Aula 10 Roteiro Imunofluorescencia e Imunodot

Reação de imunofluorescencia
indireta e imunodot
Fundamentos e Aplicações
Prof. Dr. Wilson de Melo Cruvinel / Prof. Dr. Hermínio M. da Rocha Sobrinho
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Considerações sobre Imunofluorescência
O teste de imunofluorescência (Imunodiagnóstico)

Pesquisa de anticorpos ou autoanticorpos;
Pesquisa de agentes infecciosos e seus componentes antigênicos.
Baseia-se ma capacidade das moléculas de anticorpos se ligarem
covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica
com o antígeno.
Fluorocromos são substâncias que, quando excitadas com luz de alta
energia, absorvem luz de um comprimento de onda menor e,
instantaneamente, emitem luz de comprimento de onda maior (menor
energia), fenômeno denominada fluorescência.
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Considerações sobre Imunofluorescência
Método de alta sensibilidade e alta especificidade
Teste Qualitativo:
Detecção de antígenos ou de anticorpos específicos;
Teste Semi-quantitativo:
Estima a proporção de anticorpos específicos presentes na amostra
(soro sanguíneo) através da diluição do soro (titulação).
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Leitura da reação
O microscópio de fluorescência é uma

variação do microscópio de luz ultravioleta no
qual os objectos são iluminados por raios de um
determinado comprimento de onda.
-A imagem observada é o resultado da radiação
eletromagnética emitida pelas moléculas que
absorveram a excitação primária e re-emitiram
uma luz com maior comprimento de onda.
Para deixar passar somente a emissão
secundária desejada, devem-se colocar filtros
apropriados debaixo do condensador e por cima
do objectivo.
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Microscópio de Fluorescênica
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Princípio da reação
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Técnica de Imunofluorescência Direta - IFD
O teste de imunofluorescência direta é empregado na pesquisa e na localização

de antígenos em células ou tecidos através de um anticorpo específico
marcado com fluorocromo (conjugado). O conjugado se fixa ao antígeno,
formando um imunocomplexo estável. O anticorpo não ligado é removido por
lavagens e o preparado é observado em microscópio de fluorescência.
O teste tem sido utilizado para a pesquisa de bactérias tais como: Chlamydia
trachomatis, Treponema pallidum, Legionnella sp, Escherichia coli, Estreptococos
ß-hemolítico do grupo A e vários vírus, com os do Herpes simples tipo 1 e 2, o
Citomegalovírus, os da Influenza tipo A e B, os da Parainfluenza 1,2 e 3, o da
Varicela-zoster e o Adenovírus.
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Tipos de marcação
Marcação direta
HO O
488nm c
COH 530nm
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Também conhecida como técnica de camada simples, para detecção

de antígenos em amostras clínicas utilizando-se anticorpos
específicos (monoclonais) marcados com fluorocromos.
As etapas deste procedimento compreendem:
✓Fixação do esfregaço da lâmina;

✓Tratamento com anticorpo marcado específico;
✓Incubação;
✓Lavagem para remover excesso de anticorpos marcados não ligados;
✓Visualização no microscópio de fluorescência.
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As indicações desta técnica são:
Detecção de vírus, bactérias, parasitas (Ex.: Toxoplasma gondii), antígenos de

células tumorais (imunofenotipagem tumoral) de amostras ou monocamadas
de células do paciente (secreções, esfoliações, raspados teciduais,
fragmentos teciduais de biópsia).
É utilizado também na identificação da distribuição de um antígeno no interior

de um tecido ou compartimento de uma célula.
Detecta agentes infecciosos em secreções corporais, urina, fezes e em cortes

histológicos.
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IFD – Chlamydia sp.
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Imunofluorescência Direta - IFD
Imunofluorescência direta (IFD) que permite detectar Imunofluorescência direta (IFD) biópsia de pele.
Clostridium chauvoei em esfregaços de cultivo e em Pênfigo foliáceo
impressões obtidas diretamente dos tecidos durante a
necropsia.
Carbúnculo
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bovino.
Amostras para Imunofluorescência
Pênfigo vulgar: C3
linear, intercelular, camadas
inferiores do epitélio.
Pênfigo foliáceo: IgG linear, intercelular,

