GABRIELLY CRUVINEL FERNANDES ESTRESSE NEONATAL RESULTA EM ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS E NEUROQUÍMICAS DURADOURAS Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense UNESC, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. Orientador: Prof. Drº. João Luciano de Quevedo Coorientadora: Profª Drª Gislaine Zilli Réus CRICIÚMA 2017 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação F363e Fernandes, Gabrielly Cruvinel. Estresse neonatal resulta em alterações comportamentais e neuroquímicas duradouras / Gabrielly Cruvinel Fernandes. – 2017. 91p. : il. ; 21 cm. Dissertação (Mestrado) - Universidade do Extremo Sul Catarinense, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Criciúma, SC, 2017. Orientação: João Luciano de Quevedo. Coorientação: Gislaine Zilli Réus. 1. Transtorno depressivo maior. 2. Estresse oxidativo. 3. Neuroinflamação. 4. Privação materna. I. Título. CDD. 22ª ed. 616.8982 Bibliotecária Rosângela Westrupp – CRB 14º/364 Biblioteca Central Prof. Eurico Back - UNESC FOLHA INFORMATIVA A dissertação foi elaborada seguindo o estilo Vancouver e será apresentada no formato tradicional. Este trabalho foi realizado nas instalações do Laboratório de Neurociências do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde (PPGCS) da UNESC. Os ensaios bioquímicos sobre o estresse oxidativo e níveis de citocinas pró-inflamatórias foram realizados no Laboratório de Fisiopatologia do PPGCS da UNESC. “Aos meus filhos, que todos os dias me dão motivação de ser uma pessoa melhor, tanto pessoal e profissionalmente. Aos meus pais, que me ensinaram a questionar, ousar e lutar pelos meus objetivos. Ao meu marido, que nestes 18 anos juntos, me dedica apoio incondicional.” AGRADECIMENTOS A DEUS, que em sua infinita sabedoria, em vários momentos nebulosos de minha vida se fez presente. E essa presença com certeza manifestava através da minha garra, persistência e paciência para alcançar meus objetivos , da maneira mais justa e humana possível. A minha família, especialmente Valentina (Tina) e Gabriel (Gabi), filhos maravilhosos, que me apoiam em toadas os meus projetos. Vê-los crescerem e se transformando cada vez mais, em criança e pré- adolescente, sensíveis, carinhos e entendendo minha vida profissional, me torna a pessoa mais realizada do mundo. Com certeza , conduzi-los ao longo desse período e ainda muitos outros virão, tem sido a dissertação mais importante da minha vida. A minha co-orientadora, um agradecimento carinhoso por todos os momentos de paciência, compreensão e competência. Agradecer a todos os alunos de iniciação científica, mestrado e doutorado que ajudaram na realização dos experimentos no laboratório. “É muito melhor lançar-se em busca de conquistas grandiosas, mesmo expondo-se ao fracasso, do que alinhar-se com os pobres de espirito, que nem gozam muito nem sofrem muito, porque vivem numa penumbra cinzenta, onde não conhecem nem vitória, nem derrota”. Theodore Roosevelt RESUMO O transtorno depressivo maior (TDM) é conhecido por ter uma origem desenvolvimental. O trauma, por exemplo, pode modular profundamente o desenvolvimento dos circuitos neurais, resultando em mudanças comportamentais significativas, muitas vezes permanentes. Estudos mostram que o estresse oxidativo e a neuroinflamação têm um papel importante na fisiopatologia do TDM. Assim, este estudo teve como objetivo utilizar um modelo animal de depressão induzido pela privação dos cuidados maternos para investigar se o comportamento do tipo depressivo, a neuroinflamação e o estresse oxidativo estão relacionados a alterações desenvolvimentais após o estresse no inicio da vida. Para este fim, ratos Wistar machos foram submetidos ao modelo animal de privação materna. Durante o protocolo de privação materna, os filhotes machos foram separados de suas mães durante 3 horas por dia nos 10 primeiros dias de vida. Aos 20, 30, 40 e 60 dias após o nascimento, os animais foram submetidos aos testes comportamentais de natação forçada e teste do campo aberto. Após os testes comportamentais, os animais foram mortos por decaptação e as estruturas cerebrais: córtex pré-frontal e hipocampo, e o soro foram retirados para a avaliação de parâmetros de estresse oxidativo e níveis de citocinas. Os resultados mostraram que o protocolo de privação materna não induziu alterações comportamentais nos animais com 30 e 40 após o nascimento. No entanto, os animais com 20 e 60 dias apresentaram comportamento depressivo no teste de natação forçada, sem alterações na atividade locomotora espontânea. No cérebro e no soro, os níveis das citocinas pró-inflamatórias tais como, interleucina 1β (IL-1β), interleucina-6 (IL-6) e o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) foram aumentados e a citocina anti-inflamatória interleucina-10 (IL-10) foi diminuída nos animais com 20, 30, 40 e 60 dias após o nascimento no cérebro e soro. Os níveis de carbonilação de proteínas foram aumentados, no cérebro, nos animais com 30, 40 e 60 dias após o nascimento. A atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) aumentou no cérebro dos animais com 30, 40 e 60 dias após o nascimento e a atividade da enzima catalase (CAT) diminuiu no cérebro dos animais com 20, 40 e 60 dias após o nascimento. Os resultados sugerem que a existência de eventos estressantes no inicio da vida pode induzir alterações comportamentais que persistem até a idade adulta além de, estimular a inflamação e danos oxidativos, nos sistemas nervoso central e periférico que iniciam logo a privação materna. Essas alterações, podem estar relacionada a uma maior vulnerabilidade ao desenvolvimento de transtornos mentais na adolescência e vida adulta. Palavras-chaves: Neurodesenvolvimento; inflamação; estresse oxidativo; privação dos cuidados maternos; transtorno depressivo maior. ABSTRACT Major depressive disorder (MDD) is known to have a developmental origin. Trauma, for example, may profoundly modulate developing neural circuits, resulting in significant behavioral changes that are often permanent. Evidence have been also shown that oxidative stress and neuroinflammation have an important role in the pathophysiology of MDD. Thus, this study was aimed to use an animal model of depression induced by maternal care deprivation (MCD) to investigate if depressive behavior, neuroinflammation and oxidative stress were underlying the developmental programming after early life stress. For the MCD protocol Wistar male pups were separated from their mothers for 3 h/day during the first 10 postnatal days (PND). At 20, 30, 40, and 60 PND, individual subsets of animals were evaluated in behavioral tests and then euthanized to assess prefrontal cortex (PFC), hippocampus and serum for cytokines levels and oxidative stress parameters assessment.The results showed that MCD did not induce behavioral changes at 30 and 60 PND. However, at 30 and 60 PND rats displayed a depressive-like behavior in the forced swimming test, without changes on locomotor spontaneous activity. In the brain and serum the levels of pro-inflammatory cytokines (interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor- (TNF-) were increased, and antiinflammatory cytokine (interleukin-10) was reduced, throughout the developmental programming (20, 30, 40 and 60 PND). Lipid damage did not occur. Protein carbonyl levels increased in the brain at 30, 40 and 60 PND. Superoxide dismutase (SOD) activity decreased during all developmental programming phases evaluated into the brain. Catalase (CAT) activity was decreased on 20, 40 and 60 PND into the brain. Our results revealed that the existence of “critical episodes” for early life stressful events is able to induce behavioral alterations that persist through to adulthood and it can stimulate inflammation and oxidative damage on both central and peripheral systems, which are needed for distinct patterns of resilience against psychiatric disorders later in life. Keywords: Developmental programming, inflammation, oxidative stress, maternal care deprivation, major depressive disorder. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1B: Efeitos da privação materna sobre o tempo de imobilidade, escalada e natação em ratos com 30 dias após o nascimento submetidos ao teste de natação forçada. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 12). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. .................................................................................. 48 Figura 1C: Efeitos da privação materna sobre o tempo de imobilidade, escalada e natação em ratos com 40 dias após o nascimentosubmetidos ao teste de natação forçada. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 12). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. .................................................................................. 49 Figura 1D: Efeitos da privação materna sobre o tempo de imobilidade, escalada e natação em ratos com 60 dias após o nascimentosubmetidos ao teste de natação forçada. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 12). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. .................................................................................. 49 Figura 2A: Efeitos da privação materna sobre o número de crossings e rearings no teste do campo aberto em animais com 20 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 12). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. ............................................................................................................... 50 Figura 2B: Efeitos da privação materna sobre o número de crossings e rearings no teste do campo aberto em animais com 30 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 12). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. ............................................................................................................... 51 Figura 2C: Efeitos da privação materna sobre o número de crossings e rearings no teste do campo aberto em animais com 40 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 12). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. ............................................................................................................... 51 Figura 2D: Efeitos da privação materna sobre o número de crossings e rearings no teste do campo aberto em animais com 60 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 12). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. ............................................................................................................... 