Abstract

In the present thesis selected scientific result of the candidate as well as proposals for future
research thematic are presented. The existing results are divided in two main segments:
enzymology and biocatalysis.

Enzymology: The reported presence of a coenzyme B 12-dependent methylmalonyl-CoA

mutase in potatoes has been reexamined. The enzyme converting methylmalonyl-CoA was
purified to electrophoretic homogeneity. Examination of the reaction product by 1H-, 31P-NMR
and mass spectrometry revealed that it was methylmalonyl-3’-dephospho-CoA. The
phosphatase enzyme needs neither coenzyme B12 nor S-adenosylmethionine as a cofactor.

It was proposed a detailed mechanism for the transhydroxylase action which included a direct
hydroxyl transfer from the cocatalyst 1,2,3,5-tetrahydroxy benzene to the ortho-quinone form
of pyrogallol. The oxidation of pyrogallol to quinone is required for a nucleophilic attack by 2-
OH group of the cocatalyst. The redox cofactors of the enzyme (Moco and Fe 4S4 clusters)
could catalyse this step. This mechanism leads to 3,4,5,2’,4’,6’-hexahydroxydiphenylether as
intermediate, which was synthesised together with its 3,4,5,3’,4’,5’-hexahydroxy isomer. The
behaviour of both compounds in the transhydroxylase reaction was examined, strongly
supporting our mechanistic proposal, which was in conflict with the widely expected role of
molybdopterine-containing enzymes according to which the molybdenum centre is the
acceptor and donor of the transferred OH or oxo groups. Previously two alternative
mechanisms were also formulated, although they didn't satisfy the experimental findings. (e.g.
the requirement for 1,2,3,5-tetrahydroxy benzene as cocatalyst). The elucidation of the X-ray
structure of transhydroxylase confirms the mechanism involving the hexahydroxy-
diphenylether intermediate and renders the alternative ones obsolete.

Acrylic acids and alanines substituted with nitro-phenyl and heteroaryl groups in the β-
position were synthesized (four phenyl-furan-2yl, furanyl, thiophenyl, benzofuranyl and
benzothiophenyl carrying the alanyl side chains either in 2 or 3 positions). While phenyl-
furan-2yl and heteroar-2-yl alanines are good substrates for phenylalanine ammonia-lyase
(PAL), the 3-yl izomers are inhibitors. Exceptions are thiophen-3-yl-alanine being a moderate
substrate and furan-3-yl-alanine being inert. Possible reasons for these exceptions are

1
discussed. These results together with the kinetic parameters of PAL catalyzed reactions in
presence of variously substituted phenyl-furan-2yl-alanines can be best explained by a Friedel-
Crafts type electrophilic attack at the aromatic part of the substrates as the initial step of the
PAL reaction. The same mechanistic proposal was also strengthened by the kinetic parameters
of wild-type and MIO-less mutant PAL reactions when nitro-phenyl alanines were used as
substrates.

Biocatalysis: First the lipase-catalyzed kinetic resolution of a series of aromatic β-hydroxy

esters in organic media is described. Decanoic acid and its esters were successfully used as
acyl donors for selective O-acylation. The regio- and enantioselective enzymatic hydrolysis of
the decanoate moiety of the diesters was also investigated. The effects of water, reaction
temperature, solvent type and also the influence of substrates structure on the catalytic
behavior of potential commercially available lipases were studied. A novel procedure was
developed for the efficient and highly stereoselective synthesis of both enantiomers of novel
and known target compounds.

The one-pot procedure involving the enzymatic dinamic kinetic resolution of various furan-yl
cyanohydrins is presented. Novel (R)-furylbenzothiazol- and phenyl-furan-2yl-based
cyanohydrin esters were prepared in over 90% isolated yields from the corresponding
aldehydes. The one-pot method combines a basic resin to produce hydrogen cyanide from
acetone cyanohydrin, an equilibrium between the formation and decomposition of
cyanohydrins and the unique enantioselectivity of Candida antarctica lipase A for
furylbenzotiazol based structures and lipase from Pseudomonas cepacia for phenyl-furanyl
compounds, allowing the acylation of (R)-cyanohydrins in the presence of vinyl esters.

