumo. N-alcanos e alcenos de cadeias longas são
gerados a temperatura superior a 700°C. À temperatura de 500°C, formam-se mais de 75
hidrocarbonetos aromáticos monocíclicos como o benzeno e o tolueno, devido à pirólise de
aminoácidos, ácidos gordos, açucares e parafinas. À temperatura de cerca de 700°C
formam-se naftalenos. Existem pelo menos 80 naftalenos no fumo do tabaco. A pirólise e
reacções pirosintéticas de hidrocarbonetos de cadeias longas, terpenos, fitoesterois como o
estigmasterol, parafinas, açucares, aminoácidos, celuloses e reacções envolvendo radicais
primários, originam numerosos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAH's), tendo sido
já identificados cerca de 300 PAH's no fumo do tabaco.
Uma técnica que tem sido usada para tentar estabelecer uma relação entre os
componentes do tabaco e os produtos que constituem o fumo é a análise da radioactividade
dos produtos presentes no fumo obtido a partir de cigarros que foram dopados com isótopos
radioactivos marcadores. Estes estudos permitem calcular a quantidade de constituintes e
ingredientes do tabaco que são transferidos para o fumo durante a queima do cigarro bem
como a quantidade que sofre decomposição térmica e oxidação durante a transferência.

10
 Introdução

No estudo realizado por Schmeltz et ai.,25 procederam à adsorção de nicotina

marcada radioactivamente a sílica gel, realizaram a pirólise isotérmica da mistura em
atmosfera de azoto em tubos de combustão a várias temperaturas entre os 600 e 900 °C e
analisaram, na fase particulada recolhida, os produtos marcados (que deverão ter tido
origem na nicotina). Durante a pirólise a nicotina degradou-se em piridinas, o que envolveu
simples quebras de ligações e sofreu degradações mais extensas e rearranjos dando origem a
quinolinas, arilnitrilos e hidrocarbonetos aromáticos. Neste mesmo estudo foi usada uma
máquina de fumar, para fumar cigarros que continham nicotina marcada. Neste caso, foi
encontrada uma porção substancial (aproximadamente 42%) de nicotina destilada, sem
sofrer qualquer alteração, quer no fumo aspirado quer no fumo libertado directamente na
atmosfera. Nestas condições, cerca de 11% da nicotina foi convertida em piridinas e apenas
uma pequena fracção se converteu em quinolinas, arilnitrilos e hidrocarbonetos aromáticos.
Além disso, no cigarro 12,5% da nicotina oxidou-se totalmente formando dióxido de
carbono. Portanto, este estudo mostrou que ocorreu uma degradação térmica da nicotina
mais extensa na pirólise da nicotina isolada do que na queima do cigarro.
Nesse trabalho demonstrou-se que os produtos da pirólise da nicotina isolada ou
inserida na queima do cigarro são diferentes e que o mesmo acontecerá com outros
constituintes do tabaco. Consequentemente, para que os estudos de pirólise produzam
resultados semelhantes aos que acontecem na queima do cigarro, o processo deve simular o
que ocorre na zona de queima do cigarro quando este é fumado, em termos de velocidade de
aquecimento, temperaturas atingidas, níveis de oxigénio e velocidade de gás, tamanho
realístico da amostra a ser pirolisada e do tempo de residência dos produtos na região de alta
temperatura.

1.7. Métodos de amostragem e análise de fumo de cigarro

Vários métodos têm sido usados para recolher e determinar níveis de diferentes
compostos no fumo inalável de cigarros. Métodos usando filtros de Cambridge foram
usados para recolher a fase particulada (técnica desenvolvida por Pillsbury et ai. 1969,
citado em ) assim como precipitação electrostática.
A concentração de água e nicotina na fase particulada foi determinada por Darral et
ai, usando GC-MS, após extracção com 60 mL de 2-propanol a partir do filtro com
fracção particulada. O alcatrão era determinado subtraindo a massa de nicotina e água à

II
Introdução,

massa total da fase particulada, tendo Chepiga et al.,n usado a mesma técnica. Steven e
Borgerding27 usaram um método semelhante para determinar a nicotina, sendo a fase
particulada extraída com 10 mL de metanol, com agitação durante 30 minutos. Na
determinação, por GC, foi usado um detector de emissão atómica.
Radovanovic e Misic28 usaram também uma máquina de fumar equipada com um
filtro de fibra de vidro para recolher a fase particulada. Os componentes da fase particulada
foram extraídos num extractor soxhlet durante 10 horas com 250 mL de n-hexano. Os
compostos fenólicos foram extraídos e separados por extracção ácido-base, mas de um
modo que não é explicitado pelos autores. A fracção do alcatrão constituída por PAH's foi
separada por cromatografia em coluna de sílica gel, usando como eluente o n-hexano. As
fracções extraídas foram depois analisadas por cromatografia gasosa com detecção por
ionização de chama (FID) e captura electrónica (ECD).
Desde há muitos anos que os PAHs do fumo do tabaco constituem objecto de estudo.
Sabe-se que os PAHs se encontram principalmente na fase particulada do fumo. A análise
de PAHs no fumo de cigarro envolve geralmente extracção com solventes a partir da
matéria particulada total (MPT), extracção para fase sólida e pré-concentração antes da
análise. Técnicas cromatográficas e espectrométricas são normalmente usadas na análise.
Gmeiner et ai.,30 desenvolveram um método para determinar quantitativamente
PAHs na fase particulada do fumo inalável e aplicaram-no a cigarros de referência
Kentucky 1R4F. Os cigarros foram fumados numa máquina segundo as normas ISO e foram
adicionados à solução PAHs deuterados como padrões internos antes da análise. O processo
envolveu extracção de PAH's com metanol a partir dos filtros, diluição em água, extracção
em fase sólida (SPE) numa coluna Ci8 e eluição com ciclohexano, seguindo-se
quantificação por GC-MS. O método permitiu a análise de 17 PAHs numa amostra
constituída por fumo de 20 cigarros. O desvio padrão relativo encontrado foi inferior a 10%
e os coeficientes de correlação superiores ou iguais a 0,99. Excepto para um composto
(dibenzo[a,h]antraceno) as percentagens de recuperação foram superiores a 70%. Este
método pode ser também aplicado ao fumo libertado directamente na atmosfera pela ponta
do cigarro a arder (sidestream).
Li et ai,29 desenvolveram uma técnica para análise de PAHs em cada aspiração de
ar, a qual permitiu obter informações sobre distribuição dos PAHs no fumo durante o
consumo de um cigarro. O processo consistiu numa armadilha de empacotamento
constituída por um disco laminar de alumínio, onde foi recolhida a MPT presente no fumo
de uma única aspiração. A MPT foi depois pesada e dissolvida numa mistura de tolueno,

12
 Introdução

hexano e isopropanol na proporção de 5:5:1, contendo 1 pg/mL de cada um dos seguintes

PAHs deuterados, naftaleno-d8, fenantreno-dlO, criseno-dl2 e perileno-dl2, que
funcionaram como padrões internos. A mistura MPT/solvente foi depois colocada num
banho de ultra-sons à temperatura ambiente durante 10 minutos e depois 1 pL da solução foi
injectado no GC-MS e analisada usando o sistema de iões-massa seleccionados (MIS). O
método permitiu determinar naftaleno, fenantreno, fluoranteno, pireno e benzo[aJpireno em
cigarros de referência Kentucky 1R4F, fumados segundo as normas ISO. As concentrações
típicas dos cinco PAHs estudados29 em diferentes marcas de cigarros foram de 2-4 pg, 0,2-
0,4 pg, 60-150 ng, 45-140 ng e 9-40 ng para o naftaleno, fenantreno, fluoranteno, pireno e
benzo[a]pireno respectivamente, e variaram, com o tipo de tabaco, características do papel
do cigarro, tamanho do cigarro, filtro e ventilação.
Os mesmos autores29 também estudaram a influência de diferentes acendedores do
cigarro na concentração de PAHs na primeira aspiração de ar. Utilizaram quatro
acendedores diferentes: isqueiro eléctrico, lamparina de butano, um isqueiro de butano
convencional e fósforos. Constataram níveis de incerteza associados às determinações
maiores quando usaram acendedores manuais. As concentrações de PAHs foram superiores
quando foi utilizado o fósforo e o isqueiro de butano convencional. As concentrações
obtidas quando foi utilizado o isqueiro eléctrico e a lamparina de butano foram semelhantes.
Aparentemente, os efeitos dos acendedores tornam-se mais visíveis à medida que as
concentrações dos PAHs são superiores. Isto deve-se ao facto de, quando se utiliza o fósforo
ou o isqueiro de butano convencional, uma grande porção dos PAHs detectados no fumo ter
origem na chama, quer por contribuição directa da chama, quer por interacção da chama
com o tabaco ou compostos produzidos durante a queima do cigarro.
Recentemente, Akpan et al.,b também determinaram PAHs presentes na fase
particulada do fumo inalável de cigarro. A fase particulada foi recolhida em filtros de
Cambridge, que é uma técnica eficiente para recolher PAHs menos voláteis, mas não é
eficiente na recolha de fracções mais voláteis. Seguia-se depois extracção e purificação dos
compostos e análise por HPLC com um detector fluorimétrico (tal como em ).
Compostos com um grupo carbonilo (por exemplo, aldeídos e cetonas) são
constituintes da fase de vapor do fumo de cigarro. Têm origem principalmente na
volatilização directa e pirólise do cigarro durante a combustão. Alguns dos compostos muito
voláteis ou reactivos presentes no fumo de cigarro são de difícil análise directa, tendo sido
caracterizados em poucos trabalhos publicados. Envolvem sempre uma derivatização depois
da recolha do fumo. Entre os reagentes derivatizantes utilizados destaca-se o 2,4-

13
Introdução,

dinitrofenilhidrazina (DNPH) que origina compostos muito estáveis . Os compostos

contendo grupos carbonilo mais abundantes no fumo de cigarro são o acetaldeído, a acetona
e o formaldeído.
Houlgate et ai,33 estabeleceram métodos para determinar formaldeído e acetaldeído
no fumo inalável do cigarro gerado por uma máquina de fumar. Os aldeídos foram
recolhidos fazendo passar o fumo por uma solução com DNPH em meio ácido, que era
posteriormente analisada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Miyake et
ai,34 determinaram níveis de formaldeído, acetona, propanal, 2 -metilpropanal, butanal,
hexanal e octanal após derivatização com tiazolinas, seguindo-se quantificação por
cromatografia gasosa com detecção por azoto-fósforo.
Compostos orgânicos aromáticos, tais como o benzeno e o tolueno, já foram também
objecto de estudo. Brunnemann et al.,35 e Byrd et ai.,36 fizeram a extracção deste compostos
passando o fumo inalável por armadilhas que continham metanol a muito baixas
temperaturas (-78°C), seguindo-se quantificação por GC-MS.
Para determinar benzeno e outros COVs no fumo inalável do cigarro, Darrall et ai,
26
após gerarem o fumo numa máquina de fumar, provida de dois filtros de fibra de vidro
para recolha da fase particulada, recolheram os COVs em três frascos borbulhadores
montados em série que continham metanol e eram mantidos a baixas temperaturas (-78°C).
O primeiro continha 20 mL do solvente e os restantes apenas 5 mL cada um. Os COVs
recolhidos eram depois analisados por GC-MS.
A Health Canada,37 indica como método para recolha de compostos voláteis
presentes no fumo inalável de cigarro, a passagem do fumo por filtros de fibra de vidro (92
mm) seguindo-se a passagem por armadilhas contendo metanol a baixas temperaturas (-
70°C). Às soluções obtidas deve ser adicionado padrão interno (benzeno deuterado) e
injectadas num GC-MS para quantificação. Este método foi usado por Counts et ai, ' '
para determinar os componentes que constam na regulamentação da Health Canada.

1.7.1. Padronização do "acto de fumar" para estudar o

fumo
Não existem dois fumadores que fumem cigarros do mesmo modo. Por isso, os
valores relativos aos teores de alcatrão e nicotina associados às diferentes marcas de
cigarros não são indicadores precisos das quantidades de nicotina e alcatrão inaladas por
cada fumador de cigarros de determinada marca. Porém, para que se possam obter

14
 Introdução

resultados comparáveis sobre cigarros de diferentes marcas há a necessidade de se usarem

métodos de aspiração de ar padronizados, realizados por máquinas adequadas, em condições
laboratoriais bem definidas. Este tipo de metodologias foi introduzido por autoridades
reguladoras, designadamente a Comissão Federal de Comércio dos E.U.A. (U.S. Federal
Trade Commission - FTC) em cooperação com a Organização Internacional de
Normalização (ISO). Tais metodologias permitem evidenciar diferenças relativas de teores
de constituintes do fumo de diferentes marcas de cigarros, presumindo que cada cigarro será
segurado e fumado do mesmo modo que a máquina o faz.39
Em 1936 a American Tobacco Company começou a usar máquinas de fumai" com
condições padronizadas, que tentaram reflectir os hábitos dos fumadores dessa altura. Os
níveis médios de nicotina nos cigarros fumados eram de cerca de 2.8 mg/cigarro.19 A FTC
adaptou em 1969 o método padrão de 1936, apenas com pequenas modificações, definindo
alcatrão como a fase particulada do fumo menos a quantidade de água e nicotina. A partir
daí, as condições padrão da máquina de fumar são as seguintes: uma aspiração de 2
segundos, num total de 35 mL de ar, cada minuto, sendo deixados por fumar 23 mm em
cigarros sem filtro e 3 mm a partir do filtro no caso de cigarros com filtro. No Canada e no
Reino Unido, as condições padrão ISO de fumar cigarros foram aceites desde 1991. Noutros
países Europeus, as condições padrão de fumar cigarros foram desenvolvidas pelo
CORESTA (Centre de Cooperation pour les Recherches Scientifiques Relative au Tabac),
sendo similares às condições padrão da FTC mas definindo alcatrão como o total de fase
particulada menos a quantidade de água.
Por seu lado, os legisladores do Canada, na província de British Columbia (Health
Canada - HC) consideraram que deveriam ser determinadas as concentrações máximas dos
principais componentes nos cigarros. Para tal, estabeleceram os seguintes parâmetros de
aspiração de ar: volume de 55 mL e um intervalo entre aspirações de 30 segundos; caso os
cigarros possuam furos de ventilação junto ao filtro, estes devem ser tapados. Nestas
condições, espera-se atingir um valor aproximado das concentrações máximas possíveis de
i • 14 40

obter nos cigarros. '

Por sua vez, o Massachusetts Department of Public Health (MDPH) defende que
melhor do que obter valores de concentração máximos é preferível obter uma estimativa
mais realista das concentrações médias no cigarro e propôs os seguintes parâmetros:
aspiração de um volume de ar de 45 mL e um intervalo entre aspirações de 30 segundos;
devendo ser tapados metade dos buracos de ventilação, simulando o fumador que segura o
cigarro entre os dedos essa zona.14'41 Nem a HC nem MDPH alteraram duração da aspiração
15
Introdução,

de ar estabelecido pelas normas ISO que é de 2,0 segundos. Aumentos no volume da

aspiração de ar e diminuição do intervalo entre aspirações conduzem a aumentos na dose de
exposição no fumo na fracção inalável. A Tabela 1.3 apresenta os parâmetros defendidos
nas principais normas em vigor.

Tabela 1.3. Parâmetros utilizados na máquina de fumar, referentes às puxadas de

Bloqueamento
Condições Volume (mL) Duração (s) Intervalo (s) da ventilação
(%)

ISO 35 2 60 0
MDPH 45 2 '30 50
HC 55 2 30 100

Apesar de existirem métodos padrão para a geração e colheita de fumo inalável em

máquinas de fumar (FTC, ISO) e determinação de alcatrão, nicotina e monóxido de
carbono, não existem métodos padrão conhecidos para análise de outros constituintes do
fumo.38
Sem métodos analíticos padronizados, torna-se difícil a comparação entre níveis de
constituintes do fumo de cigarro determinados por diferentes métodos analíticos.
A influência do modo de fumar cigarros nas concentrações dos compostos do fumo
tem sido tratada em diversas publicações. Counts et a/.,17,38 chegaram à conclusão de que,
tal como seria de prever, as quantidades da maioria dos constituintes presentes no fumo do
tabaco aumentam tipicamente segundo a ordem ISO < MDPH < HC. Ou seja, as
concentrações no fumo aumentam à medida que aumenta o volume da aspiração de ar e há
redução da ventilação - maior quantidade de tabaco fumado por aspiração de ar. A
concentração de água no fumo aumenta significativamente pela mesma ordem. O aumento
de água no fumo poderá afectar a filtração de alguns dos constituintes. O aumento relativo
das concentrações é geralmente maior para os constituintes da fase de vapor do fumo do que
para os constituintes da fase particulada. Existem alguns constituintes que são excepção
como é o caso do fenol e da quinolina, onde 50 a 70 % dos cigarros analisados apresentaram
concentrações similares quando foram usados os parâmetros HC e MDPH. No caso do 1-
aminoftaleno e do 2-aminoftaleno também aproximadamente 50% das determinações

16
 Introdução

realizadas apresentam valores de concentrações idênticas usando quer os parâmetros HC

quer os MDPH.
Os volumes de aspiração de ar maiores e ventilações menores no método HC levam
a um aumento do fluxo de ar dentro do cigarro e a um aumento da temperatura, o que terá
efeitos na combustão, pirólise e destilação que ocorre dentro do cigarro durante a queima.
Assim, quando se alteram os parâmetros usados na máquina de fumar as quantidades
relativas dos constituintes que fazem parte da composição do fumo do cigarro poderão
também alterar-se.

1.7.2. Importância do uso de cigarros de referência

Devido à complexidade do cigarro (atribuída aos parâmetros do design físico do
mesmo, variações nas misturas de tabacos e ingrediente adicionados), a selecção de um
cigarro de referência apropriado para ser usado por diferentes investigadores, de modo a
fornecer resultados comparáveis tornou-se uma necessidade.
Assim sendo, foram desenvolvidos cigarros de referência, da marca Kentucky, como
resultado da cooperação entre a US National Cancer Institue, a Agriculture Research
Service of the US Department of Agriculture e a University of Kentucky Tobacco and Health
Research Institute (Lexington, Kentucky). Esses cigarros incorporam as principais
características dos cigarros que foram colocados no mercado desde 1950. Os cigarros de
referência servem como um padrão internacional, com vista ao seu uso em trabalhos de
investigação.
Chepiga et ai, estudaram a composição do fumo inalável de cigarros de referência
Kentucky, tendo analisado 18 constituintes específicos, que foram seleccionados por terem
sido identificados como compostos que podem contribuir para os riscos associados ao fumo
de cigarro: nicotina (extraída com 2-propanol a partir da fase particulada recolhida em filtro,
seguindo-se analise por GC), CO (determinado por espectrofotometria no infravermelho não
dispersiva - NDIR), amoníaco (determinado por calorimetria), benzo[a]pireno (analisado
por HPLC com detecção por fluorescência), óxidos de azoto (determinados por
quimioluminescência), formaldeído, acetaldeido, acetona e 2-propenal (determinados por
HPLC com detector por fluorescência depois de derivatização com 2-difenilacetil-l ,3-
indadiona-1-hidrazona para formar derivados de azina), cianeto de hidrogénio (adsorvido
em hidróxido de sódio, seguida extracção com água e análise por colorimetria),
nitrosaminas específicas do tabaco (extracção a partir da fase particulada do fumo com

17
Introdução _

cloreto de metilo seguindo-se passagem do extracto por uma coluna de alumina à pressão
atmosférica e determinação por cromatografia gasosa com detecção por análise de energia
térmica (TEA)). Os resultados dos estudos de Chepiga et al.,u vieram confirmar a
representatividade dos cigarros 1R4F (hoje em dia substituídos pelos 2R4F) relativamente
aos cigarros do mercado americano light, no que diz respeito à actividade mutagénica da
fase particulada do fumo inalável, corroborando resultados anteriores de Steel et ai..
No estudo de Chepiga et al.,u concluiu-se também que os resultados obtidos da
análise do fumo inalável dos cigarros de referência 1R5F são representativos dos obtidos
para cigarros da categoria ultra-light, desde que as marcas analisados tenham concentrações
de alcatrão similares à dos cigarros de referência, o que não se verifica em todas as marcas
comercializadas. Esse estudo permitiu ainda concluir que a constituição química do fumo
inalável assim como a actividade mutagénica estão relacionadas com a quantidade de
alcatrão nos cigarros. Provavelmente, o resultado com maior importância deste estudo foi a
correlação observada entre os níveis de alcatrão no fumo inalável e os níveis dos
constituintes desse mesmo fumo - os níveis dos constituintes do fumo aumentam à medida
que aumenta também os níveis de alcatrão. Uma relação similar foi observada entre os
níveis de alcatrão a actividade mutagénica da fase particulada do fumo inalável.