52 Figura 3A: Efeitos da privação materna nos níveis de interleucina 1β (IL-1β) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 20 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 53 Figura 3B: Efeitos da privação materna nos níveis de interleucina 1β (IL-1β) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 30 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 53 Figura 3C: Efeitos da privação materna nos níveis de interleucina 1β (IL-1β) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 40 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 54 Figura 3D: Efeitos da privação materna nos níveis de interleucina 1β (IL-1β) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 60 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 54 Figura 4A: Efeitos da privação materna nos níveis do fator de necrose tumoral-α (TNF-α) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 20 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student......................................................................... 55 Figura 4B: Efeitos da privação materna nos níveis do fator de necrose tumoral-α (TNF-α) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 30 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student......................................................................... 56 Figura 4C: Efeitos da privação materna nos níveis do fator de necrose tumoral-α (TNF-α) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 40 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student......................................................................... 56 Figura 4D: Efeitos da privação materna nos níveis do fator de necrose tumoral-α (TNF-α) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 60 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student......................................................................... 57 Figura 5A: Efeitos da privação materna nos níveis da interleucina 6 (IL6) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 20 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 58 Figura 5B: Efeitos da privação materna nos níveis da interleucina 6 (IL6) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 30 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 58 Figura 5C: Efeitos da privação materna nos níveis da interleucina 6 (IL6) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 40 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 59 Figura 5D: Efeitos da privação materna nos níveis da interleucina 6 (IL6) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 60 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 59 Figura 6A: Efeitos da privação materna nos níveis da interleucina 10 (IL-10) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 20 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 60 Figura 6B: Efeitos da privação materna nos níveis da interleucina 10 (IL-10) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 30 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 61 Figura 6C: Efeitos da privação materna nos níveis da interleucina 10 (IL-10) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 40 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 61 Figura 6D: Efeitos da privação materna nos níveis da interleucina 10 (IL-10) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 60 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 62 Figura 7A: Efeitos da privação materna nos níveis de malondealdeído (MDA) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 20 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 63 Figura 7B: Efeitos da privação materna nos níveis de malondealdeído (MDA) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 30 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 63 Figura 7C: Efeitos da privação materna nos níveis de malondealdeído (MDA) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 40 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 64 Figura 7D: Efeitos da privação materna nos níveis de malondealdeído (MDA) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 60 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 64 Figura 8A: Efeitos da privação materna nos níveis da carbonilação de proteínas no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 20 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 65 Figura 8B: Efeitos da privação materna nos níveis da carbonilação de proteínas no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 30 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 66 Figura 8C: Efeitos da privação materna nos níveis da carbonilação de proteínas no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 40 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 66 Figura 8D: Efeitos da privação materna nos níveis da carbonilação de proteínas no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 60 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 67 Figura 9A: Efeitos da privação materna sobre a atividade da superóxido dismutase (SOD) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 20 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. .................................................................................. 68 Figura 9B: Efeitos da privação materna sobre a atividade da superóxido dismutase (SOD) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 30 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. .................................................................................. 68 Figura 9C: Efeitos da privação materna sobre a atividade da superóxido dismutase (SOD) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 40 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. .................................................................................. 69 Figura 9D: Efeitos da privação materna sobre a atividade da superóxido dismutase (SOD) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 60 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. .................................................................................. 69 Figura 10A: Efeitos da privação materna sobre a atividade da catalase (CAT) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 20 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 70 Figura 10B: Efeitos da privação materna sobre a atividade da catalase (CAT) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 30 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 71 Figura 10C: Efeitos da privação materna sobre a atividade da catalase (CAT) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 40 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 71 Figura 10D: Efeitos da privação materna sobre a atividade da catalase (CAT) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 60 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student................................................................................................... 72 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................ 31 1.1 FISIOPATOLOGIA E TRATAMENTO DO TDM........................ 32 1.2 SISTEMA IMUNE E TDM ............................................................ 33 1.3 ESTRESSE OXIDATIVO E TDM ................................................. 34 1.4 ESTRESSE E TDM ........................................................................ 38 2 OBJETIVOS ..................................................................................... 41 2.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................... 41 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS, ......................................................... 41 3 METODOLOGIA ............................................................................ 42 3.1 ASPECTOS ÉTICOS ...................................................................... 42 3.2 ANIMAIS EXPERIMENTAIS ....................................................... 42 3.3 PROTOCOLO DE PRIVAÇÃO MATERNA................................. 42 3.4 DESENHO EXPERIMENTAL....................................................... 43 3.5 TESTES COMPORTAMENTAIS .................................................. 43 3.5.1 Teste do campo aberto ............................................................... 43 3.6 ANÁLISES BIOQUÍMICAS .......................................................... 44 3.6.1 Preparação do tecido e homogenado ........................................ 44 3.6.2 Procedimentos de análise de estresse oxidativo ....................... 44 3.6.2.1 Formação de TBARS ................................................................ 44 3.6.2.2 Formação de proteínas carbonil ................................................ 45 3.6.2.3 Atividade da enzima SOD ......................................................... 45 3.6.2.4 Atividade da enzima CAT ......................................................... 46 3.6.2 Análises de citocinas ................................................................... 46 3.7. ANÁLISES ESTATÍSTICAS ........................................................ 46 4 RESULTADOS ................................................................................. 47 4.1 EFEITOS DA PRIVAÇÃO MATERNA SOBRE O COMPORTAMENTO EM DIFERENTES FASES DO DESENVOLVIMENTO ....................................................................... 47 4.2 EFEITOS DA PRIVAÇÃO MATERNA SOBRE OS NÍVEIS DE CITOCINAS NO CF, HIPOCAMPO E SORO EM DIFERENTES FASES DO DESENVOLVIMENTO .................................................... 52 4.3 EFEITOS DA PRIVAÇÃO MATERNA SOBRE PARÂMETROS DE ESTRESSE OXIDATIVO NO CF E HIPOCAMPO EM DIFERENTES FASES DE DESENVOLVIMENTO ........................... 62 5 DISCUSSÃO ..................................................................................... 73 6 CONSIDERAÇÕES FINAIS .......................................................... 78 REFERÊNCIAS .................................................................................. 79 ANEXO ................................................................................................ 90 ANEXO A: COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS ....... 