See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.

net/publication/342231621

Optimasi Teknik Western Blot untuk Deteksi Ekspresi Protein Tanaman Padi
(Oryza sativa L.)

Article · December 2019

DOI: 10.29122/jbbi.v6i2.3249

CITATIONS READS

0 1,727

4 authors, including:

Susianti . Ronny Lesmana

Universitas Padjadjaran Universitas Padjadjaran
7 PUBLICATIONS   1 CITATION    116 PUBLICATIONS   442 CITATIONS   

SEE PROFILE SEE PROFILE

Unang Supratman
Universitas Padjadjaran
203 PUBLICATIONS   1,005 CITATIONS   

SEE PROFILE

Some of the authors of this publication are also working on these related projects:

Potential effect of nutmeg for preventing sarcopenia in aging rats View project

Flavanoids from the stembark of Chisocheton pentandrus (Meliaceae) View project

All content following this page was uploaded by Susianti . on 17 June 2020.

The user has requested enhancement of the downloaded file.

 VOLUME 6 NOMOR 2 DESEMBER 2019 ISSN 2548 – 611X

JURNAL
BIOTEKNOLOGI & BIOSAINS INDONESIA

Homepage Jurnal: http://ejurnal.bppt.go.id/index.php/JBBI

OPTIMASI TEKNIK WESTERN BLOT UNTUK DETEKSI

EKSPRESI PROTEIN TANAMAN PADI (Oryza sativa L.)

Optimization of Western Blot Technique for Protein Expression of Rice Plant

(Oryza sativa L.)

Susianti1,3, Edi Sukmana2, Ronny Lesmana1,2, Unang Supratman1,3

1Laboratorium Sentral Universitas Padjadjaran, Jatinangor
2Departemen Ilmu Kedokteran Dasar, Fakultas Kedokteran, Universitas Padjadjaran, Jatinangor
3Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran, Jatinangor

*Email: susianti@unpad.ac.id

ABSTRACT
Western blot (WB) technique has been widely used for analyzing protein expression and for
identifying specific proteins derived from animals, plants, and microorganisms. During the use
of WB, especially in agricultural studies, some difficulties are encountered such as unclear or
unspecific protein bands, the presence of bubbles, and the absence of protein bands on
membrane. This study aims to determine the WB conditions appropriate for the protein
expression of rice plants (Oryza sativa L.). Protein from rice plant was extracted and the
obtained protein lysate was then used for proteomic analysis using WB with β-actin antibody.
Our experiment showed that some optimized parameters like blocking buffers, the
concentration of primary antibody and the ratio of secondary antibody determined the clarity
of the results. β-actin was used as internal control that measured the success of the WB
technique. Results showed that lysis process was important in determining good WB results
in addition to the optimal blocking solution using a BSA of 0.2%, a primary antibody
concentration of 1 μg mL–1, and a secondary antibody of 1:10,000. Optimizing techniques
during extraction, incubation, and documentation facilitated good WB results.

Keywords: β-actin, optimization, protein, rice plant, western blot

ABSTRAK
Teknik western blot (WB) telah banyak digunakan untuk analisis ekspresi protein dan
mengidentifikasi protein spesifik dari hewan, tumbuhan dan mikroorganisme. Dalam
implementasi teknik WB, khususnya studi dalam bidang pertanian, beberapa kesulitan ditemui
seperti pita protein tidak jelas, tidak spesifik, adanya gelembung, hingga tidak munculnya pita
protein pada membran. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kondisi WB yang tepat untuk
deteksi protein tanaman padi (Oryza sativa L.). Protein tanaman padi diekstraksi, kemudian lisat
protein yang didapat dianalisis dengan metode WB menggunakan antibody β-actin. Penelitian
kami menunjukkan bahwa beberapa parameter yang dioptimasi seperti larutan blocking,
konsentrasi antibodi primer dan rasio antibodi sekunder akan menentukan hasil yang jelas. β-
actin digunakan sebagai kontrol internal yang menjadi tolok ukur keberhasilan teknik WB. Hasil
menunjukkan bahwa proses lisis menjadi hal penting dalam menentukan hasil WB yang baik
disamping larutan blocking yang optimal menggunakan BSA 0,2%, konsentrasi antibodi primer
1 µg mL–1 dan antibodi sekunder 1:10.000. Mengoptimalkan teknik selama ekstraksi, inkubasi
dan dokumentasi membantu mendapatkan hasil WB yang baik.