intraepitelial.
Pênfigo paraneoplásico: IgG

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linear, intercelular, intraepidérmica e Homogênea.
Tipos de marcação
Marcação indireta
HO O
488nm c
COH 530nm
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Técnica de Imunofluorescência Indireta - IFI
Imunofluorescência Indireta
Conhecida como técnica de dupla camada, na detecção de anticorpos no soro do
paciente por meio de antígenos fixados em uma lâmina, na qual se aplica
primeiramente um anticorpo específico não fluorescente. Por fim, coloca-se um
anticorpo fluorescente com especificidade marcada contra determinados antígenos
do primeiro anticorpo usado para reagir com o antígeno.
Possibilita uma fluorescência mais evidente, uma vez que os anticorpos

fluorescentes (conjugado) associam-se somente aos anticorpos primários, além de
permite trabalhar com diversos anticorpos primários específicos para distintos
tipos de antígenos, sendo capaz de identificar qual a classe a qual o anticorpo
pertence.
Pode ser utilizada na detecção de autoanticorpos.
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Procedimento técnico da IFI
Para a Pesquisa de Anticorpos 1-Diluição do soro em PBS

Antígenos padronizados são
fixados a lâminas de vidro. O soro
do paciente é diluído, colocado
sobre o antígeno e incubado para
permitir a formação do complexo
antígeno-anticorpo.
Após lavagens, a preparação é
incubada com o conjugado
fluorescente e, se houver anticorpo
no soro, o conjugado reage com o
anticorpo específico para o
antígeno.
Page ▪ 16
2-Pipetagem do soro na lâmina 4-Lavagem com PBS
3-Incubação
Page ▪ 17
7-Lavagem com PBS
5-Pipetagem do conjugado
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6-Incubação
8-Montagem da Lâmina
Mounting medium
(alkaline-buffered glycerin)
Page ▪ 19 9-Leitura no Microscópio de Imunofluorescência

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Positivo Negativo
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Aplicações Clínicas:
Medicina Humana
Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas, tais como:
doença de Chagas, AIDS, Hepatites, Citomegalovírus, Sífilis,
Toxoplasmose, etc.
Diagnóstico de doenças autoimunes.
Medicina Veterinária
Diagnóstico de Toxoplasmose, Neosporose, Raiva, Campilobacteriose,
etc.
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IFI – Crithidia luciliae

Pesquisa de anticorpo
anti-DNA de hélice
dupla tem valor
preditivo em relação à
atividade da nefrite do
LES
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Reação de Imunofluorescência Reação de imunofluorescência indireta (RIFI)

Indireta (RIFI – IgG) positiva, para positiva mostrando formas promastigotas de
Trypanosoma cruzi Leishmania marcadas pela fluoresceína.
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Ensaio de imunofluorescência para Descrição Ensaio de

determinação de anticorpos contra imunofluorescência Indireta para
Treponema pallidum em soro ou detecção de anticorpos contra vírus
Page ▪ 25 plasma humano. sincicial respiratório em soro ou plasma
humano.
Ensaio de imunofluorescência Indireta para Ensaio de imunofluorescência indireta para

detecção de anticorpos contra vírus detecção de anticorpos contra citomegalovírus
Herpes simplex tipo 1 em soro e plasma em soro e plasma humano.
Page ▪ 26 humano. Células epiteliais e fibroblastos
Pesquisa de anticorpos específicos

Page ▪ 27 para Toxoplasma gondii.
Técnica de Imunofluorescência Indireta
VANTAGENS
✓ Alta Sensibilidade;
✓ Alta Especificidade;
✓ Reprodutibilidade;
✓ Simples padronização e execução;
✓ O mesmo conjugado pode ser usado em diferentes sistemas;
✓ Determina classes e subclasses de anticorpos.
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Avaliação Laboratorial em Autoimunidade
Método de triagem de Auto-anticorpos:

