CLONAGEM DE DNA

FERRAMENTAS BÁSICAS DA CLONAGEM DE DNA

Três tipos de enzimas de restrição:

o Tipo I e Tipo III

o Cortam a larga distância (entre 20-30 a 1000 bp) da sequência reconhecida
o Requerem a presença de co-fatores como S-adenosil metionina (SAM), ATP e Mg2+ (todas as
enzimas precisam)

o Tipo II (mais utilizadas) --> EcoRI

o Dimeros de um único tipo de subunidade
o Cortam sequências palindrómicas (seq que são iguais da esquerda para a direita e vice versa) de
4-6- 8 nucleótidos que são cortadas no interior.
o Não utilizam nem SAM nem ATP e requerem normalmente Mg 2+ como cofator.

No entanto, muitas outras enzimas classificadas como tipo II podem ser multiméricas e apresentar outros tipos de
corte (ex: a curta distância da sequência reconhecida).

*Ex de enzima tipo II muito comum: EcoRI -> corta ligações fosfodiéster em sítios de reconhecimento

CORTE -> enzima de restrição

COSTURA -> DNA ligase - faz ligações covalentes, a mais conhecida é a T4 DNA ligase

E. coli contém a enzima EcoRI -> produz a enzima EcoRI metilase -> metila adeninas que seriam reconhecidas pela
EcoRI (enzima sensível à metilação)

que catalisa a transferência de um grupo metilo sobre adeninas da sequência reconhecida pela respetiva enzima de
restrição, assegurando a sua proteção.

Tipos de corte:

o Extremidades co-adesivas (Sticky ends)

o Permite facilmente a ligação de moléculas
o Extremidades auto se encontram e ligam-se por pontes de hidrogénio, transformando-se numa
ligação covalente quando se utiliza uma ligase para unir (T4 DNA ligase)

 Extremidades rombas (Blunt ends)

o Formação de dois pontos não coesivos de DNA por um corte a direito pela enzima de restrição
o Facilita a ligação porque é possível colá-las em qualquer ponto mesmo tendo sequências
diferentes

Ligação de duas moléculas de DNA

Extremidades co-adesivas já cortadas por enzimas de DNAs diferentes são ligadas por complementaridade e as
cadeias fosfodiéster vão ser reconstruídas pela DNA ligase

Vetores:

 Plasmídeos (vetor mais comum na clonagem de DNA)

o Moléculas de DNA circular presentes em bactérias
o Conferem resistência a antibióticos, garantindo a sua sobrevivência
o São usados como vetores de clonagem, transportando genes/ fragmentos de DNA a serem
clonados dentro de uma célula hospedeira
o Têm capacidade de replicação independente

 Vetores Shuttle
o Multiplicam-se em dois ou mais tipos de células
o Tem mais do que uma origem de replicação
Os plasmídeos têm uma zona chamada de Poly Linker ou Multiple Cloning Site (MCS) => região reconhecida por
várias enzimas onde pode ser inserido um fragmento de DNA

Plasmídeo tem de conter:

o MCS -> o DNA exógeno pode ser inserido sem perturbar a capacidade de
replicação do plasmídeo ou a expressão do gene ampr
o ORI: origem de replicação
o Ampr: genes que permitem seleção, conferindo resistência -> resistente a
ampicilina, contem a enzima β-lactamase que inativa a ampicilina

Plasmídeos resistentes à ampicilina:

o pBR322
Permite a seleção azul e branca das células que contêm o insert
o pUCI9

Replicação do DNA plasmidico (DNA circular)

Quando a replicação do DNA se inicia na origem (ORI), continua nas duas direções em volta da molécula de DNA
circular até os garfos de replicação se fundirem e formarem duas moléculas. A região de origem é uma sequência
especifica necessária para a replicação da molécula de DNA circular inteira

Inserção de um fragmento no MCS

Sequência de um polylinker que inclui uma copia do local de reconhecimento para

uma das 10 enzimas de restrição indicadas.

A enzima de restrição é utilizada para cortar o plasmídeo e para gerar o fragmento com
extremidades coesivas complementares, assim, faz com que o DNA genómico seja inserido na
região do polylinker.

Ou seja:

MCS -> no plasmídeo vai ser cortado por alguma enzima de restrição (EcoRI) -> pela ação da DNA
ligase vai se ligar ao DNA genómico que foi previamente tratado com EcoRI (inserido no MCS) ->
Forma plasmídeo recombinante

CLONAGEM DE DNA EM UM PLASMÍDEO

5 passos de clonagem:

1) Seleção de DNA de interesse

2) Clivagem de DNA utilizando enzimas de restrição (gera extremidades rombas e coesivas)
3) Inserção do gene no plasmídeo com a DNA ligase
4) Introduzir em bactérias e testá-las em meio com antibiótico de seleção (células que não recebem o
plasmídeo morrem)
5) Isolar colónias em plasmídeos dentro de bactérias

OBS: biblioteca genómica - várias copias do genoma de determinado individuo

Transformação de bactérias (E. coli)

 Por choque térmico (cloreto de cálcio)

o Necessário ter células competentes  células capazes de receber o plasmídeo
o Centrifugar bactérias e ressuspender o pellet com cloreto de cálcio  os iões de cálcio
neutralizam as cargas negativas do DNA e da membrana plasmática, facilitando a passagem do
vetor pela membrana no choque
o Choque térmico  DNA entra na bactéria  gelo e depois banho maria a 42ºC
o Plaquear com o antibiótico pela qual as bactérias adquirem resistência  PCR (para saber se o
insert está lá)

PERGUNTA: Como descobrir se o insert que queremos está na bactéria? R: PCR

  Por Eletroporação
o Preparação de células eletrocompetentes
o Centrifugar bactérias e ressuspender pellet em água estéril
o Adicionar plasmídeo
o Eletroshock  destabiliza a membrana e permite a entrada do vetor na célula
o Plaquear com o antibiótico

A eficiência da eletroporação é muito maior que a do choque térmico:

o Se quisermos que cada bactéria traga um fragmento diferente: eletroporação

o Se temos um produto de PCR e queremos amplificar: choque térmico

Lise Alcalina (extração dos plasmídeos) -> retirar plasmídeos de bactérias

o Baseia-se na presença de hidróxido de sódio NaOH e de SDS (detergente)

o NaOH tem pH elevado e juntamente com o SDS vai degradar as membranas e as paredes celulares da
bactéria (plasmídeos saem)
o SDS (aniónico) vai rebentar as membranas: na sua presença todas as macromoléculas ficam com carga
negativa

Processo:

1. Romper as membranas com NaOH + SDS

2. Neutralizar com acido de potássio que precipita SDS e proteínas
3. Centrifugar-> plasmídeo fica no sobrenadante e o DNA genómico + proteínas vão estar no pellet
4. Extração do plasmídeo do sobrenadante com a extração fenol-clorofórmio ou utilizar um kit

NaOH (desnatura DNA) + SDS (lise)  Acetato de potássio  Sobrenadante com plasmídeos
Detergente Precipita SDS irreversivelmente Extrai-se com: F: C: A
aniónico (-),
remove Neutraliza NaOH - Fenol- clorofórmio
membrana
Precipita proteinas - Cromatografia de baixa

A: álcool isoemilico - ajuda a criar uma boa interface

F: fenol é básico (pH 8), tem de ser saturado com Tris HCL até chegar no pH certo. pH 5 (baixo) do fenol é utilizado para extrair RNA

C: clorofórmio precisa ser utilizado pelo menos 2x para ficar bem limpo, é muito volátil

GENES DE SELEÇÃO

Para identificação de bactérias (colónias) transformadas com plasmídeos, normalmente utiliza-se antibióticos
(inibem ribossomas e a tradução em geral).

Seleção de colónias “Azul e Branca”:

 Operão Lac
o Tem um promotor e 3 genes. Um destes genes é para a β-galactosidase
o O gene do operão Lac não vai funcionar quando estiver na presença do repressor, este impede
que a RNA polimerase se ligue -> não ocorre a expressão génica
Quando se adiciona a lactose no meio esta liga-se ao repressor e este vai embora

O plasmídeo deve ter um gene de resistência a outro antibiótico de maneira que possamos ter um antibiótico para
selecionar as células

o Manter a estirpe pura -> as que não forem resistentes morrem

o Outro antibiótico para selecionar as células transformadas pelo plasmídeo

As subunidades da enzima β-galactosidase (e o respetivo gene) podem ser divididos em dois polipéptidos: LacZα e
LacZΩ (individualmente não funcionais), que se ligam espontaneamente originando numa enzima funcional.

