A PROTEÔMICA FORENSE NO BRASIL: ESTADO ATUAL E PERSPECTIVAS

Lívia Luzia do Nascimento Koshino

Aluna de Especialização em Biociências Forenses- Ifar/PUC
livialuzia@yahoo.com.br
Edson Wagner de Souza Barroso
Especialista em Curso Superior de Polícia

1. Introdução

Meio milhão de brasileiros elegeu a violência no Brasil como um dos temas

principais para debate no próximo relatório de Desenvolvimento Humano Brasileiro de
2010. Recentes pesquisas realizadas pelo Programa das Nações Unidas para o
Desenvolvimento (PNUD) demonstraram que a violência e a criminalidade estão no topo
das preocupações que afligem os cidadãos brasileiros. Em relação à violência, a ênfase
recai sobre as agressões contra pessoas, como a violência doméstica, estupros e
homicídios.
A perícia forense brasileira está dividida em quatro áreas principais. A primeira
delas é a Criminalística, que abrange tanto as perícias externas no estudo dos locais de
crime, quanto às perícias internas na análise dos objetos e as amostras. A segunda área é a
Medicina Legal, que realiza o estudo do periciando vivo ou após a sua morte. A
Papiloscopia, que engloba a necropapiloscopia, é responsável pelo estudo das impressões
digitais. Por fim, conta com os Laboratórios de Química, Toxicologia, Entomologia e
DNA.
Na década de 90 o estudo do DNA ganhou a atenção dos pesquisadores e
alcançou um enorme avanço tecnológico com a utilização de novas metodologias como o
seqüenciamento da molécula (SANGER et al., 1997) e a reação em cadeia da polimerase
(PCR) (MULLIS et al., 1983). Somente na metade dos anos 90, com a introdução de
técnicas mais precisas e reproduzíveis em larga escala, o estudo do proteoma retorna ao
cenário científico.
Em 1992 a Polícia Civil do Distrito Federal, por intermédio da sua Polícia
Técnica, iniciou o processo de implementação de pesquisa de DNA forense, com a
fundação do seu próprio laboratório de análise de material genético para atender as
necessidades da perícia criminal. Em 1994, o exame de DNA foi utilizado pela primeira
vez nos tribunais brasileiros por dois peritos criminais da Polícia Civil; o material
biológico de dois crimes ocorridos na capital foi extraído e levado para análise nos Estados
Unidos. O resultado desse trabalho está descrito nos laudos periciais números 96.114 e
96.136, do Instituto de Criminalística do DF, referentes à ação penal nº 4040/93, da 6ª Vara
Criminal de Brasília (processo n. 9672/93, do Tribunal de Justiça do Distrito Federal)
(BARROS et al., 2008).
As técnicas biomoleculares aplicadas na análise de DNA começaram a ser
admissíveis como provas nos tribunais desde 1986 com o caso Leicester, que identificou o
assassino de duas adolescentes por meio da análise de perfis de DNA encontrados em
amostras de sêmen e sangue do suspeito (WANBAUG, 1989). Foi a primeira vez que a
análise de um perfil genético foi aceita pela corte como evidência criminal levando a prisão
do autor de crimes perpetrados no condado de Leicester, Inglaterra. Este crescente
entusiasmo e os diversos avanços nas técnicas envolvendo o DNA fizeram com que o
estudo das proteínas ficasse um pouco esquecido.
Desde os ataques de 11 de setembro de 2001, novas tecnologias têm sido
implementadas para o desenvolvimento de biometria e identificação criminal. Programas
mais avançados vêm sendo utilizados nas ciências forenses para aprimorar a procura por
vestígios. Cientistas forenses buscam sistemas que possuam elevada capacidade de
processamento de dados, maior sensibilidade e automação, maior acurácia e softwares
amigáveis para a análise de dados. Com essas melhorias, a análise dos dados se tornará
mais fácil, e as informações, mais confiáveis.
Assim como o exame de DNA pode comprovar ou negar a autoria de diversos
crimes, tranformando-o em meio de prova eficaz para a veracidade de processos penais,
futuramente, a análise proteômica poderá ser útil nos exames de corpo de delito
comprovando a materialidade, adentrando no campo da autoria e até mesmo na
culpabilidade. Como a vinculação de técnicas avançadas em genômica e proteômica, no
âmbito das ciências forenses, aponta para a elucidação dos fatos relacionados com ilícitos
penais de grande complexidade o objetivo dessa revisão é identificar os objetos de
investigação forense e verificar as técnicas disponíveis em proteômica com suas
possibilidades e perspectivas de aplicação na perícia forense brasileira.