Kata Kunci: β-actin, optimasi, protein, tanaman padi, western blot

Received: 19 December 2018 Accepted: 31 October 2019 Published: 02 December 2019

174
 J Bioteknol Biosains Indones – Vol 6 No 2 Thn 2019

PENDAHULUAN Erythropoietin (Epo) dengan Erythropoietin

receptor (EpoR) pada sel kanker ovarium
Padi (Oryza sativa L.) adalah salah satu manusia A2780. Li et al. (2015)
tanaman yang menjadi sumber makanan mengidentifikasi ikatan protein antara
pokok jutaan orang pada hampir separuh laminin dan fibronectin menggunakan Far-
populasi dunia khususnya di benua Asia (Li et WB. Hingga saat ini, WB juga digunakan
al. 2011, Mahmood dan Yang 2012, Esa et al. untuk diagnosis berbagai penyakit dan
2013, Wu et al. 2014). Sebagai bahan infeksi. Banyak penelitian dasar maupun
konsumsi pangan terpenting, yang jumlahnya klinis dilakukan menggunakan teknik WB
terus bertambah seiring dengan (Huang et al. 2019). Walentowicz-Sadlecka
pertambahan jumlah penduduk, peningkatan et al. (2018) menganalisis ekspresi protein
kualitas padi menjadi tantangan tersendiri Human Leukocyte Antigen-G (HLA-G) pada
bagi para peneliti (Zhang et al. 2017b). penderita kanker endometrial. Teknik WB
Terlebih padi juga merupakan model juga menjadi salah satu metode yang sensitif
tanaman monokotil yang banyak digunakan dan selektif untuk deteksi parasit
baik studi genomik dan proteomik. Menurut Echinococcus multilocularis pada famili
Gulcicek et al. (2005), dengan Canidae (Schurer et al. 2019). Villafanez et
berkembangnya teknologi dalam beberapa al. (2019) melakukan optimasi teknik WB
tahun terakhir, banyak studi proteomik telah untuk identifikasi regulator Post-
dilakukan baik untuk identifikasi, karakterisasi Translational Modifications (PTM). Seiring
maupun analisis tingkat ekspresi protein dari dengan kemajuan teknologi, mulai
sel atau jaringan hewan dan tanaman. dikembangkan beberapa metode alternatif
Berbagai metode yang dapat digunakan untuk meningkatkan sensitivitas dan
dalam analisis protein diantaranya adalah reproduktivitas teknik WB di antaranya
kolorimetri, kromatografi cair, elektroforesis metode WB-resolusi satu sinyal, Far-WB,
1-dimensi dan 2-dimensi, serta western blot blotting difusi, WB-mikrofluida otomatis, WB-
(Esteves et al. 2019). elektroforesis kapiler dan elektroforesis
Western blot (WB) adalah salah satu mikrochip (Mishra et al. 2017).
teknik biologi molekuler untuk analisis Teknik WB merupakan metode yang
ekspresi protein semi-kuantitatif dari pengerjaannya sederhana, spesifik dan tepat
berbagai macam bahan uji baik dari sel (Li et al. 2011). Namun demikian, dalam
maupun jaringan dengan prinsip kerjanya implementasi teknik WB untuk penelitian
berdasarkan pengikatan antigen-antibodi tertentu khususnya studi dalam bidang
(Gilda dan Gomes 2013, Nie et al. 2017). pertanian, beberapa kesulitan teknik ditemui
Tahapan teknik WB dimulai dari preparasi seperti pita protein tidak jelas, tidak spesifik,
sampel (ekstraksi dan pemurnian protein, adanya gelembung, hingga tidak munculnya
pengukuran konsentrasi serta banyaknya pita protein pada membran (Mahmood dan
jumlah protein yang akan digunakan), Yang 2012). Oleh karena itu, memahami
pemisahan protein menggunakan proses optimasi kondisi WB untuk
elektroforesis gel poliakrilamida, transfer mendapatkan hasil WB yang terbaik menjadi
protein dari gel ke membran nitroselulosa sangat penting, karena kondisi optimal setiap
atau PVDF (polyvinylidene difluoride), pengerjaan WB berbeda-beda, mulai dari
membran blocking, inkubasi antibodi primer persiapan dan penanganan sampel, hingga
dan sekunder, deteksi protein target, pemilihan dan validasi antibodi yang
perhitungan intensitas pita protein digunakan untuk deteksi protein (Alegria-
menggunakan software digital densitometri, Schaffer et al. 2009, Huang et al. 2019).
dan normalisasi data menggunakan kontrol Penelitian ini bertujuan untuk
internal protein (Mishra et al. 2017). Selain mengetahui kondisi WB yang tepat untuk
analisis ekspresi protein, teknik WB deteksi protein tanaman padi (Oryza sativa
digunakan untuk mendeteksi interaksi L.). Parameter WB yang dioptimasi meliputi
struktur protein-protein secara in vitro, yang larutan blocking yang digunakan, konsentrasi
dinamakan “far-western blot” (Cima-Cabal et antibodi primer dan antibodi sekunder. β-actin
al. 2019). Feckova et al. (2016) melakukan digunakan sebagai kontrol internal protein
penelitian dengan menggunakan metode yang menjadi tolok ukur keberhasilan teknik
Far-WB untuk analisis interaksi di antara WB.

