Synergistic effect of hexane extract of Kaempferia parviflora on antibiotics against methicillin-resistant Staphylococcus aureus IJPS Suphim B. et al. Vol. 12 No. 2 April – June 2016 _______________________________________________________________________________________________ Original Article สารสกัดเฮกเซนของกระชายดําเสริมฤทธิ์ของยาปฏิชวี นะตอการยับยั้ง เชื้อ Staphylococcus aureus สายพันธุดอื้ ยาเมธิซิลลิน บุญเลี้ยง สุพมิ พ1*, ปยะพงษ ชุมศรี1, อรทัย ปานเพชร1 1  สาขาวิชาสาธารณสุขศาสตร ภาควิชาวิทยาศาสตรประยุกต คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยราชภัฏเลย ติดตอผูนิพนธ : สาขาวิชาสาธารณสุขศาสตร ภาควิชาวิทยาศาสตรประยุกต คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยราชภัฏเลย อําเภอเมือง จังหวัดเลย 42000 โทร 086-8657541 โทรสาร 042-835238 e-mail: bunliang_sp@yahoo.com บทคัดยอ สารสกัดเฮกเซนของกระชายดําเสริมฤทธิ์ของยาปฏิชีวนะตอการยับยั้งเชื้อ Staphylococcus aureus สายพันธุดื้อยาเมธิซลิ ลิน บุญเลี้ยง สุพมิ พ1*, ปยะพงษ ชุมศรี1, อรทัย ปานเพชร1 ว. เภสัชศาสตรอสี าน 2559; 12(2) : 57-67 รับบทความ : 13 ตุลาคม 2558 ตอบรับ : 8 สิงหาคม 2559 สารสกัดจากเหงากระชายดํามีฤทธิ์ในการยับยั้งจุลินทรียไดหลายชนิด เชน เชื้อรา เชื้อยีสต และเชื้อแบคทีเรีย การศึกษานี้มี วัตถุ ป ระสงค เพื่ อ ศึ ก ษาผลของสารสกั ด เฮกเซนของกระชายดํ า และยาปฏิชี ว นะในการยั บยั้ งการเจริ ญ ของเชื้ อ methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) วัสดุและวิธีการทดลอง: ศึกษาฤทธิ์ยับยั้งเชื้อ MRSA ของสารสกัดเฮกเซนและยาปฏิชีวนะดวยวิธี agar dilution และ ศึกษาฤทธิ์ยับยั้งเชื้อ MRSA เมื่อใชสารสกัดเฮกเซนรวมกับยาปฎิชีวนะดวยวิธี checkerboard dilution โดยทําการ ทดลองในเชื้อ MRSA จํานวน 20 ไอโซเลท และวิเคราะหขอมูลโดยวิธีหาความถี่ และคํานวณคา minimum inhibitory concentration (MIC) และ คา Fractional inhibitory concentration index (FICI) ผลการศึกษาวิจัย: สารสกัดเฮกเซนสามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อ MRSA 10 ไอโซเลท ซึ่งมีคา MIC อยูระหวาง 1000 – 2000 μg/ml ในขณะที่ยาเพนิซิลลินมีคา MIC อยูระหวาง 0.125 – >256 μg/ml การศึกษาสรุปไดวาเชื้อทุกไอโซเลทดื้อตอยาเพนิซิลลิน สวนยาแวนโคมัยซิน มีคา MIC อยูระหวาง 0.25 – 2 μg/ml สรุปไดวาเชื้อสวน ใหญไวตอยาแวนโคมัยซิน ยกเวนเพียง 1 ไอโซเลท (MRSA 5 - 333) ที่ดื้อมีคา MIC เทากับ 4 μg/ml การศึกษาฤทธิ์รวมกันของสารสกัด เฮกเซนกับยาแวนโคมัยซินตอการยับยั้งการเจริญของเชื้อ MRSA พบวา ใหผลยับยั้ง MRSA แบบเสริมฤทธิ์กัน จํานวน 4 ไอโซเลท (คา FICI = 0.5) และไมมผี ลตอฤทธิ์ของยาแวนโคมัยซิน ในเชื้อ 6 ไอโซเลท (คา FICI = 1) สวนการศึกษาฤทธิ์รวมกันของสารสกัดเฮกเซน กับยาเพนิซิลลิน พบวา ใหผลยับยั้ง MRSA แบบเสริมฤทธิ์กันทุกไอโซเลท (คา FICI ≤ 0.5) สรุปผลการวิจัย: สารสกัดเฮกเซนของ กระชายดําสามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อ MRSA และเสริมฤทธิ์ของยาปฏิชีวนะในการยับยั้งเชื้อ MRSA ได ดังนั้นผลการศึกษานี้ สามารถนําไปสูการพัฒนากลยุทธในการนําสารจากธรรมชาติมาใชรวมกันกับยาปฏิชีวนะสมัยใหมเพื่อเพิ่มฤทธิ์ในการรักษาโรคติดเชื้อ MRSA ตอไป คําสําคัญ: สารสกัดเฮกเซน, กระชายดํา, Staphylococcus aureus สายพันธุดื้อตอยาเมธิซิลลิน, ยาปฏิชีวนะ 57 สารสกัดเฮกเซนของกระชายดําเสริมฤทธิ์ของยาปฏิชวี นะตอการยับยั้งเชื้อ Staphylococcus aureus สายพันธุดอื้ ยาเมธิซลิ ลิน ว. เภสัชศาสตรอสี าน ปที่ 12 ฉบับที่ 2 เม.ย. – มิ.ย. 2559 บุญเลี้ยง สุพิมพ และคณะ _______________________________________________________________________________________________ Synergistic effect of hexane extract of Kaempferia parviflora on antibiotics against methicillin-resistant Staphylococcus aureus Bunliang Suphim1*, Piyapong Choomseer1, Orathai Panpetch1 1 Lecturer, Department of Public Health, Loei Rajabhat University, Muang District, Loei, 42000 Thailand * Corresponding author: Tel: 086-8657541 Fax: 042-835238 e-mail: bunliang_sp@yahoo.com Abstract Synergistic effect of hexane extract of Kaempferia parviflora on antibiotics against methicillin-resistant Staphylococcus aureus Bunliang Suphim1*, Piyapong Choomseer1, Orathai Panpetch1 IJPS, 2016; 12(2) : 57-67 Received : 13 October 2015 Accepted : 8 August 2016 The extracts from rhizome of Kaempferia parviflora have been found to possess antimicrobial activities such as antifungal and antibacterial activities. The study was