Imunofluorescência

Testes de Imunofluorescência e
Imunoenzimáticos
Imunofluorescência (RIF)
 Técnica que possibilita a visualização de Ag ou Ac nos

tecidos/suspensões celulares
 Utilizam anticorpos marcados com fluorocromo (conjugado)
 Capazes de absorverem a luz ultravioleta (UV), permitindo sua

observação ao microscópio de fluorescência (com luz UV).
 A reação é feita em lâminas de microscopia

 A observação em microscópio com luz UV (microscópio de
fluorescência).
 Usado em larga escala em uma série de entidades patológicas,

tais como: Doenças Bacterianas, Virais, Protozooses,
Parasitoses e Doenças Imunológicas Diversas.
 Fluorocromos: substâncias que absorvem luz ultravioleta e

emitem luz visível, ou seja, ficam fluorescentes.
 São ligados covalentemente a anticorpos  CONJUGADO.
 Teste direto  pesquisa de antígenos
 Teste indireto  pesquisa de anticorpos e antígenos

Imuno-Histoquímica
 Imunofluorescência (RIF)
Imunofluorescência DIRETA
 Aplicada nos casos em que temos de identificar o microrganismo

nas secreções, em biópsias ou necropsias.
1. O Ac marcado com Fluorocromo (conjugado) é adicionado e se

fixa ao antígeno, formando um imunocomplexo estável;
2. O anticorpo não ligado é removido por lavagens;
3. O preparado é observado em microscópio de fluorescência

Imunofluorescência INDIRETA
 O método indireto serve para pesquisar o agente etiológico

(Ag) nas secreções, nos tecidos ou para se detectar anticorpos
(Ac) no soro do paciente.
1. Devemos ter a lâmina com o microrganismo para o qual se

quer pesquisar o anticorpo;
2. Depositar sobre o esfregaço o soro do paciente, deixar reagir;
3. Colocar o conjugado (Ac + Fluorocromo: Fluresceína ou

Rodamina), deixar reagir e examinar ao microscópio
fluorescente.
Imunofluorescência INDIRETA
 É mais específica, pois o anticorpo primário se encontra livre

do marcador e o sinal só aparece após duas ligações antígeno-
anticorpo
 Garantindo maior especificidade e melhor controle da reação

Imunofluorescência
OBSERVAÇÕES IMPORTANTES:
 Em todos os testes, temos que usar sempre um controle

positivo e negativo para comparação, de preferência com título
conhecido.
Imunofluorescência
VANTAGENS:
 Método de alta sensibilidade alta especificidade;
 Possibilidade de detecção de proteínas intracelulares;
DESVANTAGENS:
 “Variação individual” na leitura de resultados ;
 Alto custo de microscópio de fluorescência.
Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI ) positiva, com antígeno de Trypanosoma
cruzi.
Imunoenzimático - ELISA
 Teste utilizado para detectar a presença de antígenos (Ag) ou

anticorpos (Ac) específicos em fluidos corporais.
 Une a especificidade de uma ligação Ag-Ac com a sensibilidade

de uma reação enzimática  detecção de quantidades mínimas de
uma substância em particular e com grande confiabilidade.
 É um método tanto semi-quantitativo.

ELISA
 Elementos necessários para a realização:

 Ag ou Ac purificado
 Controles
 Padrões (soluções com concentração conhecida)
 Amostras a serem testadas
 Placa de poliestireno
 Tampão de lavagem: utilizado para remover o Ag ou Ac livres na
placa, Ag ou Ac ligados com pouca avidez e outras moléculas
interferentes
 Conjugado: Ac ou Ag ligados a uma enzima
 Cromógeno: substância incolor que, ao ser oxidada pela reação
enzimática, produz cor
 Leitora de ELISA (espectrofotômetro): converte as diferentes
intensidade de cor em valores numéricos (densidade óptica - DO)
http://www.dellta.com.br/detalhes.php?prod_id=89
http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-
bottom-271555304.html
Placas de ELISA
http://www.laborlifescience.com.br/equipamentos_elisa.html
Leitoras de ELISA
http://www.analiticaweb.com.br/images/produtos/p4ae04e96cb
c7f/placa_elisa.jpg
ELISA
•Principais Tipos:
•INDIRETO: detecta principalmente Ac
•DIRETO: detecta principalmente Ag
• COMPETIÇÃO: detecta Ag com baixo peso molecular (monovalentes)
• CAPTURA: detecção de Acs