A bactéria produz o polipéptido da enzima, o LacZΩ, e o plasmídeo traz o LacZα, originando β-galactosidase.
 Quando esta enzima é funcional e plasmídeo é transcrito na célula de interesse e expressado com IPTG, o LacZα
transcrito irá formar uma enzima funcional com o LacZΩ, e na presença de X-Gal a enzima β-galactosidase vai clivar
o X-Gal, formando colónias azuis

LacZ α (plasmídeo) + LacZ Ω (bactéria)  β-galactosidase

Insert  inativa produção de LacZ α  Não há β-galactosidase

*IPTG

o Inativa o repressor da β-galactosidase, induzindo a expressão do LacZ

o Mimetiza a alolactose e desreprresiona o sistema
o Muita afinidade para com o repressor do que a lactose  liga-se ao repressor removendo e permitindo a
síntese da β-galactosidase

É possível adicionar o insert no MCS do gene LacZα. Após a expressão com IPTG não haverá produção de LacZα,
apenas a produção de LacZΩ, ficando assim com uma enzima não funcional, que não vai clivar o X-Gal, dando
origem a colónias brancas com insert funcional.

É necessário adicionar IPTG para bloquear o repressor e permitir a síntese da β-galactosidase que irá cortar o X-gal.

*X-Gal

o É um análogo da alolactose que é substrato para a β-galactosidase

o Galactose + X-Gal -> produto insolúvel de cor azul que precipita formado por uma dimerização- ligação
dupla

Clonagem + : células brancas, insert (DNA de clonagem) impede a transcrição dos genes no operão Lac  não há
formação da β-galactosidase

Clonagem - : sem insert, ou insert em local errado  β-galactosidase  células azuis

OBS: Às vezes, mesmo estando branca a cultura de bactérias podemos não ter a certeza que o insert que queremos
está lá (pode ser outro insert). Para saber que é o insert correto é preciso sequenciar

NOTA:

o O Mg2+ é necessário para fazer PCR porque é um cofator das polimerase e DNAses
o O EDTA protege o DNA para retirar o Mg2+ da solução que deixa de ser o cofator de DNAses

Seleção Negativa -> gene letal (ccdB)

o Outra forma de seleção de bactérias transformadas com um plasmídeo contendo um “insert”

o Proteína ccdB interfere com a atividade da Topoisomerase II provocando a morte das células bacterianas
transformadas com o plasmídeo.
o A clonagem de um “insert” no interior do gene ccdB torna o produto da sua expressão inativo (a proteína
ccdB), então as células transformadas com um plasmídeo contendo um “insert” no interior do gene letal
sobrevivem

Clonagem de produtos de PCR

 TA – CLONING -> pGEM-T-Easy

o Forma mais comum de clonar produtos PCR (recorrendo à T4 ligase)
o Produto PCR: A Taq polimerase adiciona uma adenina à extremidade 3´ das cadeias
que amplifica

OBS: No PCR: a temperatura de annealing depende do comprimento do primer e da quantidade de

ligações G Ξ C (ligação mais forte, é necessário uma maior energia, eleva-se a temperatura quanto mais G Ξ C
tiverem).

Depois do primer inserido, faz-se a seleção azul e branca

 TA – cloning (usando TOPO-cloning)

 o Não usa DNA ligase
o O vetor de clonagem vem ligado de forma covalente à enzima Topoisomerase I nas duas
extremidades T.

Clonagem Direcional: importante quando se trata de uma sequência que se pretende expressar. Tem de ser
inserida na direção correta.

A sequência CACC necessita ser adicionada no início (5´) do primer foward de forma a garantir que a clonagem
direcional ocorra na direção pretendida do produto PCR. Ou seja, para se utilizar este vetor, é necessário adicionar o
primer da esquerda (foward) à sequência CACC na extremidade 5´ que irá ser complementar à sequência GTGG (co-
adesiva - usa Topoisomerase I) do plasmídeo

Primer foward -> Vai conter a seq CACC -> CACC complementar a GTGG no plasmídeo
Extra na seq do
produto de PCR que
vamos inserir

Vetores Shuttle: Fago λ  permite inserir qualquer coisa no plasmídeo

Genoma do fago é inserido no genoma da bactéria

 Ciclo lítico  Ciclo Lisogenico

Transcrição do gene λ DNA fago λ inserido no genoma da bactéria

Replicação do genoma do vírus na bactéria Não há lise celular

Lise celular -> usada para formar biblioteca

genómica

Cultura de bactérias com fagos

1. Fagos + E.coli em solução de agarose

2. Aquecer a 50ºC
3. Colocar em placas de agar
4. Incubar a 37ºC durante a noite

Placa + : possui bactérias, colónias formadas -> ciclo lisógenico

Placa - : os fagos multiplicam-se e lisam as células das bactérias. A placa fica com buracos cheios de fagos (onde era
suposto ter bactérias) -> ciclo lítico

O fago λ no genoma bacteriano insere-se sempre no mesmo sítio: entre os genes gal e bio e liga-se sempre na
região att. O fago insere-se no genoma de E.coli por recombinação entre a região att do fago e da bactéria. As
sequências att podem ser inseridas no plasmídeo criando regiões para

1) Integração no genoma bacteriano

2) Recombinação entre plasmídeos

BIBLIOTECAS DE EXPRESSÃO

Biblioteca de expressão (bibliotecas de cDNA)

Uma biblioteca de cDNA é uma coleção de clones de DNA complementar derivados de toda a população de
mensageiros da célula. Uma biblioteca de genes pode ser uma colónia de bactérias (e se for contruída utilizando um
plasmídeo ou um cosmideo) ou placas de fagos (se o vetor utilizado for um fago) com DNA recombinante

Preparação:

1. Extração de RNA dos tecidos da célula com fenol acido

2. Purificação do mRNA: cromatografia por afinidade com a cauda poliA (resina com poliT)
3. Síntese de cDNA (cDNA fita dupla - clonagem direcional em algum plasmídeo)
4. Transformação em bactérias
5. Extração do plasmídeo
o Plasmídeo isolado pelo tamanho do insert -> digestão por enzimas de restrição
o Sequenciação do DNA no insert -> sequenciamento de DNA
o Plaqueamento em bactérias e seleção de colónias

Síntese de cDNA

 Método 1

cDNA sintetizado (por transcriptase reversa)  Looping (síntese complementar do cDNA - incubado com DNA
polimerase para sintetizar a segunda cadeia)  cDNA de cadeia dupla (S1 nuclease corta o looping)

 Método 2

cDNA é sintetizado (enzima transcriptase reversa liga ao primer oligo dT e sintetiza cDNA, adiciona dNTPs)  RNAse
H degrada o mRNA  RNA polimerase I sintetiza a cadeia reversa a partir de fragmentos restantes do mRNA  T4
DNA ligase liga tudo que tiver solto

Vetores

 Necessários para a inserção do cDNA ou outros DNAs para formar a biblioteca genómica

Fago Lambda

Podem distinguir-se dois tipos de fagos de clonagem: os de inserção e os de substituição. Nos fagos de inserção
podem se clonar fragmentos de DNA com um máximo de 1-5 kb. Nos de substituição podem se clonar até
fragmentos com 10-20 kb. Nos de substituição é removida uma parte do genoma do fago que não é essencial à sua
viabilidade e pode ser substituída com DNA exógeno. Apresentam algumas vantagens em relação aos plasmídeos,
nomeadamente como vetores para construir bibliotecas de genes. Podem ser plaqueados em alta densidade e do
DNA nas placas fágicas está mais prontamente acessível ao rastreio de genes do que DNA de plasmídeos no interior
de células bacterianas.

 Clonagem por inserção: + usada por cDNA 1-5Kb

Sequências cos: necessárias para a

recirculização do fago no interior de
1. Sem inserção de fragmento de DNA

Alto nível de expressão do gene λCI e λCII. A presença do

repressor CI inibe o ciclo lítico

2. Inserção do fragmento de DNA (EcoRI fragment)

Gene λ com a presença do insert de DNA. A falta do repressor CI

A inserção de um fragmento de DNA no interior do gene cI do fago
permite o crescimento lítico dos fagos
λ leva à falta de repressor do ciclo lítico e à criação de estirpe lítica
(não lisogénica)

No ciclo lítico, o repressor (gene cI) está inativo, no ciclo lisógenico

o repressor está ativo e previne o desenvolvimento do fago. Nas
extremidades do DNA fágico linearizado estão pequenas sequências de cadeia simples que são complementar, o
que permite a formação da forma circular -> sequência cos

Se uma bactéria tiver um fago lisógenico vai ter moléculas repressoras cI, o que impede que a bactéria seja infetada
de novo.