2. Metodologia
 O presente trabalho foi desenvolvido por meio de levantamento bibliográfico
em periódicos indexados a PubMed, SCIELO, Science Direct on-line e Periódicos Capes.
Foram priorizados os artigos publicados a partir do ano 2000, no entanto artigos utilizados
com data de publicação anterior há esse ano foram julgados como relevantes para a
pesquisa. Os termos utilizados na pesquisa foram: proteomics, forensic proteome, 2-DE
electrophoresis, human body fluids. Os critérios para a escolha dos artigos envolveram
todo tipo de estudo relacionado ao tema não havendo exclusões.

3. Histórico

A proteômica é posterior à genômica. A compreensão da morfologia e função

da molécula de DNA é um pressuposto para o estudo e elaboração de metodologias
aplicadas ao estudo das proteínas. A elucidação do DNA ocorreu em 1953, quando Watson
e Crick propuseram a estrutura completa da molécula.
O DNA é uma molécula longa e fina, composta por açúcar, fósforo e quatro
diferentes tipos de bases nitrogenadas. A dupla fita complementar e invertida consiste num
pareamento de resíduos de timina (t) com adenina (a) e guanina (g) com citosina (c) por
meio de ligações do tipo pontes de hidrogênio. Outras descobertas também importantes
como o RNA mensageiro e a identificação do código genético levaram à determinação do
fluxo da informação genética conhecido como o Dogma Central da Biologia Molecular.
No inicio dos anos 70, diversas enzimas de restrição foram isoladas, vários
métodos de seqüenciamento foram aprimorados e surgiram métodos de clonagem e reação
em cadeia da polimerase. Em meados dos anos 80, cientistas descobriram que a molécula
do DNA era altamente polimórfica. Ela contém regiões em que pequenas seqüencias são
repetidas in tandem diversas vezes. O número dessas repetições, e a combinação de vários
segmento repetidos são únicos, tornando possível a diferenciação entre os indivíduos.
Alec Jefreys (1985) desenvolveu a técnica de DNA fingerprinting e a análise
de perfis de DNA, avaliando um número variável de repetições em tandem (VNTR),
baseada na RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism), em que os organismos
podem ser diferenciados pela análise de padrões derivados da clivagem do seu DNA. Suas
descobertas são amplamente utilizadas pelas perícias forenses do mundo inteiro.
Além disso, o seqüenciamento automático de DNA e o uso de computadores
para analisar os dados possibilitaram o seqüenciamento dos primeiros genomas ainda nos
anos 80. Em 1988, o Projeto Genoma foi criado por pesquisadores de diversos países para
canalizar os esforços na corrida para o mapeamento do genoma humano e a identificação
dos nucleotídeos.
Centenas de laboratórios se uniram formando um consórcio internacional para
seqüenciar os genes que codificam as proteínas. Em 14 de abril de 2003, o consórcio
anuncia oficialmente a conclusão do Projeto Genoma Humano (PGH), que seqüenciou 3
bilhões de pares de bases do DNA humano. O projeto foi liderado pelo Instituto Nacional
de Pesquisa do Genoma Humano (NHGRI), nos EUA e pelo Instituto Sanger, da Inglaterra.
Outro fato relevante descoberto no PGH é que há muito mais proteínas num
proteoma (um milhão de proteínas aproximadamente) do que genes (20.000 a 25.000)
devido a alterações como splicing alternativo e modificações pós-traducionais das
proteínas. Essa discrepância demonstra que a diversidade das proteínas não deve ser
analisada somente pela expressão gênica.
A conclusão do Projeto Genoma Humano em 2003, representou um grande
avanço na biotecnologia gerando uma enorme quantidade de seqüências completas de
genes disponíveis em bancos de dados. Contudo, as seqüências completas de DNA, apenas,
não são suficientes para a elucidação dos processos biológicos celulares.
Na era pós-genômica, uma inovadora e mais abrangente área do conhecimento:
a proteômica, ressurge como uma área complementar ao estudo do genoma. A partir dela, é
possível determinar quais proteínas estão sendo expressas, quando, e em quais níveis estas
expressões ocorrem.
