PCR e Eletroforese

Engenharia Genética e a Tecnologia do DNA
Recombinante:
PCR (Polymerase Chain Reaction )

PCR - Polymerase Chain Reaction
O método de PCR é usado habitualmente:
• No diagnóstico de doenças hereditárias e infecciosas;
• Na identificação de "impressões digitais" genéticas;
• Na construção de árvores filogenéticas;
• No seqüênciamento de genomas;
• Na expressão de genes em sistemas recombinantes;
• No estudo de genética molecular;
• Em testes de paternidade;
• Na medicina forense.
Biotecnologia: o DNA em foco. O Cortinão do Watson. NDB – Núcleo de Difusão Biotecnológica
Reação em cadeia da polimerase - PCR
O processo de PCR ocorre em três etapas.
1 – Desnaturação: o DNA que se quer amplificar é aquecido a 94-

96°C a fim separar as dupla-fitas.
2 – Anelamento: a temperatura é diminuída, a 60ºC, assim, os

primers podem unir-se às fitas-simples do DNA.
3 – Extensão: a DNA-Polimerase produz a fita complementar do

DNA molde, a uma temperatura de aproximadamente 72ºC.

Gráfico da Cinética do PCR.

Ciclagem

Problemas:
■ DNA-polimerase da bactéria Escherichia coli → Desnaturação em Altas
Temperaturas.
■ Ineficiência do processo: Altas demandas de DNA-poli. → Vários banhos-maria

de temperaturas diferentes → atenção contínua durante todo o processo.
Soluções:
DNA-polimerase termoestável foi obtida do Thermus aquaticus → Taq-polimerase.
Em 1989, o DNA Thermal Cycler apareceu como o primeiro termociclador

automático.
Biotecnologia: o DNA em foco. O Cortinão do Watson. NDB – Núcleo de DifusãoYellowstone

Biotecnológica
Toda PCR requer:

Componentes
■ Um par de oligonucleotídeos
para iniciar a síntese de DNA
■ Desoxinucleotídeos trifosfato
(dNTPs)
■ DNA polimerase termoestável
■ Tampão para manter o pH (TBE)
■ Amostra de DNA
Tampão da Taq:
■ toda DNA pol. requer cátion
divalente, usualmente MgCl -
cofator
■ (KCl) como tampão.

Resultado:

Posição da amplificação
Animação

Cinética do PCR As causas do platô são várias:

■ Perda da atividade da enzima;
■ Todas as enzimas disponíveis estão ocupadas
com a síntese de DNA;
■ Acúmulo de produtos amplificados que tendem
a parear entre si, em detrimento do pareamento
com os “primers”. Aumenta possibilidade de
amplificação de produtos inespecíficos;
■ Gasto dos reagentes, especialmente

inativação da DNA polimerase;
■ Acúmulo de pirofosfato (PiPi);
■ Competição com outros produtos que vinham

sendo amplificados com eficiência menor mas
também foram se acumulando
Etc…


Tipos de PCRs:
■ RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction)
■ RAPD (RANDOM AMPLIFIED

POLYMORPHIC DNA)
■ Nested PCR
■ Real time PCR

Eletroforese em Gel
■ Utilizada, normalmente, para separar proteínas e moléculas

de DNA e RNA.
■ Técnica de separação de moléculas que

envolve a migração de partículas em um
determinado gel durante a aplicação de
uma diferença de potencial.
■ As moléculas são separadas devido ao tamanho. O formato

das moléculas também podem influir,

Eletroforese em Gel
■ Introduzida em 1939 por Tiselius e Kabat com o

objetivo de separar partículas orgânicas.
■ O DNA da célula deve ser extraído para a utilização na

eletroforese.
■ Em princípio uma molécula com carga desloca-se em

um campo magnético em uma velocidade proporcional à
sua densidade de carga total, tamanho e forma.
-
- -
- -
- - - +
- -
-
Eletroforese em Gel
Utiliza-se uma cuba com dois compartimentos separados

por 5 a 10 cm. Num compartimento o eletrodo com fio preto
determina o pólo negativo, e no outro compartimento o eletrodo
com fio vermelho é o pólo positivo.

Eletroforese em Gel
MONTANDO A ELETROFORESE
1 - Montar a cuba;
2 - Adicionar o gel, previamente preparado;

3 - Colocar a solução tampão com pH definido;
4 - Adicionar as amostras a serem separadas:
DNA
Azul de bromofenol
O azul-de-bromofenol - acusa sua posição por sua
banda azul e adverte sobre o término da corrida antes de
chegar à extremidade do gel. Também auxilia na sedimentação
das amostras nos poços.
5 - Ligar a cuba.