91 31 1 INTRODUÇÃO A Organização Mundial de Saúde (OMS), alerta que cerca de 10% da população global, sofre com algum tipo de transtorno mental em todo o mundo, representando aproximadamente 700 milhões de pessoas. Destas, em torno de 350 milhões são afetadas pelo Transtorno Depressivo Maior (TDM), o que equivale, aproximadamente a mais de 7% da população mundial total. No Brasil, cerca de 20 a 30 milhões de pessoas, aproximadamente, apresentam, apresentaram ou virão a ter pelo menos um episódio depressivo ao longo da vida (Camargo et al., 2014). O TDM apresenta uma prevalência durante a vida de 2% a 15%, sendo um dos fatores de risco mais importantes para a incapacidade (OMS, 2012). Pacientes acometidos pelo TDM têm mais suscetibilidade a desenvolver comorbidades, como ansiedade, diabetes e doenças coronarianas (Knol et al., 2006). Trata-se de um transtorno mental sério e grave, em que muitas vezes o suicídio resulta como consequência mais grave. O suicídio está entre as dez principais causas de morte em indivíduos de todas as idades e é a principal causa de morte na maioria dos países desenvolvidos para os indivíduos com idade inferior a 35 anos (OMS, 2006). Pelo menos 50% de todos os suicídios cometidos por adultos, tinham diagnóstico prévio para o TDM (Kim et al., 2003). Além disso, até 15% dos indivíduos com diagnóstico de TDM reconhecem ter tentado o suicídio em algum momento de suas vidas (Dilsaver et al., 1996). Dados da OMS registraram aumento de 60% no número de casos de suicídios nos últimos 50 anos e estima-se um aumento a cerca de 1,5 milhões de casos até o ano de 2020. Dados, no Brasil, também são bastante relevantes, compondo um panorama de 5,6 casos de suicídios a cada 100 mil habitantes (Brasil, 2008). A etiologia do TDM ainda é desconhecida. Acredita-se em uma origem multifatorial, interação entre fatores genéticos, neurobiológicos e fatores ambientais (Jespersen et al., 2013). Além disso, a qualidade do ambiente de vida, como a exposição a eventos estressantes estão entre os fatores mais relevantes que determinam o aparecimento do TDM (Davidson e McEwen, 2012). 32 1.1 FISIOPATOLOGIA E TRATAMENTO DO TDM Em 1965 foi proposto por Schild Krout, o envolvimento do sistema monoaminérgico no TDM (Schildkraut, 1965). Tal proposição é reforçada pelo conhecimento do mecanismo de ação dos antidepressivos, que se baseia, principalmente, no aumento da disponibilidade dos neurotransmissores monoaminérgicos (dopamina, serotonina (5-HT) e noradrenalina) na fenda sináptica, seja pela inibição (seletiva ou não) de sua recaptações, ou pela inibição da enzima responsável por suas degradações (inibidores da monoaminoxidase) (Stahl et al., 1997; Nishida et al., 2002). Coppen (1967) focando no papel do sistema serotoninérgico sugeriu que o déficit de 5-HT seria a principal causa da depressão. Com isso o tratamento farmacológico eficaz seria proporcionar o aumento na fenda sináptica de 5-HT. Contudo, devido a uma série de resultados conflitantes, essa teoria simplificada, tem sido bastante criticada (Lacasse e Leo, 2005; Holtzheimer e Mayberg, 2011). Os principais antidepressivos utilizados na clínica para o tratamento do TDM são os inibidores da monoamina oxidase (ex. tranilcipromina e moclobemida), os inibidores não seletivos da recaptação de monoaminas (ex. tricíclicos, venlafaxina, duloxetina e bupropiona), os inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ex. fluoxetina, paroxetina e citalopram) e os inibidores seletivos da recaptação de noradrenalina (ex. reboxetina e desipramina) (Mathew et al., 2008). Apesar da diversidade de fármacos para o tratamento do TDM, os tratamentos disponíveis estão aquém do ideal (MachadoVieira, 2010). Isso está relacionado ao fato de que o período de resposta terapêutica para que se obtenham os primeiros benefícios clínicos é longo, sendo compreendido entre 3-5 semanas (Juli e Juli, 2014). Outras limitações relacionadas ao tratamento do TDM são os inúmeros efeitos colaterais, tais como, diminuição ou perda da libido, insônia, dor de cabeça e ganho ou perda de peso (Berton e Nestler, 2006; Holtzheimer e Nemeroff, 2006). Menos de 50% dos pacientes com TDM atingem a remissão completa após a terapia com um único antidepressivo, outros apresentam respostas parciais, refratárias ou intolerantes ao tratamento, enfatizando assim a necessidade de descobrir novos antidepressivos que possuam ação rápida, além de que sejam mais seguros e efetivos para o tratamento do TDM (Berton e Nestler, 2006; Juli e Juli, 2014). 33 1.2 SISTEMA IMUNE E TDM A ativação do sistema de resposta inflamatória na depressão está bem documentada (Maes et al., 1992; Muller et al., 1993; Maes et al., 1994; Rothermundt et al., 2001; Myint et al., 2005). No entanto, poucos estudos têm investigado a inflamação no cérebro e/ou a associação entre a inflamação periférica e central. Pacientes diagnosticados com o TDM, apresentam um aumento no número de leucócitos sanguíneos periféricos, elevação na concentração plasmática de proteínas de fase aguda, como a haptoglobina e a proteína C reativa, diminuição a resposta a mitógenos, redução do número de linfócitos, alteração na expressão de antígenos, além de um aumento nos níveis sanguíneos de citocinas proinflamatórias tais como interleucina-6 (IL-6) e interleucina-2 (IL-2) e também seus receptores (Nishida et al., 2002; Sublette et al., 2004). Este aumento significativo nas citocinas pro-inflamatórias e consequente desequilíbrio na resposta das células de defesa, poderiam desempenhar um importante papel na fisiopatologia do TDM (Vismari et al., 2008 ). Estudos sugerem que o aumento na produção de citocinas próinflamatórias observada no TDM resultaria nos sintomas a ela relacionados, ou seja, as citocinas atuariam como neuromoduladores, mediando aspectos neuroquímicos, neuroendócrinos e comportamentais do TDM (Yirmiya et al., 2000; Leonard et al., 2001). As citocinas também seriam capazes de ativar células gliais, como astrócitos e microglia, que por sua vez, produziriam mais citocinas próinflamatórias por mecanismos de feedback (Muller et al., 1998). As respostas imunológicas em nível central são reguladas por dois tipos celulares, a micróglia e os astrócitos, os quais desempenham papéis inflamatórios e anti-inflamatórios, respectivamente (Gao e Hong, 2008). Os astrócitos são os mais abundantes, compreendendo aproximadamente 80% das células cerebrais, enquanto as células microgliais representam aproximadamente 15% de células do cérebro. Os astrócitos, além de fazerem parte dos sistemas imunes e inflamatórios encontram-se com uma localização estratégica, em estreito contato com as células do sistema nervoso central (SNC) residentes (neurônios, microglia, oligodendrócitos e outros astrócitos). Apresentam como função o armazenamento, o transporte e a liberação de neurotransmissores (Gao e Hong, 2008), por exemplo, o glutamato, o qual é transportado ativamente pelos astrócitos (Aronica et al., 2003). Os principais ativadores dos astrócitos são mediadores inflamatórios, tais como o fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interferon-γ (IFN-γ), 34 interleucina 1 (IL-1) e interleucina 6 (IL-6) (Farina et al., 2007). O número e função das microglias parecem ser controlados pelo microambiente local. Estas células do sistema imunológico dotadas de receptores podem detectar mudanças ambientais sobre uma escala de tempo de minutos e responder realizando diversas funções, que de acordo com o contexto, poderiam resultar como benéficos ou prejudiciais (Kierdorf e Prinz, 2013; Siskova e Tremblay, 2013) na interface de estímulos ambientais e consequentemente mudanças em sua função, sugerindo-se que as microglias poderiam estar por trás da interação entre estímulos ambientais e vulnerabilidade ao TDM. 1.3 ESTRESSE OXIDATIVO E TDM Até hoje, nenhum processo fisiopatológico específico tem sido associado às alterações morfológicas neuronais que acompanham o TDM (Michel et al., 2012). Constantemente, as reduções volumétricas no córtex pré-frontal (PFC) e no hipocampo foram relatadas a partir de estudos estruturais de imagem cerebral de pacientes com o transtorno (Campbell et al., 2004). Estudos postmortem realizados, mostraram reduções significativas no número e densidade de células gliais nestas regiões cerebrais, bem como alterações mais sutis na densidade e tamanho neuronal (Harrison et al., 2002; Bowley et al, 2002). Uma das causas mais plausíveis para estas alterações neuronais é o aumento do estresse oxidativo devido a uma elevação da produção de radicais livres. Na última década, a "hipótese de estresse oxidativo no TDM" tem sido apoiada por diversos estudos na literatura, não só em seres humanos, mas também nos achados pré-clínicos de modelos animais (Michel et al., 2007; Michel et al., 2010). A definição mais comum de estresse oxidativo é um desequilíbrio no aumento de radicais livres e na resistência antioxidante, o que resulta em maior liberação de espécies reativas de oxigênio (ERO) (Halliwell et al., 1989). Estes radicais livres ou ânions são moléculas reativas contendo átomos de oxigênio tais como superóxido, o radical hidroxila e o peroxinitrito (Fridovich et al.,1986; Halliwell et al., 1989). As ERO desempenham um papel fundamental em vários mecanismos de sinalização celular. O aumento do estresse oxidativo resulta na inativação enzimática, na peroxidação lipídica e danos ao DNA (Michel et al., 2012). Portanto, uma maior liberação das ERO, muitas vezes em combinação com uma diminuição da defesa antioxidante, pode levar a ruptura celular e, finalmente a apoptose (Fridovich et al.,1986; Halliwell et al., 1989). Uma das mais importantes enzimas produtoras de ERO é a 35 xantina oxidase (XO) (Harrison et al., 2002; Hille et al., 2005). A XO catalisa a oxidação de hipoxantina em xantina e catalisa a oxidação de xantina em ácido úrico. Na reação citada, consequentemente ocorre a produção no mínimo de dois metabolitos de oxigênio reativos: os ânions superóxido e peróxido de hidrogênio (Brown et al., 1988; Terada et al., 1988). XO catalisa a redução de O2, levando à formação de superóxido (O2 ̇-) e do produto peróxido de hidrogênio (H2O2) (Harrison et al., 2002; McCord et al., 1985; Zweier et al., 1988). Enzimas antioxidantes, como a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT) ou glutationa peroxidase (GPX) metabolizam as ERO em moléculas menos tóxicas. Por exemplo, a SOD catalisa a reação de superóxido H2O2, molécula menos tóxica (Winterbourn et al., 1993). A SOD é uma das mais importantes enzimas antioxidantes e interage com outras substâncias neuroprotetoras (Gsell et al., 1995). No entanto, o papel da SOD é um tanto ambíguo, pois é um antioxidante muito potente, mas também pode levar ao aumento do estresse oxidativo através da via de produção de H2O2, se as mesmas se encontrarem diminuídas (Michel et al., 2012). A SOD pode existir em várias isoformas contendo cobre e zinco (Cu/ZnSOD) ou manganês (Mn-SOD). A distribuição celular destas enzimas varia de acordo com sua localização, a Cu/Zn-SOD está localizado principalmente em células gliais, enquanto Mn-SOD está localizado em neurônios e eritrócitos (Durany et al.,1999). Como foi abordado anteriormente, os danos relacionados ao estresse oxidativo foram descritos no TDM (Fridovich et al., 1986; Halliwell et al., 1989; Michel et al., 2012). As ERO podem levar à destruição da integridade neuronal, induzida por danos diretos ao DNA ou pela peroxidação lipídica da membrana celular. Este último é iniciado por radicais livres, os quais quebram os ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs) de duplos ligamentos. Este processo leva mais frequentemente a uma reação em cadeia. Uma vez que o processo pode ser iniciado por apenas uma ERO, lipídios de membrana são extremamente vulneráveis. As "ligações