aimed to investigate the antibacterial activity of the hexane extract and antibiotics against various methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) strains. Materials and Methods: The antibacterial activity of hexane extract and antibiotics were assessed by agar dilution method. The combinations of hexane extract with antibiotics (penicillin and vancomycin) were assessed for antibacterial effect by checkerboard dilution method in 20 isolates of MRSA. The data were analyzed for minimum inhibitory concentration (MIC) and fractional inhibitory concentration index (FICI). Results: Our results showed that hexane extract inhibited 10 isolates of MRSA with MICs of 1,000 – 2,000 μg/ml. The MICs of penicillin against 20 isolates of MRSA ranged from 0.125 – >256 μg/ml, suggesting that all of isolates are resistant to penicillin. The MICs of vancomycin against 19 isolates of MRSA ranged from 0.25 – 2 μg/ml, indicating that most of the isolates are sensitive to vancomycin, except one isolate showing resistance to vancomycin (MRSA 5-333) with MIC of 4 μg/ml. The combinations of hexane extract with vancomycin showed synergistic effect against MRSA 4 isolates (FICI = 0.5) and no effect on 6 isolates of (FICI = 1). The combinations of hexane extract with penicillin showed synergistic effect to all MRSA isolates (FICI ≤ 0.5). Conclusion: Hexane extract of K. parviflora enhanced the activity of antibiotics against MRSA. The study provides a strategy in utilizing compounds from natural source in combination with modern antibiotic agents to enhance antibacterial activity in the treatment of MRSA infection. Keywords: hexane extract, Kaempferia parviflora, methicillin-resistant S. aureus, antibiotic agents 58 Synergistic effect of hexane extract of Kaempferia parviflora on antibiotics against methicillin-resistant Staphylococcus aureus IJPS Suphim B. et al. Vol. 12 No. 2 April – June 2016 _______________________________________________________________________________________________ บทนํา กระชายดํา (Kaempferia parviflora) เปนพื ชวงศ Zingiberaceae ซึ่งเปนยาสมุนไพรในการรักษาอาการเจ็บปวย ตางๆ (Sawasdee et al., 2009) มีรายงานวาสารสกัดจาก กระชายดํามีฤทธิ์ตานการอักเสบ (Panthong et al., 1989; Saewong et al., 2009), ฤทธิ์ตานจุลชีพ (Kummee et al., 2008; Yenjai et al., 2004; Yenjai et al., 2007) รักษาแผลและยับยั้ง การหลั่งกรดในกระเพาะอาหาร (Rujjanawate et al., 2005), ฤทธิ์ตานการแพ (Tewtrakul and Subhadhirasakul, 2007; Tewtrakul et al., 2008), ฤทธิ์ตานอนุมูลอิสระ (Kusirisin et al., 2009) เปนตน ไดมีการศึกษาคุณสมบัติของสารสกัดกระชายดํา ในการยับยั้ งเชื้อจุลินทรี ย พบวาสารสกั ดกระชายดํ า สามารถ ยับยั้งการเจริญของเชื้อจุลินทรียไดหลายชนิด เชน สารสกัดเอ ทานอลของกระชายดํ า สามารถยั บ ยั้ ง การเจริ ญ ของเชื้ อ รา Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes and Microsporum gypseum โดยใหคา minimum inhibitory concentration (MIC) เทากับ 62.5, 125 and 250 mg/ml ตามลําดับ (Kummee et al., 2008) สารสําคัญที่พบในสารสกัด ด ว ยไดคลอโรมี เ ทนของกระชายดํ า ได แ ก สาร 5,7,4trimethoxyflavone และ 5,7,3,4-tetramethoxyflavone พบวา สามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อ Plasmodium falciparum ซึ่ง เปนสาเหตุของโรคมาลาเรีย โดยใหคา IC50 เทากับ 3.7 และ 4.1 μg/ml เมื่อเทียบกับยามาตรฐานคลอโรควิน สวนสาร 3,5,7,4tetramethoxyflavone และ 5,7,4-trimethoxyflavone สามารถ ยับยั้ง Candida albicans โดยใหคา IC50 เทากับ 39.71 และ 17.63 μg/mL เมื่อเทียบกับยามาตรฐาน แอมโฟเทอริซิน บี และ นอกจากนี้สารทั้งสองชนิดยังสามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อ Mycobacterium ซึ่งใหคา MIC เทากับ 200 และ 50 μg/mL ตามลําดับ (Yenjai, 2004; Yenjai, 2007) ดังนั้น ในการศึกษา ครั้งนี้ จึงเนนไปที่ผลของสารสกัดกระชายดําในการยับยั้งการ เจริญของเชื้อ S. aureus สายพันธุดื้อยาเมธิซิลลิน และฤทธิ์ รวมกันของสารสกัดกระชายดําและยาปฏิชีวนะในการยับยั้งการ เจริญของเชื้อ S. aureus สายพันธุดื้อยาเมธิซลิ ลิน Staphylococcus aureus เปนแบคทีเรียแกรมบวกที่ อยูใน family Micrococcaceae ซึ่งเปนเชื้อที่สามารถกอโรคได ทั้งในคนและสั ตว เชื้ อนี้ เปนสาเหตุ ของโรคติดเชื้อบนผิ วหนั ง กระดูก และกระแสเลือด ไดแก รูขุมขนอักเสบ ฝ หนอง การติด เชื้อหลังการผ าตั ด กลามเนื้อหัวใจอักเสบ สมองอักเสบ ปอด บวม (Schito, 2006) นอกจากนี้เชื้อยังสามารถสรางสารพิษ ที่ เปนสาเหตุทําใหเกิดโรคอาหารเปนพิษอยางเฉียบพลัน (Plata et al., 2009) โดยจะตรวจพบ S. aureus ไดจากการติดเชื้อใน โรงพยาบาล (nosocomial infections) และในชุมชนทั่วไป ปจจุบันเชื้อ S. aureus มีอุบัติการณการดื้อยาเพิ่มมากขึ้น โดย ตรวจพบ S. aureus สายพันธุที่มีการดื้อยาครั้งแรกเมื่อป พ.