Aula 6 - Genética Molecular
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Apresentação
A Tecnologia de DNA recombinante está relacionada com a união de moléculas de DNA de duas espécies diferentes que
são inseridas em um organismo hospedeiro para produzir novas combinações genéticas, valiosas para a ciência, a
Medicina, a agricultura e a indústria.
Como o foco de toda a Genética é o gene, o objetivo fundamental dos geneticistas em laboratório é isolar, caracterizar e
manipular os genes. Embora seja relativamente fácil isolar uma amostra de DNA de uma coleção de células, encontrar um
gene especí co dentro dessa amostra de DNA pode ser comparado a encontrar uma agulha em um palheiro, uma vez que
é importante considerar o fato de que cada célula humana contém aproximadamente dois metros de DNA. Portanto, uma
pequena amostra de tecido conterá muitos quilômetros de DNA.
No entanto, a tecnologia do DNA recombinante tornou possível isolar um gene ou qualquer outro segmento do DNA,
permitindo aos pesquisadores determinar sua sequência de nucleotídeos, estudar seus transcritos, modi cá-los de
maneiras altamente especí cas e reinserir a sequência modi cada em um organismo vivo.
Objetivos
Esclarecer a tecnologia do DNA recombinante;
A tecnologia de DNA recombinante também pode ser usada para terapia gênica, na qual um gene normal é introduzido no
genoma de um indivíduo para reparar uma mutação que causa uma doença genética.
A capacidade de obter clones de DNA especí cos usando tecnologia de DNA recombinante também tornou possível adicionar
o DNA de um organismo ao genoma de outro.
O gene adicionado é chamado de transgene, que pode ser passado para a progênie como um novo componente do genoma.
Exemplo
O Lispro (Humalog), em comparação com a insulina humana regular, é uma insulina recombinante bem e caz e de ação rápida.
Da mesma forma, a epoetina alfa é uma proteína recombinante nova e bem reconhecida que pode ser efetivamente usada na cura
da anemia.
A hGH recombinante foi encontrada com uma grande melhoria no tratamento de crianças sem capacidade de produzir hGH em
quantidade necessária. A aprovação de testes clínicos pela FDA em dezembro de 1997 para uma versão recombinante do fator
inibitório progenitor mieloide de citocina-1 (MPIF-1) foi uma conquista para dar reconhecimento a essa tecnologia.
Com sua ajuda, os efeitos colaterais do medicamento anticancerígeno podem ser atenuados, ao passo que ele tem a
capacidade de imitar a divisão de células imunologicamente importantes.
Esse sistema pode ser usado para direcionar a destruição de genes em células humanas.
Ativação, supressão, adição e deleção de genes em células humanas, camundongos, ratos, peixes-zebra, bactérias,
moscas-das-frutas, leveduras, nematoides e cultivos provaram que a técnica é promissora.
Modelos de camundongos podem ser gerenciados para o estudo de doenças humanas com CRISPR, em que o estudo
de genes individuais se torna muito mais rápido e os estudos de interações gênicas se tornam mais fáceis, alterando
vários genes nas células.
O CRISPR do genoma de H. hispanica é capaz de se adaptar de forma muito e ciente aos vírus não líticos. O operon
Cas associado codi ca as nucleases Cas3 interferentes e outras proteínas Cas.
A engenharia de uma cepa é necessária com priming de CRISPR para a produção de primer de crRNAs e aceitação de
novos espaçadores. O sistema CRISPR-cas tem que integrar novos espaçadores em seu locus para geração de
imunidade adaptativa. O reconhecimento de DNA/RNA estranho e sua clivagem é um processo controlado de maneira
especí ca da sequência. As informações relacionadas ao material genético do intruso são armazenadas pelo sistema
hospedeiro com a ajuda da incorporação do espaçador fotográ co no sistema CRISPR.
Cas9t (ferramenta de edição de genes) representa as endonucleases de DNA que usam moléculas de RNA para
reconhecer um alvo especí co. O sistema CRISPR-Cas de classe 2 com efetores únicos de proteína pode ser
empregado para processos de edição de genoma.
A cas9 inoperante é importante para o recrutamento de enzimas modi cadoras de histonas, repressão transcricional,
localização de marcadores proteicos uorescentes e ativação transcricional.
O CRISPR-Cas, o único sistema imune adaptativo em procariotos, contém o locus genômico conhecido como CRISPR,
com elementos repetitivos curtos e espaçadores (sequências únicas). O arranjo CRISPR é precedido pela sequência
líder rica em AT e anqueada pelos genes Cas que codi cam as proteínas Cas.
Em Escherichia coli catalases cas1 e cas2 promovem novos espaçadores através da formação de complexos. O
motivo adjacente foto-espaçador (PAM) é necessário para interferência e aquisição, porque a seleção da sequência-
alvo não é aleatória.