Inserção no interior do gene cI pode ser identificada como mutantes de estirpes “hfla” - alta frequência de lisogenia
de E.coli

A interpretação da seq do gene cI impede a formação do seu produto correto, o que abre caminho à lise celular e à
formação de placas fágicas “claras” que podem ser selecionadas com pouca probabilidade de erros -> SELEÇÃO

Ou seja:

Fragmento de DNA inserido no interior do gene cI do fago (expressão do gene cI leva à presença de um repressor
que inibe o ciclo lítico)  Falta de repressor do ciclo lítico  Permissão da ocorrência de ciclo lítico  Lise celular,
formação de placas fágicas  Seleção (mutante de estirpe de E.coli - hfla)

 Clonagem por substituição: + usado para clonar DNA genómico -> fragmentos 10-20 Kb

A substituição do DNA contendo os genes red e gam no vetor λEMBL3, entre dois pontos de restrição BamHI por
inserts de ~10-20 kb, permite o crescimento lítico em estirpes de E.coli que contem o bacteriófago lisógenico P2. P2
interfere com a infeção de fagos que contenham os genes red/gam Funciona como AGENTE DE SELEÇÃO

OU SEJA:

Fago λEMBL3 contendo genes red/gam (com pontos de restrição BamHI) + Fragmento de DNA criado pelo corte
com BamHI  Substituição do gene red/gam pelo fragmento de DNA  Crescimento lítico do fago λ em E.coli

Expressão do gene red/gam inibe o crescimento lítico

OBS: AGENTE DE SELEÇÃO  bacteriófago lisógenico P2 -> interfere a infeção dos fagos que têm o gene red/gam

COSMIDEOS (inserts 35-45 kb) -> circular, muito pequeno

Plasmídeos que têm os locais cos das extremidades do fago λ -> sequencias cos que lhes permite serem
empacotados em capsidas (extratos de empacotamento. São utilizados como veículos de clonagem molecular

Quando linearizados (cortados em enzimas de restrição nos MCS)  Ligam-se a fragmentos de DNA e formam
largos tandems  Inserção em fagos λ (Fago λ + (DNA + cosmideo))  Infeção em E.coli (fago não insere no seu
genoma)  BIBLIOTECA GENÓMICA (fragmentos de DNA diferentes para cada bactéria)

Os cosmideo são introduzidos em E.coli via infeção e replicam-se como plasmídeos resistentes a antibiótico
específico.

Fago P1 (inserts até 100 Kb)  bacteriófago que infeta E.coli e outras bactérias

1. O vetor plasmidico P1 contém vários elementos do genoma do fago original: pac e 2 loxP sites.
 2. É digerido por BamH1 + ScaI gerando dois braços entre os quais se podem ligar 85–100 Kb fragmentos de
DNA -> Empacotamento com extrato de extrato de empacotamento (partículas fágicas produzidas aos
pedaços)
3. Utiliza-se a pacase para quebrar o DNA na sequência pac por onde começa o empacotamento (até ao
máximo de 115 Kb) nas cabeças do fago.
4. Inserção em E.coli -> molécula circular: produto do gene cre (existe na bactéria) liga sequências loxP
5. Induz o ciclo lítico em P1

Vetor plasmidico P1 contem pac e 2x loxP  Digerido por BamHI + ScaI, formando dois braços  Liga-se a
fragmentos de DNA (85–100 Kb)  Empacotamento com extrato de empacotamento (usa-se a Pacase para quebrar
o DNA na seq, por onde se inicia o empacotamento) Inserção em E.coli  Indução do ciclo litico em P1

CRE-LOX: sistema de recombinação

o Perda de função -> retirada do gene modificado ou da resistência

o Ganho de função -> retirada de um pedaço que impede o funcionamento do gene

o Consiste em uma única enzima, cre recombinase, que recombina um par de sequências alvo- lox
o Enzima cre e o local lox são derivados do P1. Colocar sequência lox de forma adequada permite que os
genes sejam ativados, reprimidos ou trocados por outros genes.
o Cre - bactéria ; lox - cosmideo

BAC Vector: bacterial artificial chromosome

o Permite inserts 150-200 kb até 300 kb (maiores fragmentos)

o Foi utilizado para sequenciar o genoma humano
o Mais usados para preparar bibliotecas genómicas de alto peso molecular
o Baseados no plasmídeo F da E.coli
o pBeloBAC11
CMR: resistência ao cloramfenicol

PAC Vector

o PAC existe nos vírus

o EBV ori P -> permite replicação em mamíferos
o Resistência a blasticidida -> quando em cultivo de células de mamíferos
(SV40 - promotor)
o Contêm sequencias P1, mas estas são introduzidas diretamente em plasmídeos E.coli, permitindo a
inserção de fragmentos de tamanho compreendido entre 130-150 kb

YAC: Yeast Artificial Chromosomes

o Vetor eucariota produzido a partir de leveduras (Sacharomyces cerevisae)

o Constituídos por:
 Telómeros: necessário para a replicação estável e completa dos cromossomas
 Centrómero: necessário para ocorrer a mitose
 Pontos de origem de replicação de levedura

o Podem albergar fragmentos de DNA de 600 – 1400 Kb (permite clonagem de moléculas grandes)
o Afeta a instabilidade e rearranjo dos inserts

Vetor YACs cortado com EcoRI e BamH1 (separa-se em dois braços)  Recombinação com fragmentos
cromossomais grandes (DNA ligase)  Clonagem em um YAC

OBS: em cada braço do vetor há genes de seleção

Os marcados de seleção, utilizados em leveduras não são com base em antibióticos, mas sim a utilização de
mutantes auxotróficos (tornam as células deficientes).
Ex: YAC tem um gene que participa na formação de uracilo e um gene que participa na formação de triptofano.
Tendo estas mutações as células não conseguem sobreviver em meio mínimo que não seja suplementado por
uracilo e triptofano. Assim se for inserido nas células este YAC vai fornecer-lhes esta enzima funcional  sabemos
assim quais as células transformadas quando crescem sem adição de triptofano e uracilo

*pYAC4 (vetor YAC)

 Ori: permite a replicação do YAC em células bacterianas (E. coli) desde que estejam sob a forma circular e
sem ”inserts” (pelo menos demasiado grandes)
 ARS1: permite a replicação em levedura.
 CEN4: centrómero. Necessário para replicação assegurando que o cromossoma artificial possa ser
duplicado e sujeito ao processo normal da mitose.
 TEL: necessários para a replicação estável e completa dos cromossomas
 AmpR: gene de resistência à ampicilina
 URA3, TRP1 e HIS3: podem complementar mutações auxotróficas (genes de seleção) específicas em
leveduras e em E. coli

PERGUNTA: Em que tipos de estirpes o YAC4 deve ser usado? R: bactérias (Ori) ou leveduras (ARS1)

Seleção para presença de TRP1 e URA3

Descobrindo a presença de TRP1 e URA3, assegura que os transformantes terão de ter os dois braços do
cromossoma. Meio com uracilo e triptofano -> sobrevivem estirpes que contenham TRP1 e URA3

Para saber se tem o inoculo ou não, poe-se uracilo e triptofano no meio. As que sobreviverem têm TRP1 e URA3
(enzima e marcador - marca cromossomas e plasmídeos)

Mammalian (Human) Artificial Chromosomes (HAC)

o Potencial limitado
o Pedaços de cromossomas ou cromossomas inteiros
o Se transformarmos células com construções lineares as células que sobrevivem têm de sofrer uma
recombinação e ter o DNA inserido no seu genoma
o Se transformarmos com material cíclico/ circular (ex: plasmídeos) este também vai entrar na célula
mesmo que o DNA fique fora dos cromossomas.