ศ. 2548 จากการตรวจแผล ติดเชื้อไฟไหมจากผูปวยในประเทศ อังกฤษโดยพบวาเชื้อดื้อยาซัลโฟนาไมด (sulphonamide) ได และเมื่อเปลี่ยนไปใชยาในกลุม beta-lactam ไดแก เพนนิซิลลิน ต อ มาใน ป พ.ศ. 2489 ได ต รวจพบว า เชื้ อ สามารถดื้ อ ยา เพนนิซิลลินไดรอยละ 6 จากในโรงพยาบาลของประเทศอังกฤษ และเพิ่มขึ้นเปนรอยละ 50 ในป พ.ศ. 2491 (Barber and Rozwadowska-Dowzenko, 1948) กรมวิทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสุข ประเทศไทย ไดรวบรวมเชื้อตามแบบแผน ความไวของเชื้อแบคทีเรียจากโรงพยาบาลศูนยและโรงพยาบาล ทั่วไป จํานวนมากกวา 30 แหง ตั้งแตป พ.ศ. 2543 – 2548 ได พบเชื้อ methicillin-resistant S. aureus (MRSA) มีความชุก รอยละ 35 ในป พ.ศ. 2543 และความชุกคอนขางคงที่ในระหวาง รอยละ 30 – 35 ในชวง 5 ป (Aswapokee, 2008; Ziglam and Nathwani, 2003) จากปญหาการดื้อยาเพนนิซิลลินที่เพิ่มขึ้น อย างตอเนื่ อ งได พัฒ นายาปฏิ ชีว นะใหม ห ลายชนิดคือ เตตรา ซั ย คลิ น (tetracycline) อิ ริ โ ทรมั ย ซิ น (erythromycin) คลอ แ ร ม เ ฟ นิ ค อ ล ( chloramphenicol) แ ล ะ ส เ ต ร ป โ ต มั ย ซิ น (streptomycin) โดยในระยะแรกยาใหมเหลานี้สามารถใชรักษา อาการติดเชื้ออยางไดผล แตตอมาพบวาเชื้อเกิดการดื้อยาอยาง รวดเร็ว นอกจากนี้ไดมีรายงานการกลายพันธุจาก MRSA เปน สายพันธุใหม คือ vancomycin intermediate S. aureus (VISA) และ vancomycin resistant S. aureus (VRSA) เปนสายพันธุที่ ดื้อยาแวนโคมัยซิน ซึ่งแวนโคมัยซินเปน ยาปฏิชีวนะที่ใชในการ รักษาการติดเชื้อ MRSA ที่มีความรุนแรงและยาปฏิชีวนะอื่นๆ ใชรักษาไมไดผล ดังนั้น MRSA, VISA และ VRSA จึงเปน ปญหาโรคติดเชื้อในโรงพยาบาลที่มีความสําคัญ (Siriwong and Chukeatirote, 2009) 59 สารสกัดเฮกเซนของกระชายดําเสริมฤทธิ์ของยาปฏิชวี นะตอการยับยั้งเชื้อ Staphylococcus aureus สายพันธุดอื้ ยาเมธิซลิ ลิน ว. เภสัชศาสตรอสี าน ปที่ 12 ฉบับที่ 2 เม.ย. – มิ.ย. 2559 บุญเลี้ยง สุพิมพ และคณะ _______________________________________________________________________________________________ วิธีดาํ เนินการวิจัย เดิมเสมอ ผูวิจัย จึงใชวิธีการนี้ในการควบคุมการสกัดสารสกัด กระชายดําดวยเฮกเซน สารเคมี Nutrient agar (NM018, India) Mueller Hinton broth และ Mueller Hinton agar (Himedia, India) ยาปฏิชีวนะ ทั้ ง หมดได จ าก ภาควิ ช าเภสั ช วิ ท ยา คณะแพทยศาสตร โรงพยาบาลศรีนครินทร มหาวิทยาลัยขอนแกน เชื้อที่ใชทดสอบ เ ชื้ อ ที่ ใ ช ใ น ก า ร วิ จั ย คื อ methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) จํานวน 20 ไอโซเลท โดย ได รั บ ความอนุ เ คราะห เ ชื้ อ จาก หน ว ยจุ ล ชี ว วิ ท ยาคลิ นิ ก โ ร ง พ ย า บ า ล ศ รี น ค ริ น ท ร ค ณ ะ แ พ ท ย ศ า ส ต ร มหาวิทยาลัยขอนแกน สมุนไพร ใช เ หง า กระชายดํ า ที่ มี สี ม ว งเข ม อายุ 8 – 9 เดื อ น เ ก็ บ เ กี่ ย ว ใ น ช ว ง เ ดื อ น ธั น ว า ค ม ถึ ง ม ก ร า ค ม จ า ก อําเภอดานซาย จังหวัดเลย วิธีเตรียมเชื้อสําหรับการทดลอง ในการทดลองใชเชื้อประมาณ 1x108 CFU/ml (0.5 McFarland) โดยเตรียมเชื้อตามวิธี direct colony suspension (Medical Technology Laboratory, 2008) มีวิธีการดังนี้ เพาะ เชื้อ MRSA บนอาหารเลี้ยงเชื้อ Nutrient agar นําไปบมที่ อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 18 – 24 ชั่วโมง เขี่ยเชื้อ MRSA 4 – 5 โคโลนี ลงใน sterile 0.85% normal saline เขยา ใ ห เ ชื้ อ ก ร ะ จ า ย ตั ว วั ด ค ว า ม ขุ น ข อ ง เ ชื้ อ ด ว ย เ ค รื่ อ ง spectrophotometer ที่ความยาวคลื่น 625 นาโนเมตร ใหมคี วาม ขุนเทากับ 0.5 McFarland standards (1x108 CFU/ml) ถา ความขุนของเชื้อไมเทากับ 0.5 McFarland standards ใหเจือ จางเชื้อโดยใช sterile 0.85% normal saline การเตรียมสารสกัดจากกระชายดํา นําเหงากระชายดําสด ลางใหสะอาด หั่นเปนแวน อบ ใหแหงที่อุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียส เปนเวลา 24 ชั่วโมง บดให ละเอียด จากนั้นชั่งกระชายดําแหงที่บดละเอียด 1.63 กิโลกรัม แชในเฮกเซน ปริมาตร 8 ลิตร ตั้งทิ้งไวที่อุณหภูมิหอง เปน ระยะเวลา 7 วัน แลวกรองเอากากออกดวยกระดาษกรอง นํา สวนใสเก็บไว สวนกากที่เหลือนําไปแชในเฮกเซน 8 ลิตรอีกเปน ระยะเวลา 7 วัน