1.8. Métodos de recolha e análise usados neste trabalho

1.8.1. Microextmcção para fase sólida (SPME)

A microextracção para fase sólida (SPME) é definida como uma técnica em que o
volume da fase extractora é muito pequeno relativamente ao volume da amostra e
caracteriza-se por uma extracção não exaustiva, ou seja, apenas é extraída uma fracção de
analito, cuja extensão varia com as condições experimentais, como adiante se
descreverá.44,45
A SPME foi introduzida nos anos 90 por Pawliszyn e tem vindo a sofrer vários
desenvolvimentos.46 Nesta técnica, amostragem, extracção e concentrações são incorporadas
num único passo e o uso de solventes é minimizado. A amostragem processa-se expondo
uma fibra de suporte inerte recoberta com um polímero com afinidade para os analitos, a
uma amostra gasosa ou líquida. A fibra adsorve/absorve uma fracção dos analitos, sendo

18
 Introdução

depois retirada da amostra e colocada no injector de um cromatógrafo, para desadsorção

térmica dos analitos e análise.
O funcionamento da SPME é baseado no equilíbrio de partição (revestimentos
líquidos) dos analitos entre a amostra em fase gasosa ou aquosa e o polímero que cobre a
fibra. Teoricamente a fibra deverá ser exposta ao analito até que se atinja o equilíbrio de
partição. Nessas condições a quantidade de analito adsorvido/absorvido será máximo nas
condições experimentais usadas. Porém, o tempo necessário para alcançar esse equilíbrio
pode ser demasiado longo (algumas horas). Nestas situações pode ser preferível encurtar os
tempos de exposição e trabalhar em condições de não-equilíbrio, mas com tempos de
exposição constantes e iguais para padrões e amostras.
A SPME começou por ser utilizada na análise de compostos relativamente voláteis,
mas é hoje aplicada a uma grande variedade de compostos orgânicos voláteis ou semi-
voláteis, incluindo PAH's e pesticidas, entre outros.

1.8.1.1. Descrição da técnica

A SPME é uma microtécnica, em que os processos de extracção e pré-concentração

de analitos ocorrem numa escala reduzida. O dispositivo básico do SPME consiste num
bastão de fibra óptica, frequentemente de sílica fundida de 100 u m de diâmetro, em que 10
mm de uma das extremidade está recoberta com um filme fino de um polímero com
afinidade para os analitos ou de um sólido adsorvente. As espessuras dos revestimentos de
fibras comerciais variam de 7 um a 100 um e os seus volumes variam de 0,03 uL a 0,7 uL.
A Figura 1.2 ilustra o dispositivo da fibra de SPME. Com o dispositivo da fibra adaptado ao
respectivo suporte (uma espécie de seringa, Figura 1.3) o manuseio das fibras para extracção
torna-se bastante simples. O dispositivo que contém a fibra não pode ser manipulado
directamente, estando a fibra presa a um êmbolo, como mostra a Figura 1.3. Na extremidade
oposta ao êmbolo, o tubo hipodérmico fica exposto e além de proteger a fibra actua como a
agulha com que são perfurados os septos dos contentores da amostra.

I«J
Introdução,

B Tubo de fixação
da fibra (interno
ao hipodérmico)

Fibra
retraída

Figura 1.2. Representação esquemática de um dispositivo de SPME. (A) Posição com a fibra retraída na
agulha; (B) Posição com a fibra exposta. O detalhe mostra as dimensões típicas da secção com revestimento de
100 um de espessura.

Figura 1.3. (A) Vista interna com a fibra exposta e (B) vista com a fibra exposta e o êmbolo travado
pelo pino no centro da fenda em "Z".

A Figura 1.4 mostra a sequência de procedimentos para realizar quer a extracção a

partir da amostra quer a desadsorção no injector do cromatógrafo. Com a fibra retraída na
agulha, o septo do frasco que contém a amostra é perfurado e a fibra é exposta à amostra.
Terminado o tempo de extracção, a fibra é novamente recolhida, a agulha é retirada do septo
e levada para inserção no cromatógrafo. Para análise, com a fibra recolhida, a agulha perfura
o septo do injector do GC e a fibra é exposta para desadsorção térmica. Terminada a
desadsorção a fibra é recolhida e a agulha é retirada.

20
 Introdução

retirar
Perfurar o septo retirar
Colocar no
extrair cromatógrafo

desadsorção

» » Ï* •
«* J*
» » ♦ • S D ÇZJ
#*
* ■
*
»
r
« » • •
**
** * *j L*
U » . * Víín,./ B
B^K WMW*

EXTRACÇÃO ANALISE C ROMATOGRAFIC A

Figura 1.4. Modo de usar o dispositivo SPME para o processo de extracção e desadsorção do material extraído
para analise cromatográfica.47

Podem ser considerados três modos de extracção por SPME: extracção directa por
exposição à amostra líquida ou gasosa, extracção no hecidspace de uma amostra líquida e
extracção com protecção de membrana. Na extracção directa (Figura 1.5a) a fibra é imersa
directamente na amostra e os analitos são transportados directamente da matriz para a fase
extractora da fibra. Para fazer extracções mais rápidas em amostras líquidas é necessário
recorrer à agitação. Para amostras gasosas a convecção natural do ar é suficiente para
facilitar um equilíbrio rápido.

21
Introdução,

Fibra Membrana

Revestimento Amostra Revestimento Amostra

Figura 1.5. Forma de operar com SME: (a) extracção directa, (b) extracção a partir do headspace e(c) SPME
usando membrana protectora.

Quando a extracção é feita no headspace (Figura 1.5b) os analitos são extraídos da

fase gasosa em equilíbrio com a amostra líquida. Quando a extracção é feita deste modo a
fibra é protegida de efeitos adversos causados por compostos não voláteis e substâncias de
massa molecular elevada presentes na matriz da amostra (por exemplo, ácidos húmicos e
proteínas). No modo de extracção no headspace, as características da matriz da amostra,
incluindo pH, não afectam a fibra. Num sistema constituído por uma amostra líquida e o seu
headspace a quantidade de analito extraído pela fibra não depende da localização da fibra na
fase líquida ou na fase gasosa, deste modo a sensibilidade na extracção no headspace ou na
extracção directa é a mesma, desde que os volumes das duas fases sejam o mesmo nos dois
casos. Mesmo quando numa extracção directa não há headspace, uma diferença
significativa de sensibilidade entre amostragem directa e amostragem no headspace apenas
ocorre para analitos muito voláteis (considerando a inexistência de interferentes).
No terceiro modo de extracção (Figura 1.5c) a fibra está separada da amostra com
uma membrana selectiva, que deixa passar o analito pretendido e bloqueia a entrada de
interferentes. O principal objectivo do uso de uma membrana é proteger a fibra de efeitos
adversos causados por moléculas de massa molecular elevada quando são analisadas
amostras muito sujas. A extracção através do headspace também protege a fibra, mas a
extracção usando uma membrana protectora permite a extracção de compostos menos
voláteis. O processo de extracção é substancialmente mais lento quando usada a membrana

22
 Introdução

de protecção do que quando a extracção é directa, uma vez que no primeiro caso o analito
tem de se difundir através da membrana antes de alcançar a fibra. O uso de membranas mais
finas e o aumento da temperatura de extracção permitem diminuir o tempo de extracção.48

1.8.1.2. Processo de absorção/adsorção

As fibras para SPME actualmente disponíveis no mercado podem ser divididas em

dois tipos distintos no que respeita a características físicas dos seus revestimentos. Os
revestimentos de PDMS (polidimetilsiloxano) e de PA (poliacrilato), por exemplo, são
filmes líquidos, enquanto os revestimentos de PDMS-DVB (divinilbenzeno), Carbowax-
DVB, Carbowax-TR (templated resin) e de Carboxen têm como fase extractora principal
um sólido poroso.49
O mecanismo do processo de extracção de cada um destes dois tipos de revestimento
é diferente. Enquanto que um revestimento líquido extrai analitos via absorção (processo de
partição), um revestimento sólido extrai via adsorção (processo de superfície). Na realidade,
o mecanismo de absorção envolve a dissolução do analito no revestimento e a difusão para
uma zona mais interior durante o processo de extracção, enquanto que a adsorção é
caracterizada por o analito permanecer à superfície do revestimento.49
O processo de partição é baseado na distribuição do analito entre duas fases
imiscíveis e é determinado pela fugacidade do composto em cada fase. Em equilíbrio pode
ser descrito através de uma constante adimensional (coeficiente de partição - K):

K=^ - 1.1
c;

onde Ç é a concentração do composto na fase orgânica (por exemplo, revestimento da

fibra) e CJ é a concentração em equilíbrio na amostra.

Fibras adsorventes extraem os analitos por interacções físicas. A recolha ocorre por
retenção dos analitos dentro dos poros internos. As moléculas podem ser adsorvidas por
várias formas como por exemplo interacções Van der Waal, dipolo-dipolo e outras ligações
intermoleculares fracas. Neste tipo de fibras há um número limitado de locais de adsorção,
ocorrendo competição entre os analitos por esses locais, que a certa altura ficam saturados.

23
Introdução,

Enquanto que a absorção é um processo não competitivo, adsorção é por definição

um processo competitivo - as moléculas "lutam" por sítios livres existentes na superfície do
sólido. Uma molécula com maior afinidade para um determinado revestimento pode
substituir uma molécula com menor afinidade. Isto significa que a quantidade de analito
extraído pela fibra pode ser afectada pela composição da matriz.
No processo de adsorção, o comportamento da concentração de equilíbrio de um
composto na fibra e a sua concentração na amostra são normalmente descritas pela
isotérmica de adsorção. A isotérmica de adsorção que descreve adequadamente a extracção
de analito em equilíbrio através das fibras PDMS-DVB e CW-DVB é a isotérmica de
Langmuir. No modelo de Langmuir, a superfície tem um número limitado de sítios de
adsorção que podem ser ocupados pelo analito. O processo de adsorção é tratado como uma
reacção entre a molécula (A) e o local vazio (5) para originar um analito adsorvido (Aad):

A+ S^Aad

As taxas de adsorção (rad) e desadsorção (rd) são as seguintes:

KJA][S] 1.2

rd=Kd[Aj 1-3

onde, [A] é a concentração do analito na matriz e /57 é a concentração de locais não

ocupados na superfície da fase sólida em mol/cm2, [Aad] é a concentração do analito na fase
sólida em mol/cm2 e Kad e Kd são constantes de equilíbrio de adsorção e desadsorção,
respectivamente.
Em condições de equilíbrio rad é igual a rd, desta forma, o processo de adsorção é
baseado em:49

l-^ad J _ "• ad _ \U j 4
[A][S] K

onde, *P é uma constante de equilíbrio.

24
 Introdução

A Figura 1.6 ilustra os processos de absorção e adsorção que ocorrem nos

revestimentos das fibras de SPME. No início, independentemente da natureza do
revestimento, as moléculas do analito ligam-se à superfície da fibra. O facto de depois
migrarem para o interior do revestimento ou continuar na superfície depende do coeficiente
de difusão do analito no revestimento. O coeficiente de difusão de moléculas orgânicas no
PDMS é próximo do coeficiente de difusão dessas mesmas moléculas em solventes
orgânicos, sendo que este tipo de revestimento extrai analitos via absorção. Por outro lado, o
coeficiente de difusão de moléculas orgânicas em divinilbenzeno e carboxen é tão pequeno
que durante a extracção por SPME as moléculas ficam essencialmente na superfície do
revestimento.

Adsorção - poros de maiores dimensões

Adsorção - poros de menores dimensões

Figura 1.6. Comparação dos mecanismos de extracção: absorção e adsorção.

25
Introdução

Sendo a adsorção um processo competitivo, a composição da matriz, tal como as

condições de extracção, afectam a quantidade de analito extraída pela fibra. Por isso existe
apenas uma estreita gama onde a resposta de extracção do analito é linear, ao contrário do
que sucede quando o processo é de absorção, em que o intervalo de concentração em que se
obtém resposta linear é muito amplo. Isto faz com que a análise quantitativa usando
revestimento sólidos de SPME seja mais difícil. A teoria de equilíbrio desenvolvida para
revestimentos de polímeros porosos (PDMS-DVB, Carbowax-DVB) foi construída tendo
em conta os efeitos causados por diferentes variáveis experimentais na quantidade de analito
extraída pela fibra. Geralmente, revestimentos de polímeros porosos funcionam bem em
matrizes relativamente limpas ou matrizes com composição constante desde que a
concentração do analito de interesse seja baixo (de outra forma, o gama de linearidade da
curva de calibração é rapidamente ultrapassada).

1.8.1.3. Termodinâmica do processo de partição/adsorção

A SPME é um processo baseado em equilíbrios simultâneos em sistemas

multifásicos. Um sistema trifásico ideal simples é o de uma fibra mergulhada numa matriz
aquosa com um headspace; sistemas reais são mais complexos pois, nem o headspace nem
a matriz são soluções ideais, os analitos podem interagir entre si, com as paredes do frasco e
eventualmente com o suporte da fibra. Os fundamentos da distribuição de massas na
extracção podem ser descritos a partir do que ocorreria num sistema ideal trifásico: antes da
extracção, no moles do analito estariam presentes, com uma concentração Co, num volume
Va da amostra; quando a extracção está completa (isto é, o equilíbrio (e) foi atingido), os no
moles distribuem-se entre as fases, isto é, na na amostra aquosa, rí\x no headspace e n / na
fibra. A conservação de massa no processo é expressa da seguinte forma: '

n0 = nea +n H +ne/ 1.5

O balanço de massa no equilíbrio pode ser dado por:

c0va=c'fvf+cya+c'hvh 1.6

26
 Introdução

onde, Co é a concentração inicial de analito na amostra; Va é o volume de amostra (matriz);

C / é a concentração de analito na fase extractora (fibra) em equilíbrio; V/é o volume de fase
extractora; C í ( é a concentração de analito na matriz em equilíbrio; Cf h é a concentração de
analito no headspace em equilíbrio e o V/, é o volume do headspace.
As constantes de distribuição fibra/matriz, Tibra/headspace e headspace/matnz são
definidas como:50'49

K
*
c:
K
c
Jh -11-e 1.7
c
-Cl
Kha
c:

Sendo que:

KJHXK^^K^ 1.8

Combinando as equações 1.6 e 1.7, após rearranjos algébricos, obtém-se a seguinte

~ 50 49
equação: '

K„.K„y
fh ha fC
f nV.
0 a j g
nV KfhKhaVf+KhaVh+Va

A equação 1.9 mostra que a quantidade extraída é proporcional à concentração

inicial de analito na amostra, ao volume da fibra (fase extractora) e à constante de
distribuição entre a fibra e a amostra. Isto é verdade quer a fibra se encontre em contacto
directo com a matriz, quer se encontre no respectivo headspace. É também verdade que se
Va » KjhKhaVf + KhaVh, a extracção é praticamente independente do volume da amostra e
do volume do headspace. Se, por outro lado, essa condição não se verificar, a quantidade
extraída dependerá daqueles parâmetros.
De uma forma mais simplificada pode-se considerar um sistema constituído por
apenas duas fases - matriz e fibra, como será o caso de um meio aquoso. Neste caso, a
quantidade de analito extraído pela fibra no equilíbrio, é dada pela equação 1.10. '49

27
Introdução,

Neste caso, se Va » KfuVf, então a quantidade de analito extraída não é dependente

do volume da amostra e a equação 10 apresenta-se da seguinte forma:

n}=KfaVfC0 1.11

Como os revestimentos usados em SPME são escolhidos de forma a terem afinidade

elevada para os compostos orgânicos a serem extraídos, os valores de Kfa para estes analitos
são elevados. No entanto, raramente são suficientemente grandes para extrair
exaustivamente o composto da matriz da amostra, razão pela qual a SPME é um método de
amostragem em equilíbrio. Através de uma calibração adequada, a SPME pode ser usada
para determinar a concentração de analitos numa amostra.51
Estritamente falando, a teoria apresentada apenas pode ser aplicada ao equilíbrio de
partição que envolve as fases poliméricas líquidas tal como a de PDMS. No caso de
revestimentos sólidos a teoria aplicada é análoga à apresentada quando estamos na presença
de concentrações de analito baixas, de forma a que área total da superfície disponível para
adsorção seja proporcional ao volume de revestimento se se assumir uma porosidade
constante. Para concentrações elevadas de analito, ocorre saturação do revestimento
resultando numa isotérmica não linear, tal como discutido em 1.8.1.2.
A quantidade de analito presente na fibra em equilíbrio é dado por:

nef=Cyf^KadC°VaVf{Cfma" C f)
' 1.12
f s s
va+Kudvf(cfmM-q.)

onde, Cftnox é a concentração máxima de sítios activos existentes no revestimento e C / é a

concentração de analito na fibra, em equilíbrio. A constante de equilíbrio de adsorção do
analito é representada por Kaci e Co é a concentração inicial do analito na amostra. A equação
1.12 é idêntica à equação 1.10, onde a extracção era feita por absorção. A principal
diferença é a presença na equação 1.12, do termo (C/ max ~ Cf) no numerador e no
denominador. Deve também ser notado que na equação 1.12, o Kad é muito diferente do Kfa
existente na equação 1.10. O K/a é um coeficiente de partição enquanto que o Kad é uma
constante de equilíbrio de adsorção. Para concentrações de analito na fibra muito baixas,

28
 Introdução

isto é quando a concentração de analito na fibra é desprezável comparado com o número de

sítios activos totais, pode-se dizer que Cfmax » C / e que a dependência com a concentração
na amostra é linear.
Na prática é muito raro que apenas um analito da amostra tenha afinidade para a
fibra, e sendo o processo de adsorção um processo competitivo, a presença de um outro
composto B irá afectar a quantidade de analito A extraída pela fibra. A concentração em
equilíbrio do analito A na fibra, na presença de um composto competitivo B, é dada pela
seguinte equação:

A
= W« ^— 113
)A
I+KAC:A+KBC:B

onde, KadA e KadB são as constantes de equilíbrio da adsorção para os compostos A e B

respectivamente, e Ç?aA e CUB são as concentrações de A e B na amostra, em equilíbrio. A
equação 1.13 pode ser rearranjada para dar a quantidade extraída, em equilíbrio, pela fibra:50

nefA=c;Avf= c
XV/^(C/ro c;A) ^
iA fA J
(i + KBc:B)va+KAvf(cfm^-qB)

A quantidade de analito A extraída, em equilíbrio, na presença do composto

competitivo B, deverá ser menor do que a quantidade de analito A extraída num situação em
que não existe o composto competitivo. No entanto, se o composto interferente está presente
em concentrações muito baixas, ou tem pouca afinidade para com o revestimento da fibra, a
diferença de quantidade de analito A extraída, em amostras com e sem o composto
interferente B, é muito pequena.
A presença do composto B pode também ter impacto na resposta linear da curva de
calibração. Na realidade, quando o composto B é adsorvido na superfície do revestimento da
fibra, reduzem-se o número de sítios disponíveis para que ocorra adsorção de A. Isto
significa que Cfmax é baixa para A e a não-linearidade para A acontece a partir de
concentrações mais baixas, quando comparado com situações onde não existem
interferentes.

29
Introdução,

1.8.1.4. Cinética

Considerando que uma amostra líquida ou gasosa é agitada perfeitamente, ou seja, a

amostra move-se muito rapidamente em volta da fibra, então todo o analito presente na
amostra tem acesso ao revestimento da fibra. Neste caso, o tempo de equilíbrio, te> definido
como o tempo requerido para extrair 95% da quantidade de analito em equilíbrio, é dado
pela seguinte equação:

/ »/ =2(r»^)2 115

A equação 1.15, expressa o tempo para atingir o equilíbrio, te, em função da

espessura do revestimento (dado pela diferença do raio externo, r0, e raio interno do
revestimento, ri) e do coeficiente de difusão do analito nessa camada (D/).
No entanto, a equação 1.15 precisa ser avaliada com cautela. Por exemplo, quando
nela são substituídos os parâmetros para a fibra de PDMS, com 56 um de espessura de
revestimento e um analito como benzeno, de D/ = 2,8xl0~6 cm/s, é previsto que t95% seja
cerca de 20 segundos52. Na prática este valor só é aproximado quando a extracção do
benzeno é feita de uma matriz gasosa.53 Verificou-se que,52 em extracções de matrizes
aquosas (1 ppm de benzeno em água), o tempo necessário ao trânsito de analito pela matriz
até atingir a superfície da fibra (te) é de 200 segundos ou mais, dependendo da agitação a
que a matriz está sujeita.
A Figura 1.7 mostra cinco perfis de extracção (as curvas representam a fracção
extraída em função do tempo de extracção), do benzeno com fibra PDMS. A curva A é
teórica e representa o comportamento segundo a equação 1.15, as restantes curvas são
experimentais, com vários níveis de agitação da matriz aquosa (curvas B, C, D) e sem
agitação (curva E). De facto, ao comparar as curvas experimentais nota-se que o te diminui
com o aumento da agitação da matriz, porque este procedimento facilita o contacto do
analito com a fibra. No entanto, mesmo existindo agitação o te é substancialmente maior do
que o previsto pela equação 1.15. Isto ocorre porque apesar da agitação, a superfície da fibra
fica em contacto com uma camada estática da matriz, com uma determinada espessura, onde
não existe agitação. Ao contrário do que ocorre na região agitada, na camada estática a
transferência de massa ocorre exclusivamente por difusão e, portanto, é mais lenta.

30
 Introdução

Figura 1.7. Perfis de extracção, usando uma fibra PDMS, de 1 ppm de benzeno em água (A) segundo o
teoricamente esperado e sob quatro condições de agitação: (B) 100% de agitação magnética; (C) 75% de
agitação magnética; (D) 50% de agitação magnética e (E) sem agitação.

