Viral vektör

Viral vektör, moleküler biyologlar tarafından hücre içine genetik malzeme ulaştırmak için kullanılan bir araçtır. Bu işlem canlı organizmanın içinde (in vivo) veya hücre kültüründe (in vitro) yapılabilir. Virüsler, enfekte ettikleri hücrelerin içine genomlarını verimli şekilde taşımak için özelleşmiş moleküler mekanizmalar evrimleştirmiştir. Bir virüs tarafından genlerin aktarımı transdüksiyon olarak adlandırılır, bu yolla enfekte olmuş hücrelerin de transdüklenmiş olduğu söylenir. Moleküler biyologlar bu mekanizmayı ilk defa 1970'lerde kontrol altına almayı becermiştir. Paul Berg bakteriyofaj lambda DNA'sı içeren değiştirilmiş bir SV40 virüsü kullanarak kültürlenmiş maymun böbrek hücrelerini enfekte etmiştir.^[1]

Bir viral vektörün esas özellikleri

Viral vektörler kendi spesifik uygulamaları için tasarlanmış olurlar ama genelde bazı esas ortak özelliklere sahiptirler.

Güvenlik: Viral vektörler bazen patojenik virüslerden yaratılmış olsalar da, bu virüsleri kullanmakla ilişkili riskleri en aza indirmek için modifiye edilirler. Bu, genelde viral genomun çoğalma için gerekli olan bir kısmının delesyonu ile yapılır. Böylesi bir virüs hücreleri verimli şekilde enfekte edebilir ama, yeni virion üretimi için bir yardımcı virüse gerek duyar.
Düşük toksisite: Viral vektörün enfekte ettiği hücrenin fizyolojisi üzerinde asgari düzeyde etkisi olmalıdır.
Stabilite: Bazı virüsler genetik olarak kararsızdır ve genomları hızla biçim değiştirebilir. Viral vektörün kullanıldığı deneylerin öngörülebilirliği ve tekrarlanabilirliği açısından bu sakıncalıdır, tasarımlarında bundan kaçınılır.
Hücre tipi spesifisitesi: Çoğu virüs vektörleri mümkün olduğunca çeşitli hücre tiplerini enfekte edebilecek şekilde tasarlanır. Ancak, bazen bunun aksi arzu edilir. Viral reseptör modifiye edilerek virüsün belli bir hücre tipine hedeflenmesi sağlanabilir.

Uygulamalar

Temel araştırma

Viral vektörler ilk olarak moleküler genetik deneylerinde çıplak DNA ile transfeksiyona alternatif olarak geliştirildiler. Kalsiyum fosfat çökelmesi gibi geleneksel yöntemlere kıyasla, transdüksiyon, hücre yaşayabilirliğini (viabilitesini) etkilemeden hücrelerin neredeyse tamamının enfekte olmasını mümkün kılar.

Buna ilaveten, bazı virüsler hücre genomuna entegre olup kararlı gen ifadesini sağlarlar. Ancak, viral bir vektörün inşası çok daha emek-yoğun bir süreç olduğu için çoğu uygulamada transfeksiyon hâlâ tercih edilmektedir.

Protein kodlayan genler viral vektörler kullanılarak ifade edilebilir, genelde belli bir proteinin işlevini çalışmak için. Belirteç (marker) genleri (yeşil floresan protein gibi) kararlı şekilde ifade eden viral vektörler, özellikle retrovirüsler, hücreleri kalıcı şekilde işaretlemek için kullanılır. Bu şekilde işaretlenmiş hücreler kullanılarak, in vitro enfekte edilmiş hücrelerin bir konak hayvana transfer edildiği ksenotransplantasyon deneylerinde hücreler ve onları yavrularını takip etmek mümkün olur.