แลวกรองเอากากออกดวยกระดาษกรอง นํา สวนใสที่ไดครั้ง 2 รวมกับครั้งที่ 1 แลวนําไประเหยดวยเครื่อง กลั่นระเหยสารแบบหมุน (Rotary Evaporator (BUCHI Rotavapor R – 124)) ที่อุณหภูมิ 69 องศาเซลเซียส สําหรับ ระเหยตัวทําละลายเฮกเซนออกใหสารแหงเก็บสารใสขวด แกวสี ชาป ด สนิ ท ป ด ฉลากชื่ อ สมุ น ไพร วั น ที่ เ ตรี ย ม เก็ บ ในตู เ ย็ น อุณหภูมิไมตา่ํ กวา 4 องศาเซลเซียส วิธีการสกัดนี้ไดปรับปรุงมา จาก Dowrote (Dowrote, 2010) การทดสอบความไวของเชื้อตอยาปฏิชีวนะ ไดแก เพนิซิล ลิน และ แวนมัยซิน โดยวิธี agar dilution (Hausler et al., 1991) โดยการเตรียม Mueller-Hinton agar (MHA) ผสมยา ปฏิชีวนะเพนิซิลลิน หรือแวนโคมัยซิน โดยเจือจางใหไดความ เขมขนสุดทายของยา เพนิซิลลิน เทากับ 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, และ 0.125 μg/ml และ แวนโคมัยซิน เทากับ 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, และ 0.125 μg/ml ตามวิธีของ (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2009) และเตรียม Control plate ซึ่งไดแก MHA ที่ไม ผสมยาปฏิชีวนะ จากนั้นเพาะ เชื้อทดสอบแบบจุด (1x108 CFU/ml) ปริมาตร 10 μl (Thathaisong and Sangnual, 2011) จํานวน 5 จุดตอจานเพาะเชื้อ ลงบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่เตรียมไว นําจานอาหารทั้งหมดไปบมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปน เวลา 18 – 24 ชั่วโมง อานผลความเขมขนที่ต่ําที่สุด (MIC) ของ ยาที่สามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อได (ทําการทดสอบ 3 ซ้ํา) การควบคุมคุณภาพของสารสกัด เพื่อควบคุมคุณภาพของสารสกัดกระชายดําที่สกัดดวย ตัวทําละลายเฮกเซนวามีองคประกอบของสารออกฤทธิ์ในกลุม เดียวกันเสมอ จึงไดตรวจสอบคุณภาพของสารสกัดโดยชั่งสาร สกัดกระชายดําที่สกัดดวยเฮกเซน 0.2 กรัม ละลายดวยตัวทํา ละลายเฮกเซน 3 มิลลิลิตร คนสารละลายใหเขากันจนใสเปนเนื้อ เดี ย วกั น แล ว นํ า ไปเข า เครื่ อ ง UV-VIS Recording Spectrophotometer (SHIMADZU UV-1604) วัดคาการดูดกลืน แสงที่ชวงความยาวคลื่น 200 – 800 นาโนเมตร (Chattiranan et al., 2013; Indranupakorn, 2004) วิธีการนี้เปนการยืนยันวา ในการสกัดสารสกัดจากกระชายดําดวยเฮกเซน จะไดสารกลุม 60 Synergistic effect of hexane extract of Kaempferia parviflora on antibiotics against methicillin-resistant Staphylococcus aureus IJPS Suphim B. et al. Vol. 12 No. 2 April – June 2016 _______________________________________________________________________________________________ การทดสอบความไวของเชื้อตอสารสกัดกระชายดํา โดยวิธี agar dilution (Hausler et al., 1991) โดยการเตรียม MHA ที่ผสมสารสกัดกระชายดําที่สกัด ดวยเฮกเซน ความเขมขนสุดทายเทากับ 2,000, 1,000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, และ 15.62 μg/ml (Kummee, 2008) และเตรียม Control plate ซึ่งประกอบดวย Positive control plate (MHA ผสมเฮกเซน) และ Negative control plate (MHA ที่ไมผสมสารสกัดกระชายดํา) จากนั้นเพาะเชื้อทดสอบแบบจุด (1x108 CFU/ml) ปริมาตร 10 μl (Thathaisong and Sangnual, 2011) จํานวน 5 จุดตอจานเพาะเชื้อ ลงบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่ เตรี ย มไว นํ า จานอาหารทั้ ง หมดไปบ ม ที่ อุ ณ หภู มิ 37 องศา เซลเซียส เปนเวลา 18 – 24 ชั่วโมง อานผลความเขมขนที่ต่ํา ที่สุด (MIC) ของสารสกัดกระชายดํา ที่สามารถยับยั้งการเจริญ ของเชื้อได (ทําการทดสอบ 3 ซ้ํา) FICI A คือ คาดัชนีสดั สวนความเขมขนของ สาร A ในการยับยั้งเชื้อ FICI B คือ คาดัชนีสดั สวนความเขมขนของ สาร B ในการยับยั้งเชื้อ [A] คือ คา MIC ของสาร A ในสารผสม ระหวางสาร A และสาร B [B] คือ คา MIC ของสาร B ในสารผสม ระหวางสาร A และสาร B MIC (A) คือ คา MIC ของสาร A MIC (B) คือ คา MIC ของสาร B การแปลผล FICI ≤ 0.5 = เสริมฤทธิ์กัน (synergism), 0.5 < FICI ≤ 4.0 = ฤทธิ์ไมแตกตางจากการใชสารตัวเดียว (indifference), FICI > 4.0 = ฤทธิ์ตา นกัน (antagonism) (Lorian, 2005) การทดสอบประสิทธิภาพของสารสกัดกระชายดํารวมกับ ยาปฏิชีวนะโดยวิธี Checkerboard dilution (Climo et al., 1999; Spoorthi et al., 2011) เจือจางความเขมขนของยาปฏิชีวนะเพนิซิลลิน หรือ แวนโคมัยซิน ใหมีความเขมขนต่ํากวาคา MIC 8 เทา และ ป เปตยาปฏิชีวนะปริมาตร 100 μl ลงในหลอดทดลองที่มีอาหาร เลี้ยงเชื้อ MHB 1.7 มิลลิลิตร แลวเติมสารสกัดกระชายดําที่สกัด ดวยเฮกเซนที่มีความเขมขนต่ํากวาคา MIC 8 เทา ความเขมขน ละ 100 μl จากนั้นเติมเชื้อทดสอบ 100 μl ปริมาตรรวมทั้งหมด เทากับ 2 มิลลิลิตร นําไปบมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปน เวลา (1x108 CFU/ml) 18 – 24 ชั่วโมง อานผลความเขมขนที่ ต่าํ ที่สุด (MIC) ของยาและสารสกัดกระชายดําที่สกัดดวยเฮกเซน ที่สามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อ MRSA ได และประเมิน ประสิทธิภาพของสารสกัดในการเสริมฤทธิ์ของยาปฏิชีวนะ ดวย ดัชนีชี้วดั คือ fractional inhibitory concentration index (FICI) ผลการศึกษาวิจัย 1. คา MIC ของสารสกัดกระชายดําที่สกัดดวยเฮกเซนตอ การยับยั้งเชื้อ MRSA การศึก ษาฤทธิ์ ข องสารสกั ด หยาบกระชายดํ า ที่ ส กั ด ดวยตัวทําละลายเฮกเซน ในการยับยั้งการเจริญของเชื้อ MRSA จํานวน 20 ไอโซเลท โดยวิธี agar dilution ใชสารสกัดหยาบ กระชายดํา ที่มีความเขมขน ตั้งแต 15.62 – 2,000 μg/ml ผลการวิจัยพบวา สารสกัดหยาบกระชายดํา สามารถยับยั้งการ เจริญของเชื้อ MRSA ได 10 ไอโซเลท ไดแก ไอโซเลท 5-456, 5-183, 5-163, 5-184, 5-254, 5-30, 5-490, 5-85, 5-104 และ 5-272 โดยใหคา MIC ระหวาง 1,000 – 2,000 μg/ml (ตารางที่ 1) การวิเคราะหขอมูล วิเคราะหขอมูลโดยใชสถิติเชิงพรรณนา ไดแก จํานวน และนําคามาคํานวณหาคา MIC และประเมินประสิทธิภาพการ เสริมฤทธิ์ของสารสกัดกระชายดําดวยเฮกเซนและยาปฏิชีวนะ ดวยดัชนีชี้วัดที่เรียกวา fractional inhibitory concentration index (FICI) ดังสูตร FICI = FICI A + FICI B = [A]/MIC (A) + [B]/MIC (B) 61 สารสกัดเฮกเซนของกระชายดําเสริมฤทธิ์ของยาปฏิชวี นะตอการยับยั้งเชื้อ Staphylococcus aureus สายพันธุดอื้ ยาเมธิซลิ ลิน ว. เภสัชศาสตรอสี าน ปที่ 12 ฉบับที่ 2 เม.ย. – มิ.ย. 2559 บุญเลี้ยง สุพิมพ และคณะ _______________________________________________________________________________________________ ตารางที่ 1 คา MIC ของสารสกัดกระชายดําที่สกัดดวยเฮกเซนและยาปฏิชีวนะตอการยับยั้งการเจริญของเชื้อ MRSA MIC (g/ml) Penicillin* 0.25 16 16 0.25 0.25 0.25 >256 4 0.25 0.25 >256 0.25 0.25 >256 >256 0.5 0.5 4 128 >256 MRSA isolates 5-456 5-183 5-163 5-184 5-254 5-30 5-490 5-85 5-104 5-272 5-260 5-283 5-151 5-253 5-333 5-549 5-328 5-522 5-489 5-129 Hexane extract 1,000 1,000 1,000 2,000 2,000 2,000 2,000 2,000 2,000 2,000 >2,000 >2,000 >2,000 >2,000 >2,000 >2,000 >2,000 >2,000 >2,000 >2,000 Vancomycin** 0.25 1 0.25 0.5 0.25 0.5 0.5 0.5 0.25 0.5 0.25 0.25 0.25 0.5 4 0.5 0.5 2 2 1 * European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) define susceptibility as ≤ 0.12 g/ml (EUCAST, 2015) ** European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) define susceptibility as ≤ 2 μg/ml (EUCAST, 2015) โคมัยซิน คือ MRSA 5-333 ใหคา MIC เทากับ 4 μg/ml (ตาราง ที่ 1) การศึกษาฤทธิ์ของยาเพนิซิลลิน ตอการยับยั้งการ เจริญของเชื้อ MRSA จํานวน 20 ไอโซเลท โดยใชวิธี agar dilution โดยใชยาเพนิซิลลิน ที่มีความเขมขน 0.125 – 256 μg/ml โดยเชื้อที่ไวตอยาเพนิซิลลิน ตองมีคา MIC นอยกวาหรือ เทากับ 0.12 μg/ml (EUCAST, 2015) ผลการวิจัยพบวา เชื้อ MRSA สวนใหญดื้อตอยาเพนิซิลลิน ใหคา MIC อยูระหวาง 0.25 ถึง >256 μg/ml (ตารางที่ 1) 2. คา MIC ของยาปฏิชีวนะตอการยับยั้งเชื้อ MRSA การศึกษาฤทธิ์ของยาแวนโคมัยซิน ตอการยับยั้งการ เจริญของเชื้อ MRSA จํานวน 20 ไอโซเลท โดยใชวิธี agar dilution โดยใชยาแวนโคมัยซิน ที่มีความเขมขนตั้งแต 0.125 – 256 μg/ml โดยเชื้อที่ไวตอยาแวนมัยซิน ตองมีคา MIC นอย กวาหรือเทากับ 2 μg/ml (EUCAST, 2015) ผลการวิจัยพบวา เชื้อ MRSA สวนใหญไวตอยาแวนโคมัยซิน ใหคา MIC อยู ระหวาง 0.25 – 2 μg/ml โดยมีเพียง 1 ไอโซเลท ที่ดอื้ ตอยาแวน 62 Synergistic effect of hexane extract of Kaempferia parviflora on antibiotics against methicillin-resistant Staphylococcus aureus IJPS Suphim B. et al. Vol. 12 No. 2 April – June 2016 _______________________________________________________________________________________________ เจริญของเชื้อ MRSA จํานวน 4 ไอโซเลท (คา FICI = 0.5) ไดแก ไอโซเลท 5-183, 5-254, 5-30 และ 5-104 และไมมีผลตอ ฤทธิ์ของยาแวนโคมัยซิน ในเชื้อ 6 ไอโซเลท โดยไมพบฤทธิ์ ตานกันระหวางสารสกัดกระชายดําและยาแวนโคมัยซิน (ตาราง ที่ 2) สวนการทดสอบผลรวมกับยาเพนิซิลลิน พบวาสารสกัด กระชายดํา สามารถเสริมฤทธิ์ของยาเพนิซลิ ลิน ในเชื้อทั้ง 10 ไอ โซเลทได (ตารางที่ 3) 3. ฤทธิ์รวมกันของสารสกัดกระชายดําที่สกัดดวยเฮกเซน กับยาปฏิชีวนะตอการยับยั้งเชื้อ MRSA การศึกษาฤทธิ์รวมกันของสารสกัดกระชายดําที่สกัด ดวยเฮกเซน โดยใชวิธี Checkerboard dilution ใชเชื้อทดสอบ จํานวน 10 ไอโซเลท ทีไ่ วตอสารสกัดเฮกเซน มาทดสอบรวมกับ ยาปฏิชีวนะ ผลการศึกษาวิจัยพบวา สารสกัดเฮกเซนสามารถ เสริมฤทธิ์ (synergism) ของยาแวนโคมัยซิน ในการยับยั้งการ ตารางที่ 2 คา FICI