175
Optimasi Teknik Western Blot Untuk Deteksi.... Susianti et al.

BAHAN DAN METODE etilenadiaminatetraasetat (EDTA) (Merck),

aseton (Merck), bovine serum albumin (BSA)
Waktu dan lokasi penelitian (Sigma), dithiothreitol (DTT) (Promega),
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Folin-Ciocalteu (Merck), glisin (Merck),
Sentral Universitas Padjadjaran, Jatinangor, kalium klorida (Merck), protein ladder
Sumedang pada tanggal 6 Mei–24 November (Thermo Scientific 26612), larutan dapar
2018. ekstraksi, larutan dapar lisis, larutan dapar
pengendap, larutan dapar sampel, Mili-Q
Bahan (Sartorius), metanol (Merck), natrium
Daun tanaman padi (Oryza sativa L.) hidroksida (Merck), natrium klorida (Merck),
berumur 30 hari (Gambar 1) diperoleh dari nitrogen cair, polivinilpirolidon (PVP) (Wako),
lahan persawahan di Cibiuk Garut phosphate buffer saline (PBS) pH 7,4
(7°05'10.0"S 107°56'49.9"E), dibersihkan (Gibco), poliakrilamida 40% (Biorad),
dan dipotong menjadi ukuran yang lebih kecil resolving buffer, running buffer, SilverQuestTM
sebelum digunakan (Wang et al. 2008). LC6070 silver staining kit (Invitrogen,
Bahan-bahan lain yang digunakan Thermo), sodium dedocyl sulfate (SDS) 10%
meliputi antibodi primer β-actin, antibodi (1st base), stacking buffer, substrat
sekunder yang berkesesuaian, 2- chemiluminescence (GE Healthcare),
merkaptoetanol (Sigma), 2-propanol (Merck), sukrosa (Merck), susu skim (Tropicana Slim),
amonium asetat (Merck), amonium persulfat tetramethylethylenediamine (TEMED)
(APS) (Merck), asam asetat glasial (Merck), (Invitrogen), transfer buffer, triton X-100
asam klorida (Merck), asam (Invitrogen), tris-base (Promega), tween 20
(Merck), urea (Merck).