Na realidade a equação 1.15 representa um modelo de agitação perfeita onde todo o

analito tem acesso ao revestimento da fibra. No entanto, num modelo mais realista não é
isso que acontece. Para descrever melhor o que acontece na realidade, te deverá ser dado
, ~ 48,54
pela equação:

. . **(/b-r,)2
? Ó 1 1 6
K ~ 95% -

em que, õ corresponde à espessura de uma camada fronteira hipotética sem agitação e Du

corresponde ao coeficiente de difusão do analito na amostra. Desta relação, verifica-se que o
tempo de extracção aumenta com um elevado Kfa, com uma maior espessura do
revestimento (r0 - r,) e com menor coeficiente de difusão do analito na amostra.
Por outro lado, uma agitação mais eficaz irá diminuir o tempo de extracção
(diminuição do factor S na equação 1.16) por redução da fronteira hipotética sem agitação
presente junto à fibra em amostras líquidas.
Para amostras gasosas, no entanto, a agitação deixa de ser um procedimento
necessário, uma vez que a convecção natural do ar é suficiente para facilitar um equilíbrio
relativamente rápido.44

31
Introdução,

No que se refere à extracção em headspace, a relação dada pela equação 1.16 é

apenas válida se o sistema estiver sob uma agitação perfeita, no entanto, se isso não
acontecer é necessário ter em conta algumas variáveis adicionais, segundo a equação:

í„ ~ *qs% I)" '

Kh0-(Dh+2xW-5NRb2) l,6-(Da+0,03NRb2[ Kf Lf
" 1.17

onde, L/, Lh e La, designam respectivamente as espessuras do revestimento, do headspace e

da fase aquosa, N designa a velocidade de revolução da barra magnética, Rb o raio de
revolução da barra magnética e £>/, corresponde ao coeficiente de difusão do analito no
headspace.
É de realçar que, num método quantitativo, a condição de equilíbrio não é um pre-
requisite, ou seja, é possível definir um tempo de extracção inferior ao tempo necessário
para se estabelecer o equilíbrio (mantendo o tempo de extracção constante para um conjunto
de experiências relacionadas) obtendo-se igualmente uma relação linear entre a
concentração do analito e a quantidade extraída.

1.8.1.5. A escolha da fibra

A escolha do tipo de fibra a usar dependerá da estrutura química dos compostos que
se pretende analisar. Geralmente, os compostos voláteis requerem revestimentos espessos,
enquanto que revestimentos com menos espessura são mais eficientes para analitos semi-
voláteis.55 Na Tabela 1.4 são apresentadas as características da fibras de SPME
comercializadas.
Durante o presente trabalho foram usadas duas fibras de SPME, uma de PDMS e
uma de PDMS-DVB. As fibras com revestimento de PDMS encontram-se disponíveis em
três espessuras 7 pm, 30 pm e 100 pm e possuem um revestimento líquido capaz de
suportar elevadas temperaturas (cerca dos 300°C). É uma fibra apolar adequado para
analitos apoiares56'57 podendo, no entanto, também ser utilizada para extrair compostos
polares se forem optimizadas as condições de extracção, tais como pH, concentração de sais
e temperatura.

32
 Introdução

Tabela 1.4. Revestimentos de SPME comercializados: modo de uso, algumas

57
propriedades e aplicações.
Revestimento Espessura do Uso Temperatura
da fibra filme recomendado máxima do Aplicações
(Mm) injector (GC)

100 GC, HPLC 280 °C Compostos orgânicos

apoiares tais como
COVs, PAHs,
PDMS 30 GC, HPLC 280 °C benzeno/tolueno/
etilbenzeno/xileno,
pesticidas
GC, HPLC 340 °C

Compostos orgânicos
PA 85 GC, HPLC 320 °C polares tais como
triazinas, pesticidas,
organofosforaodos e
fenóis

65 GC, HPLC 270 °C

Hidrocarbonetos
PDMS-DVB aromáticos, aminas
aromáticas, COVs
60 GC 270 °C

Carboxen-PDMS 75 GC 320 °C COVs, hidrocarbonetos

Compostos orgânicos
CW-PDMS 65 GC 260 °C polares tais como
álcoois, cetonas

Tensoactivos
CW-TR 50 HPLC aniónicos, aminas
aromáticas

PDMS = Polidimetilsiloxano; PA = Poliacrilato; DVB = Divinilbenzeno; CW = Carbowax; TR = templated

resin.

As fibras de PDMS-DVB dispõem de um polímero poroso de divinilbenzeno ligado

a um polímero líquido de polidimetilsiloxano. Este tipo de fibra é maioritariamente
mesoporosa, com alguns macroporos e microporos. As fibras de PDMS-DVB retêm melhor
os analitos de pequenas dimensões do que a fibra que contem apenas PDMS. A combinação

33
Introdução.

dos dois revestimentos tem melhor afinidade para analitos polares." Revestimentos
poliméricos com partículas porosas incorporadas, como é caso da PDMS-DVB, apresentam
a desvantagem de possuírem uma menor estabilidade mecânica relativamente às fibras com
revestimentos poliméricos homogéneos, apresentando contudo, uma selectividade mais
elevada. Os analitos são fisicamente retidos nos poros da fibra, ocorrendo uma forte adesão
dos analitos que se encaixam adequadamente nos seus poros, tornando estas fibras
aplicáveis em análises de nível vestigial.

1.8.1.6. Aplicação de SPME à análise de tabaco

A SPME foi anteriormente utilizada59 na quantificação de alcalóides (nicotina,

nornicotina, miosmina, anabasina) em extractos aquosos de tabaco. Para tal, as amostras de
tabaco foram extraídas com 1% de NH4OH em água. A fibra de SPME (revestimento de
PDMS) foi exposta directamente em contacto com o extracto de tabaco durante 12 minutos
e depois no injector de um GC durante 60 segundos. Foi provado que expondo a fibra
directamente no extracto aquoso de tabaco, às condições ambiente, se obtinha uma boa
sensibilidade e precisão. No entanto foram apresentadas duas desvantagens: efeito de matriz
e envelhecimento precoce da fibra. O uso de um padrão interno (2,4-dipiridil) para
compensar estes efeitos é limitado pelas diferenças de natureza química entre o padrão
interno e cada um dos alcalóides.
Num outro trabalho60 foram optimizados parâmetros experimentais para a
determinação de compostos voláteis numa grande variedade de amostras de tabaco usando
SPME/GC-MS. A atenção foi focada no ajuste da temperatura da amostra, humidade e pH
durante o processo de extracção no headspace. A temperatura foi ajustada para abranger
compostos com uma grande gama de volatilidades enquanto o pH da mistura foi optimizado
para facilitar a amostragem de certas classes de compostos, baseado na acidez ou natureza
iónica dos analitos. Foram utilizados dois tipos de fases de SPME, PDMS e carbowax. Os
autores concluíram que à temperatura de 100°C, SPME pode, de uma forma efectiva,
absorver hidrocarbonetos na gama C15 - C20, não sendo tão efectiva a adsorção de
hidrocarbonetos mais voláteis (Cg - C14). A temperatura ambiente, os resultados da
amostragem foram opostos, com melhor adsorção para hidrocarbonetos mais voláteis. Para
adsorção de hidrocarbonetos na gama alargada de Cg a C20, foi testada uma rampa de
arrefecimento da temperatura. Os resultados mostraram que a amostragem por SPME de

34
 Introdução

hidrocarbonetos usando uma rampa de temperaturas entre 100 e 25°C foi quantitativamente
similar com a obtida com injecção líquida da amostra no cromatógrafo. Para avaliar a
amostragem com SPME, usando uma rampa de temperaturas, na colheita de compostos
voláteis do tabaco, foram estudadas duas situações: temperatura constante a 100°C e rampa
de temperatura entre os 100°C e os 25°C. Foram obtidos resultados similares aos anteriores.
A volatilidade de compostos iónicos, tal como a nicotina, é muito dependente do pH.
A nicotina é muito solúvel em soluções aquosas, logo, ao adicionar água a amostras de
tabaco a nicotina existente na fase de vapor é reduzida, sendo assim desfavorável para
amostragem no headspace por SPME. Yang et ai, verificaram que uma maior adsorção de
nicotina se conseguia adicionando uma solução básica às amostras de tabaco. Pelo contrário,
a adição de uma solução ácida convertia a nicotina em iões protonados, levando a uma
diminuição da nicotina absorvida. Nesse estudo60 verificou-se que a fibra mais polar de
CW-DVB adsorvia melhor os compostos mais voláteis, a maioria deles compostos com odor
que eram eluidos em primeiro lugar em GC. Verificaram também que as fibras CW-DVB
eram apropriadas para a análise de ácidos orgânicos. A fibra apolar PDMS-DVB mostrou
ser mais selectiva e sensível que a CW-DVB para compostos orgânicos neutros, tais como
os hidrocarbonetos. Os mesmos autores60 estudaram também a variabilidade entre fibras.
Para isso analisaram tabaco de uma mesma marca usando 5 fibras diferentes de CW-DVB e
verificam que de fibra para fibra ocorria uma variação superior a 20%. No entanto, réplicas
usando uma mesma fibra geram resultados reprodutíveis.
Existem outros estudos que relatam o uso de SPME via headspace seguindo-se
análise via GC-MS, para análise de compostos do tabaco. Um estudo61 onde foram
realizadas análises SPME (headspace)ZGC-MS a três amostras, constituídas cada uma delas
por uma mistura de duas variedades de tabaco, mostrou que a técnica permitia de uma forma
rápida e sensível, identificar qual a variedade de tabaco que constituía cada amostra,
comparando os analitos que constituíam cada amostra. As amostras de misturas de tabaco (1
g) eram colocados num vial onde era adicionado 3 ml de KC1 3M, sendo a amostra
posteriormente aquecida a 95°C para que ocorresse a extracção. Diferentes compostos
presentes no tabaco eram detectados, sendo os mais significativos a nicotina, o neofitadieno,
a geranilacetona e o 6-metil-5-hepten-2-ona.
Clark e Bunch62 usaram SPME/GC-MS para análise qualitativa e quantitativa de
ingredientes adicionados ao tabaco. Foram quantificados mentol, anetol, benzaldeído e
tetrametilpirazina. Para isso, removeram 1 g de tabaco de cigarros de referência e colocaram
num vial, onde adicionaram 2 uL de uma solução 2,6-diclorotolueno em etanol (1 ug/uL) e

35
Introdução.

1 uL da mistura de ingredientes que pretendiam quantificar (1 ug/uL de cada um dos

compostos, em etanol). As amostras ficaram a equilibrar durante 2 horas à temperatura
ambiente antes de serem analisadas. Uma vez que os ingredientes adicionados ao tabaco
estavam, na sua maioria, em concentrações baixas, a fibra de SPME teria de ser a de maior
sensibilidade para estes compostos. Como os ingredientes adicionados ao tabaco são na sua
maioria compostos ligeiramente polares, são retidos por fibras mais polares dando origem a
sinais com elevada intensidade, sendo que ao mesmo tempo as interferências sentidas por
compostos voláteis apoiares são menores. As fibras de poliacrilato foram as que mostraram
reter melhor os compostos estudados.62 A fibra de PDMS-DVB foi a segunda fibra com
melhor poder de retenção dos referidos compostos, no entanto, esta fibra mostrou ter
também uma elevada afinidade para hidrocarbonetos. Neste último caso, foi notório um
elevado efeito de matriz que dificultou a detecção dos ingredientes adicionados ao tabaco. A
fibra CW - DVB mostrou ser a fibra que permitiu identificar mais facilmente os compostos
pretendidos, havendo poucas interferências da matriz do tabaco.

1.8.2. Tubos com adsorvente63

Os adsorventes que têm sido usados, acondicionados em tubos de aço, para recolher
COVs de fluxos gasosos (usando bombas de sucção) dividem-se em duas categorias:
adsorventes à base de carbono e resinas poliméricas orgânicas. O Tenax TA (resina
polimérica porosa baseada no óxido de 2,6-difenileno) é o adsorvente mais utilizado em
estudos de COVs em ambientes interiores, pois tem uma estabilidade térmica relativamente
elevada, capacidade para reter um largo intervalo de classes de compostos e uma baixa
afinidade para a água. Além disso, permite níveis muito baixos de COVs nos brancos. O
Tenax TA é o mais aconselhado para recolher compostos orgânicos apoiares com pontos de
ebulição entre 60 - 250°C, sendo adequado para recolher hidrocarbonetos alifáticos de CÓ a
Ci8, compostos aromáticos, terpenos, aldeídos, cetonas, hidrocarbonetos clorados, álcoois e
ésteres. Também pode ser utilizado na recolha de compostos com ponto de ebulição
superiores a 250°C desde que possam ser eficientemente desadsorvidos.
Contudo, o Tenax TA não é adequado para COMVs. O seu intervalo de aplicação
pode, no entanto, ser estendido aos compostos C3 - C5, desde que se proceda ao
arrefecimento do tubo com adsorvente durante o período de recolha.
Como nenhum dos adsorventes disponíveis actualmente permite recolher e
desadsorver termicamente todos os COVs e COMVs haverá necessidade de combinar

36
 Introdução

adequadamente vários adsorventes que permitam essa recolha. Multiadsorventes típicos são
constituídos por 2 ou 3 camadas sequenciais de adsorventes do tipo Tenax, Carbotrap e
Carbosieve acondicionados em tubos de aço. O adsorvente com menor estabilidade térmica
determina a temperatura máxima de desadsorção e o limite superior do intervalo dos pontos
de ebulição dos compostos que podem ser detectados.
Outros aspectos muito importantes associados aos tubos com adsorventes são o valor
do branco, contaminações devido a reacções químicas que ocorrem no próprio material
adsorvente durante a amostragem ou armazenagem (artefactos), e o volume de amostragem.

1.8.2.1. Valores do Branco

Um aspecto importante a ter em consideração num adsorvente é o valor do branco

que idealmente deveria ser zero. Quanto mais baixo o valor do branco, mais sensível será a
determinação. Muitos dos adsorventes podem ser limpos e acondicionados por meio de um
aquecimento de várias horas num fluxo de um gás puro e inerte, usando temperaturas
ligeiramente superiores às usadas na desadsorção da amostra. Para alguns adsorventes a
limpeza térmica não é eficiente, e é necessária uma extracção por solvente (extracção-
Soxhlet) para reduzir o sinal de fundo até um nível aceitável. Mesmo após a limpeza e
acondicionamento os adsorventes podem continuar a apresentar diferentes quantidades de
contaminantes que são emitidos pelos próprios adsorventes devido a degradação ou
derivados dos reagentes usados na produção dos polímeros.

1.8.2.2. Volume de amostragem seguro

O volume de amostragem seguro (VAS, do inglês: safe sampling volume, SSV) é a

quantidade de gás que pode ser recolhida com a probabilidade de não se exceder a
capacidade de adsorção do adsorvente relativamente aos COVs. É uma variável que tem que
ser considerada com base nas condições de amostragem e nos compostos a serem
detectados. O VAS para um único COV é geralmente 50% do volume de ar contendo o
composto que pode passar através do tubo adsorvente sem que a concentração de vapor do
composto à saída atinja 5% da concentração à entrada.18 Quando se recolhem misturas de
COVs, o VAS é determinado pelo composto que apresenta o menor volume de saturação
(VS).

M
lntrodução_

O VS depende das características químicas e físicas quer do composto quer do

adsorvente. A adsorção de um COV da fase gasosa na superfície de um material adsorvente
é influenciado pela temperatura, velocidade do gás através do tubo de amostragem, pressão
parcial do composto, concentração do composto na fase gasosa e a concentração de COVs
total da fase gasosa. O aumento da temperatura e da humidade do carvão e dos polímeros
provoca uma diminuição do VS (citado por 18). Um aumento 25°C para 40 °C originou uma
diminuição do VS num factor de 2 aproximadamente. A regra geral é que um aumento de
10°C na temperatura diminui o VS em 50%.18 O fluxo de amostragem será também uma
variável importante pois o número de pratos teóricos do tubo adsorvente varia com o fluxo.
Fluxos muito altos podem prejudicar o poder de adsorção, mas também se deve evitar usar
fluxos muito baixos pois, para além de originarem um número muito baixo de pratos
teóricos, pode ocorrer amostragem passiva conjuntamente com a amostragem activa. Para o
Tenax TA recomendam-se fluxos de amostragem no intervalo 50 - 200 ml/min.
De acordo com o conhecimento actual, o volume máximo de ar recomendado a
recolher em Tenax TA é de 5 dm3 (valor estabelecido tendo em conta os dados de VAS para
tubos com 200mg de tenax TA).

1.8.2.3. Armazenamento de amostras recolhidas63

O efeito de armazenamento nas amostras recolhidas parece ser praticamente

impossível de prever. Para evitar modificações das amostras, estas devem ser guardadas a
temperaturas reduzidas (no frigorífico) e analisadas assim que for possível. De Bortoli et ai.
(citado por 18) verificaram que a concentração de n-nonano era superior em tubos de Tenax
guardados à temperatura ambiente durante 50 dias à obtida em tubos analisados
imediatamente após recolha da amostra. Tendo efectuado a armazenagem à temperatura de -
15°C já não verificaram um aumento significativo da concentração. Nas duas situações
ocorreu um decréscimo da concentração de 1-butanol. A causa poderá ter sido a adsorção
irreversível do adsorvente durante a armazenagem ou desadsorção durante esse período.
Existem também relatos de perdas de a-pineno em tubos de Tenax armazenados à
temperatura ambiente.

38
 Introdução

1.9. Breve descrição da cromatografia gasosa com detector

por espectrometria de massa (GC-MS)
Em cromatografia gasosa (GC) os componentes de uma mistura gasosa são
transportados por uma fase móvel gasosa (um gás de arraste, normalmente hélio ou azoto)
através de uma coluna que contém uma fase estacionária (sólida ou um filme líquido
adsorvido sobre uma fase sólida). A separação baseia-se na diferente afinidade dos analitos
para a fase estacionária. A amostra pode ser introduzida na coluna através de um injector,
na forma gasosa ou na fase líquida. Neste último caso será vaporizada no injector. A
injecção pode ser feita sem repartição {splitless) ou com repartição {split) permitindo assim
a transferência total ou apenas parcial da amostra para a coluna, o que funciona como uma
diluição da amostra. Os componentes básicos de um cromatógrafo gasoso encontram-se
esquematizados na Figura 1.8, sendo de destacar os blocos do injector, do forno (onde se
localiza a coluna de separação) e do detector.

Medidor
de fluxo N»

Bloco do
JJ detector
s:
Regulador D h/is or ,.- injector
de pressão fluxo

Controlador coluna

\
de fluxo
HEL
Botija de fase forno
móvel gasosa

Figura 1.8. Esquema de um cromatógrafo gasoso.'

A detecção por espectrometria de massa (MS) associada a GC permite a

identificação e determinação quantitativa de um número muito elevado e diversificado de
compostos voláteis e semi-voláteis. Num espectrómetro de massa (Figura 1.9), as amostras
constituídas por moléculas gasosas são convertidas em iões de maneira a poderem ser
separados no analisador de massas.

39
lntrodução_

Câmara de ionização
Recolha
r—T r
Armazenamento
Analisador de massas
Tratamento de dados

Amostra /1
->K—
m
or
-j1
y

Detector \ 4,- [

J Amplificador

66
Figura 1.9. Representação esquemática do funcionamento de um detector de massa

Não existe um único método de ionização para todas as amostras, uma vez que a
energia requerida difere de molécula para molécula. Assim, vários métodos de ionização são
utilizados, sendo os mais comuns a ionização por impacto electrónico e a ionização
química.64 Existem também vários métodos para efectuar a separação dos iões, sendo os
espectrómetros de massa classificados de acordo com o método: espectrómetros de massa
de quadrupolo, espectrómetros de massa de sector magnético, e espectrómetros de
armadilha de iões (do inglês, Ion Trap).
Durante o bombardeamento electrónico numa câmara de ionização, uma amostra no
estado gasoso e a muito baixa pressão (em vácuo) é bombardeada com electrões de energia
suficiente para exceder a primeira energia de ionização dos compostos em estudo. Depois da
molécula ter sido bombardeada por um electrão acelerado, pode ser convertida num ou mais
iões positivos ou numa molécula num estado excitado. Se o electrão de bombardeamento
possuir energia suficiente, a molécula pode partir-se em vários fragmentos iónicos. Os
fragmentos mais estáveis estão presentes em maiores quantidades e serão os responsáveis
pelos picos mais intensos do espectro. À medida que iões, radicais e outros fragmentos se
formam, passam por pratos aceleradores (eléctrodos) que aceleram as partículas carregadas
positivamente e por filtros que seleccionam apenas os catiões que se deslocam num
determinado sentido. As partículas neutras e as carregadas negativamente não são
aceleradas e são continuamente removidas pela bomba de vácuo.

40
 Introdução

Um espectrómetro de massa quadrupolo, é constituído por quatro barras cilíndricas,

interligados duas a duas, sendo um analisador de massa de natureza electrostática que só
permite a passagem, a cada instante, de iões de uma determinada relação massa/carga. Iões
ressonantes têm uma relação massa/carga que permite que, num determinado instante, não
sejam atraídos por nenhum dos pólos do quadrupolo, passando assim pelo fdtro e atingindo
o detector. Um espectrómetro de armadilha de iões é constituído por um eléctrodo em forma
de anel a separar dois eléctrodos hemisfércos que capturam e armazenam os iões e que
posteriormente, por aplicação de diferentes voltagens, expulsão os iões da trap que são
depois encaminhados para o detector.
Nos espectrómetros de massa de sector magnético, as partículas carregadas
positivamente (preferencialmente de carga +1) passam para um tubo analisador onde são
submetidas a um campo magnético passando a executar um percurso curvo. O raio de
curvatura depende da velocidade da partícula que por sua vez depende da intensidade do
campo, da voltagem aceleradora e da massa da partícula. Para a mesma intensidade do
campo e voltagem aceleradora, as partículas de maior massa têm maior raio de curvatura
(menor deflexão por acção do campo magnético). Por esta técnica, partículas de razão
massa/carga diferentes atingem o detector em pontos diferentes, constituindo um espectro
de massa.66
As moléculas que não absorvem energia suficiente para fragmentar, perdem apenas
um electrão, formando iões-radicais positivos com a mesma massa nominal da molécula
neutra. Estes iões são os chamados iões moleculares e contém informação sobre a massa
molecular. Para uma substância pura, o ião de massa mais elevada corresponde ao ião
molecular; os restantes iões correspondem aos fragmentos que resultam deste por quebra de
ligações. ' O padrão de fragmentação obtido pode ser interpretado de acordo com um
conjunto de regras de modo a permitir a reconstrução da molécula com base na sua
estrutura. Os espectros de massa são reprodutíveis e específicos para a grande maioria de
compostos orgânicos. Este facto permite o estabelecimento de bases de dados digitalizadas
para comparação espectral e identificação. Um espectro de massa é uma representação
gráfica da abundância (porções relativas dos diferentes fragmentos carregados
positivamente) em função da razão massa/carga (m/z) dos fragmentos correspondentes.66 Os
dados do espectrómetro de massa podem ser obtidos de duas formas: por varrimento
contínuo (SCAN, na literatura internacional) e por monitorização de ião seleccionado (MIS,
ou SEVI em inglês). No primeiro caso obtêm-se um traçado de corrente iónica total (TCIT,
ou TIC em inglês), que corresponde a um cromatograma com diversos picos,

41
lntrodução_

correspondendo a cada pico um espectro de massa. Na técnica MIS não são obtidos
espectros de massa. O espectrómetro é sintonizado para medir a corrente iónica
correspondente a apenas um ou vários iões pré-determinados, o que resulta num aumento de
sensibilidade. O traçado MIS tem um aspecto idêntico de um cromatograma de massa, mas
a sua sensibilidade é muito mais elevada, contudo não conduz à identificação segura do
composto.