A memorização da sequência do invasor começa após a transcrição da matriz CRISPR em um crRNA precursor longo.
Durante os estágios nais do processo de imunidade, o alvo é degradado através da interferência com os ácidos
nucléicos invadidos. O reconhecimento especí co impede o sistema de autoalvejamento.
Em diferentes espécies de Sulfolobus, os loci CRISPR contêm múltiplos espaçadores cuja sequência corresponde a
plasmídeos conjugativos signi cativamente, enquanto, em alguns casos, os plasmídeos conjugativos também contêm
pequenos locos CRISPR.
A aquisição do espaçador é afetada pela replicação ativa do DNA viral nas espécies Sulfolobus, enquanto o DNA
quebra a formação nas forcas de replicação, fazendo com que o processo seja estimulado. O sistema CRISPR-Cas
obteve uma posição única em sistemas biológicos avançados devido ao seu enorme papel na estabilidade e melhoria
da imunidade.
As nucleases de dedo de zinco (ZFNs) e as nucleases efetivas do tipo ativador de transcrição (TALENs) são nucleases
quiméricas compostas de módulos de ligação de DNA programáveis especí cos para sequência, ligados a um domínio
de clivagem de DNA não especí co. O potencial terapêutico de ZFNs e TALENs é mais especi cado e direcionado.
Do mesmo modo, foi desenvolvido o fator de crescimento de broblastos de proteínas recombinantes (FGF-1), que
funciona na indução da formação de novos vasos sanguíneos no miocárdio. Sua injeção (bypass biológico) em um
miocárdio humano causa um suprimento de sangue aumentado para o coração. Apligraf, um produto aprovado pela
FDA, que serve como um substituto da pele recombinante, especi cado para o tratamento da úlcera da perna e
DermaGraft, é e caz no tratamento de úlceras diabéticas.
Após a produção bem-sucedida de insulina a partir de E. coli através de tecnologia de DNA recombinante, atualmente,
vários animais, notavelmente bovinos e suínos, foram selecionados como fonte de produção de insulina, que, no
entanto, desencadearam respostas imunes.
A insulina humana recombinante é idêntica à insulina porcina e, comparativamente, raramente induz respostas
imunogênicas. Além disso, é mais acessível e pode satisfazer as necessidades médicas mais prontamente.
O hormônio do crescimento humano foi a primeira proteína expressa em plantas de tabaco. Além da insulina, várias
novas drogas relacionadas à tecnologia de DNA recombinante sofreram melhorias no desenvolvimento e vários
sistemas de produção de proteína foram desenvolvidos. Várias cepas microbianas projetadas foram desenvolvidas
para realizar a formulação de drogas.
A formação de medicina molecular, especi camente baseada em proteínas, enfrenta sérios problemas, incluindo
métodos e biologia das células que funcionam para produzir compostos medicamente importantes através de
técnicas de DNA recombinante. Para superar esses obstáculos, há uma necessidade intensa de melhorar a qualidade e
a quantidade de medicamentos com base em um fenômeno molecular.
Fábricas de células são consideradas importantes em tecnologias de DNA recombinante, mas precisam ser
exploradas com mais detalhes e em profundidade, pois as fábricas convencionais não estão atendendo às
necessidades.
Da mesma forma, o fator de crescimento endotelial e a sinalização de Notch foram usados para manipular o
adenovírus oncolítico, que atua como um agente seletivo do câncer de mama para a expressão do antagonista. Além
disso, por meio da ruptura da angiogênese do tumor, atua como agente anticancerígeno. Isso diminui o número total
de vasos sanguíneos e provoca uma mudança dramática, juntamente com os vasos perfundidos, o que indica a
e cácia melhorada contra o tumor e efeitos vasculares.
Esforços têm sido feitos para modi car o genoma do vírus in uenza usando tecnologia de DNA recombinante para o
desenvolvimento de vacinas. As modi cações são baseadas na engenharia de vetores para expressão de genes
estranhos.
Na prática, o gene NS do vírus in uenza foi substituído por gene estranho, comumente o gene da cloranfenicol
acetiltransferase. Posteriormente, o RNA previamente recombinado é expresso e empacotado em partículas virais
após a transfecção com o vírus da gripe A puri cado na presença de vírus auxiliar. Foi esclarecido que as bases
terminais 5’ e 3’ do RNA do vírus in uenza A são su cientes para produzir sinais para replicação de RNA, transcrição
de RNA e empacotamento de RNA para o vírus in uenza.
Os novos sistemas de produção melhoram os procedimentos para o desenvolvimento de várias vacinas e drogas e
assim por diante. A produção de proteínas de alta qualidade depende da siologia de uma célula e das condições
fornecidas a ela. A expressão de proteínas torna-se retardada se uma célula estiver sob condições estressantes, o que
também pode favorecer a produção em alguns casos. Assim, melhorias adicionais são necessárias para uma
produção melhor e segura nos níveis genético e metabólico.