Imunofluorescência Indireta em Células HEp-2
Métodos de identificação de Autoanticorpos:

Especificação de Autoanticorpos
✓ Imunodifusão dupla
✓ Contraimunoeletroforese
✓ Hemoaglutinação Passiva
✓ Imunoblot/imunodot
✓ ELISA
✓ Imunoprecipitação
✓ Imunofluorescência indireta com substratos específicos
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IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA - CÉLULAS HEp-2
O uso das células HEp-2 (linhagem de células tumorais derivadas de

carcinoma laríngeo humano) como substrato para a reação da
pesquisa de auto-anticorpos (FAN), pela técnica de
imunofluorescência indireta, permite a pesquisa de anticorpos contra
todos os constituintes celulares (antígenos do núcleo, membrana
nuclear, nucléolo, citoplasma e aparelho mitótico), e não apenas
anticorpos antinucleares como a denominação do teste sugere
(FAN).
A realização e interpretação desse teste no Brasil é realizada com

base nas recomendações dos Consensos Brasileiro e Internacional
para a pesquisa de Autoanticorpos.
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www.hep-2.com.br
Page ▪ 31
www.anapatterns.org
Page ▪ 32
Padrão Nuclear
Padrão Nucleolar
Padrão Citoplasmático
Padrão Aparelho Mitótico – Centrosomo
Como encontrar as informações sobre os padrões:
Acesse www.anapatterns.org
Identifique o código e acesso-o na menu “Choose AC”.
Anti-Cell pattern codes
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Page ▪ 38
ASPECTOS GERAIS DO DIAGNÓSTICO DE AUTOIMUNIDADE
O nível de autoimunidade fisiológica, ou basal, pode flutuar na dependência de

sobrecargas a que o sistema imunológico seja exposto.
Está bem demonstrada a presença de autoanticorpos desencadeada

transitoriamente por infecções, por medicamentos e por neoplasias.
Tem sido demonstrada positividade de autoanticorpos em pacientes infectados
pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) e por outros vírus linfotrópicos.
A alta freqüência de resultados positivos do teste de PAAC- IFI-HEP-2 (alta

sensibilidade) em indivíduos saudáveis ou com manifestações clínicas vagas tem
trazido à tona uma situação denominada por alguns de “Síndrome do Anticorpo
Antinúcleo Idiopático” (Auto-anticorpos em baixos títulos ≤ 1/80).
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ASPECTOS GERAIS DO DIAGNÓSTICO DE AUTOIMUNIDADE
Autoanticorpos contra alguns antígenos têm associação bastante

específica com determinadas doenças autoimunes ou ao estado de
autoimunidade em si, enquanto outros ocorrem indiscriminadamente
em indivíduos autoimunes e não autoimunes.
Determinados padrões de fluorescência (IFI - HEp-2) são mais

específicos de doença autoimune enquanto outros ocorrem com
frequência em indivíduos sadios ou em pacientes com outras
enfermidades não autoimunes ( Ex.: Padrão Nuclear pontilhado fino
denso).
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DIAGNÓSTICO DAS DOENÇAS AUTOIMUNES
Principais auto-anticorpos identificados:

✓ Anti-Sm
✓ Anti-RNP
✓ Anti-SS-A/Ro
✓ Anti-SS-B/La
✓ Anti-Scl-70
✓ Anti-Jo-1
✓ Anti-Ku
✓ Anti-P-ribossomal
✓ Anti-Mi-2
✓ Anti-PM-Scl
✓ Anti-DNA
✓ Antinucleossoma
✓ Anti-Sp-100/PML
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✓ Antifibrilarina
Avaliação Laboratorial em Autoimunidade
Método de triagem de Auto-anticorpos:

Imunofluorescência Indireta em Células HEp-2
Métodos de identificação de Autoanticorpos:

Especificação de Autoanticorpos
✓ Imunodifusão dupla
✓ Contraimunoeletroforese
✓ Hemoaglutinação Passiva
✓ Imunoblot/imunodot
✓ ELISA
✓ Imunoprecipitação
✓ Imunofluorescência indireta com substratos específicos
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IMUNODOT - Ensaio Imunoenzimático em fita de Nitrocelulose
-Fita de nitrocelulose com cavidades contendo antígenos separado por
cavidade.
Princípio:
Autoantígenos
Scl- 70 Baseia-se na reação entre anticorpos
JO- 1 séricos (autoanticorpos) do paciente com
RNP/SM
autoantígenos (da fita), sendo a reação
revelada pela interação de um anticorpo
SM
conjugado com enzima (anti-anticorpo
SSA humano) que reage com a região Fc do
SSB
autoanticorpo humano, permitindo a
evidenciação da reação Ag-Ac a partir da
Fita quebra do substrato cromogênico (kit)
pela enzima presente no conjugado.
Page ▪ 44
IMUNODOT - Ensaio Imunoenzimático em fita de Nitrocelulose
-Fita de nitrocelulose com cavidades contendo antígenos separado por
cavidade.
RESULTADO:
Positivo para os que aparecerem pontos
-
- Scl- 70 Negativo para os que não aparecerem pontos
JO- 1
RNP/SM Obs: detecta apenas títulos de soro acima de
+
160.
SM
+
Importante para detectar o antígeno alvo da

SSA
-
ação de autoanticorpos nas Doenças

SSB autoimunes (dados na literatura –
-
Reumatologia).
Page ▪ 45
Page ▪ 46

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Reação de imunofluorescencia

O teste de imunofluorescência (Imunodiagnóstico)

Método de alta sensibilidade e alta especificidade

O microscópio de fluorescência é uma

O teste de imunofluorescência direta é empregado na pesquisa e na localização

Também conhecida como técnica de camada simples, para detecção

As etapas deste procedimento compreendem:

✓Fixação do esfregaço da lâmina;

As indicações desta técnica são:

Detecção de vírus, bactérias, parasitas (Ex.: Toxoplasma gondii), antígenos de

É utilizado também na identificação da distribuição de um antígeno no interior

Detecta agentes infecciosos em secreções corporais, urina, fezes e em cortes

Pênfigo foliáceo: IgG linear, intercelular,

Pênfigo paraneoplásico: IgG

Possibilita uma fluorescência mais evidente, uma vez que os anticorpos

Para a Pesquisa de Anticorpos 1-Diluição do soro em PBS

Page ▪ 19 9-Leitura no Microscópio de Imunofluorescência

IFI – Crithidia luciliae

Reação de Imunofluorescência Reação de imunofluorescência indireta (RIFI)

Ensaio de imunofluorescência para Descrição Ensaio de

Ensaio de imunofluorescência Indireta para Ensaio de imunofluorescência indireta para

Pesquisa de anticorpos específicos

Método de triagem de Auto-anticorpos:

Métodos de identificação de Autoanticorpos:

O uso das células HEp-2 (linhagem de células tumorais derivadas de

A realização e interpretação desse teste no Brasil é realizada com

Anti-Cell pattern codes

O nível de autoimunidade fisiológica, ou basal, pode flutuar na dependência de

Está bem demonstrada a presença de autoanticorpos desencadeada

A alta freqüência de resultados positivos do teste de PAAC- IFI-HEP-2 (alta

Autoanticorpos contra alguns antígenos têm associação bastante

Determinados padrões de fluorescência (IFI - HEp-2) são mais

Principais auto-anticorpos identificados:

Método de triagem de Auto-anticorpos:

Métodos de identificação de Autoanticorpos:

Importante para detectar o antígeno alvo da

ação de autoanticorpos nas Doenças

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