Ekstraksi protein
Ekstraksi protein daun tanaman padi
dilakukan dengan metode Lin dan Wang
(2014) yang telah dimodifikasi dengan
penghilangan bahan kimia fenol dalam
dapar ekstraksi, penghilangan tahapan
pencucian pelet menggunakan aseton dan
pengeringan vakum (Tabel 1). Sebanyak
1,5 g daun tanaman padi dihaluskan hingga
menjadi serbuk dengan mortar dan alu
menggunakan nitrogen cair. Ekstraksi
dilakukan pada suhu 4ºC. Selanjutnya
ditambahkan 5 mL larutan dapar ekstraksi,
59,5 cm dan 0,5 g polivinilpirolidon sambil ditumbuk,
dan ditambahkan kembali 5 mL larutan
dapar ekstraksi, ditumbuk hingga berbuih.
Lalu protease inhibitor ditambahkan
sebanyak 25 μL dan larutan dapar ekstraksi
sebanyak 5 mL. Campuran ditumbuk hingga
berbuih. Setelah itu, campuran dipindahkan
ke dalam tabung 1,5 mL dan disentrifugasi
dengan kecepatan 15.000 rpm pada suhu
4ºC selama 20 menit. Filtrat disaring dan
dipindahkan ke dalam tabung baru 1,5 mL,
ditambahkan dapar pengendap ke dalam
filtrat dengan perbandingan 3:1 dan
diinkubasi pada −20ºC selama 4 jam.
Campuran disentrifugasi selama 20 menit,
15.000 rpm 4ºC. Pelet dicuci sebanyak 2 kali
dengan 1,8 mL larutan dapar pengendap.
Gambar 1. Sampel tanaman padi Pelet diresuspensi menggunakan larutan

176
 J Bioteknol Biosains Indones – Vol 6 No 2 Thn 2019

Tabel 1. Tahapan optimasi teknik western blot

Tahapan Teknik Western Blot Referensi Jurnal Optimasi

Ekstraksi protein Menggunakan fenol, aseton Tidak menggunakan fenol,
dan pengeringan vakum aseton dan pengeringan
metode Lin dan Wang (2014) vakum

Elektroforesis gel poliakrilamida − Menggunakan gel tris-glisin

Pewarnaan protein − Pewarnaan perak (silver stain)
Transfer protein − Metode transfer basah
Blocking − Menggunakan susu skim 0,2% atau BSA 0,2%
Inkubasi antibodi primer − Konsentrasi 1 µg mL−1
Inkubasi antibodi sekunder − Konsentrasi 1:10.000
Deteksi protein target − Chemiluminescence

dapar lisis secukupnya dan ditambahkan Transfer protein

protease inhibitor 1:1.000. Lisat protein Gel hasil elektroforesis poliakrilamida
dapat disimpan pada suhu −80ºC sebelum ditransfer pada membran menggunakan
digunakan untuk analisis selanjutnya. metode transfer basah kemudian alat transfer
dinyalakan selama 30 menit, 200 mA. Setelah
Kuantifikasi protein itu, hasil transfer dapat dicek dengan
Untuk mengetahui jumlah protein menggunakan pewarnaan Ponceau S.
dalam tanaman padi dilakukan kuantifikasi
menggunakan metode Lowry yang telah Deteksi protein dengan antibodi
dimodifikasi. Lisat protein sebanyak 0,25 mL Membran dicuci menggunakan
dimasukkan ke dalam tabung reaksi, phosphate buffer saline-tween 20 (PBST)
ditambahkan 2,5 mL reagen Lowry, 0,1% 3×5 menit. Proses blocking membran
dihomogenkan menggunakan vortex dengan menggunakan susu skim 0,2% atau
kemudian diinkubasi selama 10 menit pada BSA 0,2% pada suhu ruangan selama 60
suhu 50ºC. Setelah itu, campuran menit. Setelah selesai, membran dicuci
ditambahkan reagen Folin-Ciocalteu 1:1 dengan PBST 0,1% selama 5 menit dan
sebanyak 0,5 mL, diinkubasi kembali selama dilakukan berulang sebanyak 3 kali.
10 menit pada suhu 50ºC. Absorbansi Selanjutnya larutan antibodi primer β-actin
sampel diukur menggunakan dengan konsentrasi 1 µg mL–1 ditambahkan
spektrofotometer pada panjang gelombang ke dalam membran, kemudian diinkubasi 4ºC
650 nm. Konsentrasi sampel dihitung semalam. Setelah itu, membran dicuci
dengan menggunakan kurva standar bovine dengan menggunakan PBST 0,1% 3×5
serum albumin (BSA). menit. Kemudian langkah selanjutnya
penambahan larutan antibodi sekunder
Elektroforesis gel poliakrilamida dengan konsentrasi 1:10.000, kemudian
Pemisahan protein daun tanaman padi diinkubasi pada suhu ruangan selama 1,5
dilakukan menggunakan elektroforesis jam. Membran dicuci kembali dengan
poliakrilamida berdasarkan metode Lesmana menggunakan PBST 0,1% 3×5 menit dan
dan Hanna (2017). Lisat protein ditambahkan substrat chemiluminescence ditambahkan ke
dapar sampel dengan perbandingan 1:1, dalam membran, diinkubasi selama 5 menit
didenaturasi pada suhu 95ºC. Sampel lalu dideteksi protein β-actin dengan
dimasukkan ke dalam tujuh sumur gel menggunakan alat C-Digit LICOR.
poliakrilamida, sebanyak 20 μL tiap sumur.
Voltase diatur pada tegangan 80–100V HASIL DAN PEMBAHASAN
selama 90 menit. Pewarnaan gel hasil
elektroforesis dilakukan dengan metode Ekstraksi protein
pewarnaan perak menggunakan Hasil ekstrasi protein daun tanaman
SilverQuestTM LC6070 silver staining kit padi didapatkan lisat protein yang jernih
(Invitrogen, Thermo). (Gambar 2). Ekstraksi protein merupakan