ของยาแวนโคมัยซินเมื่อใหรว มกับสารสกัดกระชายดําที่สกัดดวยเฮกเซนในการยับยั้งการเจริญของเชื้อ MRSA MRSA strains 5-456 5-183 5-163 5-184 5-254 5-30 5-490 5-85 5-104 5-272 Agents Hexane extract Vancomycin Hexane extract Vancomycin Hexane extract Vancomycin Hexane extract Vancomycin Hexane extract Vancomycin Hexane extract Vancomycin Hexane extract Vancomycin Hexane extract Vancomycin Hexane extract Vancomycin Hexane extract Vancomycin Alone 1,000 0.25 1,000 1 1,000 0.25 2,000 0.5 2,000 0.25 2,000 0.5 2,000 0.5 2,000 0.5 2,000 0.25 2,000 0.5 MIC (g/ml) Hexane extract + VAN 500 0.125 250 0.25 500 0.125 1,000 0.25 500 0.0625 500 0.125 1,000 0.25 1,000 0.25 1,000 0.0625 1,000 0.25 FICI ≤ 0.5, synergy; FICI > 0.5 to 4.0, indifference; FICI > 4.0 antagonism (Lorian, 2005) 63 FICI Outcome 1 Indifference 0.5 Synergy 1 Indifference 1 Indifference 0.5 Synergy 0.5 Indifference 1 Indifference 1 Indifference 0.5 Synergy 1 Indifference สารสกัดเฮกเซนของกระชายดําเสริมฤทธิ์ของยาปฏิชวี นะตอการยับยั้งเชื้อ Staphylococcus aureus สายพันธุดอื้ ยาเมธิซลิ ลิน ว. เภสัชศาสตรอสี าน ปที่ 12 ฉบับที่ 2 เม.ย. – มิ.ย. 2559 บุญเลี้ยง สุพิมพ และคณะ _______________________________________________________________________________________________ ตารางที่ 3 คา FICI ของยาเพนิซลิ ลินเมื่อใหรวมกับสารสกัดกระชายดําที่สกัดดวยเฮกเซนในการยับยั้งการเจริญของเชื้อ MRSA MRSA strains 5-456 5-183 5-163 5-184 5-254 5-30 5-490 5-85 5-104 5-272 Agents Hexane extract Penicillin Hexane extract Penicillin Hexane extract Penicillin Hexane extract Penicillin Hexane extract Penicillin Hexane extract Penicillin Hexane extract Penicillin Hexane extract Penicillin Hexane extract Penicillin Hexane extract Penicillin alone 1,000 0.25 1,000 16 1,000 16 2,000 0.25 2,000 0.25 2,000 0.25 2,000 256 2,000 8 2,000 0.25 2,000 0.5 MIC (g/ml) Hexane extract + PEN 125 0.031 31.25 0.5 15.62 0.25 125 0.156 250 0.031 62.50 0.0039 62.50 8 62.50 0.25 250 0.031 125 0.031 FICI Outcome 0.249 Synergy 0.0625 Synergy 0.031 Synergy 0.125 Synergy 0.249 Synergy 0.047 Synergy 0.063 Synergy 0.063 Synergy 0.249 Synergy 0.125 Synergy FICI ≤ 0.5, synergy; FICI > 0.5 to 4.0, indifference; FICI > 4.0 antagonism (Lorian, 2005) อภิปรายผลและสรุปผลวิจัย rubrum T. mentagrophytes และ Microsporum gypseum มีคา MIC 62.5, 125 และ 250 μg/ml ตามลําดับ นอกจากนี้สาร กลุ ม ฟลาโวนอยด 9 ชนิ ด ที่ ส กั ด ได จ ากกระชายดํ า เมื่ อ นํ า มา ทดสอบคุ ณ สมบั ติ ใ นการยั บ ยั้ ง เชื้ อ จุ ลิ น ทรี ย พบว า 5,7,4trimethoxyflavone และ 5,7,3,4-tetramethoxyflavone มีฤทธิ์ ยับยั้งการเจริญของเชื้อมาลาเรีย คือ Plasmodium falciparum โดยใหคา IC50 เทากับ 3.70 μg/ml และ 4.06 μg/ml ตามลําดับ และ 3, 5, 7, 4-tetramethoxyflavone และ 5, 7, 4- ผลการทดสอบความไวของสารสกัดกระชายดําที่สกัด ดวยเฮกเซนในการยับยั้งการเจริญของเชื้อ MRSA พบวา สาร สกัดกระชายดําที่สกัดดวยเฮกเซนสามารถยับยั้งการเจริญของ เชื้อ MRSA ไดจํานวน 10 ไอโซเลท ใหคา MIC อยูระหวาง 1,000 – 2,000 μg/ml สอดคลองกับการศึกษาของ Kummee et al. (2008) ไดทดสอบความไวของสารสกัดกระชายดําที่สกัด ดวยเอทานอลในการยับยั้งเชื้อจุลินทรีย พบวา สารสกัดสามารถ ยับยั้งเชื้อรากอโรคผิวหนังได 3 สปชีส คือ Trichophyton 64 Synergistic effect of hexane extract of Kaempferia parviflora on antibiotics against methicillin-resistant Staphylococcus aureus IJPS Suphim B. et al. Vol. 12 No. 2 April – June 2016 _______________________________________________________________________________________________ สารสกัดกระชายดําสามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อ S. aureus สายพันธุดื้อยาเมธิซิลิน ได และเมื่อทดสอบรวมกับยาปฏิชีวนะ ไดแกยาแวนโคมัยซิน และเพนิซินิลิน พบวาสวนใหญมีฤทธิ์ แบบเสริ ม ฤทธิ์ กั น ดั ง นั้ น ผลการศึ ก ษาในครั้ ง นี้ อ าจสามารถ นํ า ไปสู ก ารพั ฒนากลยุ ทธ ในการนํา สารจากธรรมชาติ ม าใช รวมกับยาปฏิชีวนะ และควรมีการศึกษาเพิ่มเติมถึงสารสําคัญที่ มีฤทธิ์ตาน MRSA ในสารสกัดกระชายดําที่ผลิตเปนการคา เพื่อ ใช เ ป น ข อ มู ล พื้ น ฐานในการนํ า เอาสมุ น ไพรไปพั ฒ นาเป น ยา ปฏิชวี นะในการรักษาโรคติดเชื้อ MRSA ตอไป trimethoxyflavone สามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อ Candida albicans โดยใหคา IC50 เทากับ 39.71 μg/ml และ 