Eletroforese em Gel

Eletroforese em Gel
As bandas em um gel podem ser visualizadas

por cátions aromáticos planares como:
• íon etídeo
• proflavina
• laranja de acridina
Ligam-se ao DNA de dupla hélice por

intercalação.
Quantidades pequenas, como 50 ng de DNA,

podem ser detectados em gel contendo brometo de
etídeo (EtBr).

Eletroforese em Gel
Análise eletroforética em gel de agarose
Polímero linear extraído de algas marinhas e basicamente

composto de D-Galactose e L-Galactose.
Ao solidificar, após o aquecimento, os longos filamentos de

agarose formam uma matriz (malha) que serve de "peneira" de
separação de fragmentos de DNA.
Capaz de separar fragmentos com uma ótima resolução.

Eletroforese em Gel
Fatores que influenciam a migração em gel de

agarose:
■ Concentração da agarose no gel;
■ O tamanho dos fragmentos de DNA (fragmento menor é mais

rápido);
■ A conformação do DNA, (circular fechado, mais rápido; circular

aberto, mais lento; linear, intermediário);
■ A corrente aplicada maior voltagem resulta em migração mais

rápida;
■ A direção do campo elétrico, o DNA migra em direção ao ânodo

(pólo de carga positiva) devido aos grupos fosfatos de carga
negativa;
Eletroforese em Gel
Eletroforese em gel de poliacrilamida
Mistura de dois polímeros, acrilamida e

bisacrilamida. A acrilamida é uma molécula linear,
enquanto que a bisacrilamida é em forma de "T".
Eletroforese desnaturante
Normalmente feita em gel de agarose,

incluindo um agente desnaturante (normalmente
uréia), o que ajuda a melhorar a separação entre
as moléculas que apresentam diferenciação em
suas estruturas secundárias.
Eletrofrese capilar
O gel e a amostra estão dentro de um

capilar, e a amostra é detectada automaticamente
por um detector. Essa é a eletroforese atualmente
utilizada em seqüênciadores de DNA.
Eletroforese em Gel
Eletroforese em campo pulsado
Moléculas de DNA maiores de 10 megabases são capazes de re-

orientar e mover diferencialmente através dos poros do gel de agarose
Eletroforese bi-dimensional
1 - Focalização Isoelétrica (IEF)

2 - Eletroforese desnaturante
desnaturante em gel de Poliacrilamida
(SDS-PAGE)

Biotecnologia: o DNA em foco
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PCR (Polymerase Chain Reaction )

O método de PCR é usado habitualmente:

• No diagnóstico de doenças hereditárias e infecciosas;

• Na identificação de "impressões digitais" genéticas;

• Na construção de árvores filogenéticas;

• Na expressão de genes em sistemas recombinantes;

• No estudo de genética molecular;

Reação em cadeia da polimerase - PCR

O processo de PCR ocorre em três etapas.

1 – Desnaturação: o DNA que se quer amplificar é aquecido a 94-

2 – Anelamento: a temperatura é diminuída, a 60ºC, assim, os

3 – Extensão: a DNA-Polimerase produz a fita complementar do

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Gráfico da Cinética do PCR.

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■ Ineficiência do processo: Altas demandas de DNA-poli. → Vários banhos-maria

Em 1989, o DNA Thermal Cycler apareceu como o primeiro termociclador

Biotecnologia: o DNA em foco. O Cortinão do Watson. NDB – Núcleo de DifusãoYellowstone

Toda PCR requer:

■ DNA polimerase termoestável

■ Tampão para manter o pH (TBE)

■ (KCl) como tampão.

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Cinética do PCR As causas do platô são várias:

■ Gasto dos reagentes, especialmente

■ Acúmulo de pirofosfato (PiPi);

■ Competição com outros produtos que vinham

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■ RAPD (RANDOM AMPLIFIED

■ Real time PCR

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■ Utilizada, normalmente, para separar proteínas e moléculas

■ Técnica de separação de moléculas que

■ As moléculas são separadas devido ao tamanho. O formato

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■ Introduzida em 1939 por Tiselius e Kabat com o

■ O DNA da célula deve ser extraído para a utilização na

■ Em princípio uma molécula com carga desloca-se em

Utiliza-se uma cuba com dois compartimentos separados

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2 - Adicionar o gel, previamente preparado;

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As bandas em um gel podem ser visualizadas

Ligam-se ao DNA de dupla hélice por

Quantidades pequenas, como 50 ng de DNA,

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Análise eletroforética em gel de agarose

Polímero linear extraído de algas marinhas e basicamente

Ao solidificar, após o aquecimento, os longos filamentos de

Capaz de separar fragmentos com uma ótima resolução.

Biotecnologia: o DNA em foco. O Cortinão do Watson. NDB – Núcleo de Difusão Biotecnológica

Fatores que influenciam a migração em gel de

■ O tamanho dos fragmentos de DNA (fragmento menor é mais

■ A conformação do DNA, (circular fechado, mais rápido; circular