177
Optimasi Teknik Western Blot Untuk Deteksi.... Susianti et al.

tahapan paling penting dalam teknik WB, Pencucian dengan aseton biasanya
terutama pada sampel tanaman (Vilhena et dilakukan untuk membantu menghilangkan
al. 2015), dikarenakan jaringan tanaman sisa garam natrium asetat dari larutan dapar
memiliki jumlah protease yang tinggi dan pengendap yang digunakan sebelumnya, dan
kandungan metabolit sekunder yang juga untuk mengurangi terjadinya degradasi
biasanya menjadi pengganggu pada proses protein (Rodrigues et al. 2012).
ekstraksi karena sulit untuk dihancurkan
(Wang et al. 2008), sehingga untuk Kuantifikasi protein
mendapatkan hasil lisat protein yang tinggi Jumlah lisat protein daun tanaman padi
bergantung pada pemilihan protokol ekstraksi diukur menggunakan metode Lowry. Hasil
protein dan setiap tahapan dari ekstraksi kuantifikasi protein dari lisat daun tanaman
protein tersebut (Niu et al. 2018). padi yang didapat sebesar 239,5 µg µL–1.
Ekstraksi protein dilakukan Menurut Kurien dan Scofield (2015),
menggunakan metode Lin dan Wang (2014) pengukuran protein metode Lowry
yang telah dimodifikasi dengan penghilangan berdasarkan pada dua reaksi. Pertama,
bahan kimia fenol dalam larutan dapar pembentukan kompleks ion tembaga dengan
ekstraksi, penghilangan tahapan pencucian ikatan amida membentuk tembaga tereduksi
pelet menggunakan aseton dan pengeringan (disebut juga kromofor biuret) dan biasanya
vakum. Fenol digunakan dalam larutan dapar stabil dengan penambahan natrium-kalium
ekstraksi sebagai pengikat protein dan untuk tartrat. Reaksi kedua yaitu reduksi reagen
mengurangi degradasi protein. Metode Folin-Ciocalteu oleh kompleks tembaga-
ekstraksi protein menggunakan fenol memiliki amida beserta residu tirosin dan triptofan.
aktivitas yang baik untuk mengurangi Warna biru yang terbentuk dapat diukur
interaksi molekuler antara protein dan bahan absorbansinya dengan spektrofotometer.
lain, namun fenol memiliki sedikit BSA dijadikan sebagai standar untuk
kecenderungan untuk melarutkan asam perhitungan konsentrasi protein.
nukleat dan polisakarida (Chatterjee et al.
2012). Selain itu, fenol termasuk ke dalam Elektroforesis gel poliakrilamida
bahan berbahaya yang bersifat racun karena Untuk melihat pemisahan protein daun
sulit diuraikan oleh organisme sehingga tanaman padi berdasarkan berat molekulnya,
dalam penelitian ini larutan dapar ekstraksi digunakan teknik elektroforesis gel
dibuat tanpa penambahan fenol, sedangkan poliakrilamida (Bass et al. 2017). Lisat protein
penghilangan tahapan pencucian pelet ditambahkan larutan dapar sampel lalu
menggunakan aseton dan pengeringan didenaturasi pada suhu 95ºC selama 5 menit.
vakum bertujuan untuk mencegah hilangnya Dapar sampel terdiri dari gliserol yang
protein yang lebih banyak pada saat ekstraksi berfungsi untuk meningkatkan densitas
dan efisiensi waktu ekstraksi protein. sampel sehingga sampel dengan mudah