Os micro-organismos são considerados os hospedeiros mais convenientes para produzir medicamentos moleculares.
Essas células permitem a incorporação de genes estranhos com barreiras menos resistentes e a expressão é
facilmente controlada. Em comparação com as células de plantas e mamíferos a serem tomadas como hospedeiros,
os sistemas microbianos fornecem uma maquinaria menos complicada que, em última análise, aumenta o
desempenho e a qualidade da produção de proteínas.
O uso de espécies microbianas comuns, incluindo bactérias e leveduras, é promissor, mas as cepas menos comuns
também têm sido promissoras como sendo fábricas celulares para produzir drogas moleculares recombinantes. As
crescentes demandas de medicamentos e as necessidades de qualidade podem ser satisfeitas com melhores
resultados se essas fábricas celulares de microrganismos forem incorporadas nos processos produtivos dos
fármacos.
CRISPR.
Realização do experimento
Técnica inédita conseguiu evitar o mosaicismo
Experimento.
Na imagem podemos observar que foi injetada a ferramenta de edição genética no óvulo junto com o espermatozoide e, desse
modo, foi possível alterar o DNA paterno antes do início da divisão celular. Isso fez com que a mutação fosse corrigida em
todas as células, evitando o chamado mosaicismo, em que a correção é feita em apenas algumas das células do embrião,
enquanto outras mantêm a mutação, como ocorreu em outras pesquisas, em que a CRISPR-Cas9 foi usada em embriões já
formados.
O Projeto Genoma Humano, que começou o cialmente em 1990, foi a maior colaboração
internacional já realizada em biologia e envolveu milhares de cientistas.
Os pesquisadores trabalharam juntos em institutos ao redor do mundo, incluindo o Wellcome Trust Sanger Institute, para
ler e registrar toda a sequência do genoma humano. O projeto foi extremamente importante para a Biologia e in uenciou a
pesquisa biológica desde então.
As principais tarefas do Projeto Genoma Humano eram ler e registrar as instruções genéticas contidas no genoma
humano e fornecer essas informações a pesquisadores de todo o mundo, livremente e sem restrições. Eles também
tinham como objetivo sequenciar os genomas de vários outros organismos importantes para a pesquisa médica, como o
do rato, da mosca da fruta e do verme nematódeo C. elegans. Isso foi feito usando o sequenciamento de DNA mais
atualizado, métodos disponíveis na época.
No entanto, o projeto não foi apenas sobre sequenciamento. Houve, também, outras implicações cientí cas e sociais
importantes. Por exemplo, o projeto visava incentivar uma colaboração mais internacional entre cientistas e facilitar a
distribuição de dados de pesquisa.
Os envolvidos no projeto também tinham a responsabilidade de incentivar o debate público e fornecer informações
importantes ao público sobre as implicações éticas, sociais e legais de se olhar dentro do genoma humano. Os envolvidos
estavam comprometidos em explorar as consequências da pesquisa genômica por meio de seu programa de
Implicações Éticas, Legais e Sociais (ELSI).
A Organização do Genoma Humano (HUGO), organização internacional de cientistas envolvidos em genética, era
responsável por coletar e distribuir informações sobre projetos relacionados ao genoma humano. Eles também
ofereceram seus conselhos especializados para agências, governamentais e não governamentais, no apoio à pesquisa do
genoma humano.
O Projeto Genoma Humano também procurou desenvolver novas ferramentas para obter e analisar dados genômicos a
serem usados além do projeto para ajudar a bene ciar muitas áreas da Biologia.
O genoma humano sequenciado é agora uma referência crucial para toda a pesquisa biológica humana. É um modelo
contra o qual todos os genomas humanos são comparados. Desde que a sequência completa do genoma humano se
tornou disponível para a comunidade cientí ca, o progresso da pesquisa em saúde e doença humana acelerou
dramaticamente.
Maior conhecimento de como funcionamos
Agora sabemos muito mais sobre como funcionamos, como as doenças se desenvolvem e como podemos aplicar esse
conhecimento para melhorar o diagnóstico e o tratamento. No entanto, também levou a muitas outras questões
biológicas para os cientistas abordarem, bem como a questões sociais e éticas que todos nós devemos considerar.
Genômica
O ponto de partida da genômica é sequenciar o genoma de
um organismo, isto é, analisar a ordem dos quatro
nucleotídeos, adenina, timina, citosina e guanina, nas
moléculas de DNA (ou RNA) que representam a informação
genética hereditária do organismo.
As ferramentas envolvidas incluem microarrays, para investigar níveis de expressão gênica e as interações entre genes e seus
produtos, e bioinformática, para gerenciar e armazenar a grande quantidade de dados complexos envolvidos.