Unnatural α-arylalanines are frequent constituents of pharmaceutic products. For their

synthesis in enantiopure form three strategies have been used. 1. Lipase mediated DKR of
oxazolones followed by a chemical and an enzymatic hydrolytic step were combined for
synthesis of enantiopure L- benzofuranyl- and L-benzothienyl alanines. 2. Starting from
racemic heteroaryl-2-alanines the D-enantiomers were prepared using a stereodestructive
procedure, while from the heteroaryl-2-acrylates the L-enantiomers of the heteroaryl-2-
alanines could be prepared at high ammonia concentration in presence of PAL. 3. Various
enantiopure L-arylalanines can be prepared from the corresponding arylaldehydes in one-pot

2
fashion by a combination of chemical and enzymatic reactions. The used reagents were
(triphenyl-λ5-phosphanylidene)ethyl acetate (Wittig reaction), porcine liver esterase (PLE),
PAL and ammonia. The pure L-arylalanines were obtained after ion-exchange chromatography
in high yields, calculated from the arylaldehydes.

The stereochemical sense of the baker’s yeast mediated reduction of α-acetoxymethyl-

arylketones is governed by Prelog’s rule and in most cases, the subsequent enzymatic
hydrolysis of the formed 2-hydroxy-2-arylethyl acetate occurs, while bioreductions of α-
hydroxy ketones are yielding the opposite enantiomers of the produced 1,2-ethanediols. Both
enantiomers of various 1-aryl-1,2-ethanediols have been prepared in an one-pot procedure
from the corresponding arylethanones through the combination of chemical and enzymatic
reactions.

Further plans are including the development of new biocatalytic procedures using hydrolases
and new wild-type and mutant phenylalanine ammonia lyases and phenylalanine ammonia
mutases.

3
Rezumat

În această teză este prezentată o selecție a rezultatele ştiinţifice ale candidatului şi tematici
propuse pentru cercetarea viitoare. Rezultatele existente au fost grupate în două mari
segmente: enzimologie şi biocataliză.

Enzimologie: A fost reanalizată prezenţa (semnalată anterior) a unei metil-malonil-CoA

mutaze B12-dependente în cartof. Enzima a fost purificată până la omogenitate electroforetică.
Analiza produşilor de reactie prin 1H- şi 31
P-RMN şi spectrometrie de masă au evidenţiat
formarea metilmalonil-3’-defosfo-CoA. Această fosfatază nu necesită cofactori (coenzima B12,
sau S-adenozillmetionina).

A fost propus un mecanism detaliat al acţiunii transhidroxilazelor care include transferul direct
al unui hidroxil de pe co-catalizator, 1,2,3,5-tetrahidroxibenzen, pe forma orto-chinonică a
pirogalolului. Oxidarea pirogalolului la chinonă este necesară pentru atacul nucleofil al grupei
OH din poziţia 2 al co-catalizatorului. Cofactorii redox ai enzimei (clusteri Moco si Fe 4S4) ar
putea cataliza această etapă. Mecanismul propus decurge prin formarea intermediarului
3,4,5,2’,4’,6’-hexahidroxi-difenileteric, care împreună cu un izomer al acestuia, 3,4,5,3’,4’,5’-
hexahidroxi-difenileterul au fost sintetizați. Analiza comportamentului celor doi izomeri în
reacţia mediată de transhidroxilază susţine mecanismul propus de noi. Acest mecanism este în
discordanţă cu două mecanisme alternative anteriot formulate, care sunt în concordanță cu
rolul general acceptat a enzimelor molibdopterince, în care molibdeniul este atât acceptor cât
şi donor al grupărilor OH sau oxo transferate. Cele două mecanisme nu sunt în concordanță cu
datele experimentale (de exemplu necesitatea co-catalizatorului 1,2,3,5-tetrahidroxbenzenic).
Elucidarea structurii transhidroxilazei prin difracţie de raze X confirmă mecanismul formulat
de noi şi invalidează celelatte două alternative postulate anterior.

Au fost sintetizaţi acizi acrilici şi alanine substituite cu grupări nitro-fenil sau heteroaril în
poziţia β (patru derivaţi de fenil-furan-2-il, furanil, tiofenil, benzofuranil şi benzotiofenil în
poziţia 2 sau 3). În timp nitro-fenil, fenil-furan-2il și heteroar-2il alanine sunt substraturi bune
pentru fenilalaninamoniacliază (PAL), heteroar-3-il alaninele sunt inhibitori, cu excepţia
tiofen-3-il-alaninei care este un substrat moderat şi a furan-3-il-alaninei care este inertă.