duplas" são responsáveis pelas propriedades específicas da membrana celular, tais como, integridade e fluidez (Michel et al., 2012). Estas características podem ser interrompidas por ROS levando à destruição da célula. Os radicais peroxila induzem ainda destruições de proteínas de membrana, tais como receptores e enzimas (Halliwell et al., 1995). Estes processos, levando a células apoptóticas, foram observados em pacientes com TDM (Michel et al., 2010). Tem sido demonstrado no sangue de pacientes com TDM dano na membrana através da elevação dos ácidos graxos ômega 3 pelo aumento dos produtos de peroxidação lipídica 36 (Bilici et al., 2001; Peet et al., 1998; Sarandol et al., 2007; Selley et al., 2004). Nestes pacientes tambem têm sido associados o aumento dos níveis séricos de malondialdeído (MDA), um produto de degradação de lipoproteínas oxidadas apolipoproteína B (Bilici et al., 2001; Sarandol et al., 2006). Em pacientes com o transtorno, níveis elevados de MDA afetam negativamente a eficiência da memória visuo-espacial, auditivoverbal e memória declarativa de curto e longo prazo (Talarowska et al., 2012). A maior concentração de MDA plasmática em pacientes com depressão recorrente está associada à gravidade dos sintomas depressivos, tanto no início da farmacoterapia antidepressiva como após 8 semanas de tratamento. Além disso, uma associação de estresse psicológico e estresse oxidativo têm sido descritas repetidamente, tanto em modelos animais como em seres humanos. Sabe-se há algum tempo que o TDM pode ser desencadeado por eventos de vida que são acompanhados por estresse psicológico (Gidron et al., 2008). Como citado anteriormente, o TDM está associado a problemas cardiovasculares. Curiosamente, o estresse oxidativo é um fator de risco que liga ambos os distúrbios em um nível bioquímico (Milne et al., 2005). Maes e colaboradores (2010) encontraram um aumento de peróxidos plasmáticos e anticorpos de lipoproteína de baixa densidade oxidados em pacientes com TDM. Esses achados enfatizam o papel das vias de estresse oxidativo no TDM bem como em doenças coronarianas, o que pode explicar parcialmente as altas comorbidades dessas doenças (Maes et al., 2010). Em pacientes com TDM, a expressão, atividade e concentração de enzimas relacionadas ao estresse oxidativo no sangue e sistema nervoso estão alteradas (Michel et al., 2012). A literatura descreve os efeitos do estresse oxidativo relatado nestes pacientes observando as concentrações e atividades de enzimas pró e antioxidantes. Os resultados de níveis alterados de enzimas antioxidantes no sangue de pacientes com TDM têm sido um pouco conflituosos, alguns mostraram níveis aumentados de SOD (Sarandol et al., 2007; Bilici et al., 2001), GSH-Px e GR (Bilici et al., 2001), outros mostraram a atividade da SOD diminuída (Herken et al., 2007). Um estudo não encontrou nenhuma alteração (Srivastava et al., 2002). Pacientes com depressão parecem ter menores níveis de albumina, o que significa diminuição da atividade antioxidante (Van Hunsel et al., 1996). Foi encontrado, em pacientes depressivos não medicados, por menos 2 meses, diminuição no número total de antioxidantes e nos níveis de ácido úrico no plasma, bem como aumento do índice de peróxido no plasma total e índice de estresse oxidativo em relação aos indivíduos sem depressão (Yanik et al., 2004). 37 Analogamente, diferentes estudos também mostraram associações entre a gravidade do TDM e os índices de estresse oxidativo (Bilici et al., 2001; Forlenza et al., 2006; Sarandol et al., 2007). Em suma, o achado mais replicado, no TDM foi a elevação de radicais livres e diminuição de enzimas antioxidantes (Forlenza et al., 2006; Sarandol et al., 2007). Além disso, pacientes com depressão mostram concentrações reduzidas das vitaminas antioxidantes E e C (Maes et al., 2000; Owen et al., 2005), estes resultados foram independentes do estado nutricional (Owen et al., 2005). Outro estudo em pacientes livres de medicação com TDM em relação a controles saudáveis mostrou menor potencial antioxidante total, concentração de ácido úrico, aumento dos marcadores de peroxidação lipídica e do índice de estresse oxidativo total no plasma desses pacientes (Yanik et al., 2004). No córtex frontal, as concentrações de Cu/Zn-SOD estão aumentadas em pacientes com TDM em comparação com controles (Michel et al., 2007). Esse achado foi de interesse específico, uma vez que o Cu/Zn-SOD está localizado apenas parcialmente em neurônios, mas principalmente em células gliais, que são mais vulneráveis aos danos oxidativos (Fridovich et al., 1986; Papadopoulus et al., 1998). Em contraste com a Cu/Zn-SOD, a Mn-SOD é uma enzima mitocondrial, que pode ser encontrada principalmente em neurônios e em quantidades muito menores em células gliais. No TDM, as células gliais têm sido repetidamente descritas como alteradas, especialmente no córtex frontal (Lindenau et al., 2000; Rajkowska et al.,2000). Esses relatos de aumento de Cu/Zn-SOD, mas não de Mn-SOD no córtex frontal de pacientes com TDM, têm sido interpretados como importantes para explicar esses achados histopatológicos de lesão glial predominante nesta área cerebral (Michel et al., 2007). O aumento da oxidação das moléculas lipídicas na depressão pode ser devido à ativação da resposta imune (Babior et al., 2000), seguida pela indução de mediadores pró-inflamatórios como o TNF- e as interleucinas IL-1 e IL-6 (Miller et al., 2002; Penninx et al., 2003; Lesperance et al., 2004; Ranjit et al., 2007). Curiosamente, pacientes com o TDM também são mais vulneráveis a infecções (Miller et al., 2005). A oxidação dos lípidos parece ser parte da resposta do hospedeiro à infecção e inflamação, o que tem sido demonstrado em modelos animais in vivo (Memon et al., 2000). A resposta citotóxica do hospedeiro contra patógenos invasores leva a fagócitos ativados produzindo ROS como superóxido, peróxido de hidrogênio, óxido nítrico e peroxinitrito (Babior et al., 2000). Os leucócitos ativados segregam então a mieloperoxidase, gerando ainda 38 oxidantes reativos derivados do nitróxido que induzem a peroxidação lipídica (Zhang et al., 2002). Portanto, é possível que a depressão esteja ligada à oxidação lipídica por meio de inflamação relacionada ao estresse oxidativo. 1.4 ESTRESSE E TDM Mais de 30% dos transtornos mentais estão diretamente relacionados ao estresse precoce, incluindo transtornos de ansiedade e transtornos do humor (Afifi et al., 2008). A adversidade precoce, nos humanos, acelera o aparecimento de sintomas depressivos, que se manifestam durante a adolescência. Embora os efeitos precoces do estresse na psicopatologia do adulto possam depender do risco genético, pensa-se que a natureza da interação gênica e ambiental é um determinante crítico do resultado (Levine et al., 2012). Este modelo de diátese de estresse para os principais distúrbios do humor baseia-se, pelo menos em parte, nos achados de que o estresse frequentemente precede o aparecimento de episódios afetivos em indivíduos geneticamente vulneráveis (Dunner et al., 1979; Anisman et al., 1982; Brown et al, 1987). Não só parece que há uma correlação significativa entre o estresse ambiental e o início subsequente de um episódio de um transtorno afetivo, mas há uma marcada semelhança entre as principais características da depressão em humanos e as consequentes respostas neuroendócrinas e comportamentais frente ao estresse em modelo animal (McKinneywt et al., 1984). Com a ativação do sistema de estresse, por consequência ocorre a ativação do sistema nervoso simpático, diretamente relacionado a liberação de citocinas como a IL-6 (Nishida et al, 2002; Sublette et al, 2004). No qual, por sual vez, devido a desregulação entre o sistema de defesa e a produção de citocinas pro-inflamatórias poderiam induzir sintomas depressivos, já que parecem mediar a síndrome do comportamento doentio em humanos e animais, caracterizada com alterações do sono, do apetite, humor, atividade psicomotora e socialização. Em áreas cerebrais específicas de pacientes deprimidos, como hipocampo, pode ser encontrada perda neuronal, a qual parece correlacionar positivamente com alterações no balanço de citocinas inflamatórias na periferia (Miller et al., 1998; Nishida et al., 2002; Szelényi et al., 2007). Estressores físicos, fisiológicos e psicológicos induzem alterações tanto nas vias de neurotransmissores, quanto alterações hormonais, que podem influenciar a função immune tanto in vitro 39 quanto in vivo (Zorrila et al., 2001). Alves e colaboradores (2006) também verificaram, através de experimentos, a influência de estressores psicológicos sobre parâmetros imunológicos. O estresse tem sido um dos fatores que contribuem para o desencadeamento do TDM. Com isso, é possível verificar que o estresse ou separação no início da vida estão associados com um aumento de citocinas pró-inflamatórias, na qual conduzem a uma ativação do sistema imune e aumento de prostaglandinas pró-inflamatórias (Song et al., 1998). O cérebro está constantemente sendo moldado pelos estímulos ambientais. O circuito neural, relacionado com o comportamento social e emocional parece ser fundamentalmente moldado pelas experiências. Estímulos precoces nessa via envolvem domínios diferentes entre os indivíduos, proporcionando vulnerabilidade ou resiliência frente às adversidades (Davidson e McEwen, 2012). A ocorrência de um trauma na infância, como separação materna, por exemplo, pode modular o desenvolvimento de circuitos neurais, resultando em mudanças comportamentais significativas que muitas vezes são permanentes, fortalecendo a ideia de que a origem do TDM pode ocorrer a partir do desenvolvimento. Neste sentindo, estudos pré-clínicos demonstram que privação dos cuidados maternos durante os primeiros 10 dias pós-natal induz em ratos comportamento depressivo e alterações cerebrais como diminuição dos níveis de neurotrofinas e aumento dos níveis periféricos de IL-6 e TNF- α na idade adulta (Réus et al., 2011; Réus et al., 2015a). Um estudo pré-clínico realizado por Yirmiya e colaboradores (2011), confirmaram essa hipotése. Foi evidenciado alterações dinâmicas bidirecionais na micróglia, frente à exposição ao estresse que por sua vez, produzem comportamento do tipo depressivo induzida por estresse em roedores. Estas células podem modificar suas características e funções de acordo com estímulos ambientais, que de acordo com o contexto poderiam resultar como benéficos ou prejudiciais (Kierdorf e Prinz, 2013; Siskova e Tremblay, 2013). Por exemplo, essas células respondem a experiências sensoriais e comportamentais (privação de estímulos visuais, enriquecimento ambiental), modulando suas interações com os circuitos neuronais (Ekdahl, 2012; Reshef et al., 2014). Ratos expostos ao estresse apresentaram modificações na microglia, principalmente no giro denteado do hipocampo (Muller, 2014). Foi demonstrado que em uma exposição de curto prazo (1-2 dias) houve uma proliferação e ativação da microglia, com aumento da ativação e expressão de marcadores, tais como IL-1/IL-1R (Muller, 2014). No entanto, após 3-4 dias, uma diminuição da microglia foi observada em animais estressados em comparação com controles, 40 evidenciado pelos elevados níveis de caspase-3 (uma protease que medeia a execução da fase de apoptose) e a fragmentação do DNA (uma característica chave de apoptose). Além disso, os autores descobriram que a exposição crônica ao estresse (5 semanas) leva a um número reduzido de células, diminuição da expressão de marcadores microgliais como o Iba-1 e CD11b (Muller, 2014). Além disso, houve uma diminuição pela preferência por sacarose e exploração social nos roedores, indicando um comportamento do tipo depressivo (Muller, 2014). Embora, muitos estudos tenham documentado o papel do sistema imune e do estresse oxidativo no TDM, essa associação ainda não foi investigada em diferentes períodos do desenvolvimento após o estresse no início da vida induzido pela privação dos cuidados maternos. Assim, esse estudo teve como objetivo investigar essas alterações ao longo do desenvolvimento. 