17.63 μg/ml ตามลําดับ และพบวา 3, 5, 7, 4-tetramethoxyflavone และ 5, 7, 4-trimethoxyflavone ยังมีฤทธิ์ยับยั้งการเจริญของเชื้อ Mycobacterium ไดเล็กนอย โดยใหคา MIC 200 μg/ml และ 50 μg/ml ตามลําดับ (Yenjai, 2004) การศึกษาฤทธิ์รวมกันของสารสกัดกระชายดําที่สกัด ดวยเฮกเซนกับยาแวนมัยซิน และ เพนิซิลลิน พบวาสารสกัด กระชายดําที่สกัดดวยเฮกเซนใหผลเสริมฤทธิ์ยาแวนโคมัยซิน ตอการยับยั้งเชื้อ MRSA จํานวน 4 ไอโซเลท และไมมีผลตอ ฤทธิ์ของยาแวนโคมัยซินในการยับยั้งเชื้อ MRSA จํานวน 6 ไอ โซเลท โดยสารสกัดกระชายดําที่สกัดดวย เฮกเซนสามารถ เสริมฤทธิ์ของยาเพนิซิลลิน ตอการยับยั้งเชื้อ MRSA ไดทุกไอ โซเลท สอดคลองกับการศึกษาฤทธิ์ของเคอรคูมินเปนสารที่สกัด ไดจากขมิ้น ซึ่งเปนพืชตระกูลขิง (Zingiberaceae) เชนเดียวกับ กระชายดําในการเสริ มฤทธิ์ ของยาปฏิ ชีวนะต อการยั บยั้ งเชื้ อ MRSA โดยวิธี broth microdilution และ Checkerboard test ผลการศึกษาพบวา เคอรคูมินสามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อ MRSA ใหคา MIC อยูระหวาง 125 – 250 μg/ml และเมื่อ ทดสอบฤทธิ์ของเคอรคูมินรวมกับยาปฏิชีวนะ ไดแก ยาออกซา ซิลิน, แอมพิซิลลิน, ไซโปรฟลอกซาซิน และ นอรฟลอกซาซิน พบวาเคอรคูมินสามารถลดคา MIC ของยาปฏิชีวนะตอการ ยับยั้งเชื้อ MRSA ตอยาทั้ง 4 ชนิด (Mun et al., 2013) และ การศึกษาฤทธิ์รวมกันของสารฟลาโวนอยดที่สกัดจากพืชสวน ครัว เชน ขา และ กระชาย กับยาอะม็อกซิซิลิน ตอการยับยั้ง เชื้อ amoxicillin-resistant Escherichia coli (AREC) พบวา คา MIC ของยาอะม็อกซิซิลิน และสารฟลาโวนอยดที่สกัดจาก ขา และกระชาย มี ค า อยู ร ะหว า ง 500 ถึ ง >1,000 ไมโครกรั ม ต อ มิลลิลิตร เมื่อนํามาทดสอบฤทธิ์รวมกัน พบวา สารฟลาโวนอยด สามารถเสริมฤทธิ์ของยาอะม็อกซิซิลิน ตอการยับยั้งเชื้อ AREC โ ด ย อ อ ก ฤ ท ธิ์ ทํ า ล า ย โ ค ร ง ส ร า ง เ ยื่ อ หุ ม เ ซ ล ล ข อ ง เ ชื้ อ (Cytoplasmic membrane) โดยยับยั้งการสราง peptidoglycan ทําใหเชื้อไมสามารถเจริญได และยับยั้ง ribosome synthesis นอกจากนี้สารฟลาโวนอยดยังสามารถยับยั้งการสรางเอนไซม penicillinase ซึ่งเปนเอนไซมที่มีฤทธิ์ทําลายโครงสราง betalactam ของยาปฏิชวี นะได ทําใหเชื้อ AREC ไวตอยาอะม็อกซิซิ ลินเพิ่มมากขึ้น (Eumkeb et al., 2012) ก า ร ศึ ก ษา ผ ลข อง สา ร สกั ดก ระ ชายดํ า ต อ ก า ร ปรับเปลี่ยนความไวของเชื้อ S. aureus ตอยาปฏิชีวนะ พบวา กิตติกรรมประกาศ ขอขอบคุ ณ กองทุ น สนั บ สนุ น การวิ จั ย ของบุ ค ลากร มหาวิทยาลัยราชภัฏเลย ประจําป 2555 ที่ใหทุนสนับสนุนการ วิจัยและหนวยจุลชีววิทยาคลินิก โรงพยาบาลศรีนครินทร คณะ แพทยศาสตร มหาวิทยาลัยขอนแกน ใหความอนุเคราะหเชื้อ methicillin-resistant Staphylococcus aureus เพื่อใชในการทํา วิจยั ในครั้งนี้ References Aswapokee N. New Therapeutic Options for Resistant Gram-Positive Infections Siriraj Scientific Congress. Siriraj Hospital: 2008. Barber M, Rozwadowska-Dowzenko M. Infection by penicillin-resistant staphylococci. Lancet 1948; 2(6530): 641-644. Chattiranan S, Sabaijai W, Niyomthai S. Phytochemical Screening and Antioxidant Activity of Clerodendrum disparifolium Leaves. KKU Sci J 2013; 41(3): 723 - 730. Climo MW, Patron RL, Archer GL. Combinations of vancomycin and beta-lactams are synergistic against staphylococci with reduced susceptibilities to vancomycin. Antimicrob Agents Chemother 1999; 43(7): 1747-1753. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved standard M2-A10. 10th ed. Wayne, PA.: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2009. 65 สารสกัดเฮกเซนของกระชายดําเสริมฤทธิ์ของยาปฏิชวี นะตอการยับยั้งเชื้อ Staphylococcus aureus สายพันธุดอื้ ยาเมธิซลิ ลิน ว. เภสัชศาสตรอสี าน ปที่ 12 ฉบับที่ 2 เม.ย. – มิ.ย. 2559 บุญเลี้ยง สุพิมพ และคณะ _______________________________________________________________________________________________ Mun SH, Joung DK, Kim YS, et al. Synergistic antibacterial effect of curcumin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Phytomedicine 2013; 20(8-9): 714-718. Panthong A, Tassaneeyakul W, Kanjanapothi D, Tantiwachwuttikul P, Reutrakul V. Antiinflammatory activity of 5,7-dimethoxyflavone. Planta Med 1989; 55(2): 133-136. Plata K, Rosato AE, Wegrzyn G. Staphylococcus aureus as an infectious agent: overview of biochemistry and molecular genetics of its pathogenicity. Acta Biochim Pol 2009; 56(4): 597-612. Rujjanawate C, Kanjanapothi D, Amornlerdpison D, Pojanagaroon S. Anti-gastric