Gen ensersiyonu gen nakavtından daha ucuzdur. Ama gen susturması bazen non-spesifiktir ve başka genler üzerinde hedef dışı etkiler gösterebilir, bu yüzden daha az güvenilir sonuçlar verir. Hayvan konak vektörleri de bazen önemli rol oynarlar.

Gen terapisi

Gelecekte genetik bozuklukları tedavi etmenin bir yolu gen terapisi olabilir. Ciddi Kombine İmmün Yetmezlik, kistik fibrozis ve hatta hemofili A gibi hastalıklar belli genlerin DNA dizisinde mutasyonlardan meydana geldiği için, gen terapi denemelerinde hastanın vücudundaki hücrelerin içine mutasyonsuz gen kopyalarından götürmek amacıyla virüsler kullanılmıştır. Gen terapisi kullanılarak labortuvarda çok sayıda başarılar elde edilmiştir. Ancak, viral gen terapinin yaygın kullanılması için bazı önemli problemlerin çözülmesi gerekmektedir. Virüslere gösterilen bağışıklık tepkisi hedef hücrelere gen ulaştırılmasını engellemekle kalmaz, hasta için ciddi komplikasyonlara yol açar. 1999'da, ilk gen terapi denemlerinden birinde, adenoviral bir vektör ile tedavi edilmekte olan Jesse Gelsinger bu yüzden ölmüştür.^[2]

Bazı viral vektörler, örneğin lentivirüsler, konak kromozomlardan birinde genomlarını rastgele konumlara sokarlar, bu durum hücresel genlerin işlevlerini bozup kansere yol açabilir. 2002'de yapılan, Ciddi Kombine İmmün Yetmezlik için retroviral gen terapi denemesinde, hastalardan ikisi tedavinin sonu olarak lösemi geliştirdiler.^[3] Adeno-ilişkili virüs-temelli vektörler bu bakımdan çok daha güvenilirdirler çünkü insan genomunda hep aynı konumda entegre olurlar.

Aşılar

DNA aşılamasının mantığından hareketle, patojen protein ifade eden virüsler hâlen bu patojenlere karşı aşı olarak geliştirilmekteler. T-lenfositler hücre-içi parazitleri tanımak için hücre içinde üretilen yabancı proteinleri kullanırlar. T hücresi bağışıklığı viral enfeksiyonlar ve malarya gibi hastalıklardan korunmak için çok önemlidir. Viral bir aşı, patojen proteinlerin konak hücre içinde ifadesini indükler, Sabin Polio aşısı ve diğer zayıflatılmış aşılar gibi. Ancak, viral açılar patojen genlerin sadece ufak bir bölümünü içerdiği için, çok daha güvenlidirler ve aşı yapmakta kullanılan patojen tarafından bir enfeksiyon mümkün değildir. Adenovirüs türü viral aşıların geliştirilmesi aktif bir araştırma konusudur.

Viral vektör tipleri

Retrovirüsler

Retrovirüsler gen terapisi uygulamalarının ana konularından biridir. Moloney mürin lösemi virüsü gibi rekombinant retrovirüsler, konak genomun içine stabil şekilde entegre olabilirler. Taşıdıkları ters transkriptaz bu virüslerin konak genom ile bütünleşmesini sağlar.

Retroviral vektörler ikileşim-yeterli veya ikileşim-kusurlu olabilirler. İkileşim kusurlu vektörler deneysel çalışmalar için en yaygın seçenektir çünkü viral ikileşme ve paketleme için gerekli genler çıkarılmış veya başka genlerle değiştirilmiştir. Bu virüsler hedef hücrelerini enfekte edebilir ve taşıkdıkları yükü teslim edebilirler ama hücrenin parçalanması ve ölümü ile sonuçlanacak tipik bir litik bir yolak takip etmekten acizdirler.