42
 Introdução

Bibliografia

1. Sociedade Beneficente Israelita Brasileira Hospital Albert Einstein (SB1BHAE)

História do Tabaco, http://72.21.62.210/alcooledrogas/drogas historia tabaco.htm
(01/03/2007)

2. World Health Organization. 10 Facts on the Tobacco Epidemic and Global Tobacco
Control.
http://www.who.int/features/factfiles/tobacco epidemic/tobacco epidemic facts/en/in
dex.html (01/02/2007)

3. Fundação Portuguesa de Cardiologia, Algumas reflexões sobre o tabaco.

http://cardiologia.browser.pt/PrimeiraPagina.aspx7ID Conteudo=21 (31/06/2007)

4. Fundação Portuguesa de Cardiologia, Tabagismo.

http://www.fpcardiologia.pt/factor4.htm (31/05/2007)

5. Tonnessen, P.; Vermeire, P. A., Promoting a future without tobacco: also a continuing
task for respiratory medicine in Europe. European Respiratory Journal 2000, 16,
1031-1034.

6. Akpan, V.; Huang, S.; Lodovic, M.; Dolara, P., High levels of carcinogenic polycyclic
aromatic hydrocarbons (PAH) in 20 brands of Chinese cigarettes. Journal of Applied
Toxicology 2006, 26, (6), 480-483.

7. Mizoue, T.; Tokui, N.; Nishisaka, K.; Nishisaka, S.-i.; Ogimoto, I.; Ikeda, M.;
Yoshimura, T., Prospective study on the relation of cigarette smoking with cancer of
the liver and stomach in an endemic region. International Journal of Epidemilogy
2000, 29, (2), 232-237.

8. Universidade Nova de Lisboa - Faculdade de Ciências e Tecnologia: Apresentação da

Nicotina, http://www.geocities.com/qpn nicotina/ (04/10/2005)

9. Smith, C. J.; Perfetti, T. A.; Rumple, M. A.; Rodgman, A.; Doolittle, D. J., "IARC
Group 2B carcinogens" reported in cigarette mainstream smoke. Food and Chemical
Toxicology 2001, 39, (2), 183-205.

10. Hoffmann, D. Analysis of toxic smoke constituints; US consumer product safety

commission and US department of health and human services, Toxicity Testing Plan:
New York, 1993.

11. Chepiga, T. A.; Morton, M. J.; Murphy, P. A.; Avalos, J. T.; Bombick, B. R.;
Doolittle, D. J.; Borgerding, M. F.; Swauger, J. E., A comparison of the mainstream
smoke chemistry and mutagenicity of a representative sample of the US cigarette

43
Introdução.

market with two Kentucky reference cigarettes (K1R4F and K1R5F). Food and
Chemical Toxicology 2000, 38, (10), 949-962.

12. Baker, R.; Proctor, C, Where there's smoke. Chemistry in Britain January, 2001, pp
38-41.

13. Baker, R. R.; Bishop, L. J., The pyrolysis of tobacco ingredients. Journal of Analytical
and Applied Pyrolysis 2004, 71, ( 1 ), 223-311.

14. Geiss, O.; Kotzias, D. Tobacco, cigarettes and cigarette smoke - an overview; EUR
22783 EN; European Commission, Institute for Health and Consumer Protection:
Luxemburgo, 2007.

15. Proctor, C ; Martin, C ; Beven, J.; Dymond, H., Evaluation of an apparatus designed
for the collectio of sidestream tobacco smoke. Analyst 1988, 113, (10), 1509-1513.

16. Sloan, C. J.; Morie, G. P., Determination of ammonia in tobacco and tobacco smoke
with an ammonia electrode. Analytica Chimica Acta 1974, 69, 243-247.

17. Counts, M. E.; Morton, M. J.; Laffoon, S. W.; Cox, R. H.; Lipowicz, P. J., Smoke
composition and predicting relationships for international commercial cigarettes
smoked with three machine-smoking conditions. Regulatory Toxicology and
Pharmacology 2005, 41, (3), 185-227.

18. Tirkkonen, T.; Mroueh, U. M.; Orko, I. Tenax as a collection medium, for volatile
organic compounds; 06:E; NKB Committee and Work reports: Helsínquia, 1995.

19. Hoffmann, D.; Hoffman, I., The changing cigarette: chemical studies and bioassays. In
Smoking and Tobacco Control Monographs no.13, 2001.

20. Smith, C. J.; Perfetti, T. A.; Rumple, M. A.; Rodgman, A.; Doolittle, D. J., "IARC
group 2A carcinogens" reported in cigarette mainstream smoke. Food and Chemical
Toxicology 2000, 38, (4), 371-383.

21. Baker, R. R.; Massey, E. D.; Smith, G., An overview of the effects of tobacco
ingredients on smoke chemistry and toxicity. Food and Chemical Toxicology 2004,
42, (Supplement 1),53-83.

22. Carmines, E. L., Evaluation of the potential effects of ingredients added to cigarettes.
Part 1: cigarette design, testing approach, and review of results. Food and Chemical
Toxicology 2002, 40, (1), 77-91.

23. Rustemeier, K.; Stabbert, R.; Haussmann, H. J.; Roemer, E.; Carmines, E. L.,
Evaluation of the potential effects of ingredients added to cigarettes. Part 2: Chemical
composition of mainstream smoke. Food and Chemical Toxicology 2002, 40, (1), 93-
104.

44
 Introdução

24. Roemer, E.; Tewes, F. J.; Meisgen, T. J.; Veltel, D. J.; Carmines, E. L., Evaluation of
the potential effects of ingredients added to cigarettes. Part 3: In vitro genotoxicity and
cytotoxicity. Food and Chemical Toxicology 2002, 40, (1),105-111.

25. Schmeltz, I.; Wenger, A.; Hoffmann, D.; Tso, T. C , Chemical studies on tobacco
smoke. On the fate of nicotine during pyrolysis and in a burning cigaret. Journal of
Agriculture and Food Chemistry 1979, 27, (3), 602-608.

26. Darrall, K. G.; Figgins, J. A.; Brown, R. D.; Phillips, G. F., Determination of benzene
and associated volatile compounds in mainstream cigarette smoke. Analyst 1998, 123,
1095-1101.

27. Stevens, N. A.; Borgerding, M. F., GC-AED studies of nicotine fate in a burning
cigarette. Analytical Chemistry 1999, 71, 2179-2185.

28. Radovanovic, B. S.; Misic, Z., Gas chromatographic analysis of some toxic organic
compounds in mainstream cigarette smoke. The scientific journal Facta Universitatis
1999, 1,59.

29. Li, S.; Olegário, R. ML; Banyasz, J. L.; Shafer, K. H., Gas chromatography-mass
spectrometry analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in single puff of cigarette
smoke. Journal of Analytical and Applied Pyrolysis 2003, 66, (1-2), 155-163.

30. Gmeiner, G.; Stehlik, G.; Tausch, H., Determination of seventeen polycyclic aromatic
hydrocarbons in tobacco smoke condensate. Journal of Chromatography A 1997, 767,
(1-2), 163-169.

31. Lodovici, ML; Luceri, C ; Guglielmi, F.; Bacci, C ; Akpan, V.; Fonnesu, M. L.; Boddi,
V.; Dolara, P., Benzo(a)pyrene diolepoxide (BPDE)-DNA adduct levels in leukocytes
of smokers in relation to polymorphism of CYP1A1, GSTM1, GSTP1, GSTT1, and
mEH. Cancer Epidemiology Biomarkers & Preventionn 2004, 13, 1342-1348.

32. Wang, T. L.; Tong, H. W.; Yan, X. Y.; Sheng, L. Q.; Yang, J.; Liu, S. M.,
Determination of volatile carbonyl compounds in cigarette smoke by LC-DAD.
Chromatographia 2005, 62, 631-636.

33. Houlgate, P. R.; Dhingra, S.; Nash, S. J.; Evans, W. H., Determination of
formaldehyde and acetaldehyde in mainstream cigarette smoke by high-performance
liquid chromatography. Analyst 1989, 114, 355-360.

34. Miyaké, T.; Shibamoto, T., Quantitative analysis by gas chromatography of volatile
carbonyl compounds in cigarette smoke. Journal of Chromatography A 1995, 693, (2),
376-381.

35. Brunnemann, K. D.; Kagan, M. R.; Cox, J. E.; Hoffmann, D., Analysis of 1,3-
butadiene and other selected gas-phase components in cigarette mainstream and

45
lntrodução_

sidestream smoke by gas chromatography-mass selective detection. Carcinogenesis

1990,11,(10),1863-1868.

36. Byrd, G. D.; Fowler, K. W.; Hicks, R. D.; Lovette, M. E.; Borgerding, M. F., Isotope
dilution gas chromatography-mass spectrometry in the determination of benzene,
toluene, styrene, and acrylonitrile in mainstream cigarette smoke. Journal of
Chromatography A 1990., 503, 359-368.

37. Tobacco Reporting Regulations. Official methods for collection of emission data on
mainstream smoke. In Canada Government Tobacco Act: Registration June 26, 2000;
Vol. SOR/2000-273.

38. Counts, M. E.; Hsu, F. S.; Laffoon, S. W.; Dwyer, R. W.; Cox, R. H., Mainstream
smoke constituent yields and predicting relationships from a worldwide market
sample of cigarette brands: ISO smoking conditions. Regulatory Toxicology and
Pharmacology 2004, 39, (2), 111-134.

39. Federal Trade Commission (FTC), Comunicado à imprensa.

http://www.philipmorrisinternational.com/global/downloads/SH/1967 FTC press.pdf
(25/07/2005)

40. Cigarette yields using intense smoking protocols Parte 1: NFDPM, Nicotine and
carbon monoxide yields; Report FN40/M08/00; LGC - Setting standards in analytical
science: April, 2000; pp 1-26.

41. Philip Morris International; Teores de alcatrão e nicotina - o que significam e o que
não significam.
http://www.philipmorrisinternational.com/pages/por PT/smoking/T and N vields.as
p (20/07/2005)

42. Smith, C. J.; Livingston, S. D.; Doolittle, D. J.; , An international literature survey of
IARC group I carcinogens reported in mainstream cigarette smoke. Food and
Chemical Toxicology 1997, 35, (10), 1107-1130.

43. Steele, R.; Payne, V.; Fulp, C ; Rees, D.; Lee, C ; Doolittle, D., A comparison of the
mutagenicity of mainstream cigarette smoke condensates from a representative sample
of the US cigarette market with a Kentucky reference cigarette (K1R4F) Mutation
Research 1995, 342, 179.

44. Lord, H.; Pawliszyn, J., Evolution of solid-phase microextraction technology. Journal
of Chromatography A 2000, 885, (1-2), 153-193.

45. Gbatu, T. P.; Sutton, K. L.; Caruso, J. A., Development of new SPME fibers by sol-
gel technology for SPME-HPLC determination of organometals. Analytica Chimica
Acta 1999, 402, (1-2), 67-79.

46
 Introdução

46. Arthur, C. L.; Pawliszyn, J., Solid phase microextraction with thermal desorption
using fused silica optical fibers. Analytical Chemistry 1990, 62, (19), 2145-2148.

47. Valente, A. L. P.; Augusto, F., Microextração por fase sólida. Química Nova 2000, 23,
523-530.

48. Pawliszyn, J., Quantitative aspects of SPME. In Applications of solid phase

microextraction, Pawliszyn, J., Ed. Cambridge, 1999; pp 3-21.

49. Góreki, T., Solid versus liquid coatings. In Applications of Solid Phase
Microextraction, Pawliszyn, J., Ed. Cambridge, 1999; pp 92-108.

50. Lord, H.; Pawliszyn, J., Microextraction of drugs. Journal of Chromatography A

2000, 902,17-63.

51. Supelco, Solid phase microextraction: theory and optimization of conditions. Bulletin
923 1998.

52. Louch, D.; Motlagh, S.; Pawliszyn, J., Dynamics of organic compound extraction
from water using liquid-coated fused silica fibers. Analytical Chemistry 1992, 64,
(10),1187-1199.

53. Martos, P. A.; Pawliszyn, J., Calibration of solid phase microextraction for air
analyses based on physical chemical properties of the coating. Analytical Chemistry
1997, 69, (2), 206-215.

54. Ulrich, S., Solid-phase microextraction in biomedical analysis. Journal of

Chromatography A 2000, 902, ( 1 ), 167-194.

55. Valor, I.; Pérez, M.; Cortada, C ; Apraiz, D.; Moltó, J. C ; Font, G., SPME of 52
pesticides and polychlorinated biphenyls: extraction efficiencies of the SPME coatings
poly(dimethylsiloxane), polyacrylate, poly(dimethylsiloxane)-divinylbenzene,
Carboxen-poly(dimethylsiloxane), and Carbowax-divinylbenzene. Journal of
Separation Science 2001, 24, (1), 39-48.

56. Negrão, M. R.; de Fátima Alpendurada, M., Solvent-free method for the determination
of polynuclear aromatic hydrocarbons in waste water by solid-phase microextraction-
high-performance liquid chromatography with photodiode-array detection. Journal of
Chromatography A 1998, 823, (1-2), 211-218.

57. de Fátima Alpendurada, M., Solid-phase microextraction: a promising technique for

sample preparation in environmental analysis. Journal of Chromatography A 2000,
889,(1-2),3-14.

58. Mani, V., Properties of commercial SPME coatings. In Applications of Solid Phase
Microextraction, Pawliszyn, J., Ed. Cambridge, 1999; pp 57-71.

47
Introdução.

59. Yang, S. S.; Smetena, I., Determination of tobacco alkaloids using solid phase
microextraction and GC-NPD. Chromatographic! 1998, 47, (7-8), 443-448.

60. Yang, S. S.; Huang, C. B.; Smetena, I., Optimization of headspace sampling using
solid-phase microextraction for volatile components in tobacco. Journal of
Chromatography A 2002, 942, (1-2), 33-39.

61. Mindrup, R. F., New applications for SPME/capillary GC: screening for
amphetamines in urine; identifying tobacco varieties; monitoring nitrogen-containing
herbicides herbicides in water. The Reporter 1995, 14, 1-3.

62. Clark, T. J.; Bunch, J. E., Qualitative and quantitative analysis of flavor additives on
tobacco products using SPME-GC-mass spectroscopy. Journal of Agriculture and
Food Chemistry 1997,45, (3), 844-849.

63. Silva, G. V. A. Estudo de emissões de COVs por materiais usados em interiores de

edifícios. Dissertação de Doutoramento, Faculdade de Ciências da Universidade do
Porto, Porto, 2000.

64. kellner, R.; Mermet, J.; Otto, M.; Widmer, H., Analytical Chemistry. Wiley-VCH:
1998.

65. Holler, F. J.; Nieman, T. A.; Skoog, D. A., Principles of Instrumental Analysis. 5 ed.;
Saunders College Publishing: New York, 1998.

66. Braun, R. D., Introduction to Instrumental Analysis. McGraw-Hill International

Editions: Singapura, 1987.

48
 2. Parte Experimental

2. Parte Experimental

2.1. Geração do fumo de cigarro

2.2. Padrões e cigarros utilizados

2.3. Amostragem

2.4. Descontaminação do material utilizado

2.5. Calibração

2.6. Análise química

2.7. Cálculos

Bibliografia
Parte Experimentai

2.1. Geração do fumo de cigarro

Para gerar fumo de cigarros utilizou-se um equipamento especialmente concebido

para o efeito, de origem alemã, Borgwaldt modelo RM 1/Plus (Figura 2.1), cujas
especificações satisfazem as normas ISO 3308 e ISO 4387.

Local onde está colocado

o detector de Infra-vermelho

(B)

Figura 2.1. (A) Vista geral da máquina Borgwaldt, modelo RM 1 /Plus, usada para gerar o fumo do tabaco' e
(B) respectivo esquema.2

50
 Parte Experimental

Este equipamento imita o funcionamento do pulmão humano através do

deslocamento de um êmbolo no interior de uma cavidade cilíndrica (Figura 2.2), permitindo
fumar cigarros individuais mecanicamente.

Figura 2.2. Imagem do interior da máquina onde é possível observar o êmbolo e a cavidade cilíndrica onde ele
se desloca em movimento de vai e vem, imitando o funcionamento do pulmão humano.

Cada cigarro foi fumado em condições previamente estabelecidas e padronizadas (de

acordo com as normas ISO anteriormente referidas), designadamente: 35 mL de volume de
aspiração de ar, 2 segundos de duração da aspiração, 58 segundos de pausa entre aspirações
e 30 mm de comprimento de cigarro não fumado.
O volume de aspiração de ar é o volume de ar aspirado pela máquina em cada
puxada; a duração da aspiração é o tempo durante o qual a máquina aspira ar; e a pausa
entre aspirações é o tempo de "descanso" entre duas puxadas consecutivas. Na pausa entre
aspirações o cigarro continuava a arder mas nenhum fumo era aspirado. Cada um destes
parâmetros pode ser modificado e alterado na unidade de controlo, sendo possível variar os
valores dentro dos seguintes intervalos: volume de aspiração: 1 0 - 5 0 ml, duração da
aspiração: 1,0 - 9,9 segundos, pausa entre aspirações: 2,0 - 99 segundos. Quando a máquina
acaba de fumar um cigarro, imprime um pequeno relatório do qual consta a designação da
amostra (estabelecida pelo operador antes de iniciar a queima do cigarro), a data, a hora e o
número de aspirações efectuadas.
Na prática, a forma como o cigarro é queimado depende também das condições
atmosféricas, particularmente da velocidade do ar junto ao cigarro. A norma ISO 3308

51
Parte Experimentai

prescreve uma velocidade de ar junto ao cigarro de 200 ± 30 mm/s. Esta velocidade de ar é

medida com um anemómetro colocado no canal de fluxo de ar, de forma fazer a medição
junto à ponta do cigarro a arder. O anemómetro coloca-se preso no suporte, na posição
indicada na Figura 2.3. A velocidade de ar junto ao cigarro pode ser controlado actuando no
botão de velocidade.

Figura 2.3. Fotografias onde se vê o anemómetro que permite controlar a velocidade do ar junto da ponta do
cigarro.

A máquina possui no fundo do "corredor de fluxo de fumo" um sistema que aspira o

fumo que é produzido na combustão/pirólise do cigarro e que é emitido directamente para a
atmosfera. Esse fumo é depois encaminhado por um tubo para o exterior da máquina.
O equipamento foi colocado numa hotte, para não contaminar o ambiente do
laboratório.
Todos os cigarros foram acesos manualmente usando um acendedor eléctrico
externo. Na realidade, alguns outros métodos de ignição podem contribuir com mensuráveis
quantidades de analitos na fase de vapor, contaminando a amostra. '
Antes de iniciar a queima de cada cigarro programou-se o processo de queima,
definindo os valores de cada parâmetro, colocou-se o cigarro no respectivo suporte (Figura
2.4) e procedeu-se ao seu acendimento.

52
 Parte Experimental

Figura 2.4. Vista parcial da máquina, com o cigarro colocado.

A referida máquina de fumar permite a recolha da fase particulada e da fase gasosa

do fumo inalável. Para isso, o sistema está equipado com dois porta filtros, onde foram
colocados filtros de fibra de vidro de 44 mm de diâmetro (Figura 2.5) que permitem a
recolha da fase particulada do fumo. Estes filtros de fibra de vidro, são mais conhecidos
como filtros de Cambridge e toda a matéria que fica retida nestes filtros corresponde à
matéria particulada total (MPT).

Figura 2.5. Imagem dos porta filtros existentes na máquina de fumar, (A) sem o filtro colocado, (B) com o
filtro colocado e (C) ligados por um tubo de teflon (tal como acontece no interior da máquina de fumar).

53
Parte Experimentai

Estes filtros têm uma eficiência de 99% para partículas com um diâmetro
aerodinâmico superior a 0,1 um.5 O primeiro filtro está ligado ao suporte onde se coloca o
cigarro para ser queimado, de modo a filtrar imediatamente o fumo produzido. Um segundo
filtro, chamado de segurança, está ligado ao primeiro por um tubo (Figura 2.5) e está
colocado antes da seringa (ou "pulmão" da máquina) e tem como principal função garantir
que a fase particulada fica completamente retida e não passa para o interior do equipamento.
A fase de vapor é então encaminhada para o exterior da máquina.