120—
90—

50—

34—

26—

20—

Gambar 3. Hasil pewarnaan perak daun tanaman padi

(L: Ladder protein, 1-7: Lisat protein daun
Gambar 2. Lisat protein daun tanaman padi tanaman padi)

178
 J Bioteknol Biosains Indones – Vol 6 No 2 Thn 2019

turun ke dasar sumur gel, bromophenol blue terperangkap di antara gel dan membran
sebagai tracking dye, dan 2-merkaptoetanol yang dapat mengakibatkan hasil transfer
yang berfungsi untuk mereduksi ikatan tidak optimal (Mahmood dan Yang 2012).
disulfida menjadi protein yang bermuatan Metode transfer yang digunakan yaitu
sehingga pada saat elektroforesis transfer basah, dimana selama proses
berlangsung, sampel akan bermigrasi melalui transfer, larutan dapar digunakan untuk
gel dari katoda (−) menuju anoda (+) meningkatkan permeabilitas gel
(Mahmood dan Yang 2012). poliakrilamida, sehingga membantu proses
transfer protein menjadi lebih cepat (Gibbons
Pewarnaan gel (pewarnaan perak) 2014).
Gel hasil elektroforesis dilakukan Membran yang digunakan dalam
pewarnaan menggunakan metode proses transfer protein yaitu nitroselulosa.
pewarnaan perak untuk melihat pemisahan Biasanya membran nitroselulosa digunakan
protein. Hasil pewarnaan pada Gambar 3 untuk protein yang memiliki afinitas tinggi
menunjukkan bahwa protein tanaman padi (Mahmood dan Yang 2012). Tanaman padi
terseparasi dengan baik sesuai dengan diketahui mengandung protein HKT (High-
ukuran berat molekulnya. Pada pewarnaan affinity K+ Transporter) yang berperan dalam
perak, ion perak yang berasal dari reagen mempertahankan homeostatis Na+/K+ pada
perak nitrat berikatan dengan rantai samping tanaman (Ariyarathna et al. 2016, Zhang et al.
yang bermuatan negatif dari protein sehingga 2017a).
dihasilkan warna coklat kehitaman pada gel Untuk melihat keberhasilan proses
poliakrilamida. Pewarnaan gel menggunakan transfer protein, dilakukan pewarnaan
metode pewarnaan perak 30−100 kali lebih membran menggunakan Ponceau S (Bass et
sensitif dari metode coomassie blue (Zhao et al. 2017). Ponceau S merupakan metode
al. 2012). pewarnaan negatif dimana akan berikatan
dengan gugus amino yang bermuatan positif.
Transfer protein Protein yang ditransfer (> 200 ng) akan
Setelah proses elektroforesis muncul sebagai pita merah jambu. Hasil
poliakrilamida selesai, dilanjutkan proses pewarnaan Ponceau dilakukan pada 2
transfer protein dari gel ke membran (blotting) membran, dan didapatkan hasil pita merah
dengan membuat “sandwich”: Katoda(−) - jambu seperti terlihat pada Gambar 4 yang
sponge pad (kasa) - kertas saring - gel - menandakan bahwa proses transfer protein
membran - kertas saring - sponge pad (kasa) dari gel ke membran berhasil dengan baik.
- Anoda(+). Harus dipastikan posisi Kelebihan dari pewarnaan Ponceau S yaitu
penempatan gel dan membran tidak terbalik pengerjaannya sederhana, cepat, dan
serta tidak ada gelembung yang reversible (Goldman et al. 2016).