4
Posibile cauze pentru excepții sunt discutate. Aceste rezultate, împreună cu parametrii cinetici
ai reacţiilor unor fenil-furan-2-il-alanine substituite catalizate de PAL, pot fi cel mai bine
explicate printr-un atac electrofil tip Friedel-Crafts al componentei aromatice a substratului în
prima etapă a reacţiei. Acelaşi tip de mecanism este susţinut şi de parametrii cinetici ai
reacţiilor nitrofenilalaninelor cu PAL nativ şi mutantul MIO-deficitar al acestei enzime.

Biocataliza: Mai întâi a fost prezentată rezoluţia cinetică mediată de lipaze în mediu organic a
unei serii de β-hidroxiesteri aromatici. A fost utilizat cu succes acidul decanoic ca şi agent
selectiv de O-acilare. A fost realizată şi hidroliza enzimatică regio- şi enantioselectivă a
grupării decanoat când diesterii racemici au fost folosiți drept substraturi. A fost studiat efectul
apei, a temperaturii de reacţie şi a naturii substratului asupra comportamentului unor lipaze
disponibile comercial. A fost elaborat un procedeu nou de sinteză înalt stereoselectivă a
ambilor enantiomeri ai unor compuşi cunoscuţi sau noi din această clasă.

În continuare este prezentată o metodă „one-pot“ de sinteză implicând rezoluţia cinetică

dinamică a unor furanilcianohidrine. Au fost preparaţi cu randamente mai mari de 90% acetaţii
(R)-furilbenzotiazol- şi fenil-furan-2-il- cianohidrinelor, pornind de la aldehidele
corespunzătoare. Varianta „one-pot“ combină utilizarea unei răşini bazice cu scopul dublu de a
generarea acidului cianhidric din acetoncianohidrină și a media procesul de echilibru între
formarea si descompunerea cianohidrinei, cu enantioselectivitatea unică a lipazei A din
Candida antarctica pentru derivaţii furilbenzotiazolici, respectiv a lipazei din Pseudomonas
cepacia pentru derivaţii fenil-furanici, permiţând astfel acilarea (R)-cianohidrinelor cu esteri
vinilici.

α-Arilalaninele nenaturale sunt constituenţi uzuali ai unor compuşi farmaceutici şi biologici.

Pentru sinteza lor în formă enantiopură au fost utilizate trei strategii. 1. Rezoluţia cinetică
enzimatică a oxazolonelor mediate de lipaze urmată de hidroliza chimică și apoi enzimatică a
intermediarilor formați pentru sinteza L- benzofuranil- si L-benzotienil alaninelor enantiopure.
2. Pornind de la heteroarilalaninele racemice au fost preparaţi enantiomerii D printr-o
procedură stereodistructivă, în timp ce enantiomerii L au fost obtinuti din acrilaţii
corespunzători în soluţii concentrate de amoniac, ambele mediate de PAL. 3. L-arilalaninele
enantiopure pot fi obţinute din arilaldehidele corespunzătoare printr-o procedura “one-pot”
care combină etape chimice și enzimatice, utilizând ca reactivi: acetat de (trifenil-λ5-

5
fosfaniliden)etil (reacţia Wittig), esteraza din ficat porcin (PLE), PAL şi amoniac. L-
Arilalaninele au fost purificate cu randamente mari utilizând cromatografia de schimb ionic.

Reducerile mediate de drojdie ale α-acetoximetil-arilcetonelor sunt guvernate de regula lui

Prelog şi în general sunt însotite de hidroliza ulterioară a acetaţilor de 2-hidroxi-2-ariletil, în
timp ce prin bioreducerea α-hidroxicetonelor se formează enantiomerii opuşi ai 1,2-
etandiolilor. Astfel au fost preparaţi pornind de la ariletanonele corespunzătoare ambii
enantiomeri ai unor 1-aril-1,2-etandioli cu structuri variate printr-o procedură “one-pot” care
include etape chimice şi enzimatice.

Planurile de viitor includ dezvoltarea unor proceduri biocatalitice noi prin utilizarea
hidrolazelelor şi a unor noi fenilalaninamoniacliaze sau fenilalaninamoniacmutaze naturale
sau modificate genetic.