Genômica Comparativa
A genômica comparativa é um novo campo no qual as sequências do genoma de diferentes espécies são comparadas. As
semelhanças e diferenças entre a função de partes do genoma em diferentes espécies fornecem informações sobre a
expressão gênica, a regulação gênica, os processos de mudança evolutiva e os elos evolutivos entre as espécies.
Os organismos envolvidos, além dos seres humanos, tendem a ser aqueles de interesse comercial ou de pesquisa e os
genomas de cerca de 200 organismos foram sequenciados até o momento. A quantidade de informação envolvida signi ca
que grande parte do trabalho envolve técnicas inovadoras de análise de dados e extensas bases de dados eletrônicas.
O sequenciamento do genoma ca ao lado do trabalho para sequenciar os produtos proteicos produzidos pelo genoma.
O campo da proteômica envolve a determinação das sequências de aminoácidos de todas as proteínas produzidas por um
dado genoma (conhecidas coletivamente como proteoma), e o projeto para sequenciar o proteoma humano é coordenado pela
Organização de Proteomas Humanos (HUPO).
Leitura
Veja o infográ co No coração dos genes sobre o sequenciamento de trechos das porções codi cadoras localizadas na região
central dos genes. Fonte: Fapesp.
Atividades
1) (FATEC) A Engenharia Genética consiste EM uma técnica de manipular genes, que permite, entre outras coisas, a fabricação de
produtos farmacêuticos em bactérias transformadas pela tecnologia do DNA recombinante. Assim, já é possível introduzir em
bactérias o gene humano que codi ca insulina, as quais passam a fabricar sistematicamente essa substância. Isto só é possível
por quê:
a) Bactérias
b) Vírus
c) Príons
d) Fungos
e) Células embrionárias
3) (UNIFESP-SP) Em abril de 2003, a nalização do Projeto Genoma Humano foi noticiada por vários meios de comunicação
como sendo a decifração do código genético humano. A informação, da maneira como foi veiculada, está:
a) Correta, porque agora se sabe toda a sequência de nucleotídeos dos cromossomos humanos.
b) Correta, porque agora se sabe toda a sequência de genes dos cromossomos humanos.
c) Errada, porque o código genético diz respeito à correspondência entre os códons do DNA e os aminoácidos nas proteínas.
d) Errada, porque o Projeto decifrou os genes dos cromossomos humanos, não as proteínas que eles codificam.
e) Errada, porque não é possível decifrar todo o código genético, existem regiões cromossômicas com alta taxa de mutação.
4) De acordo com pesquisas desenvolvidas no Projeto Genoma Humano, o número total de genes do genoma humano situa-se
entre 30 mil a 40 mil, resultado que surpreendeu a comunidade cientí ca, que acreditava ser esse número maior que 100 mil. A
próxima meta de pesquisadores, na área da genética humana, é inventariar todos os genes efetivamente transcritos pelas células
do organismo humano. Acerca desse assunto, assinale a opção correta.
a) O genoma humano consiste em todo o material genético contido nas células, que está organizado sob a forma de 46 cromossomos no
núcleo, além de várias cópias de um cromossomo mitocondrial. Cada célula, individualmente, abriga todo o genoma do organismo que a
contém.
b) O Projeto Genoma Humano trouxe respostas a todas as questões que envolvem o funcionamento do organismo humano.
c) O sequenciamento de um gene envolve sua clonagem em um vertebrado e a posterior amplificação em uma reação em cadeia da
polimerase.
d) O sequenciamento do genoma humano dificultará o desenvolvimento de novos fármacos.
e) O sequenciamento do genoma dificultará o desenvolvimento de novas moléculas.
5) É uma técnica de biologia molecular que em poucos anos se tornou protagonista de um avanço surpreendente na genética. Por
meio dela é possível inativar genes (knockout), integrar transgenes em regiões especí cas do genoma (knock-in), mapear genes
nos cromossos, regular positiva ou negativamente a expressão gênica (CRISPRa e CRISPRi), rastrear RNAs na célula (RNA
tracking), visualizar regiões no genoma (DNA labeling), substituir sequências alélicas (allelic replacement), deletar genes, entre
muitos outros. A técnica em questão é denominada:
a) PCR
b) RNA tracking
c) CRISPR
d) DNA labeling
e) knockout
6) (UNIFOR CE/2003) Ultimamente tem sido anunciada uma série de “Projetos Genoma”, com o objetivo de sequenciar o genoma
de espécies de importância econômica, como o eucalipto e o café. Sequenciar o genoma de um organismo signi ca descobrir:
Referências
MICAS, A. Genética. 1. ed. Rio de Janeiro: Editora Universidade Estácio de Sá, 2015.
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Heredogramas;
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