No campo da proteômica, está inserido o estudo do proteoma, termo proposto
por Wilkins e usado pela primeira vez no Encontro 2-DE de Siena em 1994. Caracteriza-se
como o conjunto de todas as proteínas expressas pelo genoma. Não só as proteínas podem
ser analisadas como também os diversos processos biológicos das células, suas isoformas,
modificações e interações (TYERS et al., 2003).
Enquanto o genoma é uma entidade constante, o proteoma está em constante
mudança em cada célula do corpo seja por interações bioquímicas com o genoma ou por
interferência do meio ambiente (ABHILASH, 2009).
O Projeto Proteoma, iniciado em 1995, se tornou possível pela combinação de
géis de proteína de segunda dimensão, capaz de isolar um grande número de proteínas,
combinados com espectrometria de massa para identificar e caracterizar as proteínas
dispostas no gel (HERBERT et al., 1997).
 Em fevereiro de 2001, a Organização do Proteoma Humano (HUPO) foi
fundada para integrar projetos de pesquisas na proteômica, ampliando o conhecimento
global e o suporte para a análise das proteínas em larga escala.( HANASH et al., 2002).
Um conselho de experts no campo da proteômica foi oficialmente formado por
acadêmicos, membros do governo e terceiro setor. Estes defendem que a elucidação de
padrões de produção de proteínas é elemento central para o entendimento das funções
celulares. Diversas iniciativas já foram escolhidas incluindo o projeto proteoma do cérebro,
pulmão e do fígado (TAYLOR et al, 2006).
No Brasil, as pesquisas de seqüenciamento genômico iniciaram-se em maio de
1997, com o projeto genoma da bactéria Xylella fastidiosa, fitopatógeno causador da
clorose ou praga do amarelinho em plantas (SIMPSON et al., 2000). Este projeto foi
desenvolvido pela Fapesp no Instituto Virtual de Genômica (ONSA) em parceria com o
Fundo de Defesa da Citricultura (Fundecitrus). Atualmente, esses mesmos pesquisadores
estão trabalhando no proteoma da Xylella fastidiosa a fim de detectar quais as proteínas
responsáveis pela infecção das plantas, além de produzir um banco de dados sobre a
identificação e caracterização das proteínas presentes nessa bactéria.
Além de detectar o nível de expressão do gene, o estado do desenvolvimento
celular, as interações gênicas e as diversas respostas celulares, em relação às diferentes
condições a que a célula está submetida, o estudo da proteômica torna possível uma análise
mais detalhada e dinâmica da expressão gênica nos processos metabólicos dos seres vivos.

4. Fluidos Corporais na análise forense

Com o uso de DNA forense nos tribunais as análises forenses de DNA vêm
progredindo e desenvolvendo protocolos cada vez mais precisos. Resultados no perfil de
DNA já são amplamente aceitos como evidências importantes nos tribunais por meio da
implementação de bases de dados consistentes de DNA forense (CAREY et al., 2002).
Métodos similares são usados em outros tipos de identificação humana como testes de
paternidade, identificação de corpos em caso de desastre ou de guerra. O sucesso na
identificação de qualquer biomarcador dependerá da qualidade das amostras analisadas, da
habilidade de gerar informações válidas nos diferentes níveis protéicos e da interpretação
precisa dos dados gerados.
 A análise do proteoma de fluidos corporais humanos tem se tornado uma das pesquisas
mais promissoras na descoberta de biomarcadores para identificação de doenças. (HU et
al., 2006). A detecção de proteínas conhecidas presentes em fluidos corporais como o
sangue, a saliva e o sêmen e a possivel diferenciação dessas proteinas em nível tecidual
pode esclarecer o que deve ter ocorrido na cena do crime. Ainda por meio dessa pesquisa,
espera-se determinar quais itens da evidência podem ser usados em testes moleculares mais
detalhados para a identificação do possível suspeito de um crime. Fluidos corporais
possuem algumas vantagens para serem coletados devido a facilidade da coleta e
processamento, além de serem menos invasivos quando comparados a exames de sangue
ou de impressão digital (VEENSTRA et al., 2005). Desta maneira, fica preservado o direito