2.1.1. Interferências da própria máquina de fumar

cigarros
No decurso do trabalho após alguns meses de utilização da máquina, começou-se a
notar uma redução significativa nos níveis determinados no fumo de cigarro. Após várias
tentativas de despistagem da razão do problema, chegou-se à conclusão que a origem do
problema estaria na própria máquina de fumar. De facto, colocando uma concentração
conhecida de vários compostos num saco de gases, fazendo a máquina sugar essa mistura
gasosa e analisando a mistura recolhida à saída da máquina verificou-se a ocorrência de
perdas significativas. De referir que essas perdas variaram bastante, não sendo
reprodutíveis. As perdas eram superiores para o m/p-xileno, sendo que a concentração mais
baixa determinada era cerca de 16 vezes menor que a real. Para o tolueno a menor
concentração determinada foi 5 vezes inferior à real. No caso da acetona, 2-butanona e
benzeno as menores concentrações determinadas foram cerca de metade das reais. Estas
perdas ocorrem de um modo aleatório sendo que uma determinação que apresente níveis
mais baixos pode anteceder uma determinação com níveis mais elevados.
Uma pesquisa na literatura5'6 permitiu constatar que este problema foi já sentido
noutros estudos. Nas máquinas convencionais de fumar de cigarros o fumo é inicialmente
aspirado para um tubo de vidro, sendo de seguida expulso para o exterior através do
funcionamento de um pistão. No entanto, parecem existir nestas máquinas efeitos
importantes de memória para compostos voláteis e semi-voláteis: mesmo depois do cigarro
ser retirado na máquina, nas aspirações seguintes verifica-se a existência de sinal associado
aos compostos.6 Este efeito de memória pode ser explicado pelo facto de algum do fumo
permanecer no volume morto existente nas tubagens (antes de chegar ao tubo de vidro).
Para além disso, e uma vez que é detectado sinal nas cinco aspirações após o cigarro ter sido
retirado da máquina, há evidência da ocorrência de condensação e adsorção dos compostos

54
 Parte Experimental

no interior da máquina. No caso da fase gasosa do fumo, esta poderá condensar quando em
contacto com os filtros existentes na máquina. Determinações de níveis de alguns
compostos, nomeadamente acetona, benzeno e tolueno, fazendo a recolha apenas das
aspirações necessários para queimar o cigarro e por outro lado fazendo a recolha dessas
aspirações acrescidas das aspirações de limpeza (cerca de duas) mostraram que na realidade
os níveis determinados no primeiro caso eram substancialmente mais baixos (ver Anexo 3).5
No presente trabalho, e apesar da máquina ser descontaminada após cada utilização
tendo mesmo sido desmontada para limpar o seu interior, verificou-se que perdas e falta de
reprodutibilidade começaram a acontecer de uma forma cada vez mais pronunciada,
acabando por inviabilizar o prosseguimento do trabalho. Na realidade, existem peças da
máquina não desmontáveis cuja descontaminação não é possível, e onde se deverá acumular
partículas do fumo. Verificou-se também que essas perdas são inferiores para os compostos
mais voláteis, o que deverá estar relacionada com sua maior capacidade de "fuga".
O uso deste tipo de máquinas de fumar no futuro poderá ter de passar pela recolha
não só das aspirações necessárias para a queima de todo o cigarro, mas também das
aspirações de limpeza da própria máquina. Mesmo assim, a exactidão será sempre
questionável.
No presente estudo a parte experimental deu-se por terminada quando se constatou o
problema e não se conseguiu descontaminar eficientemente a máquina de fumar.

2.2. Padrões e cigarros utilizados

Os cigarros usados na quantificação foram adquiridos nos anos de 2005 e 2006.
Foram utilizados cigarros com filtro, de uma marca americana muito conhecida na Europa,
que será designada por marca A. Os produtos de combustão/pirólise dos cigarros da marca A
são constituídos por 10 mg/cigarro de alcatrão, 0,8 mg/cigarro de nicotina e 10 mg/cigarro
de monóxido de carbono. Foram também utilizados cigarros de referência 2R4F da
Universidade de Kentucky (Kentucky Tobacco Research & Development Center). Estes
cigarros vêm acompanhados das seguintes informações sobre a sua composição: 9,7
mg/cigarro de alcatrão 0,85 mg/cigarro de nicotina e 13,0 mg/cigarro monóxido de carbono.
Os compostos químicos utilizados na preparação das diversas misturas de calibração
para cromatografia gasosa constam da Tabela 2.1.

55
Parte Experimentai

Tabela 2.1. Padrões utilizados, qualidade e marca.

Composto Qualidade / Marca
acetona p.a., Merck
2-butanona p.a., Merck
benzeno p.a., 99.5 %, Merck
tolueno p.a., 99.5 %, Merck
m/p-xileno p.a. 98%, Merck
metanol Chromasolv, 99,9% Sigma-aldrich

2.3. Amostragem

2.3.1. Recolha da fase de vapor do fumo inalável de

cigarro
As amostras da fase de vapor do fumo inalável foram recolhidas à saída da máquina
para sacos de gases Tedlar, construídos em filme de fluoreto de polivinilo transparente e
adequados para armazenar compostos na forma gasosa. Os sacos de gases Tedlar têm sido
usados em recolha e análise de emissões de poluentes para a atmosfera. Na realidade, níveis
de COVs foram determinados em atmosferas interiores e atmosferas ocupacionais usando o
sistema SPME/GC-MS após recolha em sacos de gases.7
O material dos sacos é inerte à maioria dos gases. Os sacos possuem uma válvula e
um septo que permitem admitir ou remover gás do saco. Ao longo do estudo usaram-se
sacos de 0,6 L, 1 L, 2 L, 3 L e 5 L de capacidade. O saco Tedlar foi adaptado à saída do
fumo da máquina, usando um tubo de teflon, como mostra a Figura 2.6.

Figura 2.6. Saco na posição de recolha de fumo a partir da máquina de fumar.

56
 Parte Experimental

Após a recolha do fumo de um cigarro, fechava-se a válvula do saco que era de

seguida separado da máquina e registava-se o volume de fumo contido no saco. O saco era
colocado numa sala com ar condicionado a 22°C e à pressão atmosférica. Em alguns casos a
amostra foi diluída com diazoto (N45, Air Liquide). Para isso, deixava-se passar o diazoto
para dentro do saco durante um determinado tempo (cronometro analógico, Sportex) com
um fluxo conhecido medido num rotâmetro (Cole Parmer).
Obedecendo ao método n°55 do Centre de Cooperation pour les Recherches
Cientifiques Relative au Tabac (CORESTA - organização francesa, fundada em 1956, que
tem como objectivo promover a cooperação internacional da investigação cientifica na área
do tabaco) o saco utilizado em cada situação foi sempre grande o suficiente para que a
pressão final no interior não excedesse a pressão atmosférica.

2.3.2. Adsorção / Absorção para fase sólida dos

compostos recolhidos
Os compostos a analisar foram adsorvidos/absorvidos, ou seja pré-concentrados, em
fase sólida. Para este fim, usaram-se dois métodos diferentes para comparação.

2.3.2.1. Microextracção para fase sólida (SPME)

A recolha das amostras gasosas para análise foi feita através de uma unidade de
SPME (Supelco), provida de uma fibra adsorvente/absorvente apropriada. Ao longo do
trabalho foram usadas fibras com revestimentos diferentes: um de polidimetilsiloxano
(PDMS), com 100 um de espessura do filme de revestimento e outra de polidimetilsiloxano
(PDMS), revestida de divinilbenzeno (DVB), com 65 um de espessura do filme.
A fibra foi exposta à amostra no saco de gases, através do respectivo septo.

2.3.2.2. Tubos com adsorvente

Os vapores foram adsorvidos em tubos de aço, marca DANI, com enchimento de

Tenax TA 60/80 mesh (Supelco). No empacotamento dos tubos o adsorvente foi introduzido
por aspiração. Cada tubo comportava 160 + 2 mg de adsorvente. Nas duas extremidades
colocou-se lã de vidro silanizada, para evitar perdas. 9
As amostras de fumo de cigarro contidas no saco de gases, e antes de se iniciar a
amostragem, foram diluídas fazendo entrar azoto durante 15 minutos, com um fluxo de 234

57
Parte Experimentai

mL/min para o interior do saco. A recolha de amostra gasosas a partir do saco para os tubos
com enchimento foi efectuada por meio de uma bomba de sucção de baixo caudal de ar
(Casella, modelo Vortex). Acoplado à bomba existia um rotâmetro, Cole-Parmer, com
escala apropriada ao fluxo de 0 a 250 mL/min. O fluxo de amostragem situou-se no
intervalo de 35 a 60 ml/min e os volumes recolhidos foram sempre aproximadamente de 1
L. O sentido da entrada de ar no tubo foi seleccionado, referenciado e mantido em todas as
amostragens. Após amostragem os tubos foram de imediato fechados, sendo analisados no
espaço de tempo máximo de uma semana. Até à análise, os tubos eram conservados no
frigorífico.

2.4. Descontaminação do material utilizado

2.4.1. Máquina de fumar

Antes de iniciar a queima de cada cigarro, a máquina de fumar era limpa para
eliminar resíduos de fumo do cigarro queimado anteriormente, que contaminaria a amostra.
Para isso, a máquina era desmontada, os suportes dos filtros, as tubagens e o suporte do
cigarro eram removidos peça a peça e limpos primeiramente com água e detergente,
seguidamente com etanol e por fim apenas com água. Enquanto isso, colocava-se a máquina
a trabalhar de forma a serem efectuadas cerca de 20 bombadas de ar para limpar o "pulmão"
da máquina (ou seringa). O sistema era depois remontado, colocando-se sempre filtros
novos. Ao fim de cada dia de trabalho limpava-se também o detector de infra-vermelho
(controlador da extensão de cigarro fumado) e o canal de fluxo de ar.

2.4.2. Sacos de gases

Os sacos de gases foram descontaminados antes de ser usados pela primeira vez e
entre utilizações. Para tal, enchia-se o saco com diazoto, e esvaziava-se o saco, 10 vezes
sucessivas.
Foi verificada a existência de sinais correspondentes a possíveis compostos que estão
presentes no fumo de cigarro e que não são completamente eliminados durante a
descontaminação do saco de gases e máquina de fumar, tendo-se verificado que os valores
residuais eram insignificantes.

58
 Parte Experimental

2.4.3. Fibras de SPME

As fibras de SPME foram acondicionadas (descontaminadas) no início do dia de
trabalho, sendo mantidas à temperatura de 250°C durante 30 minutos. Antes de usar uma
fibra pela primeira vez, esta era colocada a 250°C durante 1 hora (tal como é indicado no
folheto informativo). Estas operações foram realizadas no injector do GC.

2.4.4. Tubos com enchimentos

Os tubos contendo enchimento adsorvente após empacotamento eram colocados a
300°C durante 16 h, com um fluxo de diazoto constante de cerca de 15-20 mL/min. Para
esta operação usava-se um forno, construído no Departamento de Engenharia Mecânica da
Faculdade de Engenharia do Porto, que permitia a limpeza de 5 tubos em simultâneo. Entre
utilizações os tubos eram descontaminados durante 20 minutos a 300°C. Após vinte
utilizações, o enchimento era removido e rejeitado, procedendo-se a novo empacotamento.

2.4.5. Coluna do cromatógrafo gasoso

Para limpeza da coluna do GC, o forno era, diariamente, colocado à temperatura
máxima do programa a utilizar (adiante indicado) durante 30 minutos (o mesmo período de
tempo de limpeza da fibra). Após este tempo, era traçado um cromatograma na presença da
fibra para confirmar a ausência de contaminantes no sistema.

2.5. Calibração

2.5.1. Obtenção de padrões gasosos para calibração

Um passo difícil de ultrapassar quando se estudam compostos em fase gasosa é a
preparação de padrões para calibração. As soluções gasosas de concentração conhecida
obtidas a partir de compostos líquidos à temperatura e pressão ambiente são
necessariamente muito diluídas em relação aos compostos na fase líquida de partida, o que
acarreta erros de diluição elevados. Por outro lado, o volume dos gases e vapores varia
acentuadamente com a pressão e com a temperatura, ao contrário do que acontece nas fases
condensadas.

59
Parte Experimentai

Cada um dos padrões foi preparado colocando 4,0 mL (micropipeta Gilson de 5000
uL) num frasco de vidro de 22 mL, (SUPELCO, Ref. 27173), fechado de seguida
hermeticamente com um septo de politetrafluoretileno (PTFE)/silicone também da Supelco.
Em seguida o frasco foi colocado num banho termostático a 30°C, ficando a estabilizar
durante pelo menos 30 minutos, para estabelecimento do equilíbrio entre a fase líquida e a
fase de vapor.
Depois de estabelecido o equilíbrio líquido/vapor no frasco que continha cada um
dos padrões, recolhia-se do headspace do frasco um volume de gás previamente
seleccionado, com a seringa de gases (Supelco - 22268, de 25uL ou 250 uL de capacidade)
por meio da tampa provida de septo. Para tal, a seringa era deixada no frasco, durante 2
minutos com o êmbolo na posição desejada. Seguidamente, colocava-se (através do septo)
esse volume de gás no interior do saco de gases que já continha o fumo de cigarro, sendo o
saco deixado numa sala a 22°C. Após estabilização de cerca de 3 minutos, iniciava-se a
exposição da fibra à mistura gasosa existente no interior do saco.
O cálculo da concentração adicionada foi feito como descrito mais à frente, na
secção 2.7.1.

2.5.2. Calibração usando fibras de SPME

O fumo de cigano é uma matriz muito complexa, pelo que inicialmente se optou
pelo método de calibração por adição de padrão. Contudo, após vários ajustes de método
utilizado, impunha-se averiguar se o efeito de matriz era de facto sentido. Desta forma, foi
também realizada calibração externa para comparar os declives obtidos por este método e
por adição de padrão. Em qualquer um dos casos os padrões foram preparados e injectados
com descrito em 2.5.1.

2.5.2.1. Adição de padrão

Na calibração por adição de padrão começou-se por recolher a fase gasosa do fumo
inalável de um cigarro no saco de gases e em alguns casos foi também adicionado diazoto
para diluição, seguindo-se as sucessivas adições de padrão. Antes de iniciar a adição de
padrão e entre cada adição de padrão a fibra era exposta no interior do saco durante 5
minutos, procedendo-se de seguida a desadsorção e análise por GC-MS. Para cada amostra
de fumo de cigarro, assim como para cada adição de padrão efectuada, realizavam-se duas

60
 Parte Experimental

medições independentes, a partir de uma mesma mistura gasosa presente no interior do saco
de gases.

2.5.2.2. Calibração externa

Para efectuar uma calibração externa, foram injectados diferentes volumes (25 uL,
50 uL, 75 uL, 100 uL) de cada um dos padrões, na forma de vapor, num saco de gases de 5
L contendo 1,9 L de diazoto. O diazoto era deixado a passar para dentro do saco durante
rigorosamente 8 minutos, com um fluxo de 234 mL/min. A fibra era exposta no interior do
saco durante 5 minutos, procedendo-se de seguida a desadsorção e análise por GC/MS.
Antes de se injectar um novo volume de padrão, procedia-se à descontaminação do saco
(descrito em 2.4.2) seguindo-se o procedimento de recolha de diazoto e nova injecção de
padrão. Para cada adição de padrão efectuada ao diazoto, realizavam-se duas medições
independentes, a partir de uma mesma mistura gasosa presente no interior do saco de gases.

2.5.3. Calibração usando tubos com adsorvente

Este é um método desenvolvido e optimizado durante um trabalho de doutoramente,9
diariamente utilizado no laboratório onde foi realizado este estudo e sujeito regularmente a
programas de intercalibração. Como tal, seguiu-se o procedimento habitual associado ao
método.
Inicialmente, uma solução líquida de mistura de padrões foi previamente preparada
por pesagem rigorosa (balança Mettler Toledo, modelo AG245, sensível aos 0,01 mg) dos
compostos, em balão volumétrico, e com diluição em metanol. A concentração da solução
foi de 2000 pg/mL (concentração individual de cada um dos compostos na mistura).
Um volume de 1 uL de mistura de calibração era injectado num tubo de adsorção,
usando uma seringa Hamilton de 10 uL. Seguidamente os tubos eram purgados com
diazoto, durante 2 ou 3 minutos. O sentido da passagem de gás no tubo era o mesmo da
amostragem. Os tubos com a mistura de calibração eram depois processados como os que
continham as amostras.

61
Parte Experimentai

2.6. Análise química

2.6.1. SPME-GC/MS
As amostras recolhidas por SPME foram analisadas num cromatógrafo gasoso
(Varian, modelo 3900) acoplado com um espectrómetro de massa (Varian, modelo 2100 T).
O cromatógrafo estava equipado com um injector para SPME e uma coluna de separação
(Varian, CP-SIL 8 CB low bleed/MS), com 60 m de comprimento, 0,250 mm de diâmetro
interno e 0,25 um de espessura de filme. O gás de arraste foi o hélio (99,9999%), a uma
pressão interna de 1 bar. A temperatura da trap foi de 180°C e a da linha de transferência foi
de 200°C. Na Tabela 2.2 são apresentadas as características do método usado.

Tabela 2.2. Características do método usado no GC/MS.

Fluxo do gás de arraste 1,0 mL/min
Temperaturas da coluna 40°C durante 3,75 min
40°Catél60°C, 20°C/min
Temperatura do injector 240°C (split com uma razão de repartição de
5 desde o inicio da desasorção)
Tempo total de corrida 12,75 min
Intervalo de aquisição de massas 40 - 120 m/z

O equipamento GC/MS era, antes de cada dia de trabalho, verificado e ajustado. Para
se verificar e ajustar o detector era realizado um auto-tune. Durante este procedimento o
aparelho verificava a razão ar/água, calibrava a armadilha de iões, ajustava o multiplicador
de electrões e calibrava o sistema de determinação de massas através de um gás de
calibração.
No processo de cálculo das áreas dos picos contemplou-se todos os iões adquiridos
(entre 40 e 120 m/z) no respectivo tempo de retenção, sendo a única excepção o cálculo da
área do pico cromatográfico correspondente ao m/p-xileno. No caso do m/p-xileno,
observou-se desdobramento do pico cromatográfico o que levou à necessidade da
eliminação de interferentes. Para tal, forneceu-se ao computador a razão massa/carga que
deveria ser usada nos cálculos, tendo o programa usado, dos dados armazenados, apenas
aqueles que interessava considerar (neste caso a intensidade dos sinais para 91 u.m.a, por
corresponder ao sinal mais intenso no respectivo espectro de massa) e desprezando os
restantes. O cromatograma era então refeito, bem como o cálculo das áreas dos picos.

62
 Parte Experimental

2.6.2. Tubos com adsorvente - GC/MSD

Quando as espécies a determinar foram amostradas em tubos adsorventes usou-se
um sistema de desadsorção térmica / pré-concentração, da marca DANI, modelo SDT 33.50,
acoplado a montante de um cromatógrafo gasoso de marca Agilent Technologies, modelo
6890N, com um detector selectivo de massa (MSD 5973).
No processo de desadsorção térmica da amostra, durante o período de aquecimento
(10 min) o tubo onde os analitos estavam adsorvidos era atravessado por um fluxo de hélio
que arrastava os analitos para um pré-concentrador que se encontrava à temperatura de -
35°C, onde eram concentrados. A amostra era depois aquecida a 300°C e arrastada por um
fluxo de hélio, através de uma linha de transferência aquecida a 250°C, para o injector do
cromatógrafo. Após cada injecção, todo o sistema era descontaminado por um fluxo de hélio
em contracorrente (backflush) a uma temperatura 20°C superior à temperatura de injecção,
de modo a minimizar riscos de contaminação entre amostras. Os valores dos parâmetros
ajustáveis no sistema constam na Tabela 2.3.
O cromatógrafo gasoso utilizado estava equipado com um injector do tipo
split/splitless, regulado para um razão de split de 1:50 (de 50 mL de fluxo total da amostra
injectada, 1 mL é introduzido na coluna, uma parte alimenta o backflush, e os restantes 40
mL dividem-se entre o fluxo de split e o fluxo de purga do injector.
A coluna usada era capilar e apolar, com fase sólida de 100% polissiloxano,
referência PONA, diâmetro interno 0,2 mm, espessura do filme de 0,50 u m e comprimento
de 50 m.
A informação obtida com o detector selectivo de massa (MSD) foi utilizada na
identificação dos compostos estudados. O MSD corria em varrimento contínuo (modo
SCAN). A identificação dos compostos baseava-se na comparação com espectros de massa
da biblioteca do MSD (ca. 75000 espectros).

63
Parte Experimentai

Tabela 2.3. Parâmetros usados no sistema analítico, para amostras recolhidas em

tubos com adsorvente.
Temperatura Tempo Fluxo
(°C) (minutos) (mL/minuto)
SDT
Desadsorção 260 10 10
Pré-concentração -35 10 10
Injecção 300 5 10
Backflush 320 25 2

GC
Injector 250

Forno
Valor inicial 40 5
Rampa 6°C/min 40
Valor final 280 5

MSD 280

2.7. Cálculos

2.7.1. Concentrações de padrão adicionadas

Para calcular as concentrações dos padrões gasosos adicionados de cada uma das
vezes à amostra, começou-se por estimar a pressão vapor de cada padrão à temperatura em
que se encontravam os padrões (banho termostático) por interpolação na curva:

vapor A=f(temperatura), a partir de dados da literatura io (Figura 2.7)

64
 Parte Experimental

Acetona 2-Butanona
500

1 400 y=4,27E-05e5'"E"2" y=7,00E-05e'" a

/♦
E R2= 0,991 . R 2 . 0,990
- 300
8.
> 200 > 200

S loo

0
270 285 290 310
Temperatura (K) Temperatura (K)

Benzeno Tolueno

| 800 y=4,99E-04e"°5E(,!"
/+
1 100 y.5,89E-07e 5a8E02"
/♦
R2« 0,995 E R2 = 0,991
Pressão Vapor(m

.
E 80

Í
,g
60

40 -

S 20
o.