ulcer effect of Kaempferia parviflora. J Ethnopharmacol 2005; 102(1): 120-122. Sae-wong C, Tansakul P, Tewtrakul S. Anti-inflammatory mechanism of Kaempferia parviflora in murine macrophage cells (RAW 264.7) and in experimental animals. J Ethnopharmacol 2009; 124(3): 576-580. Sawasdee P, Sabphon C, Sitthiwongwanit D, Kokpol U. Anticholinesterase activity of 7-methoxyflavones isolated from Kaempferia parviflora. Phytother Res 2009; 23(12): 1792-1794. Schito GC. The importance of the development of antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Infect 2006; 12 Suppl 1(3-8. Sirikhansaeng P, Vichitphan K, Vichitphan S. The flavonoid content and antibacterial activity of Kaempferia parviflora Wall. ex Baker in Krachai-Dum herbal wine. 13th International Biotechnology Symposium & Exhibition (IBS-2008) Dalian China Biotechnology for the Sustainnability of Human Society 2008. p. S746 Siriwong N, Chukeatirote E. Antibiotic resistance in Staphylococcus aureus and controlling. Songkla Med J 2009; 27(4): 347 - 358. Dowrote N. The effects of Kaempferia parviflora and Hibiscus sabdariffa extracts on arterial blood pressure and renal functions in rats. [Master of Science in Physiology.]. Songkla: Prince of Songkla University; 2010. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Routine and extended internal quality control as recommended by EUCAST, Version 5.0.http://www.eucast.org.; 2015. Eumkeb G, Siriwong S, Phitaktim S, Rojtinnakorn N, Sakdarat S. Synergistic activity and mode of action of flavonoids isolated from smaller galangal and amoxicillin combinations against amoxicillinresistant Escherichia coli. J Appl Microbiol 2012; 112(1): 55-64. Hausler WJ, Herrmann KL, Isenberg HD. Manual of clinical microbiology. 10th ed. Washington, DC: American Society for Microbiology; 1991. Indranupakorn R. Identification, extraction and separation of active constituents of herb. Bangkok: chulalongkorn University; 2004. Kummee S, Tewtrakul S, Subhadhirasakul S. Antimicrobial activity of the ethanol extract and compounds from the rhizomes of Kaempferia parviflora. Songklanakarin J Sci Technol 2008; 30 (4): 463 466. Kusirisin W, Srichairatanakool S, Lerttrakarnnon P, et al. Antioxidative activity, polyphenolic content and anti-glycation effect of some Thai medicinal plants traditionally used in diabetic patients. Med Chem 2009; 5(2): 139-147. Lorian V. Antibiotice in laboratory medicine. 5th ed. Philadephia: Lippincott Williams & Wilkins; 2005. Medical Technology Laboratory. Direct colony suspension method (DCS). Thammasat University Hospital; 2008. 66 Synergistic effect of hexane extract of Kaempferia parviflora on antibiotics against methicillin-resistant Staphylococcus aureus IJPS Suphim B. et al. Vol. 12 No. 2 April – June 2016 _______________________________________________________________________________________________ Spoorthi NJ, Vishwanatha T, Reena V, et al. Antibiotic synergy test: checkerboard method on multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa. International research journal of pharmacy 2011; 2(12): 196 198. Tewtrakul S, Subhadhirasakul S. Anti-allergic activity of some selected plants in the Zingiberaceae family. J Ethnopharmacol 2007; 109(3): 535-538. Tewtrakul S, Subhadhirasakul S, Kummee S. Anti-allergic activity of compounds from Kaempferia parviflora. J Ethnopharmacol 2008; 116(1): 191-193. Thathaisong U, Sangnual S. Synergistic Effect of AlphaMangostin and Gentamicin against Methicillinresistant Staphylococcus aureus Isolated from King Narai Hospital. Burapha Sci J 2011; 16(2): 89 - 96. Yenjai C, Prasanphen K, Daodee S, Wongpanich V, Kittakoop P. Bioactive flavonoids from Kaempferia parviflora. Fitoterapia 2004; 75(1): 89-92. Yenjai C, Sutthanut K, Sripanidkulchai B, et al. Further studies of bioactive flavonoids from Kaempferia parviflora. KKU Sci J 2007; 35(1): 37 - 41. Ziglam H, Nathwani D. New therapeutic agents for resistant Gram-positive infections. Expert Rev Anti Infect Ther 2003; 1(4): 655-665. 67