°
a intimidade, direito fundamental, e cláusula pétrea, presente no artigo 5 , inciso X, da
Constituição Federal de 1988. Nestes casos, o material coletado na cena do crime é
considerado prova, não havendo a necessidade de autorização do suspeito para a coleta dos
vestígios por autoridade policial.

4.1. Sangue

A identificação humana feita por manchas de sangue possui enorme

importância para a elucidação de crimes como homicídios, estupros e também para o
reconhecimento de pessoas em acidentes, seqüestros e desastres. Os estudos imunológicos
para a determinação dos grupos sanguíneos aplicados as ciências forenses iniciaram-se em
1913 por Lattes, que desenvolveu o primeiro teste de anticorpos para o sistema ABO
obtidos por meio de manchas secas. Três anos depois, utilizando seus conhecimentos em
sorologia, apresentou um diagnóstico médico legal sobre manchas de sangue no tribunal.
As proteínas presentes no plasma se originam de diversos tecidos e células
sanguíneas. Os níveis de proteínas presentes no plasma refletem estados fisiológicos e
patológicos do organismo podendo ser utilizado para o diagnóstico de doenças
(ANDERSON, 2002). Amostras do plasma são obtidas na presença de um anticoagulante
como o EDTA, citrato de sódio ou heparina e centrifugadas para remover as células
sanguíneas. Contudo, na ausência de um anticoagulante, o soro sanguíneo é obtido depois
que o sangue coagula, e os elementos celulares são removidos. Uma grande dificuldade
encontrada é a padronização das amostras e a escolha entre plasma ou soro, pois a
composição desses é bastante diferente (LUNDBLAD, 2005). Além disso, o proteoma é
muito complexo com diversas proteínas que podem estar glicosiladas ou ligadas a outras
proteínas carreadoras. O desafio está na quantificação das proteínas de forma global.
O proteoma sanguíneo é definido como o complemento mais completo
expresso pelo sangue num dado momento. Este está em constante mudança e,
modificações nas células em qualquer nível podem resultar em alterações na expressão das
proteínas revelando uma fonte rica de potenciais biomarcadores celulares.

4.2. Saliva
O fluido salivar é secretado por três pares de glândulas principais: parótida,
submandibular e sublingual, que contribuem com o volume da secreção e de eletrólitos.
Glândulas menores localizadas em varias regiões da mucosa bucal como lábios, língua,
bochecha, palato e faringe também secretam saliva e, embora sejam responsáveis por um
pequeno volume da secreção, são importantes, pois estão relacionadas a substâncias
provenientes do sangue.
A composição da saliva é de 99% de água e 1% de sólidos (proteínas e
eletrólitos). As proteínas presentes na saliva possuem funções biológicas diversas como
atividade antibacteriana, lubrificação e digestão. Pesquisas bioquímicas e moleculares por
meio do estudo de genes e proteínas têm analisado a estrutura e a função de algumas
proteínas salivares de interesse científico. Uma análise global dessas proteínas pode
contribuir para o entendimento do perfil protéico da saliva.
O proteoma salivar humano (HSP), utilizando a eletroforese de gel 2D
acoplado a espectrometria de massa, é capaz de identificar, aproximadamente, 100
diferentes proteínas salivares (GHAFOURI et al., 2003). Um número significativo de spots
em um gel 2-DE típico pode captar fragmentos de proteínas salivares abundantes como
amilases, cistatinas e imunoglobulinas (HIRTZ et al., 2005). Para a identificação de
proteínas salivares menos abundantes, a análise feita por técnicas avançadas de
espectrometria de massa garante um aumento significativo na resolução, quando
comparado a eletroforese em gel bidimensional (MESSANA, 2004). Geralmente, um pré
fracionamento de proteínas salivares intactas empregando técnicas de separação de alta
resolução, é necessário para alcançar uma ampla cobertura no proteoma salivar humano
(XIE, 2005).
Manchas de saliva humana podem ser encontradas em cenas de crimes,
isoladas ou misturadas com outros fluidos biológicos. Os locais de ocorrência mais comuns
são: na superfície de objetos como envelopes (FRIDEZ et al., 1996), bitucas de cigarro
(HOCHMEISTER, 1991), tecidos, copos, locais próximos a mordidas e freqüentemente,
em vítimas de estupro (BARNI, 2006).
Para a identificação de manchas de saliva, diferentes métodos são utilizados,
sendo o mais comum a detecção da enzima alfa-amilase, seja por métodos químicos ou
imunológicos (GAENSSLEN, 1983).
O grupo das a-amilases se caracteriza por enzimas monoméricas, produzidas e
estocadas nas glândulas salivares, estando, por essa razão, presentes em abundância em
suas secreções. Constituem-se dos principais biomarcadores salivares, sendo encontradas
na saliva em concentrações relativamente altas quando comparadas a outros fluidos
corporais como suor, lágrima, leite materno e urina (AUVDEL, 1986).