41 2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL Avaliar as alterações comportamentais, parâmetros inflamatórios e parâmetros de estresse oxidativo em diferentes fases do desenvolvimento de ratos Wistar submetidos à privação dos cuidados maternos. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS, a) Avaliar o comportamento do tipo depressivo através do tempo de imobilidade no teste do nado forçado em diferentes fases do desenvolvimento de ratos Wistar submetidos a privação dos cuidados maternos; b) Avaliar a atividade locomotora espontânea através do teste do campo aberto em diferentes fases do desenvolvimento de ratos Wistar submetidos a privação dos cuidados maternos; c) Avaliar os níveis das citocinas pró-inflamatórias IL-1, TNF- e IL-6 e da citocina anti-inflamatória IL-10 no córtex frontal (CF), hipocampo e soro de ratos Wistar em diferentes fases do desenvolvimento após a privação dos cuidados maternos; d) Avaliar os níveis de carbonilação de proteínas, de espécias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e a atividade de enzimas antioxidantes superóxido dismutase e catalase no CF e hipocampo de ratos Wistar em diferentes fases do desenvolvimento após a privação dos cuidados maternos. 42 3 METODOLOGIA 3.1 ASPECTOS ÉTICOS Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as recomendações internacionais para o cuidado e o uso de animais de laboratório, além das recomendações para o uso de animais da Sociedade Brasileira de Neurociências e comportamento (SBNeC). O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC) sob o protocolo 058/2016-1. 3.2 ANIMAIS EXPERIMENTAIS Para este estudo, foram obtidas ratas fêmeas Wistar (idade de 3 meses, peso de 250-280 g) da colônia de reprodução da Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC, Criciúma, SC, Brasil) e permaneceram durante uma semana na presença de machos para fins de acasalamento. No final de 7 dias, as ratas grávidas foram alojadas individualmente com acesso ad libitum a alimento e água. As ratas grávidas foram alojadas individualmente para o nascimento dos filhotes e sua identificação. Todas as mães e filhotes foram mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 horas (06:00 às 18:00) e a uma temperatura de 23 ± 1°C. 3.3 PROTOCOLO DE PRIVAÇÃO MATERNA No primeiro dia pós-natal as ninhadas foram abatidas a oito filhotes (quatro machos e quatro fêmeas, quando possível). Os filhotes foram privados da mãe durante 3 horas por dia, durante os 10 primeiros dias. A privação consiste em retirar a mãe da caixa e manter os filhotes na caixa original, para ficarem na presença do odor materno. Os animais não privados permaneceram imperturbáveis na gaiola original com sua mãe. As caixas em ambos os grupos só foram trocadas no 11o dia após o período pré-natal. Os ratos foram desmamados apenas no 22o dia após o período pré-natal e apenas os machos foram utilizados para o estudo, as fêmeas foram doadas para outros grupos de pesquisa. 43 3.4 DESENHO EXPERIMENTAL Após o protocolo de privação materna, diferentes grupos de animais (privados e não-privados) foram submetidos aos testes comportamentais de natação forçada e atividade lomocotora e exploratória. Aos 20, 30, 40 e 60 dias após o nascimento (infância, adolescência, adultos jovens e adultos, respectivamente) diferentes grupos de animais foram submetidos aos testes comportamentais (n = 12 privados, n = 12 não-privados para cada fase, com um n total = 96 animais). Após os testes comportamentais os ratos foram mortos e, em seguida, o soro, CF e hipocampo foram retirados para avaliar os níveis de citocinas e parâmetros de estresse oxidativo. 3.5 TESTES COMPORTAMENTAIS 3.5.1 Teste do campo aberto Nos dias 20, 30, 40 e 60 após o nascimento, os ratos foram submetidos ao teste do open field para avaliar possíveis efeitos na atividade locomotora espontânea (n=12 por grupo). Foi realizado em um campo aberto de 40 x 60 cm delimitado por 4 paredes com 50 cm de altura, sendo 3 de madeira e uma de vidro transparente. O piso do campo aberto foi dividido em 12 quadrados iguais marcados por linhas pretas. Os animais foram cuidadosamente colocados no quadrado do canto posterior esquerdo do aparelho, a partir do qual explora livremente o ambiente por 5 minutos. Foram contados pelo avaliador o número de cruzamentos e o número de levantamentos dos animais no período de 5 minutos (Réus et al., 2015). 3.5.2 Teste do nado forçado Após o teste do campo aberto, os mesmos animais foram submetidos ao teste do nado forçado (n=12 por grupo). Este teste consiste em dois dias de procedimentos no qual cada rato é posto em um cilindro com água a 23º C, a água deve ser suficiente para o animal não conseguir apoiar as patas no fundo. No período de treino, os animais foram forçados a nadar durante 15 minutos. No dia seguinte, (24 horas após o treino) no período de teste, cada animal foi novamente forçado a nadar durante 5 minutos. Foram avaliados os parâmetros de 44 imobilidade, nos quais incluem imobilidade total ou movimentos para manter a cabeça fora da água sem intenção de escapar, parâmetros de nado, que incluem movimentos horizontais através da superfície da água, e parâmetros de escalada, movimentos verticais contra as paredes (Porsolt et al., 1977). 3.6 ANÁLISES BIOQUÍMICAS 3.6.1 Preparação do tecido e homogenado Amostras de tecidos do CF, hipocampo foram homogeneizados (1:10, w/v) em tampão SETH, pH 7,4 (250 mM de sacarose, 2 mM de EDTA, 10 mM base Trizma, 50 UI/mL de heparina). Os homogenados foram centrifugados a 800 x g durante 10 minutos a 4oC. Os sobrenadantes foram mantidos a -80o C, até serem usados para a determinação da atividade enzimática. O intervalo máximo entre a preparação do homogenado e a análise enzimática foi sempre inferior a cinco dias. O teor de proteína foi determinado pelo método descrito por Lowry et al. (1951). A albumina de soro bovino foi utilizada como padrão. 3.6.2 Procedimentos de análise de estresse oxidativo 3.6.2.1 Formação de TBARS A peroxidação lipídica foi analisada através da formação de TBARS (Esterbauer e Cheeseman 1990). As amostras de tecido cerebral foram lavadas com PBS, colhidas e lisadas. As espécies reativas foram obtidas por hidrólise ácida de 1,1,3,3-tetra-etoxi-propano (TEP) e foram utilizadas como padrão para a quantificação de TBARS. A cada tubo foi adicionado TBA a 0,67% e em seguida foram agitados. A mistura da reação foi incubada a 90oC durante 20 minutos e posteriormente as amostras foram colocadas em gelo. A densidade óptica de cada solução foi medida em um espectrofotômetro a 535 nm. Os dados foram expressos como nmol de equivalente malondialdeído (MDA) por mg de proteína. 45 3.6.2.2 Formação de proteínas carbonil O dano oxidativo em proteínas teciduais foi determinado pela medida de grupos carbonil. O conteúdo de proteínas carboniladas foi medido nas amostras homogeneizadas de cérebro utilizando 2,4dinitrofenil-hidrazina (DNPH) em um ensaio espectrofotométrico (Levine et al., 1990). Amostras de tecidos foram sonicadas em homogeneização gelada de tampão contendo inibidores de fosfatase e de protease (200 nM caliculina, 10 µg/ml de leupeptina, 2 µg/ml de aprotinina, 1 mM de ortovanadato de sódio e 1 µM microcistina-LR) e centrifugadas a 1000 x g durante 15 minutos para sedimentar o material insolúvel. Trezentos microlitros de alíquotas do sobrenadante contendo 0,7-1,5 mg de proteína foram tratados com 300 µl de 10 mM de DNPH, dissolvido em HCl a 2M, e comparado com 2M de HCl sozinho (reagente branco). Em seguida as amostras foram incubadas no escuro sob agitação a cada 10 minutos, durante uma hora e à temperatura ambiente. As amostras foram precipitadas com ácido tricloroacético (concentração final de 20%) e centrifugadas a 16,000 x g a 4oC, durante 15 minutos. O sedimento foi lavado por três vezes com 1 ml de etanol/acetato de etil (1:1 v/v). Os sedimentos foram seguidamente levemente agitados em vórtice e após, expostos à solução de lavagem durante 10 minutos antes da centrifugação (16,000 x g, durante 5 minutos). O sedimento final foi dissolvido em 1 ml de guanidina 6M e 10 mM de tampão fosfato trifluoroacético ácido, pH 2,3. O material insolúvel foi removido por centrifugação a 16,000 x g, por 5 minutos. Absorbância foi registrada em um espectrofotômetro a 370 nm, tanto para as amostras tratadas com DNPH, quanto para o HCl sem DNPH. Os níveis de proteínas carboniladas foram expressos como nmol de carbonil por mg de proteína. 3.6.2.3 Atividade da enzima SOD A estimativa da SOD foi realizada com base em sua capacidade para inibir espontaneamente a oxidação da adrenalina para adrenocromo (Bannister e Calabrese, 1987). Uma combinação de 2,78 ml de tampão carbonato de sódio (0,05 mM; pH 10,2), 100 µl de EDTA (1,0 mM), e 20 µl do sobrenadante ou sacarose (branco) foi incubada a 30oC, durante 45 minutos. Em seguida, a reação foi iniciada após adição de 100 µl de solução de adrenalina (9,0 mM). A variação na absorbância foi registrada a 480 nm, durante 8 minutos. Durante todo o procedimento do ensaio, a temperatura foi mantida a 30oC. Uma 46 unidade de SOD produziu aproximadamente 50% de auto-oxidação de adrenalina. Os resultados foram expressos em unidades/mg de proteína. 3.6.2.4 Atividade da enzima CAT A atividade da CAT foi medida através do método que utiliza o peróxido de hidrogênio (H2O2) para gerar H2O e O2 (Aebi 1984). As amostras de tecido cerebral foram sonicadas em 50 mmol/l de tampão fosfato (pH 7,0). A suspensão resultante foi centrifugada a 3000 x g, durante 10 min. A alíquota de amostra (20 µl) foi adicionada a 980 µl da mistura de substrato. A mistura de substrato continha 0,3 ml de H2O2 em 50 ml de tampão fosfato a 0,05 M (pH 7,0). As absorbâncias inicial e final foram registradas a 240 nm, após 1 e 6 minutos, respectivamente. Uma curva padrão foi estabelecida, utilizando-se catalase purificada (Sigma, MO, EUA) nas mesmas condições. 