Vetor HAC Vetor Convencional

 DNA genómico com o seu próprio promotor  Integra-se no genoma do
 Só é necessário uma copia hospedeiro
 Não tem limitações do insert de DNA  Tem de inserir várias copias
 Não silencia transgenes  Limitação do tamanho do insert de
DNA inserido
 Silencia transgenes
Problemas:
Constituintes:
o Provoca mutações
o Nº de copias imprevisível o Centrómeros
o Silenciamento dos transgenes (ex: por metilação) o Telómero
o Poucas quantidades de DNA o Origem de replicação
o Gene
Vantagens:

o Não é necessário integração, o cromossoma vai ter centrómero e assim sempre que a célula se divide
passamos a ter as duas células com esse cromossoma (funciona como um cromossoma à parte
independente)
o Não se multiplica muito no interior da célula
o Não silencia os genes; podem ser utilizados fragmentos de DNA muito grandes

Genes repórter

o Permite ver se a construção de interesse está lá

 o Construção: Gene de seleção + GOI + Gene repórter
o Gene facilmente detetado por presença de fluorescência e que permite investigar as características dos
outros genes com quais se funde

Tipos:

 Glucoronidase (GUS)
o Isolado de E.coli.
o Pode ser determinado por fluorescência

 Luciferase
o Retirado dos pirilampos, na presença de ATP
o A reação produz luz amarelo - esverdeada (luminescência) com um pico de emissão a 560 nm.
o Quando catalisada pela Luciferase codificada pelo gene isolado de Renilla a reação liberta luz
com um pico de emissão a 475 nm.
o O uso simultâneo do sistema luciferase/luciferin e luciferase/coelenterazine (Renilla) permite
criar um sistema repórter duplo
o Possui grande afinidade ao seu substrato (luciferina)

 GFP – Green Fluorescent Protein

o Gene isolado de alforrecas fluorescentes (Aequorea victoria).
o As proteínas são revelados por fluorescência na presença de luz ultravioleta.
o Existem muitas versões modificadas deste gene (p.ex. para utilização em plantas ou para
utilização em animais).

EXPRESSÃO DE TRANSGENES
Transgenes necessitam sempre de uma região promotora e de uma região terminadora para poderem ser
expressos.

Se for um gene eucariota ou um gene para expressar em eucariota é necessária também uma zona de
poliadenilação (necessária para exportar o mRNA do núcleo para o citoplasma).

Para serem expressos corretamente os transgenes terão de se enquadrar no “ambiente” genómico geral do
organismo hospedeiro:

1) Promotor: tem de ser reconhecível por uma RNA polimerase expressa no hospedeiro (normalmente a
RNA polimerase do próprio hospedeiro)

2) Estrutura do gene: (presença de intrões) deverá estar de acordo com o tipo de hospedeiro utilizado (ex:
não é expectável que células procariotas procedam à maturação do transcrito primário de um gene
eucariótico) -> proteína vai ser lida de uma ponta a outra e gerar codões stop

*Um gene eucariota só vai ser expresso numa célula procariota se lá não houver intrões. Isto acontece porque uma
bactéria não tem a capacidade de realizar o splicing do RNA (retirar intrões e colocar exões). Ou seja, só podem ter
lá exões

3) Codões do gene: poderão ter de ser adaptados ao uso de codões do hospedeiro. Como o código genético
é degenerado existem vários codões diferentes para o mesmo aa

Para serem corretamente expressos, isto é, serem corretamente transcritos e traduzidos os transgenes devem
conter: uma seq. promotora, uma seq. codificante e uma seq. terminadora (nos eucarióticos esta última região deve
conter regiões de poliadenilação) -> poliA importante para a terminação da transcrição

Site - Directed Mutagenesis

 o Estudar papel de aminoácidos, domínios proteicos, na atividade de uma enzima ou no comportamento de
uma proteína
o Adaptações ao “uso de codões” do hospedeiro
o Obtenção de proteínas e enzimas mais interessantes (enzimas mais produtivas, maior fidelidade, etc)

*Usar codões para alterar os aminoácidos, fazendo a enzima ser alterada ou para mais ativa ou para menor ativa

Mutagénese dirigida refere-se à capacidade de se poder provocar mutações muito especificas.

o Pode se substituir especificamente um nucleótido de um gene por outro com a consequência de mudar
um aminoácido dessa proteína
o Muito utilizado para aumentar a expressão proteica em sistemas heterólogos em que certos codões são
pouco utilizados, por substituição desses codões pelos codões equivalentes.

Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit (PCR)

o São utilizados dois oligonucleotidos mutagénicos (complementares entre si) que hibridam em duas
cadeias opostas dos plasmídeos recombinantes, ambos contendo a alteração desejada
o Ferramenta para a introdução de mutações pontuais, inserções ou deleções em qualquer tipo de DNA
plasmidico
o O plasmideo completo é amplificado com primers fosforilados que vão introduzir as mudanças desejadas´
o O produto linear de PCR vai conter as mutações. Volta para a sua forma circular com a ajuda da T4 DNA
ligase, podendo ser transformado em células competentes de E.coli

Ou seja:

Plasmídeo amplificado com PRIMERS FOSFORILADOS que induzem a mutação  Produto de PCR com mutações 
Circularização do plasmídeo com T4 DNA ligase  Transformação em E.coli

Mutações = afeta só um nucleótido, primer vem com o nucleótido que se quer trocar

Inserções = seq de nucleótidos a mais que vai ser inserido quando se realizar PCR (na ponta ou no meio). OBS: os
nucleótidos adicionais não se ligam ao DNA por completo, só se ligam em algumas partes

Deleções = primer começa em outro lugar, excluindo a parte que não queremos

O produto do transgenes:

Deverá ser expresso no momento certo e em quantidade apropriada:

1) Promotor: regulável (ser expresso quando necessário, ou manter-se inativado quando necessário) e ter
um nível de expressão adequado

2) Número de copias: adequado à quantidade de produto pretendido

3) Produto de expressão do transgenes: localizado nas zonas celulares que melhor correspondam aos
objetivos pretendidos (ex: extração e purificação mais fácil)

4) Hospedeiro: deverá assegurar a obtenção do produto pretendido

o Deverá ser capaz de proceder às modificações pós-tradução necessárias (ex: glicosilação exata
das glicoproteínas)
o Não degradar o produto

Promotores e Regiões terminais (terminadores):

 O promotor do operão Lac

o O repressor liga-se ao operão quando não temos lactose no meio (pode também se usar IPTG que tem
maior afinidade ainda com o repressor e quando este se liga o sistema volta ao normal e a RNA
polimerase pode funcionar).
o Operão indutivel (regulação negativa-> repressor)
o Na ausência do substrato a ser utilizado, um repressor liga-se ao operador impedindo que a RNA
polimerase se ligue ao promotor não havendo transcrição
 o Na presença do substrato este liga-se ao repressor fazendo com que deixe de ter afinidade com o
operador

IPTG  Inativa repressor do operão lac  Transcrição procede

Logo, o promotor é induzido pela adição de IPTG

 O promotor Trp
o Para a regulação deste promotor, utiliza-se o análogo do triptofano: 3-β-ácido indoliacrílico
(IAA)
o Funciona por feedback -> quem vai reprimir o sistema é o próprio produto do gene. Quando o
triptofano está em excesso, liga-se ao repressor que sem o triptofano não é repressor
o Operão repressivel (repressão negativa) -> repressor inativo
o Repressor inativo na ausência do produto a ser sintetizado não se pode ligar ao operador,
havendo transcrição
o Quando existe a substância, ela própria se liga ao repressor inativo fazendo com que ele se ligue
ao operador impedindo a RNA polimerase e assim a transcrição

Triptofano  Ativa repressor do operão  Não ocorre a transcrição

Logo, o promotor induzido com a falta de triptofano (ou seu análogo IAA) no meio

Baixos níveis de triptofano, o repressor fica inativo, e a transcrição ocorre

Altos níveis de triptofano, ativa o repressor (liga-se a este) e a transcrição não ocorre

 Promotor T7 -> sistema em dois passos

Vetor de expressão de duas etapas é um sistema baseado no bacteriófago T7 RNA polimerase e no promotor tardia
T7 de uma E.coli que contem a copia do gene T7 RNA polimerase no seu cromossoma.

Quando a transcrição a partir do promotor lac é induzida por IPTG, o T7 RNA polimerase é transcrito
e o mRNA é traduzido em uma enzima. As moléculas de T7 RNA polimerase produzidas inicia a
transcrição em altos níveis a partir do T7 promotor no vetor expressão. A larga quantidade de mRNA
produzido a partir do cDNA clonado, é traduzido em abundantes produtos de proteínas.

Coloca-se as bactérias a crescer e adiciona-se IPTG ao meio, o sistema inicia e começa a sintetizar
RNA polimerase T7 que vai reconhecer o promotor do plasmídeo dando início à transcrição.