Benzer şekilde, replikasyon-yetkin viral vektörler virion sentezi için gerekli tüm genlere sahiptirler ve enfeksiyon başlayınca kendilerini çoğaltmaya devam edebilirler. Bu vektörlerdeki viral geno0mlar çok daha uzun olduğu için, hücre içine ulaştırılmak istenen DNA ensersiyonun uzunluğu sınırlıdır, replikasyon kusurlu viral vektörlerdekine kıyasla. Viral vektöre bağlı olarak, maksimum DNA parça uzunluğu genelde 8-10 kB kadardır.^[4] Bu durum çoğu genomik dizinin kullamını kısıtlasa da, cDNA dizileri rahatlıkla sığar.

Moloney retrovirüs gibi retrovirüslerin başlıca sakıncası, transdüksiyon olabilmesi için hücrelerin aktif olarak bölünüyor olma gereksinimidir. Bunun sonucu olarak, nöron gibi hücreler retrovirüs enfeksiyonu ve transdüksiyonuna çok dirençlidir. Ayrıca, ensersiyon mutagenezi bir endişe konusudur, çünkü konak genomunun içine entegrasyon kansere yol açabilir.

Lentivirüsler

Bir lentiviral vektör tarafından paketleme ve transdüksiyon.

Lentivirüsler retrovirülerin bir alt grubudur. Bölünmeyen hücrelerin genomlarına entegre olma özellikleri onları diğer retrovirüslerden farklı kılar. Virüs hücre içine girdikten sonra, RNA'dan oluşan viral genom ters transkripsiyona uğrayıp DNA üretir, bu da viral bir entegraz enzimi sayesinde genom içinde rastgele bir yere girer. Bu aşamada provirüs olarak adlandırılan vektör genom içinde kalır ve hücre bölününce yavru hücrelere aktarılır. Entegrasyon yeri öngörülemez olması sorun yaratabilir. Provirüs, hücresel genlerin işlevini bozabilir ve kanser gelişimine yol açan onkogenlerin aktivasyonuna yol açabilir, bu yüzden lentivirüslerin gen terapisi için uygulanmalarına çekince getirebilir. Ancak, lentivirüslerin kansere yol açabilecek yerlere entegre olma eğilimlerinin daha düşük olduğu bulunmuştur, gama-retroviral vektörlere kıyasla.^[5] Kansere eğilimli bir fare suşu üzerinde yapılan bir çalışmada lentiviral vektörlerin tümör insidansının artmasına veya tümörlerin daha erken belirmesine neden olmadığı bulunmuştur.^[6] Üstelik, klinik denemelerde, HIV tedavisi için lentiviral vektörle gen terapisi yapıldığında mutagenik veya onkolojik olaylara rastlanmamıştır.

Güvenlik nedenleriyle de lentiviral vektörler çoğalmaları için gerekli olan genler taşımazlar. Bir lentivirüs üretmek için bir paketleme hücre suşu (genelde HEK 293) içine birkaç plazmidin transfeksiyonu yapılır. Paketleme plazmidi olarak adlandırılan bir veya birkaç plazmit, gerekli virion proteinlerini (kapsit ve ters transkriptaz gibi) kodlar. Başka bir plazmit, vektör içine dahi edilmesi gereken genetik malzemeyi taşır. Bu genin transkripsiyonu yapılınca tek iplikli RNA viral genom üretilir ve ψ (psi) dizisini içerir. Bu dizi genomun virion içine paketlenmesini sağlar.

Adenovirüsler

Lentivirüslerden farklı olarak adenoviral DNA genoma içine entegre olmaz ve hücre bölünmesi sırasında ikileşmez. Bu özellik onların temel araştırmada kullanılmasını sınırlar ama adenoviral vektörler bazen in vitro deneylerde kullanılırlar. Bunların başlıca uygulaması gen terapisi ve aşılamadır. Adenovirüsler solunum yolu, sindirim yolu ve göz enfeksiyonlarına yol açar. İnsanlar genelde adenovirüslerle sık sık karşılaştıkları için bu virüsler hızla immün tepkilere yol açar, bunun da potansiyel olarak tehlikeli sonuçları olabilir.^[2] Bu problemin üstesinden gelmek için bilim insanları hâlen insanların bağışıklığı olmayan adenovirüsler üzerinde araştırmalarını sürdürmektedir.