3.6.2 Análises de citocinas Os níveis das citocinas IL-1β, IL-6, IL-10 e TNFα (n = 5 por grupo) no cótex pré-forntal, hipocampo e soro foram analisados por imunoensaio (ELISA Sanduíche) através dos kits da Chemicon International e R&D Sistems. 3.7. ANÁLISES ESTATÍSTICAS Os dados foram analisados pelo teste T de Student para dados não pareados e foram expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.). Valores p < 0,05 foram considerados estatísticamente significativos. As análises foram realizadas utilizando o software Statistical Package for the Social Science (SPSS) versão 21.0. 47 4 RESULTADOS 4.1 EFEITOS DA PRIVAÇÃO MATERNA SOBRE O COMPORTAMENTO EM DIFERENTES FASES DO DESENVOLVIMENTO A figura 1 ilustra os efeitos da privação materna sobre o comportamento depressivo no teste de natação forçada. Aos 20 dias após o nascimento o tempo de imobilidade e de escalada não se alterou nos ratos privados (F = 0,387; p = 0,790 e F = 11,569; p = 0,155, respectivamente, Fig. 1A). No entanto, nos ratos privados observou-se uma diminuição no tempo de natação, em comparação com o grupo não-privado (F = 11,569; p = 0,049, Fig. 1A). Aos 30 dias após o nascimento, não foi encontrada alteração no teste do nado forçado para os parâmetros analisados, tempo de imobilidade (F = 0,346; p = 0,671, Fig. 1B), tempo de natação (F = 0,13; p = 0,735, Fig. 1B) e tempo de escalada (F = 0,898; p = 0,698, Fig. 1B). Além disso, aos 40 dias após o nascimento, também não foi encontrada diferença estatística para o tempo de imobilidade (F = 2,472; p = 0,412, Figura 1C), natação (F = 2,382; p = 0,368, Fig. 1C) e escalada (F = 0,112; p = 0,917, Fig. 2C). Curiosamente, nos ratos adultos privados com 60 dias, houve um aumento no tempo de imobilidade (F = 7.541; p = 0.003, Fig. 1D) e uma diminuição no tempo de escalada (F = 1.206; p = 0.025; 1D), indicando um comportamento do tipo depressivo. No tempo de natação, não houve diferença estatística para os animais com 60 dias após o nascimento (F = 0,17; p = 0,182, Fig. 1D). 48 Figura 1A: Efeitos da privação materna sobre o tempo de imobilidade, escalada e natação em ratos com 20 dias após o nascimentosubmetidos ao teste de natação forçada. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 12). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. Figura 1B: Efeitos da privação materna sobre o tempo de imobilidade, escalada e natação em ratos com 30 dias após o nascimento submetidos ao teste de natação forçada. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 12). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. 49 Figura 1C: Efeitos da privação materna sobre o tempo de imobilidade, escalada e natação em ratos com 40 dias após o nascimentosubmetidos ao teste de natação forçada. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 12). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. Figura 1D: Efeitos da privação materna sobre o tempo de imobilidade, escalada e natação em ratos com 60 dias após o nascimentosubmetidos ao teste de natação forçada. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 12). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. 50 Os resultados da atividade locomotora espontânea estão representados na Figura 2. Não houve alteração estatística para os animais com 20 dias após o nascimentoquanto ao número de crossings (F = 0,232; p = 0,464, Fig. 2A) e rearings (F = 0,853; p = 0,142, Fig. 2A). O número de crossings não foi alterado nos animais com 30 dias após o nascimento (F = 1,037; p = 0,141, Fig. 2B), porém houve um aumento no número de rearings (F = 0,533; p = 0,015, Figura 2B) nos ratos privados em comparação com os não-privados. Não houve diferença estatística tanto no número de crossingss quanto rearings para os animais com 40 dias (F = 0,341; p = 0,541 e F = 1,110; p = 0,348, Fig. 2C, respectivamente) e 60 dias após o nascimento(F = 0,000; p = 0,271; e F = 1,877; p = 0,233, Fig. 2D). Figura 2A: Efeitos da privação materna sobre o número de crossings e rearings no teste do campo aberto em animais com 20 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 12). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. 51 Figura 2B: Efeitos da privação materna sobre o número de crossings e rearings no teste do campo aberto em animais com 30 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 12). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. Figura 2C: Efeitos da privação materna sobre o número de crossings e rearings no teste do campo aberto em animais com 40 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 12). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. 52 Figura 2D: Efeitos da privação materna sobre o número de crossings e rearings no teste do campo aberto em animais com 60 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 12). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. 4.2 EFEITOS DA PRIVAÇÃO MATERNA SOBRE OS NÍVEIS DE CITOCINAS NO CF, HIPOCAMPO E SORO EM DIFERENTES FASES DO DESENVOLVIMENTO Na figura 3 estão representados os resultados para os níveis de IL-1β no CF, hipocampo e soro. Nos ratos privados com 20 dias houve uma diminuição nos níveis de IL-1β no CF (F = 4,421; p = 0,016, Fig. 3A) e um aumento nos níveis de IL-1β no hipocampo (F = 0,778; p = 0,049, Fig. 3A) em comparação com os ratos não-privados. Porém, no soro não houve diferença estatística (F = 23.750; p = 0.049, Fig. 3A). Nos animais privados com 30 dias após o nascimento, houve um aumento nos níveis da IL-1β no CF (F = 5,614; p = 0,004, Fig. 3B), no hipocampo (F = 7,053; p = 0,036, Figura 3B) e no soro (F = 3,931; p = 0,014, Fig. 3B) em comparação com os animais não-privados. Por outro lado, nos animais com 40 dias após o nascimento, os níveis da IL-1β não foram alterados no CF (F = 3,411; p = 0,520, Fig. 3C), no hipocampo (F = 0,895; p = 0,126, Fig. 3C) e no soro (F = 0,001; p = 0,344, Fig. 3C). Já nos animais com 60 dias após o nascimento, houve uma diminuição dos níveis da IL-1β no hipocampo (F = 1,284; p = 0,015, Fig. 3D), e um aumento no soro (F = 4,459; p = 0,008, Fig. 3D) 53 em comparação com os animais não-privados. No CF os níveis da IL-1β não foram alterados nos animais com 60 dias após o nascimento (F = 3.857; p = 0.015, Fig. 3D). Figura 3A: Efeitos da privação materna nos níveis de interleucina 1β (IL-1β) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 20 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. Figura 3B: Efeitos da privação materna nos níveis de interleucina 1β (IL-1β) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 30 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. 54 Figura 3C: Efeitos da privação materna nos níveis de interleucina 1β (IL-1β) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 40 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. Figura 3D: Efeitos da privação materna nos níveis de interleucina 1β (IL-1β) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 60 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. Os níveis de TNF-α estão ilustrados na figura 4. Nos animais privados com 20 dias após o nascimento houve um amento nos níveis de TNF-α no CF (F = 1,115; p = 0,002, Fig. 4A), hipocampo (F = 1,647; p = 0,010, Fig. 4A) e soro (F = 0,662; p = 0,004, Fig. 4A) em comparação com os ratos não-privados. Os níveis de TNF-α foram aumentados nos ratos com 30 dias após o nascimento no CF (F = 5,557; p = 0,026, Figura 4B) e no hipocampo (F = 3,451; p = 0,031, Figura 4B) 55 em comparação com os ratos não-privados, porém não foram alterarados no soro (F = 1,246; p = 0,252, Fig. 4B). Nos animais privados com 40 dias após o nascimento houve também um aumento nos níveis de TNF-α no CF (F = 6,306; p = 0,001, Fig 4C), no hipocampo (F = 9,578; p = 0,018, Fig. 4C) e no soro (F = 13,179; p = 0,048, Fig. 4C) em comparação com os ratos não-privados. No CF (F = 4,535; p = 0,165, Fig. 4D) e no hipocampo (F = 11,449; p = 0,156, Fig. 4D) não houve diferença estatística nos níveis de TNF-α para os animais com 60 dias após o nascimento. Figura 4A: Efeitos da privação materna nos níveis do fator de necrose tumoral-α (TNF-α) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 20 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. 56 Figura 4B: Efeitos da privação materna nos níveis do fator de necrose tumoral-α (TNF-α) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 30 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. Figura 4C: Efeitos da privação materna nos níveis do fator de necrose tumoral-α (TNF-α) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 40 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. 57 Figura 4D: Efeitos da privação materna nos níveis do fator de necrose tumoral-α (TNF-α) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 60 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. Nos animais com 20 dias após o nascimento foi encontrado uma diminuição nos níveis de IL-6 no hipocampo (F = 8,330; p = 0,004, Figura 5A), e nenhuma alteração foi encontrada no CF (F = 26,619; p = 0,051; Fig. 5A) e soro (F = 1,564; p = 0,225, Fig. 6A). Nos animais privados com 30 dias após o nascimento, os níveis de IL-6 no CF não se alteraram (F = 2,800; p = 0,063, Fig. 5B), porém no hipocampo, os níveis de IL-6 aumentaram (F = 3,673; p = 0,023, Figura 5B) e diminuíram no soro (F = 14,605; p = 0,002, Figura 6B) em comparação com os ratos não-privados. Os níveis de IL-6 foram elevados nos animais privados com 40 dias após o nascimento no CF (F = 0,626; p = 0,001, Fig. 5C), no hipocampo (F = 0,25; p = 0,002, Fig. 5C) e no soro (F= 0,738; p <0,001, Fig. 5C) em comparação com os animais não-privados. Já nos animais com 60 dias após o nascimento os níveis de IL-6 não foram alterados no soro (F = 0,230; p = 0,208, Fig. 5D), mas foram aumentados no CF (F = 10,862; p = 0,030, Fig. 5D) e no hipocampo (F = 24,483; p = 0,006, Fig. 5D) em comparção com os animais não privados. 58 Figura 5A: Efeitos da privação materna nos níveis da interleucina 6 (IL-6) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 20 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. Figura 5B: Efeitos da privação materna nos níveis da interleucina 6 (IL-6) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 30 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. 