4.3. Sêmen
No Brasil, estima-se, em média, que de todos os crimes sexuais existentes
apenas 10 a 20% são registrados em delegacias (BEDONE & FAÚNDES, 2007). Vários
fatores contribuem para o baixo conhecimento das autoridades acerca da violência sexual
dentre eles o preconceito, o julgamento, e a intolerância em relação às vitimas,
principalmente, mulheres jovens em idade reprodutiva (CAMARGO, 2000).
A identificação do sêmen é de extrema importância nos casos de violência
sexual. Nesses casos, o procedimento comumente utilizado é a detecção citológica do
espermatozóide. Além dessa técnica, um biomarcador denominado fosfatase ácida
prostática (FAP) foi amplamente utilizado na prática forense. Sua especificidade e
sensibilidade, porém, foram consideradas limitadas e por isso, esse método de identificação
foi abandonado após a descoberta do antígeno prostático específico (PSA) (OESTERLING
et al, 1987). A PSA ou P30 foi primeiramente descrita por Hara (1971) que a batizou de
gama-semiproteína. Li e Schulman (1971) descreveram a mesma proteína, denominada de
E1, com peso molecular correspondente a 31 kD supondo que ela seria uma proteína
específica do esperma humano. Uma análise bioquímica mais profunda acerca desta
proteína foi feita por Sensabaugh (1978) utilizando métodos eletroforéticos na análise de
proteínas do sêmen. A proteína finalmente ficou conhecida por p30, pois possuía peso
molecular de aproximadamente 30 kDa. Ela apresentava reatividade com o anti-soro
preparado contra a proteína E1. Em 1979, descreveu uma proteína com peso molecular
entre 33-34 kDa como sendo específica da glândula prostática, que denominou PSA
( antígeno prostático específico). Em trabalhos publicados por Wang (1982), Graves
(1990), Sensabaugh e Blake (1990) e Johnson e Kotowski (1993) evidências bioquímicas
sugerem a identidade entre a PSA e a p30. A detecção e análise de proteínas como a p30,
um biomarcador na prática forense, é muito relevante, pois permite a identificação do
fluído seminal em evidências criminais deixadas por indivíduos vasectomizados,
azoospérmicos ou oligospérmicos, casos onde pode não ser possível detectar a presença de
espermatozóides por avaliação microscópica (HOCHMEISTER et al., 1999).
O PSA também está presente em fluídos extra prostáticos, como no soro de
mulheres e crianças, urina de mulheres, líquido amniótico, leite materno, saliva e líquido
encefaloraquidiano (LAUX & CUSTIS, 2003). Apesar disso, a concentração desse
antígeno no sêmen varia de 0,2 até 5,5 x 106 ng/mL sendo, portanto, um milhão de vezes
mais concentrada do que no soro sangüíneo de indivíduos saudáveis (SAWAYA & ROLIM,
2003).
Estes reduzidos níveis de PSA existentes em fluídos extra prostáticos não
interferem nas investigações de PSA do líquido seminal em perícias criminais, permitindo
seu uso como marcador na determinação dos vestígios de esperma coletados das vítimas,
preservativos e a partir de manchas obtidas em peças de vestuário.