90— 90—
50—

34—
50—
26—

20—
34—

26—

A B
Gambar 4. Hasil pewarnaan Ponceau S. (L: Ladder protein, 1-7: Lisat protein daun tanaman padi) A. Membran untuk
blocking menggunakan susu skim 0,2%, B. Membran untuk blocking menggunakan BSA 0,2%

179
 Optimasi Teknik Western Blot Untuk Deteksi.... Susianti et al.

Deteksi protein dengan antibodi digunakan akan mengganggu hasil pengujian

Membran dicuci menggunakan PBST (Mahmood dan Yang 2012).
0,1%. Tahap pencucian sangat penting untuk Selanjutnya, membran diinkubasi
meminimalkan background pada membran menggunakan antibodi primer β-actin dengan
dan menghilangkan sisa antibodi yang tidak konsentrasi 1 µg mL–1. Penentuan
terikat (Mahmood dan Yang 2012). konsentrasi antibodi disesuaikan dengan
Selanjutnya, tahap blocking membran instruksi dari produsen antibodi. Antibodi β-
menggunakan larutan blocking susu skim actin dilarutkan dalam BSA karena
0,2% atau BSA 0,2%. Menurut Bass et al. memungkinkan antibodi untuk digunakan
(2017), tahap blocking penting untuk kembali, jika membran tidak memberikan
mencegah pengikatan antibodi yang tidak hasil yang baik (Mahmood dan Yang 2012).
spesifik (baik antibodi primer maupun Pemilihan β-actin sebagai marker untuk
antibodi sekunder) dan mengurangi WB didasarkan pada karakteristik protein
background pada membran. Idealnya, larutan yang selalu terekspresi dengan baik pada
blocking akan mengikat semua bagian non- berbagai sel (Li dan Shen 2013, Ghosh et al.
spesifik, menghilangkan semua background 2014, Taylor dan Posch 2014). β-actin
tanpa mengubah interaksi dengan protein merupakan protein yang terdapat pada sel
target yang akan terikat dengan antibodi. eukariotik dalam jumlah yang melimpah,
Hasil penelitian pada Gambar 5 umumnya digunakan sebagai kontrol internal
menunjukkan bahwa penggunaan larutan untuk menormalisasi dalam studi ekspresi
blocking BSA 0,2% lebih efektif gen ataupun protein (Gorr dan Vogel 2015).
meminimalkan background pada membran, Penggunaan kontrol internal dalam biologi
terlihat dari pita protein yang muncul pada molekuler tergantung pada asumsi bahwa
Gambar 5B lebih jelas dibandingkan dengan tingkat ekspresinya tetap dan konstan antara
Gambar 5A. Susu skim banyak digunakan kontrol dan sampel percobaan dengan
sebagai larutan blocking karena mudah ditunjukkan tidak terpengaruh perlakuan atau
didapat dan harganya relatif murah. Namun, intervensi dalam setiap kondisi eksperimen
tidak semua label antibodi sekunder (Bass et al. 2017).
kompatibel dengan protein dalam susu, Prinsip WB adalah deteksi protein
sehingga harus cermat dalam memilih larutan melalui pengikatan dan pengenalan antibodi
blocking yang tepat. Penelitian Nie et al. ke satu atau lebih target. Ikatan ini harus
(2017) dan Petras et al. (2017), sangat spesifik antara sebagian antigen
menggunakan susu skim sebagai larutan (protein) atau epitop dan daerah pengenalan
blocking pada WB untuk deteksi β-actin, dan khusus yang ditemukan pada fragmen
didapatkan hasil pita protein dengan high pengikatan antigen yang disebut paratop.
background pada membran yang dapat Setelah itu, membran diinkubasi
berpengaruh pada saat perhitungan menggunakan antibodi sekunder label
intensitasnya, sedangkan penelitian WB oleh horseradish peroxidase (HRP) dengan
Vavilis et al (2015) didapatkan hasil pita konsentrasi 1:10.000. Pemilihan antibodi
protein dengan low background pada sekunder berdasarkan isotype antibodi
membran. BSA biasa digunakan untuk label primer. Penentuan konsentrasi antibodi
antibodi sekunder biotin dan alkalin fosfatase, disesuaikan dengan instruksi dari produsen
dan antibodi antifosfoprotein, karena susu antibodi. Label antibodi HRP banyak
mengandung kasein, yang juga merupakan digunakan dengan mekanisme kerja
fosfoprotein dan biotin, sehingga jika mengkatalisis oksidasi luminol peroksida
untuk menghasilkan asam 3-aminoftalat,
A
~42 menghasilkan cahaya pada 425 nm.
kDa Deteksi pita protein β-actin dilakukan
dengan alat C-Digit LICOR menggunakan
B ~42
kDa
substrat chemiluminescence. Prinsip
deteksinya berdasarkan cahaya yang
dihasilkan dari asam 3-aminoftalat akibat
Gambar 5. Hasil WB β-actin daun tanaman padi: reaksi enzim (HRP)-substrat, yang akan
A. Blocking menggunakan susu skim 0,2%, ditangkap dengan film X-ray, kamera Charge-
dan B. Blocking menggunakan BSA 0,2% Coupled Device (CCD) atau imager lainnya