280 295 310 325 340 355 240 255 270 285 300 315 330
Temperatura (K) Temperatura (K)

m/p-Xileno

50
X
E 40 y=1,58E-07e593E02"
E
R2 = 0,996 y
r 30

5 20

S io
°- 0 ♦
2 >0 270 280 290 300 310 320 3!10
Temperatura (K)

Figura 2.7. Representação gráfica da pressão vapor em função da temperatura para cada um dos compostos
utilizados.

Através da equação dos gases perfeitos, estimou-se o número de moles, de cada

composto (A) injectado no saco (equação 2.1).

P AxV .
n vaporA seringa
A =
RT

Sendo que nAéo número de moles do composto A, PvaporA é a pressão vapor do composto A
(atm), Vsering a é o volume medido na seringa (dm3), R é a constante dos gases perfeitos
(0,082057 atm dm3 mol"1 K"1) e Té a temperatura em K.
A partir do número de moles e massa molecular de cada padrão calculou-se a massa
adicionada.

65
Parte Experimentai

2.7.2. Parâmetros das rectas de calibração11'12

O declive (m) e a ordenada na origem (b) foram calculados para cada uma das rectas
de regressão de y em x, y = mx + b, aplicando o método dos mínimos quadrados:

Yh-~My,-~y)\
2.2
m

b — y — m- x 2.3

Sendo x,os valores individuais de concentração, v, valores individuais de sinal instrumental,

x a média de valores de x (concentração dos padrões utilizados), e y a média dos valores de

y (sinal instrumental).
Os coeficientes m e b são uma estimativa da verdadeira função que é limitada pela
dispersão inevitável do método. A precisão da estimativa é quantificada pelo desvio padrão
residual da recta (Sy/X) da regressão:

ïZb,-(mxl+b)f
S , -iH 2-4
n—i

Sendo que n corresponde ao número de pontos marcados na recta. Este desvio padrão
exprime a dispersão dos valores do sinal instrumental em torno da curva de calibração.
Os desvios padrão do declive m e da ordenada na origem b são dados por:

2.5

P^f
I X;
2

S =S , ■ '■ 2.6
y/
" "' - y ( x -~x)2

66
 Parte Experimental

O limite de detecção (L.D.) do método, definido12 como teor mínimo medido a partir
do qual é possível detectar a presença do analito com uma certeza estatística razoável, foi
calculado tal como se apresenta na equação 2.7.

L.D. = 4L 2.7
m

Sendo que Sy/X é o desvio padrão residual da curva de calibração e m é o declive da mesma
recta (atrás definido).
O limite de quantificação (L.Q.) corresponde à menor concentração medida a partir
da qual é possível a quantificação do analito, com uma determinada exactidão e precisão.12
O seu cálculo foi efectuado como se apresenta na equação 2.8.

1 0
-sy/
L.Q. = à. 2.8
m

Os níveis dos diferentes compostos presentes no fumo de cigarro foram

determinados por adição padrão, sendo que a concentração na amostra corresponde ao valor
de intercepção da recta com o eixo dos xx. O desvio padrão estimado para uma
concentração qualquer xe é dado por:

2.«)

2.7.3. Tratamento dos resultados11'12

Os níveis dos diferentes compostos foram apresentados como uma média, JC,
resultante de várias repetições (equação 2.10).

2.10
r n

Associado a essa média está um desvio padrão, s, (equação 2.11) assim como um
intervalo de confiança, /J (equação 2.12).

67
Parte Experimentai

2.11

2.12

O valor de t depende dos graus de liberdade {n-1) e do nível de significância

pretendido. Nas determinações realizadas utilizou-se um nível de confiança de 95%.

2.7.4. Comparação de médias através da aplicação do

teste t11'12
Durante o trabalho foram, feitas comparações estatísticas de médias obtidas
usando métodos diferentes sendo, para isso, aplicado o teste t. Este teste pressupõe a
comparação entre dois valores de t, o t experimental designado por texp (em valor
absoluto), e o í tabelado designado por tUlb, sendo tomado como critério de aceitação: texp
< ttab. Ou seja, conclui-se estatisticamente que os resultados provenientes dos dois
métodos não apresentam desvios significativos se o texp (em valor absoluto) for inferior
ou igual ao ttab.
Na prática, calculam-se as médias dos resultados das réplicas (xm\ e xm2) e
respectivos desvios padrão associados (s,„i e 5,,,2) para cada método. De seguida, faz-se
uma análise de variâncias afim de verificar se existem ou não diferenças significativas
entre as variâncias obtidas pelos dois métodos (s2mi e s2,n2). Para isso comparam-se os
valores de Fexp com os valores tabelados da distribuição F de Snedecor/Fisher para (n-1)
graus de liberdade, sendo que:

Send s2
^exo ~ ~1 ' ° <»l > s2
'»2 2
'13
S ml

Quando Fexp < F de Snedecor/Fisher, calcula-se o texp do seguinte modo:

Affll Affl2 _ - .
t ex = 2.14
P Í7 \
'< 1 1 ^
— + —
\nm\ n
ml J

68
 Parte Experimental

Sendo,

{nml-\)-s2nii+{nm2-l)-s2m2
2.15
nml+nm2-2

Compara-se o texp (em valor absoluto) com o tUlh, para um determinado grau de
confiança e n,„i + nm2 - 2 graus de liberdade.
Por outro lado, quando Fexp > F de Snedecor/Fisher, calcula-se o texp do seguinte
modo:

X m\ Xml
2.16
( 1 2 A
S ml S m2
+
V nm\ n
ml J

Neste caso, a comparação entre o texp (em valor absoluto) com o tu,i„ para um
determinado grau de confiança, é feita com um número de graus de liberdade (GL) dado
por:

/»i. S ml,

GL = -2
2A
„2 2.17
S ml. S ml.
n
'ml ml
+
«ml+1 nm2 +1

Os resultados provenientes dos dois métodos não apresentam desvios

estatisticamente significativos se o texp (em valor absoluto) for inferior ou igual ao tUlh.
Este teste foi também usado para comparar os declives obtidos por calibração
externa e por adição padrão, para averiguar se existia efeito de matriz (declives
estatisticamente diferentes confirmam o efeito de matriz). Para este fim foram usadas as
mesmas equações apresentadas, sendo que os valores de x,„\ e xm2 foram substituídos
pelos valores do declive das rectas (bi e b2) e os desvios padrão associados às médias
(s mi e s m2) foram substituídos pelos desvios padrão associados a cada um dos declives
(sbi es b2 ).

69
Parte Experimentai

Bibliografia

1. Borgwaldt KC Produkte.
http://www.borgwaldt.de/cms/front content.php?idart=37&idcat-35&lang=l
(08/03/2007)

2. Borgwaldt Technik GmbH. Smoking Machine RMl/Plus - Operating Instructions

3. Li, S.; Olegário, R. M.; Banyasz, J. L.; Shafer, K. H., Gas chromatography-mass
spectrometry analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in single puff of cigarette
smoke. Journal of Analytical and Applied Pyrolysis 2003, 66, (9), 155-163.

4. Darrall, K. G.; Figgins, J. A.; Brown, R. D.; Phillips, G. F., Determination of benzene
and associated volatile compounds in mainstream cigarette smoke. Analyst 1998, 123,
(5), 1095-1101.

5. Adam, T.; Mitschke, S.; Streibel, T.; Baker, R. R.; Zimmermann, R., Quantitative
puff-by-puff-resolved characterization of selected toxic compounds in cigarette
mainstream smoke. Chemical Research Toxicology 2006, 19, (4), 511-520.

6. Mitschke, S.; Adam, T.; Streibel, T.; Baker, R. R.; Zimmermann, R., Application of
time-of-flight mass spectrometry with laser-based photoionization methods for time-
resolved on-line analysis of mainstream cigarette smoke. Analytical Chemistry 2005,
77, (8), 2288-2296.

7. Lee, J. H.; Hwang, S. M.; Lee, D. H.; Heo, G. S., Determination of volatile organic
compounds (VOCs) using tedlar bag/solid-phase microextraction/gas
chromatography/mass spectrometry (SPME/GC/MS) in ambient and workplace air.
Bulletin of the Korean Chemical Society 2002, 23, 488-496.

8. CORESTA Determinations of carbon monoxide in the vapour phase of cigarette

sidestream smoke using a fishtail chimney and a routine analytical/linear smoking
Machine.; Método Padrão n.° 55; Centre de Cooperation pour les Recherches
Scientifiques Relative au Tabac: 2002.

9. Silva, G. V. A. Estudo de emissões de COVs por materiais usados em interiores de

edifícios. Dissertação de Doutoramento, Faculdade de Ciências da Universidade do
Porto, Porto, 2000.

10. Lide D, E., Handbook of Chemistry and Physics. 55 ed.; CRC Press, Inc.: Eleveland,
1974;pD-198-D213.

11. Miller, J. C ; Miller, J. N., Statistics for Analytical Chemistry. 3 ed.; 1993.

12. Castro, A., Guia Relacre 13, Validação de métodos internos de ensaio em análise
química. Relacre: Porto, 2000.

70
 3. Resultados e Discussão

3. Resultados e Discussão

3.1. Implementação do método analítico

3.2. Comparação défibras de SPME com revestimentos de PDMS-DVB e de PDMS

3.3. Determinação dos níveis de alguns compostos no fumo inalável de cigarro por
SPME/GC-MS

3.4. Utilização de um método de amostragem alternativo

3.5. Comparação dos resultados obtidos neste trabalho com outros da literatura

Bibliografia
Resultados e Discussão_

3.1. Implementação do método analítico

Este trabalho incidiu fundamentalmente na determinação de benzeno e alguns dos
seus derivados alquilados, designadamente tolueno e m/p-xileno, por serem muito nocivos
para o Homem e por se dispor de meios para determinação de COVs em amostras gasosas.
Inicialmente tentou-se determinar também níveis de etilbenzeno. No entanto, este composto
apresentava um sinal de intensidade muito baixa quando comparado com os restantes
compostos estudados, o que impedia a determinação dos quatro analitos numa mesma
análise, por exigir graus de diluição diferentes. Deste modo, optou-se por não determinar
etilbenzeno. O método foi posteriormente alargado à determinação de acetona e 2-butanona.
Embora a fibra de SPME usada não fosse a mais adequada para cetonas por não ter grande
afinidade para estes compostos, como os níveis eram relativamente elevados, não impediu a
respectiva quantificação.
Quando se iniciou este estudo não havia experiência prévia sobre caracterização de
fumo de tabaco e as informações na literatura sobre o tema eram escassas' e referentes a
equipamentos e outros meios analíticos diferentes dos disponíveis no laboratório onde este
trabalho foi desenvolvido. Assim sendo, na primeira parte do trabalho foi necessário
encontrar um método de amostragem de fumo de cigarro eficaz e compatível com o
processo de SPME/GC-MS que se pretendia utilizar na análise.
Nas secções que se seguem descrevem-se os procedimentos adoptados e os
resultados a que eles conduziram.

3.1.1. Estabelecimento da quantidade de fumo a

recolher
Começou-se por recolher o fumo de 6 cigarros (de marca A) para um saco de gases
de 2 L. A fibra de SPME (com revestimento de PDMS-DVB) foi exposta ao fumo no
interior do saco, durante 15 minutos, e os compostos adsorvidos analisados por GC-MS. O
tempo de desadsorção térmica dos COVs a partir da fibra foi fixado em 8 minutos, depois de
se ter verificado que este tempo era suficiente para garantir a desadsroção quantitativa dos
compostos previamente adsorvidos (não detecção cromatográfica de analitos adsorvidos nos
ensaios a branco da fibra). Usou-se um split com uma razão de repartição de 15 só a partir
dos 6 minutos. Até esse instante a válvula de split foi mantida fechada (split 0). Constatou-
se que, com este procedimento, o espectro de massa da zona correspondente ao tempo de

72
 Resultados e Discussão

retenção do tolueno não correspondia ao espectro característico desse composto (no espectro
de massa na Figura 3.1 estão assinalados com uma seta os picos não característicos), o que
terá resultado da presença de substâncias interferentes e muito provavelmente da saturação
do detector de massa, devido à elevada quantidade de tolueno presente na amostra.

Miam

Figura 3.1. Cromatograma referente ao fumo de 6 cigarros recolhido num saco de gases de 2 L onde uma fibra
de SPME foi exposta durante 15 minutos e espectro de massa da zona correspondente ao tempo de retenção do
tolueno.

Para tentar identificar a origem do problema, preparou-se uma amostra menos

concentrada recolhendo apenas o fumo de um cigarro para um saco de gases de 0,6 L, e
expondo a fibra de SPME ao fumo apenas 10 minutos. Apesar da concentração do fumo e
do tempo de exposição da fibra serem inferiores às anteriores, no espectro de massa da zona
correspondente ao tempo de retenção do tolueno continuaram a surgir picos não
característicos desse composto (Figura 3.2).
Procedeu-se, então, à diluição em diazoto até 2 L (capacidade do saco de gases) do
fumo de um cigarro e expôs-se a fibra de SPME à mistura durante 10 minutos. O problema
permaneceu (Figura 3.3).

73
Resultados e Discussão,

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Figura 3.2. Cromatograma referente ao fumo de 1 cigarro recolhido num saco de gases de 0,6 L onde uma
fibra de SPME foi exposta durante 10 minutos, e o espectro de massa da zona correspondente ao tempo de
retenção do tolueno.

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do tolueno

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Figura 3.3. Cromatograma referente ao fumo de 1 cigarro recolhido num saco de gases de 2 L, que foi de
seguida enchido com diazoto e onde a fibra de SPME foi exposta 10 minutos e espectro de massa da zona
correspondente ao tempo de retenção do tolueno.

Realizou-se uma nova experiência usando o split do cromatógrafo com uma razão de
repartição de 5 desde o início da desorção térmica dos analitos a partir das fibras de SPME,
de modo a diluir a amostra que era sujeita a análise. A amostra de fumo de cigarro foi
recolhida num saco de 1 L e não foi adicionado azoto. Desta forma, os picos não
característicos deixaram de se evidenciar, tal como mostra a Figura 3.4.

74
 Resultados e Discussão

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Figura 3.4. Cromatograma referente ao fumo de 1 cigarro recolhido num saco de gases de 1 L, onde foi
exposta uma fibra de SPME durante 10 minutos. Na análise cromatográfica, foi usado split com uma razão de
repartição de 5.

Considerou-se então que o tolueno (e possivelmente os outros analitos) do fumo

inalável de cigarro podiam ser eficazmente detectados fazendo a recolha do fumo de um
cigarro para um saco de 1 L, seguindo-se extracção por SPME e análise por GC-MS
(usando split com uma razão de repartição de 5). Porém, posteriormente verificou-se que
para poder quantificar os compostos pretendidos seria necessário proceder a uma diluição da
amostra com diazoto, uma vez que só desta forma se obtinha uma resposta linear no
intervalo pretendido, usando o método de adição de padrão.

3.1.2. Estabilidade do fumo no interior do saco de gases

Os sacos de gases não são absolutamente estanques, tendo lugar fenómenos de
efusão. Como a velocidade de efusão é inversamente proporcional à raiz quadrada da
respectiva massa molar, a composição de uma mistura gasosa contida num saco de gases
altera-se ao longo do tempo, enriquecendo-se nos compostos de massa molar mais elevada.
Uma zona particularmente crítica em termos de efusão será o septo, se este já tiver sido
perfurado em anteriores utilizações do saco. Impunha-se, por isso, averiguar a extensão das
perdas por efusão a partir dos sacos usados neste trabalho, para avaliar se os sacos poderiam
ser usados mais de uma vez. Para isso, utilizou-se um saco de gases já anteriormente usado
(o septo tinha sido perfurado cerca de 30 vezes). Fez-se a recolha do fumo de um cigarro
para o saco (seguindo-se adição de diazoto para diluição) e foi-se registando as áreas dos
picos cromatográficos obtidos, ao longo do tempo, para os vários compostos, após
sucessivas exposições de 10 minutos da fibra de SPME ao fumo. Usando uma fibra de

75
Resultados e Discussão,

PDMS foram estudados os comportamentos do benzeno, do tolueno, do m/p-xileno, da

acetona e da 2-butanona. O intervalo de tempo entre cada amostragem/análise foi de 20
minutos, tendo sido feita a última análise 420 minutos depois da recolha. De salientar que o
ponto 0 minutos correspondeu ao tempo mínimo desde que se faz a recolha do fumo de
cigarro até à remoção da fibra do interior do saco para a primeira análise.
Este teste mostrou que a mistura gasosa homogeneizou rapidamente, permitindo a
extracção para a fibra poucos minutos após a recolha de fumo no saco de gases, uma vez
que o sinal já estava praticamente estabilizado (Figura 3.5). A composição da mistura nos
compostos em estudo manteve-se relativamente estável durante o dia de trabalho, mostrando
que os sacos de gases usados são praticamente estanques nas condições usados neste estudo.
As oscilações de intensidade de sinal, relativamente à média, não foram superiores a 16%. O
desvio padrão relativo associado ao conjunto de medições (n = 22) foi superior para o
benzeno (10%) e mínimo para a acetona e para o tolueno (5%), sendo que para a 2-butanona
e para o m/p-xileno foi de 8%.

A benzeno
100000 -
** * ' S a . » ■> . tolueno
" ■ ■ ■ " ■ ■
80000 - X acetona

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§
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60000 ' ^^^^^^/^½^°
A m/p-xileno
ëCO 40000 -
(O
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20000 |

0 'I A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A

} 100 200 . , 300 400

tempo (mnutos)

Figura 3.5. Variação das áreas dos picos obtidos por GC/MS em função do tempo, partir de fumo de cigarro
armazenado um saco de gases (usando a fibra PDMS).

Estes resultados estão de acordo com um estudo realizado anteriormente numa

atmosfera interior1 que mostrou que os BTEX (benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno) não
apresentavam perdas importantes a partir de um saco de gases.
Com este estudo verificou-se também que o decaimento por absorção/adsorção
sucessivas (de cada vez que a fibra de SPME era exposta) não teve influência na intensidade
do sinal.

76
 Resultados e Discussão

3.1.3. Tempo de exposição necessário para extracção

por SPME
Com o objectivo de verificar qual o tempo mais adequado para extracção dos
analitos do fumo para a fibra, expôs-se uma fibra quer de PDMS quer de PDMS-DVB por
períodos de tempo diferentes ao fumo de um mesmo cigarro (diluído em diazoto). A Figura
3.6 ilustra para PDMS que, aparentemente, o equilíbrio era atingido logo ao fim de 2 a 3
min de exposição, uma vez que para tempos mais longos não se verificava aumento
significativo de sinal analítico. Resultados semelhantes foram obtidos para a fibra de
PDMS-DVB. O facto do equilíbrio ser atingido rapidamente é compreensível por se tratar
de uma amostra gasosa e, como tal, ocorrerem correntes de convecção que facilitam o
estabelecimento do equilíbrio. Um outro estudo2 em que foi usada também uma fibra de
PDMS (100 um de espessura de filme) exposta a uma mistura gasosa (benzeno, tolueno,
etilbenzeno, p-xileno, o-xileno, a-pineno e 1,3,5-trimetilbenzeno) de 34 ug/L de cada
composto a 298K, o tempo de equilíbrio foi de 60 segundos para benzeno e para tolueno e
de 90 segundos para p-xileno, o que é compatível com os presentes resultados.

♦ acetona
60000 -m—2-butanona
c -t,— benzeno
o -X—tolueno
o
40000
M

20000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12
tempo exposição da fibra (min.)

(A)

-m/p xileno

2600

2100

1600
2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12
tempo exposição da fibra (min.)

(B)
Figura 3.6. Variação das áreas dos picos obtidos por GC/MS em função do tempo de exposição de uma libra
de PDMS ao fumo de um cigarro (diluído em azoto) armazenado um saco de gases, para (A) acetona, 2-
butanona, benzeno e tolueno e (B) numa escala diferente para m/p-xileno.

77
Resultados e Discussão.

As oscilações de intensidade de sinal, relativamente à média não foram superiores a

15%, sendo o desvio padrão relativo associado ao conjunto de medições (n = 11), máximo
para acetona (8%) e mínimo para m/p-xileno (5%), sendo que para 2-butanona e para
tolueno foi de 7% e para benzeno de 6%.

3.2. Comparação de fibras de SPME com revestimentos de

PDMS-DVB e de PDMS
Antes de proseguir com os estudos decidiu-se averiguar qual das fibras PDMS ou
PDMS-DVB seria mais adequada para o fim em vista. Para tal, começou-se por comparar os
sinais obtidos com as duas fibras a partir de uma mesma amostra e nas mesmas condições.
Constatou-se (Figura 3.7) que os sinais obtidos usando a fibra de PDMS eram muito menos
intensos do que os obtidos usando uma fibra de PDMS-DVB.

MCojnts'
2ÏT-

Tolueno

m/p-xileno
Benzeno
Acetona 2-Butanona

IkMJjLd
4¾

Figura 3.7. Comparação dos sinais obtidos na análise do fumo de um cigarro usando duas fibras de SPME
diferentes: PDMS-DVB (a verde) e PDMS (a vermelho).

78
 Resultados e Discussão

Estes resultados estão de acordo com uma observação anterior em que a quantidade
de COVs extraída por uma fibra de PDMS-DVB após 10 segundos de exposição era muito
maior que a quantidade extraída por uma de PDMS após 10 minutos de exposição. Portanto,
a fibra de PDMS-DVB permite maior sensibilidade. Pôs-se então a hipótese de passar a usar
a fibra de PDMS-DVB e foi-se estudar a resposta quanto ao intervalo de resposta linear.

3.2.1. Avaliação das características de resposta do

método SPME/GC-MS
Uma vez que o fumo de cigarro é uma amostra complexa susceptível de introduzir
efeitos de matriz, optou-se por utilizar o método de adição de padrão para avaliar as
características do método (calibração).