5. Principais técnicas utilizadas na Proteômica

5.1 Eletroforese bidimensional (2-DE)

Estudos envolvendo a técnica de eletroforese bidimensional iniciaram-se em
1927 por Reiner. Dez anos mais tarde, Arne Tiselius apresentou um novo método
denominado eletroforese livre, em que uma mistura complexa de proteínas do plasma
sanguíneo era decomposta em 5 frações protéicas distintas (TISELIUS, 1937).
Nos anos 50, géis de eletroforese formados por dois monômeros orgânicos:
acrilamida e N, N1-metilenobisacrilamida foram denominados PAGE (eletroforese em gel
de poliacrilamida) e se mostraram eficientes nessa área (RAYMOND & WEINTRAUB,
1959). A adaptação do gel de acrilamida para a focalização isoelétrica em um gradiente de
pH estável, foi realizada no final dos anos 60 (SVENSSON, 1962). O gel bidimensional
combinado com a focalização isoelétrica para separar proteínas desnaturadas de acordo
com sua carga e o gradiente SDS-PAGE para uma segunda separação de acordo com a
massa molecular (KENRICK & MARGOLIS, 1970).
Pouco tempo depois, a focalização isoelétrica foi utilizada em condições
desnaturantes, como se conhece hoje, seguida de um gel 2-D PAGE (O´FARREL, 1975;
KLOSE, 1975; SCHEELE, 1975). Esse sistema identificou mais de mil proteínas de
Escherichia coli presentes num único gel 2D-E se tornando o método mais utilizado para a
separação e análise da expressão de proteínas dos 20 anos seguintes. Devido a enorme
complexidade de se analisar padrões de géis 2-DE, desenvolveu-se, no final dos anos 1979,
o primeiro programa de computador com escaneamento para a comparação quantitativa de
géis 2-D (BOSSINGER et al., 1979; CAPEL et al., 1979).
O gel de eletroforese bidimensional de alta resolução (2D-PAGE) para a
separação de proteínas complexas introduzido por O’Farrel combina a focalização
isoelétrica (IEF) da primeira dimensão na presença de uréia, detergentes e DTT com gel de
poliacrilamida de sódio dodecil sulfato (SDS-PAGE) na segunda dimensão (Figura 1).

Figura 1. Esquema de técnicas aplicadas na Proteômica, adaptado de Penque et al (2009).