59 Figura 5C: Efeitos da privação materna nos níveis da interleucina 6 (IL-6) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 40 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. Figura 5D: Efeitos da privação materna nos níveis da interleucina 6 (IL-6) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 60 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. Os níveis de IL-10 foram diminuídos nos animais privados com 20 dias após o nascimento no CF (F = 5,997; p = 0,001, Figura 6A), no hipocampo (F = 8,728; p = 0,001, Figura 6A) e no soro (F = 0,617; p = 0,001, Fig. 6A) em comparação com os ratos não-privados. Nos ratos com 30 dias após o nascimento, os níveis de IL-10 também foram diminuídos no CF (F = 187.745; p = 0.050, Fig. 6B), no hipocampo (F = 60 1.947; p = 0.025, Fig. 6B) e no soro (F = 30.175; p <0,001, Fig. 6B). Nos animais com 40 e 60 dias após o nascimento, os níveis de IL-10 não se alteram no CF (F = 3.269; p = 0.407, Fig. 6C e F = 2.983; p = 0.778, Fig. 6D, respectivamente). Contudo, no hipocampo foi observado uma diminuição para os níveis de IL-10 para os animais privados com 40 dias (F = 17,539; p = 0,001, Figura 6C) e 60 dias após o nascimento (F = 1,601; p = 0,034, Figura 7D), assim como no soro para os animais com 40 (F = 0,000; p = 0,001, Figura 6C) e 60 dias após o nascimento (F = 16,007; p = 0,010, Fig. 6D) em comparação com os animais nãoprivados. Figura 6A: Efeitos da privação materna nos níveis da interleucina 10 (IL-10) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 20 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. 61 Figura 6B: Efeitos da privação materna nos níveis da interleucina 10 (IL-10) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 30 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. Figura 6C: Efeitos da privação materna nos níveis da interleucina 10 (IL-10) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 40 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. 62 Figura 6D: Efeitos da privação materna nos níveis da interleucina 10 (IL-10) no córtex frontal (CF), hipocampo e soro nos animais com 60 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. 4.3 EFEITOS DA PRIVAÇÃO MATERNA SOBRE PARÂMETROS DE ESTRESSE OXIDATIVO NO CF E HIPOCAMPO EM DIFERENTES FASES DE DESENVOLVIMENTO Os níveis de MDA, que é um marcador para o dano lipídico, não foram alterados para os animais privados com 20 dias após o nascimento no CF (F = 1,890; p = 0,408, Fig. 7A) e hipocampo (F = 0,179; p = 0,843, Figura 7A), para os animais com 30 dias após o nascimento no CF (F = 0,001; p = 0,601, Figura 7B) e hipocampo (F = 0,27; p = 0,295, Figura 7B), e também para os animais com 40 dias após o nascimento no CF (F = 0,546; p = 0,205 Figura 7C) e hipocampo (F = 0,949; p = 0,067, Figura 7C) e por fim nos animais com 60 dias após o nascimento no CF (F = 1,745; p = 0,140, Figura 7D) e hipocampo (F = 1,831; p = 0,889, Fig. 7D). 63 Figura 7A: Efeitos da privação materna nos níveis de malondealdeído (MDA) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 20 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. Figura 7B: Efeitos da privação materna nos níveis de malondealdeído (MDA) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 30 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. 64 Figura 7C: Efeitos da privação materna nos níveis de malondealdeído (MDA) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 40 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. Figura 7D: Efeitos da privação materna nos níveis de malondealdeído (MDA) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 60 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. A Figura 8 demonstra os resultados relacionados a carbolinação de proteínas no CF e no hipocampo. Nos animais com 20 dias após o nascimento, os níveis da carbonilação de proteínas não foram alterados 65 no CF (F = 0,428; p = 0,254, Fig. 8A) e no hipocampo (F = 4,601; p = 0,905, Fig. 8A). Por outro lado, nos animais privados com 30 dias após o nascimento, houve um aumento na carbonilação de proteínas no CF (F = 6,133; p = 0,008, Figura 8B) e no hipocampo (F = 2,007; p = 0,008, Fig. 8B) em comparação com os animais não-privados. Nos animais privados com 40 dias após o nascimento, houve um aumento na carbonilação de proteínas no hipocampo (F = 36.193; p = 0.021, Fig. 9C) em comparação com os ratos não-privados, e se manteve inalterada no CF (F = 8.404; p = 0.673, Fig. 8C). Já nos animais privados com 60 dias após o nascimento, os níveis da carbonilção de proteínas foram aumentados tanto no CF (F = 9,231; p = 0,003, Fig. 8D) quanto no hipocampo (F = 7,397; p <0,001, Fig. 8D) em comparação com os ratos não-privados. Figura 8A: Efeitos da privação materna nos níveis da carbonilação de proteínas no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 20 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. 66 Figura 8B: Efeitos da privação materna nos níveis da carbonilação de proteínas no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 30 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de nãoprivado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. Figura 8C: Efeitos da privação materna nos níveis da carbonilação de proteínas no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 40 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de nãoprivado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. 67 Figura 8D: Efeitos da privação materna nos níveis da carbonilação de proteínas no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 60 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. A atividade de SOD foi diminuída em todas as fases do desenvolvimento de ratos privados dos cuidados maternos. A privação materna levou a uma diminuição da atividade da enzima SOD nos animais privados com 20 dias após o nascimento no CF (F = 0,34; p <0,001, Fig. 9A) e no hipocampo (F = 8,180; p <0,001, Fig. 9A); nos animais com 30 dias após o nascimento no CF (F = 2,393; p = 0,015, Fig. 9B) e no hipocampo (F = 7,076; p <0,001, Fig. 9B); nos animais com 40 dias após o nascimento no CF (F = 0,074; p <0,001 Fig. 9C) e no hipocampo (F = 3,678; p <0,001, Fig. 9C), e por fim, nos animais com 60 dias após o nascimento no CF (F = 0,819; p <0,001, Fig. 9D) e no hipocampo (F = 3,241; p <0,001, Fig. 9D) em comparação com os animais não-privados. 68 Figura 9A: Efeitos da privação materna sobre a atividade da superóxido dismutase (SOD) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 20 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. Figura 9B: Efeitos da privação materna sobre a atividade da superóxido dismutase (SOD) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 30 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. 69 Figura 9C: Efeitos da privação materna sobre a atividade da superóxido dismutase (SOD) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 40 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. Figura 9D: Efeitos da privação materna sobre a atividade da superóxido dismutase (SOD) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 60 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de não-privado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. A privação materna induziu a uma diminuição da atividade da CAT nos animais privados com 20 dias após o nascimento no CF (F = 21,157; p = 0,087, Fig. 10A) e no hipocampo (F = 11,746; p = 0,001, Fig. 10A) em comparação com os animais não-privados. Nos animais com 30 dias após o nascimento a atividade da CAT foi diminuída no CF 70 (F = 21,959; p = 0,065, Figura 10B) em comparação com os ratos nãoprivados, e se manteve inalterada no hipocampo (F = 5,728; p = 0,692, Fig. 10B). Nos animais com 40 dias após o nascimento, a atividade da CAT foi diminuída no CF (F = 4,911; p = 0,001, Fig. 10C) e aumentada no hipocampo (F = 2,137; p = 0,006, 10C) em comparação com os animais não-privados. Já nos animais privados com 60 dias após o nasciment oa atividade da CAT foi diminuída no CF (F = 10.457; p = 0.006, Fig. 10D) em comparação com os animais não-privados, porém no hipocampo a atividade da CAT se manteve inalterada (F = 0,785; p = 0,666, Fig. 10D). Figura 10A: Efeitos da privação materna sobre a atividade da catalase (CAT) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 20 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de nãoprivado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. 71 Figura 10B: Efeitos da privação materna sobre a atividade da catalase (CAT) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 30 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de nãoprivado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. Figura 10C: Efeitos da privação materna sobre a atividade da catalase (CAT) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 40 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de nãoprivado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. 72 Figura 10D: Efeitos da privação materna sobre a atividade da catalase (CAT) no córtex frontal (CF) e hipocampo nos animais com 60 dias após o nascimento. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (N = 5). Diferente de nãoprivado; * p <0,05, de acordo com o teste t de Student. 73 5 DISCUSSÃO O estresse pré-natal, como a privação materna, principalmente durante períodos sensíveis no início da vida, pode levar à alterações no desenvolvimento cerebral e contribuir para o desenvolvimento de transtornos psiquiátricos, incluindo a ansiedade e o TDM. Evidências mostram que as alterações imunes podem afetar o cérebro e levar a alterações comportamentais associadas com a vulnerabilidade ou a resiliência ao estresse (Ménard et al., 2016). O presente estudo mostrou que ratos submetidos à privação dos cuidados maternos não apresentaram alterações comportamentais aos 30 e 40 dias após o nascimento. Aos 20 dias após o nascimento (fase da infância) foi demonstrado uma diminuição no tempo de natação no teste do nado forçado nos animais privados. Aos 30 dias após o nascimento (período da adolescência) foi observado um aumento no número de rearings, mostrando uma alteração na atividade locomotora espontânea. Aos 60 dias após o nascimento (idade adulta), os ratos privados maternalmente apresentaram um comportamento depressivo no teste do nado forçado, evidenciado por um aumento no tempo de imobilidade e uma diminuição no tempo de escalada. Estes resultados sugerem que os eventos adversos ocorridos durante o período pós-natal podem alterar o curso normal do desenvolvimento, resultando em alterações nos animais adultos. Estudos anteriores também mostraram que a privação materna induziu a um aumento no tempo de imobilidade, uma diminuição no tempo de escalada e nenhuma alteração no tempo de natação nos animais com 60 dias após o nascimento (Réus et al., 2011). Em concordância, outros estudos também associaram a privação materna ao comportamento depressivo na idade adulta (Réus et al., 2013a, b) e a déficits cognitivos (Valvassori et al., 2014). Embora as alterações comportamentais induzidas pela privação materna, tenham ocorrido somente na idade