Adeno ilişkili virüsler

Adeno-ilişkili virüs (AİV) insan ve bazı primat türlerini enfekte edebilen küçük bir virüstür. AİV'nin bir hastalığa neden olduğuna dair bir bilgi yoktur ve dolayısıyla çok mülayim bir immün tepkiye neden olur. AİV hem bölünebilen hem de bölünmeyen hücreleri enfekte edebilir ve genomunu konak hücre içine entegre edebilir. Bu özellikler AİV'yi gen terapisinde kullanılacak viral vektör üretimi için cazip bir aday kılmaktadır.

Nanotasarlanmış özdekler

Ormosil gibi viral olmayan özdekler (substanslar) da DNA vektörü olarak kullanılmıştır ve DNA kargolarını canlı hayvanlarda spesifik olarak hedeflenmiş hücrelere ulaştırabilir. (Ormosil, organik modifiye edilmiş silikat veya silika anlamına gelir.)

Kaynakça

^ Goff SP and Berg P. (1976) Construction of hybrid viruses containing SV40 and lambda phage DNA segments and their propagation in cultured monkey cells. Cell. 9:695-705. Şablon:Entrez Pubmed
^ ^a ^b Beardsley T, February 2000, A tragic death clouds the future of an innovative treatment method.^{[ölü/kırık bağlantı]} Scientific American
^ McDowell N, 15 January 2003, New cancer case halts US gene therapy trials. 22 Ekim 2008 tarihinde Wayback Machine sitesinde arşivlendi. New Scientist
^ Principles of Retroviral Vector Design, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=rv.section.4357 3 Ocak 2007 tarihinde Wayback Machine sitesinde arşivlendi.
^ Cattoglio C, Facchini G, Sartori D, et al. Hot spots of retroviral integration in human CD34+ hematopoietic cells. Blood.2007 Sep 15;110(6):1770-1778
^ Montini E, Cesana D, Schmidt D, et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat Biotechnol. 2006 Jun;24(6):687-696.

Dış bağlantılar

Nöron tercihli lentiviral vektör üretimi (bir protokol) (İngilizce)
Plasentaya özgü gen manipülasyonu, zona-sız blastosistlerinl lentiviral vektör ile transdüksiyonu (bir protokol) (İngilizce)
Gene Therapy Net 23 Temmuz 2019 tarihinde Wayback Machine sitesinde arşivlendi. (İngilizce)
Klinik gen terapide kullanılan vektörlerinin karşılaştırması 24 Mayıs 2011 tarihinde Wayback Machine sitesinde arşivlendi. (İngilizce)

[1] Goff SP and Berg P. (1976) Construction of hybrid viruses containing SV40 and lambda phage DNA segments and their propagation in cultured monkey cells. Cell. 9:695-705. Şablon:Entrez Pubmed

[immunity-2] Beardsley T, February 2000, A tragic death clouds the future of an innovative treatment method.^{[ölü/kırık bağlantı]} Scientific American

[3] McDowell N, 15 January 2003, New cancer case halts US gene therapy trials. 22 Ekim 2008 tarihinde Wayback Machine sitesinde arşivlendi. New Scientist

[4] Principles of Retroviral Vector Design, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=rv.section.4357 3 Ocak 2007 tarihinde Wayback Machine sitesinde arşivlendi.

[5] Cattoglio C, Facchini G, Sartori D, et al. Hot spots of retroviral integration in human CD34+ hematopoietic cells. Blood.2007 Sep 15;110(6):1770-1778

[6] Montini E, Cesana D, Schmidt D, et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat Biotechnol. 2006 Jun;24(6):687-696.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]