1.Preparação da amostra; 2.Primeira dimensão (I-EF); 3.Segunda dimensão (SDS-PAGE); 4.Visualização no
gel; 5.Análise de software; 6.Seleção de proteínas e digestão para análise de espectrometria de massa.
 O processo de eletroforese se inicia com a obtenção das proteínas que devem
ser misturadas com SDS (sódio dodecil sulfato), um detergente anfipático, que irá
desnaturá-las a fim de convertê-las numa estrutura linear carregada negativamente. A
estrutura tridimensional dos polipeptídios também pode ser desfeita com o auxílio de
agentes redutores como o ditiotreitol (DTT) ou o 2-mercaptoetanol que desfazem as pontes
dissulfetos. Nesse processo, as proteínas são separadas em duas etapas: a primeira de
acordo com o Ponto Isoelétrico (PI) e a segunda de acordo com a Massa Molecular. Na
primeira dimensão ocorre a separação das proteínas de acordo com sua carga elétrica. As
proteínas migram no gel até atingirem o seu ponto isoelétrico, local estacionário onde sua
carga liquida é nula. A próxima separação, denominada de segunda dimensão, submete as
proteínas previamente separadas por IEF à eletroforese desnaturante em gel de
poliacrilamida (SDS PAGE) e finalmente as separa de acordo com suas massas
moleculares. Um único gel 2-DE pode revelar mais de 5.000 proteínas simultaneamente,
possuindo um alto grau de resolução. Ao final desse processo, as proteínas são visualizadas
diretamente no gel, por meio de coloração de Azul de Comassie ou coloração com Nitrato
de Prata resultando num perfil bidimensional de pontos (“spots”) cada um contendo
múltiplas cópias das proteínas.
A vantagem de se produzir esse gel em relação à cromatografia líquida (LC-
MS/MS) é que nele um mapa de proteínas intactas com mudanças nos níveis de expressão,
isoformas e modificações traducionais. Já na Cromatografia multidimensional acoplada a
espectrometria de massa, as informações relativas ao ponto isoelétrico e a massa molecular
são perdidas, apesar de ser bastante útil se o objetivo for produzir uma lista com todas as
proteínas presentes na amostra.
Outra vantagem do gel 2-DE é a capacidade de se estudar proteínas que foram
fosforiladas ou glicosiladas ou sofreram proteólise e que podem ser localizadas no gel 2-
DE como spots distintos. O gel 2-DE também permite que se isole a proteína para uma
futura análise. Proteínas são excisadas do gel, digeridas, geralmente utilizando tripsina, e a
mistura de peptídeos resultante é levada ao espectrômetro de massa para a identificação
das proteínas.
Apesar de tantos benefícios, esses géis possuíam desvantagens como a
instabilidade e as dificuldades de se produzir um padrão para ser utilizado em diversos
laboratórios. Com a introdução de gradientes de pH imobilizados em tiras de gel de
poliacrilamida.(IPG) por Bjellqvist (1982) e Görg (1988) esses problemas foram
resolvidos. IPGs são baseados no princípio de que o gradiente de pH é gerado por um
número limitado (<10) de compostos bem definidos que co-polimerizam com a matriz de
poliacrilamida. IPGs permitem a geração de gradientes de Ph de qualquer faixa desejada de
pH entre 2,5 a 12 (GÖRG et al., 1998).

6.2. Espectometria de massa

A espectrometria de massa tem se tornado uma ferramenta importante na
análise de peptídeos e proteínas, na última década, devido a sua alta capacidade de
processamento das amostras, por ser bastante sensível e ter uma elevada acurácia para a
produção dos resultados esperados (CAREY et al., 2002).
Ela se baseia na fragmentação de proteínas em peptídeos antes de sua ionização
e separação por massa molecular. Estudos na área de macromoléculas por espectrometria
de massa na década de 80 foram marcados pelo desenvolvimento de dois processos de
ionização capazes de gerar íons a partir de proteínas e peptídeos. Estes dois processos são
conhecidos como ionização por dissociação da matriz mediada por Laser (MALDI- matrix-
assisted laser desorption ionization) e por pulverização de elétrons em microcapilares sob
pressão atmosférica e alta voltagem (electron spray ionization-ESI). Nesses processos
considerados suaves, não há significativa decomposição química e mesmo ligações fracas
como as ligações não covalentes são mantidas (MANN et al., 2001).
A ionização feita por MALDI (Figura 2) utiliza pulsos de Laser como fonte de
energia de ionização e depende do uso de uma matriz. Os peptídeos derivados da
fragmentação enzimática formam uma mistura que é embebida numa matriz orgânica
composta de peptídeos padrões com outras moléculas pequenas que absorvem energias do
tipo ultravioleta (UV) e infravermelho (IV) e que se co-cristalizam com os peptídeos da
amostra na presença de um doador de prótons (GARBIS et al., 2005).
Os peptídeos ionizados são liberados a partir dessa matriz após o
bombardeamento com o feixe de laser emitido em uma câmara a vácuo. A ionização via
MALDI é feita com analisadores de massa do tipo tempo de vôo (Time of Flight- TOF). O
valor obtido no cromatograma reflete a relação de massa e carga do íon (m/z).
 Figura 2. Ionização feita por MALDI. (Fonte: TEIXEIRA et al., 2006).