adulta, o presente estudo mostrou um estado inflamatório e oxidativo em diferentes fases do desenvolvimento. De fato, um aumento nas citocinas pró-inflamatórias e uma diminuição nas citocinas anti-inflamatórias foram encontrados tanto na periferia como no cérebro dos animais com 20, 30, 40 e 60 dias após o nascimento. Além disso, foi observado um aumento de dano em proteínas e uma diminuição na atividade das enzimas antioxidantes durante o desenvolvimento. Sabe-se que a neuroinflamação, em nível normal, é uma resposta do sistema imune inato do sistema nervoso central contra danos e patógenos (Song et al., 2017). Por outro lado, a neuroinflamação não controlada, pode levar a um comprometimento 74 importante das células residentes no cérebro (Choi et al., 2009; Abo-Ouf et al., 2013). Com isso, em resposta a inflamação, o organismo libera citocinas (Allan e Rothwell, 2001). As citocinas, no SNC, também são recrutadas sob condições fisiológicas, desempenhando um papel importante na neurogênese, plasticidade sináptica, memória e aprendizagem (Levin e Godukhin, 2017). Alguns estudos tem descrito o TDM como uma doença inflamatória. Em modelo animal, foi relatado que a IL-1 induziu “comportamento de doença”, com sintomas semelhantes à depressão acompanhados de uma resposta infecciosa (Kent et al., 1992). Por outro lado, a administração de um antagonista do receptor de IL-1 foi capaz de reverter o “comportamento de doença” (Kent et al., 1992). A resposta inflamatória aguda é iniciada pelas citocinas pró-inflamatórias, tais como a IL-1β, TNF-α e IL-6. Em pacientes com TDM, baixos níveis da citocina anti-inflamatória IL-10 foram encontrados (Dhabhar et al., 2009). Além disso, níveis elevados das citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-1β, TNF-α e IL-6, foram associados com humor deprimido (Reichenberg et al., 2001, Wright et al., 2004). Um metanálise, Müller (2014) confirmou que os níveis de IL-6 estão elevados em pacientes com TDM. No presente estudo demonstrou-se que o estresse precoce induziu um aumento nos níveis de TNF-α, IL-1β e IL-6 e uma diminuição nos níveis de IL-10 tanto no soro quanto no cérebro nas fases da infância, adolescência e idade adulta. É difícil concluir se o estresse na vida precoce induzido pela privação materna no presente estudo induziu um estado inflamatório em primeiro lugar na periferia ou no cérebro. O aumento dos níveis de mediadores inflamatórios na periferia pode aumentar a inflamação noSNC. As respostas imunes periféricas comunicam-se ao cérebro através de nervos vagais, atravessando a barreira hemato-encefálica (BHE) ligada a macrófagos e associada a receptores de IL-1 localizados em macrófagos perivasculares, e células endoteliais de vênulas cerebrais (Dantzer et al. 2008). Além disso, células da microglia ativadas em uma resposta inflamatória podem liberar o ligante de quimiocina 2 (CCL2) no sangue, que por sua vez pode se ligar ao seu receptor CCR2 nos monócitos, e atravessar a BHE e penetrar nas áreas do cérebro envolvidas com o estresse e com o TDM, aumentando os níveis das citocinas, tais como IL-1β (Brevet et al., 2010; Ménard et al., 2016). Assim, tanto a periferia como a inflamação cerebral podem contribuir para uma exacerbada inflamação. Estudos prévios também já demonstraram níveis elevados de TNF- e IL-1 no soro e líquido cefalorraquidiano e uma diminuição dos níveis de IL-10 75 no soro de ratos privados 60 dias após o nascimento (Réus et al., 2013, 2015c). Além disso, o tratamento com antidepressivo imipramina (Réus et al., 2013) e com cetamina, um antagonista do receptor N-metil-Dasparto (NMDA) (Réus et al., 2015c) reverteu as alterações nas citocinas periféricas induzidas pela privação materna. Avalio e colaboradores (2016) mostraram um aumento nos níveis de IL-1β e NF-kB no hipocampo, amígdala e CF de hamsters submetidos ao estresse crônico Os níveis de IL-10 também foram aumentados nas mesmas áreas do cérebro, mas os níveis elevados de IL-10 foram associados à resiliência (Avalio et al., 2016). Uma superprodução de IL-1β no PFC, hipocampo, amígdala e núcleo accumbens de ratos foi associada com comprometimento da memória e comportamento depressivo em um modelo animal de dor neuropática (Gui et al., 2016). O presente estudo também mostrou que os níveis de IL-1β foram reduzidos no CF de ratos com 20 dias após o nascimento e no hipocampo de ratos com 60 dias após o nascimento, e os níveis de IL-6 diminuíram no soro de ratos com 30 dias após o nascimento, porém normalmente foi encontrado altos níveis de citocinas pró-inflamatórias e redu;cão de citocinas antiinflamatórias. No cérebro, tanto a micróglia quanto os astrócitos, influenciados por estímulos estressantes, podem produzir altos níveis de citocinas pró-inflamatórias e reduzir as citocinas anti-inflamatórias, essas deficiências no equilíbrio normal de citocinas podem afetar a neuroplasticidade em todo o cérebro (Levin e Godukhin, 2017). Sob condições crônicas, as células da microglia podem ser ativadas e elevar mediadores inflamatórios. Níveis reduzidos de IL-10 contribuíram para aumentar a expressão de IL-6 no cérebro de ratos idosos (Ye e Johnson, 2001). Em um estudo em humanos, demonstrou-se que o estresse materno pré-natal esteve associado a uma redução das proporções de linfócitos CD4 + e níveis mais elevados de TNF-α, IL-1β e IL-6 no sangue de adolescentes, indicando que o estresse materno pré-natal é um fator de programação que leva a consequências duradouras sobre a imunidade (Veru et al., 2015). Em crianças, a metilação do DNA das citocinas Th1 também foi associada ao estresse materno pré-natal (CaoLei et al., 2016). Assim, sugere-se que estressores ambientais, como a privação materna, independente do gene, podem levar a respostas inflamatórias ao longo do desenvolvimento e culminar em um fenótipo depressivo na vida adulta. De fato, um ambiente neuroinflamatório pode levar a uma interrupção nas células cerebrais e alterar a trajetória do desenvolvimento cerebral (Jones e Friedman, 1982). Além disso, níveis aumentados de citocinas pró-inflamatórias podem resultar na diminuição 76 da função do receptor de NMDA e na produção elevada das ERO, podendo levar a morte de células neurais (Koriauli et al., 2015). As células cerebrais são particularmente mais vulneráveis aos efeitos das ERO, uma vez que 20% do consumo total de oxigênio são usados para a atividade cerebral (Gandhi e Abramov, 2012). As ERO, no cérebro também podem ser produzidas pela atividade de monoamina oxidase que é requerida pela inativação das momoaminas, tais como a serotonina, a noradrenalina e a dopamina (Gandhi e Abramov, 2012), que estão envolvidos na fisiopatologia do TDM. O estresse oxidativo pode resultar em uma disfunção mitocondrial (Gandhi e Abramov, 2012) e levar a neuroinflamação (Bakunina et al., 2015). Após o estresse oxidativo, as proteínas podem ser danificadas e suas estruturas podem sofrer fragmentação e degradação. Assim, as alterações nas proteínas podem levar à atividade enzimática, e consequentemente, perder e/ou alterar funções fisiológicas (Kohen e Nyska, 2002). O presente estudo demonstrou um aumento nos níveis de carbonilação de proteínas nos animais com 30, 40 e 60 após o nascimento, sugerindo que danos protéicos no cérebro ocorreram na adolescência e na fase adulta decorrentes da privação materna. Níveis elevados de carbonilaçao de proteínas também foram demonstrados no CF, hipocampo, estriado e córtex de ratos submetidos ao estresse crônico moderado (Lucca et al., 2009b). Após a privação materna, em ratos adultos com 60 dias após o nascimento, foi demonstrado um aumento nos níveis da carbonilação de proteínas no hipocampo, amígdala e núcleo accumbens (Réus et al., 2015b). De forma interessante, uma única injeção de cetamina reduziu os níveis da carbonilação de proteínas em ratos privados 14 dias após a administração (Réus et al., 2015b). Embora muitos estudos tenham demonstrado um aumento nos níveis de MDA (um dos produtos de peroxidação lipídica) associados à depressão (Lopresti et al., 2014; Camkurt et al., 2016) no presente estudo, não foi encontrado alterações nos níveis de MDA nos diferentes estágios de desenvolvimento. Camkurt e colaboradoress (2017) não revelaram diferenças nos níveis de MDA em sangue do cordão umbilical de mães deprimidas. Ratos adultos submetidos a estresse crônico moderado apresentaram níveis elevados de MDA no cerebelo e estriado, mas não no CF e no hipocampo (Lucca et al., 2009b). Ao contrário, ratos privados maternalmente com 60 dias após o nascimento tiveram um aumento nos níveis de MDA no CF, amígdala, hipocampo e núcleo accumbens (Réus et al., 2015b). As ERO são neutralizados por enzimas antioxidantes, tais como SOD e CAT. No presente estudo foi demonstrado que a atividade da SOD foi diminuída em todos os estágios de desenvolvimento no CF e 77 no hipocampo. A atividade da CAT foi reduzida no hipocampo dos animais com 20 dias após o nascimento, e no CF dos animais com 40 e 60 após o nascimento. No entanto, com 40 dias após o nascimento a atividade da CAT foi aumentada no hipocampo. O desequilíbrio da razão SOD/CAT pode ser um indicador de aumento de ERO (Michel et al., 2004). Um aumento na atividade da CAT no hipocampo foi também relatado em ratos submetidos ao estresse crônico e diabéticos (Lucca et al., 2009b, Ceretta et al., 2012; Réus et al., 2016). Outros fatores estressores também podem levar a alterações antioxidantes durante o desenvolvimento, por exemplo, um desequilíbrio nos micronutrientes maternos também foi associado a uma redução nas enzimas antioxidantes, SOD e glutationa peroxidase (GPx) no cérebro de filhotes (Roy et al. 2014). Além disso, Tsai e Huang (2016) demonstraram que pacientes com TDM em fase aguda apresentavam os níveis de SOD e CAT elevados no soro. Assim, o estresse oxidativo pode ser mediado de maneira diferente, dependendo da área cerebral, estressor e estágio de desenvolvimento. 78 6 CONSIDERAÇÕES FINAIS As evidências deste estudo sugerem que o estresse precoce na vida induzido pela privação dos cuidados maternos tem efeitos negativos na programação do desenvolvimento da prole. Embora as alterações comportamentais tenham sido mais evidentes na vida adulta, a neuroinflamação e o estresse oxidativo começaram no início da adolescência. Outros estudos são necessários para elucidar o mecanismo pelo qual essas alterações ocorrem. Além disso, o uso de potenciais intervenções antidepressivas para mudar a abordagem terapêutica da idade adulta para o início da vida, antes de sintomas depressivos aparecem, poderiam ser estratégias importantes. 79 REFERÊNCIAS Abo-Ouf H, Hooper AW, White EJ, van Rensburg HJ, Trigatti BL, Igdoura SA. Deletion of tumor necrosis factor-α ameliorates neurodegeneration in Sandhoff disease mice. 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