T7 RNA polimerase é uma RNA poli que depende de DNA (enzima do bacteriófago T7 E.coli vai estar clonada com
genes que produz T7 RNA poli)  Sintetiza mRNA a partir da seq promotor T7  Transcrição eficiência de uma
molde de DNA contendo promotor T7  mRNA produzido - produção de altos níveis de proteínas recombinantes

Clonagem e expressão em leveduras

AOX1 -> promotor mais usado  funciona bem em álcool  indutivel

*pPIC9-lb  vetor para utilização em Pichia pastoris  levedura metilotrofica

Integra no genoma da levedura 

evita instabilidade plasmidica
 o AOX1: promotor
o Ampr + ColE1: permite replicar em E.coli
o His4: genes de seleção em células Pichia  em meio com histidina: vão crescer células com o gene
funcional

OBS: para inserir em leveduras, retira parte que replica em E.coli (Ampr + ColE1) e insere eletroporação => Antes
disso “cassete de DNA” é preparado e multiplicado em E.coli (para serem expressos)

A estirpe utilizada deve ter uma mutação auxotrófica para a histidina e o plasmídeo vai ter um gene da histidinol
desidrogenase funcional para que só sobrevivam as bactérias/ leveduras que tiverem o plasmídeo

Desvantagem: estando inserida dentro da levedura se multiplica vai lá estar o gene e não ocorrem perdas de
plasmídeo.

Inserção em Levedura (pós cultivo em E.coli)

Inserção por recombinação de um gene de interesse (sob controlo do promotor AOX1) no genoma da levedura da
levedura Pichia

Fragmento do plasmídeo linearizado (Ampr + colE1) + Região do gene AOX1 no cromossoma da levedura =>
Inserção do gene de interesse sob controlo do promotor AOX1 no genoma da levedura

Plantas e células Vegetais

o Transferência de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens

O plasmídeo Ti (tumor inducing plasmid) tem genes que são transferidos pela bactéria para dentro das células
vegetais -> o DNA transferido dos plasmídeos das bactérias chama-se T-DNA.

O T-DNA sob a forma de DNA monocaternário, pode ser transferido para as células vegetais onde os genes nela
compreendidos podem ser expressos, em particular pelos seus promotores serem eucariotas e, por conseguinte,
reconhecidos pela RNA polimerase II eucariota e não pela bacteriana.

Organização do T-DNA selvagem:

Os mRNA transcritos destes genes são poliadenilados e têm presença de CAAT- e TATA-BOX características dos
genes eucariotas.

O plasmídeo Ti é uma molécula circular de DNA de cadeia dupla que além do T-DNA possui ainda um grupo de
genes VIR. Durante o processo infecioso, os genes VIR são ativados por sinais químicos provenientes de um
ferimento nos tecidos vegetais e os seus produtos de expressão vão medir a transferência e integração do T-DNA no
genoma de uma célula vegetal.

O Agrobacterium de maneira constitutiva tem sempre algumas moléculas do produto da zona de virulência (genes
VIR A e VIR G que produzem proteínas que estão sempre dentre da bactéria. Quando aparecem açucares e
Acetoseringonas (produzidos pelas plantas) a bactéria dirige-se para a fonte desses exudados e cria canais).

Quando Acetoseringonas e açucares entram dentro da bactéria ligam-se à proteína VIR A que então se liga à
proteína VIR G, e este complexo liga-se a vários promotores aliviando o sistema de virulência (induz)-> os genes VIR
começam-se a produzir. VIR B participa na formação dos canais de ligação à célula vegetal

Os produtos dos genes VIR D1 e VIR D2 vão reconhecer a Left-border e a Right-Border ligando-se a essas regiões e
cortam o plasmídeo e é essa copia monocatendária que vai ser inserida dentro da célula vegetal -> o resto do
plasmídeo depois volta a se ligar. VIR E participa no transporte porque vai para dentro da célula vegetal.

Plasmídeo Ti (200 kb)

 o T-DNA (genes eucariotas)
o Left border e Right border
o Região de virulência  genes que trabalham no processo infecioso da bactéria
o Origem de replicação  plasmídeo replica em Agrobacterium
o Catabolismo de opinas  para a sua alimentação

Plasmideo TiC58 => contem região T-DNA que é transferido para as células vegetais sob a forma de DNA
monocaternário para os seus genes serem expressos pela planta

Genes do T-DNA

1. Que promovem a biossíntese de auxinas e citoquinas => estimulam a proliferação celular e formam
tumores (galhas)
2. Promovem síntese de opsinas (plantas produzem para as bactérias usarem )

*Sistema de infeção da A. tumefaciens

VirA + VirG => região de virulência (acetoseringona ajuda) -> são proteínas que se encaixam

VirB => faz ligação com a célula vegetal

VirD1/D2 => complexo de proteínas gera várias copias de T-DNA

VirD2: formam um complexo com T-DNA, transportando-o para dentro da célula vegetal  VirB facilita entrada 
VirE2: proteínas que vão proteger o T-DNA (suscetível a DNAses)  T-DNA vai se introduzir no genoma da planta
(transformação genética)

O que faz a Engenharia Genética?

Substitui os genes que se encontram entre o Left-border e o Right-

Border por outras construções genéticas. O Agrobacterium transfere para o núcleo das células qualquer DNA que se

Para que a transferência genética tenha lugar não é necessário que o T-DNA e a região VIR se encontrem na mesma
molécula de DNA (plasmídeo Ti).

o Isso permitiu criar vetores (shuttle) menores que contenham o T-DNA criado em laboratório enquanto os
genes VIR são mantidos num segundo plasmídeo (Ti)

Vetor Shuttle via Agrobacterium

o Preparação e multiplicação em E.coli e utilização em Agrobacterium

o Eliminação da zona de virulência, mantem T-DNA => bactérias não vão provocar tumores
o Ri Ori: origem de replicação em Rhizobium
o ColEi Ori: origem de replicação em E.coli

Transferência de genes por Biolística

o Bombardeamento com microprojécteis

o Método de transferência direta de genes numa célula, com o objetivo de criar organismos transgénicos. É
o método de transferência direta mais usado para transformar células vegetais.
o Consiste na propulsão dos genes de interesse no interior das células com a ajuda de um canhão de DNA,
com o qual se modifica o DNA da célula.

Vários tipos de equipamento: da pólvora ao hélio:

o Microprojécteis: partículas de tungsténio e partículas de ouro

o Absorção de DNA sobre as partículas de ouro por precipitação com Ca+ + espermidina (faz DNA ser
absorvido em partículas)

As primeiras variedade Bt de milho - obtidas via biolistica

Possibilidade de transformar simultaneamente com duas construções de DNA:

1. Gene de interesse e
2. Gene de seleção (e gene repórter)

Em certas descendências existe a possibilidade de selecionar plantas contendo unicamente o gene de interesse ->
gene de seleção tem de ser eliminado depois

A transformação por biolística é uma alternativa à transformação das plantas por Agrobacterium tumefaciens, de
células de levedura, fungos, insetos e em particular na transfecção de células de mamíferos, já que não requer
sequências exógenas para permitir a integração do fragmento de DNA.

Plantas transgénicas no mercado:

a) Resistentes a Herbicidas: permite à empresa dar a possibilidade aos produtores para aplicarem o
herbicida sem danificarem a cultura -> permite diminuir tratamentos fitosanitários
b) Resistentes a Pragas (insetos).

*RESISTÊNCIA A HERBICIDAS

 Fosfinotricina (PPT) e Bialafos

o Bialafos - Tripéptido produzido pelo Streptomyces hygroscopicus
Inibidor da Glutamina sintase -> levam à morte celular da planta
Produto “biológico”
o Glufosinato - Sal de amónio de fosfinotricina (produzido sinteticamente)
Inibidores da enzima Glutamina Sintetase (GS)

Ambos PPT e bialafos Inibem a enzima Glutamina Sintetase (GS) -> leva à acumulação de amónio nos tecidos
vegetais e à morte das plantas. => Herbicida bom contra ervas daninhas

Planta transformada possui genes de resistência bar e pat  codificam para a enzima Fosfinotricina
acetiltransferase (PAT), prevenindo a morte das plantas

 Herbicida Glifosato (Roundup - Monsanto)

o Glifosato inibe a enzima EPSPS interferindo na síntese de aminoácidos aromáticos (expressa nos
cloroplastos)
o O glifosato é uma substância ativa do herbicida

 Gene mutado aroA - isolado de Salmonella typhimurium, codifica para uma isoforma da enzima EPSP não
reconhecida pelo glifosato. (plantas transgénicas de tomate, tabaco e milho).

Planta transformada possui genes de resistência aroA  transforma a EPSPS para uma isoforma EPSP que o
glifosato não reconhece

As variedades da Monsanto – Roundup Ready

A) Soja, Algodão e Colza são portadoras da construção:

o EPSPS isolada de uma estirpe de A. Tumefaciens resistente ao glifosato.
o Promotor CaMV 35S com uma sequência “enhancer” e um péptido de transito para os
cloroplastos, originário de Arabidopsis ou Petunia.