ELISA Direto
1. Ac é fixado a placa 3. Adiciona-se conjugado

específico para o Ag
procurado
2. Adiciona-se a solução com

o Ag a ser pesquisado e este, 4. Cromógeno e o substrato são
caso presente, se liga aos Ac adicionados, e se o cromógeno for
nos poços oxidado pela ação da reação enzimática,
haverá desenvolvimento de cor
ELISA Direto
• Interpretação dos resultados:
• A intensidade da cor é diretamente proporcional à

concentração de Ag da amostra pesquisada.
ELISA Indireto
1. Inicialmente, o Ag 2. Amostra é adicionada. 3. É adicionado o 4. O cromógeno e o

é adicionado à placa Caso contenha Acs conjugado, que se substrato são
e se adere à específicos contra os liga aos Acs adicionados, e se o
superfície dos poços Ags presentes na placa, cromógeno for oxidado
estes se ligarão aos Ags pela ação da reação
enzimática, haverá
desenvolvimento de cor
ELISA Indireto
• Interpretação dos resultados:
• A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração de Ac

da amostra pesquisada.
• O ELISA Indireto não determina se o indivíduo ESTÁ ou não doente

naquele momento  determina se já teve ou não contato com o agente
causador da enfermidade em algum momento de sua vida.
ELISA
 Vantagens
 Teste com alta sensibilidade (habilidade de detectar quantidades

mínimas do Ag ou Ac pesquisados – menor risco de falsos-negativos.
 Teste com alta especificidade (habilidade de identificará somente o

Ag ou Ac desejado) – menor risco de falsos-positivos.
 Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo.
 Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo a médio em

comparação com outras técnicas de imunodiagnóstico.
ELISA
 Desvantagens
 Necessidade de mão de obra especializada.
 Alguns reagentes podem degradar-se com facilidade, com exposição

à luz do sol ou a elevadas temperaturas.
 Por ser uma técnica altamente sensível e específica, é muito

susceptível a erros de pipetagem, variações nos tempos de incubação
e lavagens, e alterações nos reagentes.
ELISA
 Aplicações
 Diagnóstico sorológico de doenças infecto-contagiosas, onde a

detecção de Ac IgG, IgA ou IgE seja significativa.
 Dosagem de hormônios, marcadores tumorais e outras proteínas

séricas, bem como para a detecção de antígenos virais e de outros
patógenos nas fezes, na urina e em secreções.

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 Técnica que possibilita a visualização de Ag ou Ac nos

 Utilizam anticorpos marcados com fluorocromo (conjugado)

 Capazes de absorverem a luz ultravioleta (UV), permitindo sua

 A reação é feita em lâminas de microscopia

 Usado em larga escala em uma série de entidades patológicas,

 Fluorocromos: substâncias que absorvem luz ultravioleta e

 Teste direto  pesquisa de antígenos

 Teste indireto  pesquisa de anticorpos e antígenos

 Aplicada nos casos em que temos de identificar o microrganismo

1. O Ac marcado com Fluorocromo (conjugado) é adicionado e se

2. O anticorpo não ligado é removido por lavagens;

3. O preparado é observado em microscópio de fluorescência

 O método indireto serve para pesquisar o agente etiológico

1. Devemos ter a lâmina com o microrganismo para o qual se

2. Depositar sobre o esfregaço o soro do paciente, deixar reagir;

3. Colocar o conjugado (Ac + Fluorocromo: Fluresceína ou

 É mais específica, pois o anticorpo primário se encontra livre

 Garantindo maior especificidade e melhor controle da reação

 Em todos os testes, temos que usar sempre um controle

 Teste utilizado para detectar a presença de antígenos (Ag) ou

 Une a especificidade de uma ligação Ag-Ac com a sensibilidade

 É um método tanto semi-quantitativo.

 Elementos necessários para a realização:

•INDIRETO: detecta principalmente Ac

•DIRETO: detecta principalmente Ag

• COMPETIÇÃO: detecta Ag com baixo peso molecular (monovalentes)

• CAPTURA: detecção de Acs

1. Ac é fixado a placa 3. Adiciona-se conjugado

2. Adiciona-se a solução com

• A intensidade da cor é diretamente proporcional à

1. Inicialmente, o Ag 2. Amostra é adicionada. 3. É adicionado o 4. O cromógeno e o

• A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração de Ac

• O ELISA Indireto não determina se o indivíduo ESTÁ ou não doente

 Teste com alta sensibilidade (habilidade de detectar quantidades

 Teste com alta especificidade (habilidade de identificará somente o

 Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo.

 Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo a médio em

 Necessidade de mão de obra especializada.

 Alguns reagentes podem degradar-se com facilidade, com exposição

 Por ser uma técnica altamente sensível e específica, é muito

 Diagnóstico sorológico de doenças infecto-contagiosas, onde a

 Dosagem de hormônios, marcadores tumorais e outras proteínas

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