3.2.1.1. Fibra com revestimento de PDMS-DVB

Começou-se por estudar o método apenas para benzeno e tolueno. Para tal, usou-se
fumo de um cigarro colocado num saco de gases de 1 L a que se adicionou sucessivos
volumes de 10 uL de cada um dos padrões gasosos (equilíbrio gás/líquido existente no
frasco, tal como descrito em 2.5.1). No final, o volume total adicionado de cada um dos
padrões foi de 40 uL, correspondendo a uma massa de padrão adicionada de cerca de 18 ug
para o benzeno cerca 6 ug para o tolueno. Os ensaios foram realizados em duplicado.

Como mostra a Figura 3.8 ocorreu saturação a partir da segunda adição para o
benzeno e logo a partir da primeira adição para o tolueno. Para contornar este problema,
repetiu-se o procedimento após diluição da amostra. Para tal, ao fumo de um cigarro diluído
em 1 L de diazoto num saco de gases de 2 L adicionou-se, sucessivamente, volumes de 20
uL de padrão de cada um dos compostos em estudo na forma de vapor. Continuou a
observar-se saturação da fibra logo após as primeiras adições (Figura 3.9).

79
Resultados e Discussão,

2.0E+06
6 8 10
massa (u.g)

(A)

tolueno

2.0E+07

| 1.5E+07
o
o
m 1.0E+07
(D

5,0E+06
3 4

massa (pg)

(B)
Figura 3.8. Curvas obtidas para (A) benzeno e (B) tolueno, usando uma fibra de PDMS-DVB, por adição de
padrão à mistura contida num saco de gases de 1 L constituída pelo fumo de um cigarro.

Passou-se, então, a usar um saco de gases de 5 L enchido previamente com 3 L de

diazoto. Foram feitas quatro adições de padrão de 20 uL de cada um dos padrões, na forma
de vapor, os resultados obtidos são mostrados na Figura 3.10. Porém, continuou a ocorrer
saturação da fibra, o que inviabilizava a aplicação do método.

80
 Resultados e Discussão

Benzeno

9.2E+05

Í2 7.2E+05 ♦
c ♦ ♦ ♦
3
8 5.2E+05
£ t
£ 3.2E+05
4
1 2Ei05
0 5 10 15 20 25 30 35 40
massa (ug)

(A)

Tolueno

3.1E+06
♦ ♦ ♦
£ 2.7E+06 ♦
c
3
8 2.3E+06 <►

2 1.9E+06

1 5E+06
() 2 4 6 8 10 12 14

massa (ng)

(B)

Figura 3.9. Curvas obtidas para (A) benzeno e (B) tolueno, usando uma fibra de PDMS-DVB, por adição de
padrão à mistura gasosa, contida num saco de gases 2 L, constituída pelo fumo de um cigarro diluído em 1 L
de diazoto.

Concluiu-se que a fibra com revestimento sólido de PDMS-DVB , que extrai

compostos por adsorção à superfície da mesma, não seria adequada para este estudo e
prosseguiu-se com uma fibra de PDMS.

Hl
Resultados e Discussão.

Benzeno

4,0E+05
♦
♦
«J 3.0E+05
c
8 2,0E+05

g 1.0E+05
■ra

0,0E+00
5 10 15 20 25 30 35 40
massa (ng)

(A)

. Tolueno

1.5E+06
♦
♦ ♦ ♦
| 1.0E+06
o
° 4►
"n" 5,4E+05
•ra

0 2 4 6 8 10 12 14

massa (]ig)

(B)
Figura 3.10. Curvas obtidas para (A) benzeno e (B) tolueno, usando uma fibra de PDMS-DVB, por adição de
padrão à mistura gasosa contida num saco de gases de 5 L, constituída pelo fumo de um cigarro e diluído em 3
L de diazoto.

3.2.1.2. Fibra com revestimento de PDMS

Na fibra de PDMS o processo de extracção predominante é via absorção que é,

geralmente, um processo não-competitivo. Isto significa que, teoricamente, a presença de
outras moléculas orgânicas na matriz não deverá afectar a extracção dos compostos de
interesse. No entanto, o processo de absorção não obedecerá a esta regra quando se estiver
na presença de concentrações muito elevadas de interferentes.
Para estudar a resposta da fibra de PDMS, a um saco de gases de 5 L contendo o
fumo de um único cigarro diluído em 1,9 L de diazoto adicionou-se sucessivos volumes de
50 uL de padrão (como descrito em 2.5.2.1). Apesar de inicialmente a gama ser menos
alargada, o método foi sendo optimizado sendo apresentadas na Figura 3.11 as rectas
obtidas após quatro adições de 50 uL (gama usada para quantificação).

82
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Resultados e Discussão_

O volume final de padrão adicionado foi de 200 uL o que corresponde a 89 ug para

benzeno, 32 ug para tolueno, 12 ug para m/p-xileno, 168 ug para acetona e 83 ug para 2-
butanona. A Figura 3.11 mostra que a resposta foi linear em todo o intervalo de
concentrações usado, constando na Tabela 3.1 os parâmetros respectivos.

Tabela 3.1. Parâmetros das rectas de calibração obtidas por adição de padrão ao
fumo de um cigarro para os diferentes compostos.
declive ± desvio ordenada na origem coef. de Concentração ±
Anahto padrão ± desvio padrão correlação intervalo de confiança
2 3
(xlO ) (xlO ) (r) (ug)

Benzeno 13,9 + 0,4 49+1 0,999 35 + 1

34,3 + 0,2
Tolueno 67 + 1 230 + 2 1,000

4,4 + 0,3
m/p-Xileno 154 ±8 69 + 6 0,996

Acetona 5,9 + 0,2 109 + 2 0,997 184 + 2

0,995 36 + 2
2-Butanona 26 + 1 96 + 8

3.2.1.3. Calibração externa vs. adição de padrão

Para verificar se se estava na presença de efeitos de matriz que afectassem o declive

realizaram-se também calibrações externas (com a fibra de PDMS) para comparar os
declives das rectas obtidas por este método e por adição de padrão.
Para tal usaram-se soluções padrão na forma de vapor, sendo injectados volumes de
25 uL, 50 uL, 75 uL e 100 uL de cada um dos padrões num saco de gases de 5 L de
capacidade, contendo 1,9 L de diazoto, tal como descrito em 2.5.2.2. A Figura 3.12 mostra
os resultados obtidos.

84
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9
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Resultados e Discussão,

Para todos os compostos estudados a resposta foi linear no intervalo de

concentrações testado, como seria de esperar com base nos resultados obtidos na presença
do fumo de tabaco. Os parâmetros das rectas de calibração obtidas estão resumidos na
Tabela 3.2.

Tabela 3.2. Parâmetros das rectas de calibração externa obtidos para os diferentes
compostos.
declive ± ordenada na origem coef. de L.D. L.Q.
Analito desvio padrão + desvio padrão correlação (ug) (ug)
2 2
(xlO ) (xlO ) (r)

Benzeno 15,7 + 0,6 22+17 0,998 4,1 13,5

Tolueno 88 + 4 -32 + 42 0,996 1,9 6,2

m/p-Xileno 282 + 10 50 + 37 0,998 0,51 1,7

Acetona 17,2 ±0,7 -21+38 0,997 8,5 28,3

2-Butanona 41+4 -47 + 104 0,985 9,9 33,1

Os declives das rectas obtidas por calibração externa foram comparados com os
declives das rectas obtidas por adição de padrão. O teste F foi aplicado para comparar
variâncias,5 tendo-se verificado que as variâncias associadas aos declives, para um mesmo
composto, não diferiam estatisticamente.
Aplicando o teste t,5 verificou-se para todos os compostos que os declives das rectas
obtidas por calibração externa e por adição padrão eram estatisticamente diferentes.
Concluiu-se então, que existia efeito de matriz e, por esse motivo, adoptou-se a adição de
padrão para método de calibração para caracterização do fumo de cigarro.

86
 Resultados e Discussão

3.2.1.4. Repetibilidade dos resultados

No traçado de cada recta de calibração, realizavam-se duas medições independentes

por ponto, a partir de uma mesma mistura gasosa presente no interior do saco de gases. No
caso das soluções sintéticas (calibração externa) o desvio médio relativo observado para as
diferentes concentrações de padrão foi sempre inferior a 6%. Na presença do fumo de
cigarro, o desvio médio relativo observado para os diferentes compostos nunca excedeu os
7%.
As características de reprodutibilidade dos resultados serão apresentados e discutidos
a seguir nas secções 3.3.1 e 3.3.2.

3.3. Determinação dos níveis de alguns compostos no fumo

inalável de cigarro por SPME/GC-MS
Uma vez estabelecido o método para extracção e análise de alguns COVs (benzeno,
tolueno e m/p-xileno) e COMVs (acetona e 2-butanona), passou-se à determinação dos
níveis destes compostos em cigarros comerciais e de referência.
No que respeita a cigarros comerciais, o estudo incidiu sobre uma marca de cigarros
americana, com filtro, muito conhecida na Europa, que será aqui designada por marca A.
Estudou-se também os cigarros de referência 2R4F produzidos pelo Kentucky
Tobacco Research & Development Center da Universidade de Kentucky, para fins de
investigação.

3.3.1. Cigarros comerciais

Foram realizados, em dias diferentes, ensaios independentes sendo cada amostra
constituída pelo fumo de um único cigarro, diluído em 1,9 L de diazoto, num saco de gases
de 5 L. Os diferentes compostos foram quantificados adicionando quatro alíquotas
sucessivas de 50 uL de cada um dos padrões gasosos referentes aos compostos em estudo.
Os resultados são apresentados na Tabela 3.3. Observaram-se concentrações da ordem das
dezenas de u g/cigarro para benzeno, tolueno e 2-butanona e da ordem das centenas de
ug/cigarro para a acetona. Os níveis mais baixos foram observados para m/p-xileno (9
ug/cigarro).

87
Resultados e Discussão.

Tabela 3.3. Resultados (média e intervalo de confiança) observados em fumo

inalável de cigarros de marca A, após extracção por SPME. Apresentam-se também os
valores do desvio padrão (DP) e do desvio padrão relativo (DPR).
jug / cigarro
Composto
(número de determinações Média ± Int. ).P. D.P.R. (%)
independentes)

Benzeno (n=9) 44 + 9 8 18
Tolueno (n=9) 26 + 9 8 29
m/p-Xileno (n=5) 9±4 2 27
Acetona (n=3) 155 + 91 36 24
2-Butanona (n=5) 47 + 26 19 41

Em termos de reprodutibilidade, os erros relativos foram relativamente elevados,

principalmente para a 2-butanona, que é uma cetona para a qual a fibra de PDMS não é
particularmente adequada. No entanto, deve-se notar que estes erros incluem a
heterogeneidade natural da composição dos cigarros, que é relativamente grande, como tem
sido amplamente discutido na literatura,6 incluindo também o problema associado à
máquina de fumar. De notar que os níveis apresentados foram determinados ao longo de 12
meses, implicando cigarros adquiridos em alturas diferentes, o que poderá também
contribuir para uma maior variabilidade.

3.3.2. Cigarros de referência

A Tabela 3.4 mostra que, de um forma semelhante ao observado no fumo de cigarros
de marca A, os níveis de concentração nos cigarros de referência 2R4F foram da ordem das
dezenas de ug/cigarro para benzeno, tolueno e 2-butanona e das centenas de ug/cigarro para
a acetona, sendo os níveis mais baixos associados ao m/p-xileno (8 ug/cigarro). Portanto, a
composição dos dois tipos de cigarros estudados foi muito semelhante no que se refere aos
compostos em estudo.
Quanto à reprodutibilidade, neste caso o número de ensaios efectuados não foi
exactamente igual ao conseguido para os cigarros comerciais, pelo que os valores não são
directamente comparáveis. Porém, os valores de DPR foram semelhantes para alguns
compostos e mais baixos para a 2-butanona e tolueno. Mais uma vez, faz-se notar que a

88
 Resultados e Discussão

heterogeneidade natural da composição dos cigarros deve ser tida em conta, sendo que neste
caso os cigarros foram adquiridos numa mesma altura mas pertenciam a diferentes volumes.

Tabela 3.4. Resultados (média e intervalo de confiança) observados em fumo

inalável de cigarros 2R4F, após extracção por SPME. Apresentam-se também os valores do
desvio padrão (DP) e do desvio padrão relativo (DPR).
ug I cigarro
Composto
(número de determinações Média ± Int. 3.P. D.P.R. (%)
independentes)

Benzeno (n=5) 41 ±10 8 20

Tolueno (n=5) 40 + 5 4 10
m/p-Xileno (n=6) 8+2 2 28
Acetona (n-5) 172 + 56 45 26
2-Butanona (n=4) 41+6 4 10

3.4. Utilização de um método de amostragem alternativo

O método de adição de padrão corrige/elimina interferências de matriz que afectam o
declive da recta de calibração, mas não garante a exactidão dos resultados. Efectivamente,
se houver interferentes que em GC/MS apresentem um sinal sobreposto ao sinal do analito
(o que implica idêntico tempo de retenção e fragmentações nos mesmos iões que são usados
para a quantificação em MS) o resultado pode estar errado por excesso. Para detectar este
tipo de erros é necessário dispor de amostras de referência do material em estudo, com
concentração do analito certificada e/ou participação em programas de intercalibração em
que diversos participantes usam métodos independentes. Nenhuma destas possibilidades
existia para a análise de COV's e COMV's no fumo de cigarro. Assim sendo, procurou-se
pelo menos efectuar também análises por um método alternativo que, usa um processo de
extracção dos analitos bastante distinto: adsorção em Tenax TA contido num tubo de aço,
que é depois sujeito a desadsorção térmica para análise por GC-MSD.

89
Resultados e Discussão_

3.4.1. Resultados obtidos usando Tenax TA / GC-MSD

A recolha de COVs em Tenax TA é utilizada há bastante tempo no laboratório onde
foi realizado este estudo e o método foi desenvolvido e optimizado durante um trabalho para
doutoramento7 com vista à determinação de COVs no ar interior, sendo sujeito regularmente
a programas de intercalibração.
O Tenax TA é o adsorvente mais aconselhado para recolher compostos orgânicos
não polares com pontos de ebulição entre 60 - 250°C que correspondem aos compostos
eluídos em cromatografia gasosa, usando uma coluna capilar apolar e um programa de
temperaturas adequado, entre o hexano e o hexadecano8 e que se designam por COVs.
Quer a acetona quer a 2-butanona são eluidos (na coluna usada) antes do hexano, sendo por
isso considerados compostos orgânicos muito voláteis (COMV's). No caso da acetona não
se pode garantir a recolha efectiva em Tenax TA e por isso não foi quantificada. No caso da
2-butanona, que tem ponto de ebulição de 80°C, optou-se por fazer a sua quantificação, uma
vez que experiências anteriores evidenciaram resultados de qualidade aceitável.
As determinações, foram realizadas com base no factor de resposta do próprio
composto. Nas tabelas 3.5 e 3.6 apresentam-se os níveis de cada um dos compostos
determinados em diferentes amostras de cigarros da marca A e de cigarros 2R4F,
respectivamente.

Tabela 3.5. Resultados (média e intervalo de confiança) observados em fumo

inalável de cigarros de marca A, após adsorção em tubos com Tenax TA. Apresentam-se
também os valores do desvio padrão (DP) e do desvio padrão relativo (DPR).
jug / cigarro
Composto
(número de determinações M é d i a ± i n t . COnf. D.P. D.P.R. (%)
independentes)

Benzeno (n=6) 27 + 8 6 21
Tolueno(n=6) 30 + 7 7 24
m/p-Xileno (n=6) 5+2 2 29
2-Butanona (n=7) 44 + 7 8 18

90
 Resultados e Discussão

Tabela 3.6. Resultados (média e intervalo de confiança) observados em fumo

inalável de cigarros 2R4F, após adsorção em tubos com Tenax TA. Apresentam-se também
os valores do desvio padrão (DP), do desvio padrão relativo (DPR).
ug I cigarro
Composto
(número de determinações M é d i a ± i n t . COnf. D.P. D.P.R. (%)
independentes)

Benzeno (n=5) 35 + 11 9 25
Tolueno(n=5) 32 + 7 5 16
m/p-Xileno (n=6) 7+3 3 46
2-Butanona (n=6) 47+11 10 21

Da análise das Tabelas 3.5 e 3.6 pode-se concluir que a reprodutibilidade obtida com
Tenax TA foi semelhante à obtida com SPME.
Mais uma vez se faz notar que os desvios padrão associados aos níveis dos diferentes
compostos determinados no presente trabalho deverão contemplar não só os erros
associados à calibração, amostragem e análises, mas também a variabilidade entre amostras
de fumo de cigarro.

3.4.2. Comparação dos níveis determinados usando

dois métodos de amostragem diferentes
Na Tabela 3.7 comparam-se os níveis médios e respectivo desvio padrão de cada um
dos compostos determinados no fumo inalável de cigarros comerciais e de referência usando
os métodos de amostragem SPME e Tenax TA. Esta tabela e a Figura 3.13 mostram que as
duas técnicas de extracção conduziram a níveis da mesma ordem de grandeza para cada um
dos compostos estudados.

(
JI
Resultados e Discussão,

Tabela 3.7. Comparação dos resultados obtidos por dois métodos de extracção
diferentes.
Média ± desvio padrão (jig/cigarro)
Composto Marca A 2R4F
SPME Tenax *exp hab SPME Tenax *exp hab

Benzeno 44 + 8 27 + 6 4,65 2,16 41+8 35 + 9 1,0 2,31

(P=0,05) (P=0,05)

3,01
(P=0,01)

2,31
0,87 2,20 2,55 (P=0,05)
Tolueno 26 + 8 30 + 7 40 + 4* 32 + 5*
(P=0,05) 3,36
(P=0,01)

m/p-Xileno 9±2 5+2 1,02 2,20 8+2 7+3 0,56 2,23

(P=0,05) (P=0,05)

2-Butanona 47 + 19 44 + 8 0,11 2,23 41 ± 4 47 + 10 0,68 2,31

(P=0,05) (P=0,05)

Nota: Os resultados estatisticamente diferentes encontram-se sombreados na tabela. Todos os restantes

resultados foram estatisticamente iguais assumindo um nível de significância de 5%, excepto os marcados com
* que só foram estatisticamente iguais assumindo um nível de significância de 1%.

Compararam-se estatisticamente as médias obtidas para as duas marcas de cigarros

usando métodos diferentes. Segundo o teste /5 apenas os níveis de benzeno em cigarros
comerciais de marca A foram estatisticamente diferentes. Os resultados foram
estatisticamente iguais a um nível de significância de 5%, para todos os outros compostos
com excepção de tolueno em cigarros de referência que só foram considerados
estatisticamente iguais a um nível de significância de 1%. De referir ainda que as variâncias
associadas às médias foram estatisticamente iguais em todos os casos. Estes resultados
sugerem que o método de extracção não introduzirá erros sistemáticos nos resultados.

92
 Resultados e Discussão

Cigarros da marca A

ITenax TA
60 ISPME

cõ 4 0
O)
'o
D)
20

2-butanona benzeno tolueno m/p-xileno

(A)

Cigarros Kentucky 2R4F

60,0 ITenax TA
ISPME

o 40,0
O)

O)
a. 20,0

0,0
í
2-butanona benzeno tolueno m/p-xileno

(B)
Figura 3.13. Comparação dos níveis observados no fumo inalável de (A) cigarros da marca A e (B) cigarros de
referência Kentucky 2R4F, usando as diferentes técnicas de extracção (Tenax TA e SPME). Incluíram-se os
respectivos desvios padrão.

Apesar do método alternativo ter sido usado com o simples intuito de despistar
possíveis erros sistemáticos, uma vez que os dois métodos de amostragem conduziram a
resultados muito semelhantes, faz sentido avaliar as vantagens relativas de cada um deles. O
uso de Tenax TA como adsorvente tem a vantagem de as amostras poderem ser
armazenadas (no frigorífico) durante alguns dias, não tendo portanto de se efectuar a análise
imediatamente a seguir à amostragem. Além disso, requer apenas calibração externa, o que
permite a análise de um muito maior número de amostras por dia e é muito menos
dispendioso do que SPME.
A SPME não implica a produção diária de resíduos de solvente, uma vez que a
calibração pode ser feita retirando volumes de padrão gasoso (resultante do equilíbrio

93
Resultados e Discussão,

gás/liquido) a partir de um mesmo padrão líquido. A SPME apresentou ainda a vantagem de

permitir a análise simultânea dos COVs e dos COMVs estudados e não implicar a
destruição da amostra. No caso do adsorvente em tubo, a amostragem de COMVs exigirá
combinar vários adsorventes no enchimento.