B) Milho : contém um gene da EPSP de milho resistente ao glifosato (obtido por mutagénese e seleção in
vitro) com um promotor isolado do arroz.

*A MONSANTO foi adquirida pela BAYER que continua a produzir várias variedades resistentes ao Glifosato

*RESISTÊNCIA A INSETOS

Bacillus thuringiensis  genes cry  esporulação forma cristais de proteínas inseticidas

Inseticida biológico  pulverizados sobre as plantas  as larvas dos insetos ingerem e morrem

Proteínas inseticidas  toxicas  prototoxicas

Passam a ser toxicas quando metabolizadas  Libertam extremidade-N (toxica) que liga às células do intestino do
inseto  Provocam fluxo de catiões, levando à sua morte

*RESISTÊNCIA a Vírus

o Planta vai ter genes que codificam para a proteína da capsida do vírus, interfere com as funções virais

Problema: possibilidade dos novos genes poderem recombinar com genes de outras estirpes de vírus (ou de outros
vírus), complementar deficiências de outras estirpes

Papaia Transgénica resistente a virus

o PRSV  gene da cápside do vírus introduzida na papaia por biolística

o A criação de variedade transgénicas resistentes a vírus permitiu recuperar a produção.

TOMATE FLAV SAVR

o Primeira variedade transgénica homologada para consumo humano (depois foi retirada)
o Tem um gene que inibe a poligalacturonase -> é o próprio gene da poligalacturonase só que sob a forma
invertida

Tomate que dura mais tempo  Atrasa maturação  Inibição da enzima poligalacturonase (leva à maturação dos
frutos) => TÉCNICA DE “ANTI-SENSE”

Objetivo específico: Inibir a enzima poligalacturonase que ao degradar a pectina presente nas paredes celulares
leva ao amolecimento dos tecidos.

A técnica anti-sense mecanismo no tomate Flav-Savr

1. Insere-se na planta a seq reversa do mRNA da PoliG que já é produzida nos tecidos dos frutos
2. RNA anti-sense emparelha com o mRNA da PoliG
3. Formação do RNA híbrido (dupla cadeia)
4. RNA híbrido não é reconhecido e traduzido pelos ribossomas
5. É degradado pela RNase H.

Resultado: muito menor quantidade de PoliG. Retarda amolecimento dos tecidos

Golden Rice - transgénico

É uma variedade geneticamente modificado através da engenharia genética para sintetizar o β-caroteno, um
precursor da vitamina A . A falta da vitamina A nos países menos desenvolvidos tem provocado cegueira infantil, ou
até morte precoce por doenças infeciosas.

Amarelo  β-caroteno  pré vitamina A

SISTEMAS DE EXPRESSÃO EM CÉLULAS DE INSETOS

Insetos possuem mecanismos de modificação pós-tradução que existem nas células de mamíferos.

Proteínas recombinantes são menos alergogénicas e funcionalmente mais similares às proteínas nativas dos
mamíferos do que quando expressas em leveduras e outras células eucariotas

Baculovirus (AcMNPV):

o Vírus que infetam artrópodes (maioritariamente insetos)

Vírus infeta célula  Formação de corpos de oclusão (polihidrina que forma)  Proteção das partículas virais do
stress ambiental

AcMNPV -> células de inseto infetadas -> produzem proteínas

O genoma do vírus AcMNPV 130 kb o que torna difícil a sua manipulação. A preparação da cassete de DNA e a sua
amplificação fazem-se em células de E.coli

Um plasmídeo contendo uma cassete de DNA formada pelo gene de interesse flaqueado por sequencias iniciais e
terminais do gene da polihidrina e sob o controlo do promotor deste gene é transfectado para as células de inseto
em simultâneo com DNA linearizado do vírus. No interior das células o gene da polihidrina existente no genoma do
vírus é substituído por recombinação homologa pela cassete de DNA. O vetor vai ser o próprio vírus que vai ficar
sem o gene da polihidrina, não tendo a possibilidade de se replicar sob a forma infeciosa.

Geração do vírus recombinante (recombinação homologa) - CLONTECH System

Produto PCR com GOI  Clonado em BacPAK (vetor de transferência - contem forte promotor da polihidrina) 
Transformação em E.coli  Co-transfeção em sf9 e sf21 (células de insetos) => BacPAK6 genoma viral modificado e
linearizado do AcMNPV com seq lacZ

OBS: GOI vai ser transferido para o AcMNPV por recombinação homologa quando ambos tiverem co transfectados
nas células do inseto

CLONTECH System

o Vai restaurar a forma circular do genoma do vírus

o GOI sob controlo do promotor da polihidrina vai substituir o gene da polihidrina no genoma viral (mesma
seq promotora)
o Depois é fácil a purificação do virus

Na utilização de AcMNPV para produção de proteínas em células de inseto, o gene de interesse é co-transfetado
para as células de inseto juntamente com o DNA linearizado do BacPAK6. O plasmídeo já traz sequências de
polihidrina e o promotor contém um tag terminal com 6 histidinas vão ter como função purificar o produto do gene.

Sistema da Invitrogene

Baculovirus recombinates  Possuem seq att do transposão tm7 da bactéria (“SITE-SPECIFIC TRANSPOSITION”) 
Ligação da zona att do plasmideo com a zona att do Bacimid recombinate

Nota: uso do promotor CMV (promotor eucariota

O transgene é clonado no plasmideo pBac-CMV5 em que o promotor da polihedrina

foi substituido pelo promotor CMV

O plasmídeo dador (contendo o transgene) é transferido para a estirpe DH10Bac de E.

coli, na qual a transposase expressa pelo plasmídeo ajudante transpõe a cassete de
DNA flanqueada pelas seq. att do transposão Tn7 para a região att do Bacmid
provocando a disrupção do gene lacZα.

O Bacmid recombinante pode ser em seguida isolado de colónias brancas bacterianas

em identificadas em placas contendo IPTG e X-gal, e transfectado para células de
inseto onde dará origem a vírus recombinante.

ANIMAIS TRANSGÉNICOS
Um animal transgénico é um animal que tem um DNA exógeno nas suas moléculas de DNA que foram introduzidas
no seu genoma. A transferência do DNA exógeno pode ser feito através da microinjeção pronuclear. A microinjeção
pronucelar consiste na injeção de uma solução de DNA contendo o transgenes de interesse, no pronúcelo de um
ovulo recém fertilizado.

Abordagens e Técnicas:

1. Microinjeção
2. Injeção intracitoplasmática de esperma (ICSI)
3. Transfeção de células-tronco embrionárias (ES).
4. Transferência nuclear de células somáticas (SCNT)
5. Transfecção
6. Eletroporação
Microinjeção

o Estímulo de ovulação de ratos com gonodotrofina

o Coleta dos óvulos fecundados
o Pró-nucleo do espermatozoide é injetado com construção transgénica (DNA)
o Injeção dos óvulos transgénicos
o Analise do PCR para saber se o animal é transgénico

Injeção intracitoplasmática de esperma

o Isolamento da cabeça do espermatozoide por sonificação (rutura da membrana) e detergente iónico

(danifica membrana)
o Encubação: cabeça + DNA exógeno
o Injeção do espermatozoide no ovulo (fertilização)
o Identificação da descendência transgénica (nem todos os óvulos podem estar transformados)

Transfecção de células- tronco embrionárias

RATO 1: coleta-se células estaminais embrionárias  DNA exógeno é introduzido nestas células

RATO 2: coleta-se embrião hospedeiro  serve de hospedeiro para as células

Embrião rato 2

+ Animal transgénico

Células estaminais rato 1

OBS: DNA exógeno pode se integrar em qualquer lugar do genoma, seja aleatório ou específico por:
RECOMBINAÇÃO HOMOLOGA => O DNA exógeno pode passar para as gerações seguintes se as células
desenvolvidas passarem a ser órgãos germinativos

*Celulas estaminais embrionárias precisam de um embrião hospedeiro, estas vão colonizar o seu hospedeiro,
surgindo um rato transgénico. As células estaminais vão contribuir para a linha germinativa, produzindo
espermatozoides que carregam DNA extra

Seleção Positiva- Negativa

o Seleção positiva: vai ter uma resistência a um antibiótico que vai fazer com que as células que são
transformadas possam ser selecionadas -> quando cultivadas com o antibiótico só vão sobreviver as
transformadas/ resistentes

O DNA exógeno inserido em qualquer lugar do genoma pela presença de um gene seletivo

o Seleção negativa: serve para as células positivas eliminar aquelas cuja inserção não está no sítio correto.
Para isto vão ser usadas duas cinases (enzimas) da timidina (tk1 e tk2) -> enzimas que transferem fosforo
para outra molécula que vêm do herpes simplex vírus (HSV)
As cinases transformam o Ganciclovir em produtos (trifosfatos) altamente tóxicos.