O processo de ionização por pulverização de elétrons (ESI) permite que

amostras de peptídeos em solução sejam submetidos à ionização pela passagem através de
um capilar sob alta voltagem e pressão atmosférica. Neste caso o uso de um gás,

geralmente N promove a volatilização do solvente e com base no potencial eletrostático

2,
ocorre a dissociação de íons de diferentes cargas. As gotículas contendo moléculas
carregadas são evaporadas em câmara durante o fluxo de gás inerte sob pressão
atmosférica. A capacidade desse método em produzir íons de interesse com múltiplas
cargas é adequada para seu uso com instrumentos de espectrometria de massas do tipo
quadrupolo, que funcionam como um filtro de íons de diferentes cargas, ou outros tipos de
analisadores de massa com faixa limitada de m/z (massa/carga).
Espectrômetros de massa (MS) disponíveis atualmente para a análise de
proteínas e peptídeos permitem a aplicação de técnicas para identificação de proteínas por
meio de mapeamento (fingerprinting) e seqüenciamento de aminoácidos, caracterização de
modificações pós-traducionais e também como ferramenta para quantificação da expressão
das proteínas. O equipamento de massa seqüencial (MS/MS, TOF/TOF) é o mais adequado
por separar os peptídeos em uma câmara de dissociação induzida por colisão e separação
de fragmentos parciais derivados após a quebra da ligação peptídica.
A análise de peptídeos em espectrômetros do tipo MS/MS também informa
sobre a estrutura primária e conferem alta especificidade na identificação de proteínas em
banco de dados públicos ou de projetos de seqüenciamento. Contudo, a análise de
proteínas intactas em MS é pouco informativa e menos sensível que a caracterização das
massas dos peptídeos derivados de sua proteólise. A obtenção de massa de uma proteína
intacta não permite a sua identificação por estarem sujeitas a modificações pós-
traducionais e pelo alto número de proteínas com massas semelhantes. Já a fragmentação
de proteínas isoladas derivadas de fracionamentos permite a obtenção de um perfil de
massas dos peptídeos presentes em sua composição. Por meio desta técnica, analisam-se as
modificações pós-traducionais das proteínas, como o processamento de peptídeo sinal, cuja
informação presente no gene não é recuperada na forma de proteína ativa e neste caso a
massa deduzida in silico difere da massa obtida experimentalmente (TEIXEIRA et al.,
2006).

8. Conclusões e perspectivas futuras

A utilização de técnicas analíticas de biologia molecular envolvendo DNA como

instrumento das Ciências Forenses já é comumente aceita como evidência de crimes nos
tribunais. O DNA forense é capaz de indicar se o perfil genético contido em uma amostra
biológica guarda relação com o perfil genético de determinado indivíduo. Também é útil
para comparar se duas amostras distintas, que podem ser duas gotas de sangue ou sangue e
saliva, por exemplo, apresentam um mesmo perfil genético, o que demostra que os fluidos
corporais se originaram de um único contribuidor.
Contudo, os exames relacionados a perfis de DNA não são capazes de esclarecer a
natureza da amostra coletada. Não conseguem definir se os vestígios coletados na cena do
crime são, por exemplo, exemplares de sangue, esperma, saliva , lágrima, ou pertencem a
algum outro fluido corporal. Essa diferenciação entre os tipos de amostras coletadas é de
extrema importância para as investigações forenses. A partir dela, pode-se estabelecer o
que deve ter ocorrido na cena do crime e identificar a parte do iter criminis que deixou
vestígios, ou seja, elucidar a seqüência dos fatos, a dinâmica do evento. Se em um
homicídio, também houver saliva ou esperma no corpo da vítima, isto pode indicar a
ocorrência de um crime sexual.
O emprego da eletroforese 2-DE combinada com a espectrometria de massa é a
principal ferramenta para detecção de um perfil protéico atual. Os avanços recentes nessa
área têm aumentado a versatilidade dessa tecnologia permitindo uma adaptação dessas
técnicas para o estudo de biomarcadores de fluidos corporais de importância forense.
 Novas técnicas biomoleculares aliadas a novas ferramentas computacionais devem
ser desenvolvidas para aumentar a padronização e a taxa de processamento dos dados, e
aprimorar a sensibilidade na detecção desses biomarcadores,.
Com o uso da proteômica forense pode-se afirmar com maior precisão a ocorrência
de um delito, suas qualificações, e até mesmo provar a culpabilidade de um suspeito. É,
portanto, fundamental para a máxima clareza e complementação do conjunto das provas
forenses.

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