3.5. Comparação dos resultados obtidos neste trabalho

com outros da literatura
Existem vários estudos publicados onde constam resultados sobre a composição do
fumo de cigarro no que se refere a alguns compostos orgânicos voláteis e muito voláteis. Na
Tabela 3.8 compilaram-se alguns dos dados disponíveis para compostos que foram objecto
de estudo neste trabalho.
Uma análise da tabela mostra que todos os resultados publicados para um mesmo
composto foram da mesma ordem de grandeza, independentemente da marca e origem do
cigarro e do método usado na sua determinação. Concretamente, os níveis médios de
benzeno situaram-se entre 22 e 50 ug/cigarro, os de tolueno entre 34 e 88 ug/cigarro, os de
2-butanona entre 54 e 88 ug/cigarro e os de acetona entre 118 e 395 ug/cigarro. Quando
comparados os resultados de diferentes estudos com os resultados obtidos no presente
trabalho (para cigarros da mesma marca) observou-se que em alguns casos existiam
diferenças estatisticamente significativas.
A dispersão de resultados para um mesmo composto em cigarros de uma mesma
marca também foi relativamente elevada, não permitindo concluir que a composição do
fumo inalável, no que respeita aos compostos estudados, seja distinta de marca para marca.
Sendo o tabaco um produto natural que cresce em diferentes locais do mundo, será
de esperar uma variabilidade na sua composição dependente do local onde a planta é
cultivada. Além disso, é também de esperar uma certa variabilidade sazonal na planta. O
grau de empacotamento de cigarro para cigarro também poderá afectar os resultados
independentemente da sua composição/origem. A diferença no grau de empacotamento de
cigarro para cigarro também poderá afectar os resultados independentemente da sua
composição/origem. Desta forma, é compreensível que em diferentes amostras de fumo de
cigarro os níveis dos compostos que o constituem não sejam exactamente iguais, mesmo
quando se trata de cigarros de uma mesma marca, sendo que as diferenças deverão ser

94
 Resultados e Discussão

maiores para constituintes presentes em concentrações mais baixas e nos mais voláteis, em
que as perdas no processo analítico terão maior probabilidade de ocorrer.

Tabela 3.8. Níveis de benzeno, tolueno, m/p-xileno, acetona e 2-butanona medidos

por diferentes autores no fumo inalável de cigarros de diferentes marcas.

Hg/cigarro Tipo de cigarro Referência

Benzeno
41 + 8 Cigarros de referência 2R4F Presente trabalho
44 + 8 Marca A (Portugal) Presente trabalho
48 + 2* Cigarros de referência 2R4F 9
22 + 2 Cigarros de referência 2R4F 10
50 + 3* Cigarros de referência 2R4F 11
44 + 3* Marca A (Europa) 12
42 + 2 Marcai (Austrália) 12
27 + 2 Marca A (Taiwan) 12
24+1 Marca A (Japão) 12
44 + 4 Cigarros comercializados no 13
Reino Unido

Tolueno
40 + 4 Cigarros de referência 2R4F Presente trabalho
26 + 8 Marca/4 (Portugal) Presente trabalho
82 ± 4 Cigarros de referência 2R4F 9
37 + 3 " Cigarros de referência 2R4F 10
88 + 6 Cigarros de referência 2R4F II
66 + 6 Marca A (Europa) 12
63+4 Marca A (Austrália) 12
37 + 3 Marca A (Taiwan) 12
34 + 3 Marca A (Japão) 12
61+6 Cigarros comercializados no 13
Reino Unido

m/p-Xileno
8±2 Cigarros de referência 2R4F Presente trabalho
9+2 Marcai (Portugal) Presente trabalho
10+1 Cigarros comercializados no 13
Reino Unido

95
Resultados e Discussão,

Tabela 3.8. (Continuação) Níveis de benzeno, tolueno, m/p-xileno, acetona e 2-

butanona medidos por diferentes autores no fumo inalável de cigarros de diferentes marcas.

u g/cigarro Tipo de cigarro Referência

Acetona
172 + 45 Cigarros de referência 2R4F Presente trabalho
155 + 36 Marca A (Portugal) Presente trabalho
206 ± 8* Cigarros de referência 2R4F 14
262 + 42 Cigarros de referência 2R4F 15
277 + 20 Cigarros de referência 2R4F 11
148 + 10* Cigarros de referência 2R4F 10
291 + 2 9 Marca A (Austrália) 12
203 + 22 Marca A ( Taiwan) 12
291 + 18 Marca A (Europa) 12
257 + 14 Marca A (Japão) 12
a b
133 ±24-395±8 Cigarros comercializados nos 16
EUA
a
118 - 242 b Cigarros cedidos por 17
"Technology Center of
ChongQing Tobacco Industrial
Company", China

2-Butanona
41+4 Cigarros de referência 2R4F Presente trabalho
47 + 19 Marca A (Portugal) Presente trabalho
73 + 1 #
Cigarros de referência 2R4F 14
54 a - 88 b Cigarros cedidos por
"Technology Center of 17
ChongQing Tobacco Industrial
Company", China
a
Concentração determinada que apresentou um nível mais baixo. 'Concentração determinada que apresentou
um nível mais elevado.
"determinado em todo o fumo inalável e não apenas na fase gasosa do fumo inalável.
médias são estatisticamente iguais às determinadas no presente trabalho para um nível de significância de
5%;** médias são estatisticamente iguais às determinadas no presente trabalho mas apenas para um nível de
significância de 1%.

A falta de métodos analíticos standardizados para determinações dos constituintes do

fumo de cigarro (com excepção do alcatrão, da nicotina e do monóxido de carbono) levou a
grandes diferenças entre resultados obtidos por diferentes laboratórios, mesmo quando se
tratam de cigarros de uma mesma marca.

96
 Resultados e Discussão

Um estudo realizado em 200318 comparou os níveis de diferentes constituintes do

fumo de cigarro determinados por sete diferentes laboratórios num mesmo período de
tempo. Para cada composto, cada laboratório usou o método que achou mais conveniente, o
que implicou o uso de diferentes máquinas de fumar, métodos de recolha e de detecção.
Além disso, cada laboratório aplicou os seus processos internos de validação. Cigarros das
mesmas três marcas foram entregues e analisados em cada laboratório. As determinações
que apresentaram menor variabilidade entre laboratórios foram as de alcatrão, sendo que nos
70% dos restantes analitos a variabilidade em relação à média foi relativamente elevada
entre laboratórios. A variação entre os níveis determinados mais elevados e os mais baixos
(em relação à média) foi cerca de 80%. Considerando os dados disponíveis na literatura (
Tabela 3.8) constata-se que a Variabilidade máxima dos níveis medidos foi de 78%
para benzeno, 88% para tolueno, 48% para 2-butanona e 99% para acetona. Logo, não foi
muito diferente da que ocorreu no referido trabalho18 de intercalibração. Estes factos
deverão ser tidos em conta quando se interpretam resultados, referentes a constituintes do
fumo de cigarro.

97
Resultados e Discussão.

Bibliografia

1. Lee, J. H.; Hwang, S. M.; Lee, D. H.; Heo, G. S., Determination of volatile organic
compounds (VOCs) using tedlar bag/Solid-phase Microextraction/gas
Chromatography/Mass Spectrometry (SPME/GC/MS) in Ambiente and Workplace
Air. Bulletin of the Korean Chemical Society 2002, 23, 488-496.

2. Martos, P. A.; Pawliszyn, J., Calibration of solid phase microextraction for air
analyses based on physical chemical properties of the coating. Analytical Chemistry
1997,69,(2),206-215.

3. Lord, H.; Pawliszyn, J., Evolution of solid-phase microextraction technology. Journal

of Chromatography A 2000, 885, (1-2), 153-193.

4. Góreki, T., Solid versus liquid coatings. In Applications of Solid Phase

Microextraction, Pawliszyn, J., Ed. Cambridge, 1999; pp 92-108.

5. Miller, J. C ; Miller, J. N., Statistics for Analytical Chemistry. 3 ed.; 1993.

6. Gregg, E.; Hill, C ; Hollywood, M.; Kearney, M.; McLaughlin, D.; McAdam, K.;
Williams, M.; Purkis, S., The UK smoke constituents testing study. Summary of
results and comparison with other studies. Beitrage zur Tabakforschung International
2004,21,(2), 117-138.

7. Silva, G. V. A. Estudo de emissões de COVs por materiais usados em interiores de

edifícios. Dissertação de Doutoramento, Faculdade de Ciências da Universidade do
Porto, Porto, 2000.

8. Evaluation of VOC emmissions from building products - Solid flooring materials;

Report Nr.18; ECA (European Collaborative Action "Indoor Air Quality and Its
Impact on Man"): Luxembourg: Office for Official Publications of the European
Communities, 1997.

9. UK Smoke Constituents Study; Arista Laboratories Europe: 2003.

10. Adam, T.; Mitschke, S.; Streibel, T.; Baker, R. R.; Zimmermann, R., Quantitative
puff-by-puff-resolved characterization of selected toxic compounds in cigarette
mainstream smoke. Chemical Research Toxicology 2006, 19, (4), 511-520.

11. Counts, M. E.; Hsu, F. S.; Tewes, F. J., Development of a commercial cigarette
"market map" comparison methodology for evaluating new or non-conventional
cigarettes. Regulatory Toxicology and Pharmacology 2006, 46, (3), 225-242.

12. Counts, M. E.; Morton, M. J.; Laffoon, S. W.; Cox, R. H.; Lipowicz, P. J., Smoke
composition and predicting relationships for international commercial cigarettes

98
 Resultados e Discussão

smoked with three machine-smoking conditions. Regulatory Toxicology and

Pharmacology 2005, 41, (3), 185-227.

13. Darrall, K. G.; Figgins, J. A.; Brown, R. D.; Phillips, G. F., Determination of benzene
and associated volatile compounds in mainstream cigarette smoke. Analyst 1998, 123,
1095-1101.

14. Chen, P. X.; Moldoveanu, S. C., Mainstream smoke chemical analyses for 2R4F
kentucky reference cigarette. Beitrage zur Tabakforschung International 2003, 20, (7),
448-458.

15. Dong, J.-Z.; Moldoveanu, S. C., Gas chromatography-mass spectrometry of carbonyl

compounds in cigarette mainstream smoke after derivatization with 2,4-
dinitrophenylhydrazine. Journal of Chromatography A 2004, 1027, (1-2), 25-35.

16. Miyaké, T.; Shibamoto, T., Quantitative analysis by gas chromatography of volatile
carbonyl compounds in cigarette smoke. Journal of Chromatography A 1995, 693, (2),
376-381.

17. Wang, T. L.; Tong, H. W.; Yan, X. Y.; Sheng, L. Q.; Yang, J.; Liu, S. M.,
Determination of volatile carbonyl compounds in cigarette smoke by LC-DAD.
Chromatographia 2005, 62, 631-636.

18. Purkis, S. W.; Hill, C. A.; Bailey, I. A., Current measurement reliability of selected
smoke analytes. Beitrage zur Tabakforshung International 2003, 20, (5), 314-324.

99
 Conclusões

Este trabalho permitiu implementar um método de análise directa de amostras

gasosas de fumo de cigarro recolhidas em sacos de gases à saída de uma máquina que
simula o acto de fumar, de um modo padronizado. Para recolha de analito e análise usou-se
SPME/GC-MS.
A fibra de SPME que se mostrou mais adequada foi a que contém um revestimento
de PDMS. A fibra com revestimento de PDMS-DVB, apesar de mais sensível para os
compostos em estudo, saturava os locais de adsorção a níveis relativamente baixos de
concentração dos compostos estudados, não permitindo o uso do método de adição de
padrão para calibração.
A fibra de PDMS foi capaz de providenciar respostas lineares na gama de
concentrações estudada (L.Q. - maior concentração medida em ug/cigarro) para benzeno
(14 - 124), tolueno (6 - 64), m/p-xileno (2 - 16), acetona (28 - 353) e 2-butanona (33 -
119). Uma comparação de declives obtidos por calibração externa e por adição de padrão
mostrou que o fumo de cigarro causava interferência de matriz, pelo que a quantificação dos
diferentes compostos foi realizada sempre por adição de padrão.
A máquina de fumar, que era nova no início do estudo, começou, a partir de certa
altura, a evidenciar irreprodutibilidade das emissões e níveis de emissão inferiores aos
fornecidos anteriormente para o mesmo tipo de cigarros. Acabou-se por concluir que
ocorreriam adsorções significativas no interior da máquina, em locais inacessíveis à limpeza
para descontaminação. Uma pesquisa na literatura permitiu constatar que o mesmo
problema já havia sido observado por outros investigadores e constituirá uma enorme
limitação para o estudo da composição de fumo de cigarro.

101
Conclusões^ _

Quer cigarros de referência 2R4F da Universidade de Kentucky quer cigarros de

uma marca comercial A, apresentaram níveis de concentração no fumo inalável que
obedeceram à seguinte ordem: m/p-xileno < tolueno < benzeno < 2-butanona < acetona. Os
níveis (e respectivos desvios padrão) expressos em u g/cigarro, nos cigarros de marca A
foram de 155 ± 36 para acetona, 47 + 19 para 2-butanona, 44 + 8 para benzeno, 26 + 8 para
tolueno e 9 + 2 para m/p-xileno. No caso de cigarros de referência 2R4F, os níveis foram de
172 + 46 para acetona, 4 1 + 4 para 2-butanona, 4 1 + 8 para benzeno, 40 + 4 para tolueno e 8
+ 2 para m/p-xileno. Os erros associados às determinações reflectem não só os erros
experimentais associados ao processo de amostragem e análise, mas também a
heterogeneidade natural da composição dos cigarros (cada análise incide sobre um cigarro
diferente) que é relativamente elevada.
Averiguou-se a existência de erros sistemáticos associados à fase de extracção de
analitos para análise recorrendo à extracção por adsorção em Tenax TA, contido num tubo
de aço. Compararam-se as médias obtidas para as duas marcas de cigarros usando SPME e
Tenax TA. Apenas os níveis de benzeno determinados pelas duas técnicas em cigarros da
marca A foram estatisticamente diferentes. Os restantes resultados foram estatisticamente
iguais, para um nível de significância de 5% para todos os compostos, com excepção dos
níveis de tolueno em cigarros de referência 2R4F, que foram estatisticamente iguais apenas
para um nível de significância de 1%.
O método de análise por SPME/GC-MS implementado revelou-se uma alternativa
aos anteriormente existentes, tendo como principal vantagem o facto de não envolver o uso
de solventes para extrair os analitos do fumo, o mesmo acontecendo com os tubos com
enchimento de Tenax TA/GC-MSD.

102
Anexos
Anexo 1 _

Anexo 1. Principais constituintes da fase gasosa do fumo inalável de cigarros sem

filtrou
Composto3 Concentração/Cigarro
Azoto 280 - 320 mg
Oxigénio 50 - 70 mg
Dióxido de carbono 45 - 65 mg
Monóxido de carbono 14 - 23 mg
Água 7 - 12 mg
Argon 5 mg
Hidrogénio 0,5-1,0 mg
Amoníaco 10- 130 u g
Óxidos de azoto (NOx) 100 - 600 ug
Cianeto de hidrogénio 400 - 500 ug
Sulfureto de hidrogénio 20 - 90 u g
Metano 1,0 - 2,0 mg
Outros alcanos aromáticos voláteis (20) 1,0 - 1,6 mg
Alcenos voláteis (16) 0,4 - 0,5 mg
Isopreno 0,2 - 0,4 mg
Butadieno 25 - 40 u g
Acetileno 20 - 35 ug
Benzeno 12-50ug
Tolueno 20 - 60 u g
Estireno 10 u g
Outros hidrocarbonetos voláteis (29) 15 - 30 u g
Ácido fórmico 200 - 600 ug
Ácido Acético 300 - 1700 ug
Ácido propionico 100 - 300 u g
Formato de metilo 20 - 30 u g
Outros ácidos voláteis (6) 5 - 10 ug!b

§
Hoffmann, D. Analysis of toxic smoke constituints; US consumer product safety commission and
US department of health and human services, Toxicity Testing Plan: New York, 1993.
a
Os números entre parêntesis representam o número de compostos individuais identificados no grupo
b
Valores estimados

104
 Anexo 1

Anexo 1. (continuação) Principais constituintes da fase gasosa do fumo inalável de cigarros

sem filtro.8
Composto3 Concentração/Cig
Formaldeído 20- 100 pg
Acetaldeido 400 - 1400 ug
Acrolina 60- 140 ug
Outros aldeídos voláteis (6) 80- 140 ug
Acetona 100- 650 ug
Outras cetonas voláteis (3) 50- 100 ug
Metanol 80- 180 ug
Outros álcoois voláteis (7) 10-30ug b
Acetonitrilo 100-150 ug
Outros nitrilos voláteis (10) 50 - 80 ugb
Furano 20 - 40 ug
Outros furanos voláteis (4) 45 - 125 ugb
Pindina 20 - 200 ug
Piridina (3) 15 - 80 ug
3-Vinilpiridina 10-30 Mg
Outras piridinas voláteis (25) 20 - 50 ugb
Pirrole 0,1-10 ug
Pirrolidina 10-18 |ag
N-Metilpirrolidina 2,0-3,0 pg
Pirazinas voláteis (18) 3,0-8,0 Mg
Metilamina 4-10Mg
Outras aminas alifáticas (32) 3-10Mg

Hoffmann, D. Analysis of toxic smoke constituints; US consumer product safety commission and
US department of health and human services, Toxicity Testing Plan: New York, 1993.
a
Os números entre parêntesis representam o número de compostos individuais identificados no grupo
b
Valores estimados

105
Anexo 2

Anexo 2. Principais constituintes encontrados na fase particulada do fumo inalável

de cigarros sem filtro.§
Composto ug/Ci garro
Nicotina 1000 -3000
Norticotina 50- 150
Anatabina 5 - 15
Anabasina 5 - 12
Outros alcalóides do tabaco (17) N.D.
Bipiridilos (4) 10- 30b
n-Hentriacontano (n-C3lH64) 100
Hidrocarbonetos não voláteis totais (45) 300- 400b
Naftaleno 2 -4
Naftalenos (23) 3--6 b
Fenantrenos (7) 0,2 -0,4 b
Antracenos (5) 0,05 -0,l b
Fluorenos (7) 0,6 -l,0 b
Pirenos (6) 0,3 -0,5 b
Fluorantenos 0,3- 0,45b
Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos 0,1 - 0,25
carcinogénicos (11)
Fenol 80-160
Outros Fenóis (45)b 60-180 b
Catecol 200 - 400
Outros catecois (4) 100 - 200b
Outros dihidroxibenzenos (10) 200 - 400
Escopoletina 15-30
Outros polifenois (8)b N.D.
Ciclotenos(10)b 40 - 70b
Quinonas (7) 0,50
Solanesol 600 - 1000

§
Hoffmann, D. Analysis of toxic smoke constituints; US consumer product safety commission and
US department of health and human services, Toxicity Testing Plan: New York, 1993.
a
Os números entre parêntesis representam o número de compostos individuais identificados no grupo
b
Valores estimados
N.D. Não disponível

106
 Anexo 2

Anexo 2. (continuação) Principais constituintes encontrados na fase particulada do

fumo inalável de cigarros sem filtro.§
Composto3 ug/Cigarro
Neofitadienos (4) 200 - 350
Limoneno 30 - 60
Outros terpenos (200-250) N.D.
Ácido palmítico 100-150
Ácido esteárico 50 - 75
Ácido oleico 40 - 110
Ácido linoleico 150-250
Ácido linolénico 150 - 250
Ácido Láctico 60 - 80
Indol 10-15
Escatol 12-16
Outros indois (13) N.D.
Quinolinas (7) 2-4
Benzofuranos (4) 200 - 300
Outros compostos heterociclicos (42) N.D.
Estigmasterol 40 - 70
Sitosterol 30 - 40
Campesterol 20 - 30
Colesterol 10-20
Anilina 0,36
Toluidinas 0,23
Outras aminas aromáticas ( 12) 0,25
N-nitrosaminas específicas do tabaco (6) 0,34 - 2,7
Glicerol 120

Hoffmann, D. Analysis of toxic smoke constituints; US consumer product safety commission and
US department of health and human services, Toxicity Testing Plan: New York, 1993.
a
Os números entre parêntesis representam o número de compostos individuais identificados no grupo
b
Valores estimados
N.D. Não disponível

107
Anexo 3

Anexo 3. Evidencia do efeito de memória na máquina de fumar, que constitui uma

limitação séria no uso deste equipamento para caracterização do fumo de cigarro -
Resultados observados para fumo inalável de cigarros de referência Kentucky 2R4F.'

Puffs da queima do cigarro

+ Puffs da queima do cigarro
Puffs de Limpeza

Acetona (148,1 ± 9,6) pg/cigarro (63,6 ± 4,5) pg/cigarro

Benzeno (22,5 + 1,7) pg/cigarro (9,9 ± 0,8) pg/cigarro

Tolueno (37,1 ±3,1) pg/cigarro (12,1 + 1,1) pg/cigarro

§
Adam, T.; Mitschke, S.; Streibel, T.; Baker, R. R.; Zimmermann, R., Quantitative puff-by-puff-
resolved characterization of selected toxic compounds in cigarette mainstream smoke. Chemical
Research Toxicology 2006, 19, (4), 511-520.

108
 PORTO

DECLARAÇÃO

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DOUTORAMENTO
MESTRADO

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RAMO/ ESPECIALIDADE

^VA-VrnvGO

TÍTULO

ORIENTADOR (ES)

e
_J5^ Uç|o< de ^F^Vas Cco-oAwUdor)

Declaro, para os devidos efeitos, que concedo gratuitamente à Universidade do Porto

P ra alem do títujo e resumo por mim disponibilizados, autorização para arquivar e tomar acessível aos
s o o n í b f ' nnoTformato
d.spombilizo
d a m e n t e atraVéS d
e nas condições
reP SÍtóri0
° ^ abaixo
° indicadas
'-tituo-onal o trabalho s u p r aœntmeado,
ln" que
A subscrição da presente declaração não implica a renúncia à titularidade dos direitos de autor a direito
de-usar a obra em trabalhos futuros, os quais são pertença do seu criador intelectual.

ASSINALAR AS OPÇÕES APLICÁVEIS EM 1,2 E 3.

1-T.PODEDiVULGAÇAo 2. ÂMBITO DE DIVULGAÇÃO

3. FORMATO DO FICHEIRO
T O m
[ V i I I NA UNIVERSIDADE DO PORTO
i I PAPEL

Qp A R a A L m ««AL
DKtTAL(CD/DVD)

OBSERVAÇÕES (*)

DATA
ASSINATURA
16/O6/2GO£
Susana ZLkx^Aq ca SGJG KAaÁw?