Este tipo de construção de DNA pode ser utilizada no knockout de genes alvo. Para esse objetivo não é necessário a
presença de um transgenes de interesse.

Células em que a construção transgénica (gene de

Células que estão com genes de interesse
interesse) não está no local certo
exatamente no sítio do genoma que queremos
Integração não especifica
Integração especifica
Sobrevive a geneticina, mas as células morrem porque
Genes HSV-tk1 e HSV-tk2 vão estar ausentes
vão ter a presença dos genes HSV-tk1 e HSV-tk2 que
porque a integração é feita por recombinação
codificam para dois tipos de timinas quinases que vão
homologa, então as células irão sobreviver
transformar o medicamento em produtos toxicos
OBS: Construção do DNA

o Gene HSV-tk1 e HSV-tk2

o HR1 e HR2: seq homologa a região alvo na célula
o Neor: gene que confere resistência a geneticina
o Tgene: gene de interesse

Logo… São dois passos:

1. SELEÇÃO NEGATIVA: para saber se a contrução transgénica está inserida em qualquer lugar do genoma
(células que vão sobreviver em meio com o antibiótico de resistência)
2. SELEÇÃO POSITIVA: contra as células que não vão ter a construção transgénica no local de interesse
(negativa porque não vai ter os genes tk - as células de interesse)

Transferência do núcleo de células somáticas - TRANSGÊNESE

*Pegar num núcleo de uma célula somática de um individuo qualquer e colocar dentro de um ovulo de outro
individuo

Engenharia genética de animais

Produtos biotecnológicos  mais fácil de purificar (menos proteínas no leite)  melhoramento do leite e aumenta
a resistência do leite a contaminações

Animais como biorreatores  Produção de fármacos de interesse:

o Inserção da construção transgénica no ovulo do animal

o Implante na mae
o Expressão do gene de interesse no animal
o Retira leite com produto
o Purificação do produto

AquAdvantage salmon

o Único animal transgénico produzido para consumo humano

o Construção do DNA ribossomal que tem um gene de uma hormona de crescimento de outro
salmão sob o controlo de um promotor de outro peixe que permite o peixe produzir proteínas
anti-congelantes
o Cresce mais rápido que o salmão não transgénico

Clonagem animal por transferência nuclear

Ovelha Dolly

 Ovulo de outro animal sem núcleo para onde é transferido um núcleo somático de outro animal
 Obtém-se um quase clone -> não é clone devido ao citoplasma do ovulo: muitas mitocôndrias provém do
dador de ovulo

Terapia genética em Humanos

A transferência de genes pode ser feita para um conjunto de células do paciente sob duas formas:

a) In vivo: injetando o vetor (contendo a construção transgénica) diretamente no paciente tentando atingir
células alvo afetadas
b) Ex vivo: introduzindo o gene em células removidas do paciente (entretanto cultivadas em laboratório)
seguindo-se a re- introdução das células no paciente

Retirar células do organismo  Transformá-las (vetor DNA + células em cultura)  Injetar no órgão do qual a célula
foi retirada
 MÉTODOS DE TRANSFERÊNCIA DE GENES PARA CULTURAS DE CÉLULAS ANIMAIS

Métodos de transferência:

 Transdução: transferência de genes mediado por vetores virais

Só as cápsides dos vírus, porque os genes são essenciais para o vírus. Vão ser removidos e os genes pertencentes à
construção de DNA vão ser co-transfectados

 Transfecção:
o Fosfato de Cálcio: neutraliza cargas negativas de DNA e precipita o DNA -> liga-se à superfície da
célula -> DNA entra por endocitose
o Vesiculas lipídicas artificiais (lipossomas): o DNA liga-se a estas vesiculas que se fudem com a
membrana plasmática o que facilita o seu acesso ao interior

Lipossomas atraem e envolvem o DNA (ligam-se)  Formação do complexo lípido catiónico- DNA  Interação do
complexo com a membrana  Endocitose (DNA ENTRA)

o Polímeros catiónicos: formam complexos com o DNA com carga positiva que o protegem da
degradação e facilitam a sua penetração nas células

DNA

+ = Complexo DNA-polimero  Adere e membrana, interações eletrostáticas  Endocitose

do complexo
Polímero catiónico
DNA vai ao
o Eletroporação: impulso eletrico de alta voltagem aplicado a uma mix contendo DNA núcleo
transgénico e células a serem transformadas

Vetores virais

o Estes vetores são normalmente modificados sendo-lhes retirados múltiplos genes essenciais e
assegurando a separação de vários dos seus componentes, sem anular totalmente o seu poder de infetar
as células do hospedeiro.
o Não é utilizado o vírus completo, mas sim como vetor. A vantagem é que o vetor procura sozinho a célula
hospedeira sem ser necessário eletroporação

Vantagens dos vetores virais:

o Funcionam por reconhecimento indireto dentro da capsida e a própria membrana celular

o Eficiência muito mais alta- os vetores virais são auto transfetados e constituídos por DNA monocatenário
homologo são 1000 vezes mais eficientes na sua inserção por recombinação homologa do que vetores
baseados em plasmídeos

Retrovírus

o Possuem a habilidade de integrar o seu DNA dentro dos cromossomas da célula infetada. Então, o gene
será inserido no genoma das células hospedeiras e, podem assim ser transmitidos a todas as células-filhas
das infetadas. Eles infetam somente as células que estão proliferando.
o γ-Retrovirus, vírus de RNA, usa transcripatse reversa para produzir um pró-virus que vai integrar no
genoma do hospedeiro e expressar o transgene

Lentivírus

o Um tipo de retrovírus, derivado do HIV, permitem também transferir material genético para células que
não proliferam ou para células refratárias para o retrovírus
o Sistema de replicação = retrovirus

Adeno associated vírus:

o Muito eficiente em conduzir a entrega do material genómico a uma grande variedade de células
o Após se ligar a recetores na superfície a membrana da cápside viral vai para dentro da célula e usa uma
maquinaria da célula para libertar um pedaço de DNA monocatenário para o núcleo
 o A recombinação homologa nativa da célula (mecanismo de reparo) introduz a mudança desejada dentro
do genoma -> pode causar mudanças de nucleótidos (inserções e deleções)
o Virus de ssDNA, precisam do adenovírus para se multiplicarem

Vantagem: o reconhecimento é direto entre as proteínas da cápside do vírus e a superfície da membrana celular. O
reconhecimento interno é simplesmente por recombinação homologa entre sequencias do próprio DNA e da
própria célula

OBS: Para a produção de partículas virais contendo o DNA transgénico de interesse, 3 plasmídeos são transfectados
para a linha celular especifica

1. Plasmídeo envelope: gene ENV e promotor

2. Plasmídeo de empacotamento: gene GAG e POL e promotor
3. Plasmídeo de transferência: com construção de DNA (sem genes do vírus e promotor LTR)

Com a inserção destes 3 plasmídeos juntos numa linha celular, vai formar o vetor viral contendo o DNA transgénico
lá dentro e este vai Transfetar as células

MOLECULAR FARMING (PHARMING)

Modificação de genes de plantas com o objetivo de que sejam capazes de produzir certas proteínas que podem ser
utilizadas como medicamentos ou vacinas.

IDEIA: passar da produção em reatores (mais cara) para a produção em campo (mais barato, larga escala)

Gene de interesse -> vetor de expressão vegetal -> Introdução em planta -> Planta transgénica -> Plantação
( produção) -> Colheita -> Extração e purificação -> Metabolitos (produto)

Molecular pharming -> expressão em culturas celulares (suspensões celulares)

Vantagem de plantas como Biorreatores

1) São seguras, não replicam patogénicos humanos

2) Cultivação simples, não precisa de ambientes estéril
3) Barato, não precisam de meios caros -> solução fertilizante
4) Expansão para a escala agrícola (hectares)
5) Expressão transiente de proteínas recombinantes (rápida expressão) -> é a expressão de um transgenes
por um breve período de tempo
6) Alta produção de proteínas recombinantes
7) Modificações pós-tradução parecidas com células animais
8) Proteína recombinante recebe um padrão de glicosilação humano autêntico.
9) Produzem IDPs: proteínas intrinsecamente desordenada, carecem de uma estrutura tridimensional,
podem ter efeito toxico na célula, mas as plantas conseguem produzir
10) Produzem proteínas extras que nem células de mamíferos e células procariotas conseguem produzir

Desvantagens:

Os custos de processos pós-colheita são altos (downstream process)

o Extratos precisam de amplo esclarecimento;

o Proteínas e metabólitos secundários (pigmentos, fenóis) precisam ser removidos.
o Processos de purificação mais eficientes estão a ser desenvolvidos

Produtos Farmacêuticos de Plantas

Forma recombinante de β-glucocerebrosidase -> 1º produto de planta aprovado (FDA) -> Tratamento da
doença de Gaucher
 Sistema de Expressão Transiente

Vetores baseados em vírus de planta -> Expressão rápida e elevada quantidade de proteínas recombinantes ->
gene de interesse e nº de plantas hospedeiras

Sistema de expressão transiente com vetores baseados em vírus, tem a vantagem de rápida expressão e de alto
nível de proteínas recombinantes

Exemplo:

TMV (tobamovirus) -> vírus produz proteínas recombinantes nas folhas do tabaco

o Sistema viral desconstruído: magnICON

o Produzia ZMapp: usado para infeções com ébola vírus

Ou seja, TMV é um sistema viral desconstruído que foi projetado para atingir altos níveis de acumulação de
proteinas recombinantes nas folhas de tabaco (ex: ZMapp usado para infeções com ébola virus )

*Expressão:

o Estável: geneticamente transformado no próprio genoma da planta (núcleo ou cloroplasto (biolística))

o Transiente: quando não é inserido no genoma da planta

Vantagens: Desvantagens:
o Baixo custo de produção o Pode se desenvolver alguma
o Produção em larga escala alergia com algum alimento
o Uso eficiente de energia
o Sistema de produção ecológico
o Menor risco de exposição a patógenos humanos / animais

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)

Sistema de imunidade adaptativa de bactérias que permite remoção de DNA exógeno

Genoma Bacteriano

 tracrRNA: importante para prender o RNA guia na Cas9

 Cas9: Proteína “associada a CRISP” , contém dois domínios de
nucleases.
 Cas: genes associados a CRISP
 crRNA: CRISP RNA -> região onde ocorre o reconhecimento da
sequencia de DNA alvo

O lócus do CRISPR é onde se encontra o material genético das bactérias, que contem fragementos de DNA de vírus que
infetaram as bactérias no passado, servindo como mecanismo de defesa contra invasores.

O locus do CRISPR contem uma proteína, a Cas9, que tem como propósito cortar o DNA num local específico. Para que
isto seja possível, a Cas9 produz um RNA guia que é feito a partir de uma sequência de DNA viral, indicando a
sequência que é preciso que seja cortada

1. DNA exógeno é clivado em pequenos fragmentos e estes vão ser inseridos no locus CRISPR (entre os
crRNAs)
2. Durante uma nova invasão, o locus CRISPR é transmitido e é maturado em pequenos crRNAs
3. A endonuclease Cas9 liga-se ao RNA maturado e quando este complexo se encontra com o DNA exógeno
por complementaridade do crRNA, e cas9 cliva este DNA

*Cas9: proteína que contem endonucleases

Engenharia genética usando a endonuclease Cas9

Direcionar Cas9 para uma seq especifica do genoma usando RNA sintético (gRNA) => RNA guia, substitui
crRNA+tracrRNA que é feito para encontrar uma seq especifica de DNA para a Cas9 clivar

NOTA: para a Cas9 ser ativada, tem que ter a presença do RNA guia

O sistema é baseado no uso da nuclease Cas 9 direcionada para uma sequência específica no genoma por um RNA
sintético (que substitui o crRNA + tracrRNA original) denominado RNA guia (gRNA).

Mecanismos de reparo de DNA

1. Reparo por recombinação homologa

Alta fidelidade  gRNA liga-se ao sítio correto para assim adicionar ou retirar genes

2. União de extremidade não homologa

Com erros  ligação da extremidade não homologa

 Suficiente para o gene “Knock-out” deletar ou inativar

Outras aplicações das Cas9

dCas9: cas “morta” quando ambos os domínios da nuclease são inativados por mutação. Só se liga a seq guiadas
pelo gRNA, mas tem a capacidade de cortar o DNA

OBS: knock down: genes vão ser reduzidos. dCas9 vai se ligar no início da transcrição e na enzima vai ser adicionado
genes ativadores, repressores ou localizadores (GFP)

O sistema CRISPR/dCas9 é uma ferramenta de regulação transcricional de genes codificantes e não codificantes de
proteínas. Pode ser usada tanto para a ativação, como para a repressão da transcrição, porque não modifica o
genoma, e com capacidade de regulação

Promotores Cas 9

o Constitutivo (CMV ou CBA ): ativos em todas as circunstâncias da célula

o Indutivel (Tet-ON): ativos com resposta a estimulos
o Promotor U6 (reconhecido pela Polimerase III, que transcreve pequenos RNAs (sRNAs): usado para a
transcrição de gRNA

A TRANFECÇÃO do gene Cas9 e sequências de gRNA

o Transdução: usando vírus (Lentivírus ou vírus Adenoassociado)

o Injeção ou eletroporação de plasmídeos
o Transfecção (lipo-transfecção) dos complexos de riboproteína (Cas9 / gRNA): usando lipídios catiónico

GENE KNOCK-DOWN - RNA de interferência (RNAi)

Silenciamento de gene mediado por RNAi (RNA de interferência)

Interferência de RNA (RNAi) é um meio de silenciar genes por meio da degradação do mRNA. O knockdown do gene
por esse método é obtido pela introdução de siRNAs no citoplasma. Uma vez introduzidos na célula, os siRNAs
exógenos são processados pelo complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC ). O complexo RISC usa os siRNA
como forma de procurar o mRNA, sendo depois clivado por uma ribonuclease

RNAi: processo celular que permite silenciar genes específicos para a produção de proteínas especificas.

NOTA: O RNAi pode ser usado para identificação de potenciais alvos terapêuticos, desenvolvimento de
medicamentos ou outros propósitos.

Expressão de shRNA/miRNA (exógeno ou endógeno) forma o siRNA

 Exógeno (citoplasma)

dsRNA exógeno  dicer degrada a cadeia sense  siRNA  RISC (complexo proteico): siRNA + proteína argo

Cliva mRNA complementar da seq siRNA

Pode-se inserir siRNA exógeno para se ligar a um mRNA em que se pretende silenciar o gene que ele produz =>
degrada mRNA

 Endógeno (núcleo)

pré miRNA  shRNA/miRNA sai do núcleo e vai para o citoplasma  Dicer degrada a cadeia sense  RISC: shRNA +
proteína argo  Cliva mRNA complementar da seq shRNA (ago cliva atividade endonucleotidica )

Pode-se inserir o gene shRNA (entregue por vetor) para este se inserir no genoma da célula e fazer o processo de
degradar um mRNA

Mecanismos de interferência da expressão gênica por:

a) miRNA endógeno: Expressão de genes específicos; transcritos gerados a partir de sequências tandem

b) siRNA exógeno: introduzido através de um parasita genético (i.e.retrovírus); transgénese e micro-injeção no

núcleo das células (usado como ferramenta em investigação científica básica e em terapias genéticas)

*Knock-down: diminui genes e proteína

A principal diferença entre o gene knockout e knockdown é que o gene knockout envolve a eliminação total de
certos genes alvo, ou a inativação destes genes alvo através de mutações nonsense pela introdução de codões de
stop na sequência, enquanto o knockdown leva à anulação de uma proteína de tradução e à degradação do mRNA .
Além disso, o gene knockout é aplicável em nível de DNA, enquanto gene knockdown é aplicável em nível de RNA.

Gene knockout e gene knockdown são dois mecanismos de silenciar a expressão de genes dentro de organismos.

O sistema CRISPR/Cas9 é um método de edição do genoma que pode ser utilizado para o gene-knockout

Gene knockdown é outro método de silenciamento de genes responsáveis pela inativação de um gene em
particular. É direcionada ao RNA, em particular ao mRNA produzido pela transcrição do gene alvo. Portanto, o gene
knockdown é uma forma de pós-transcricional regulação da expressão gênica. O RNA de interferência (RNAi),
permite a degradação do mRNA.

miRNA , siRNA , e shRNA desempenham um papel fundamental através da ligação ao mRNA alvo. O RNA resultante
é degradados pela ação da Dicer e do complexo RISC. Eles vão desligar a expressão do gene de interesse
materialmente.