180
 J Bioteknol Biosains Indones – Vol 6 No 2 Thn 2019

menghasilkan pita protein yang intensitasnya extraction protocol compatible with two-
dapat dihitung dengan menggunakan dimensional electrophoresis and mass
software digital densitometri (Luo et al. 2011, spectrometry from recalcitrant phenolic
Bass et al. 2017). rich roots of chickpea (Cicer arietinum
Hasil WB pada Gambar 5 menunjukkan L.) Int J Proteomics 2012:1–10. doi:
bahwa antibodi yang digunakan spesifik dan 10.1155/2012/536963
cukup sensitif untuk mendeteksi protein Cima-Cabal MD, Vazquez F, de Los Toyos
target. Namun, masih diperlukan optimasi JR, Del Mar García-Suárez M
lebih lanjut untuk konsentrasi BSA yang (2019) Protein expression analysis by
digunakan karena pita protein yang western blot and protein–protein
dihasilkan belum konsisten. interactions. Methods Mol Biol
1968:101–111. doi: 10.1007/978-1-
KESIMPULAN 4939-9199-0_9
Esa NM, Ling TB, Peng LS (2013) By-
Optimasi kondisi WB dengan mengatur products of rice processing: An
formulasi larutan blocking menggunakan BSA overview of health benefits and
0,2%, dan konsentrasi antibodi primer 1 µg applications. J Rice Res 1:107. doi:
mL–1 khususnya β-actin dan antibodi 10.4172/ jrr.1000107
sekunder yang bersesuaian dengan Esteves CV, de Campos WG, de Souza MM,
konsentrasi 1:10.000 akan memberikan Lourenço SV, Siqueira WL, Lemos-
gambaran pita protein yang lebih jelas dan Júnior CA (2019) Diagnostic potential
baik. of saliva proteome analysis: A review
and guide to clinical practice. Braz Oral
UCAPAN TERIMA KASIH Res 33:1–13. doi:10.1590/1807-
3107bor-2019.vol33.0043
Penelitian ini didanai oleh Hibah Feckova B, Kimáková P, Ilkovičová L,
Internal Unpad dalam skema Hibah Riset Szentpéteriová E, Debeljak N, Solárová
Tenaga Kependidikan Universitas Z, Sačková V, Šemeláková M, Bhide
Padjadjaran Gelombang I Tahun 2018 M, Solár P (2016) Far-western blotting
kepada Susianti. as a solution to the non-specificity of the
anti-erythropoietin receptor antibody.
DAFTAR PUSTAKA Oncol Lett 12:1575–
1580. doi:10.3892/ol.2016.4782
Alegria-Schaffer A, Lodge A, Vattern K (2009) Ghosh R, Gilda JE, Gomes AV (2014) The
Performing and optimizing western necessity of and strategies for
blots with an emphasis on improving confidence in the accuracy of
chemiluminescent detection. Methods western blots. Expert Rev Proteomics
Enzymol 463:573–599. doi: 11:549–560. doi:
10.1016S0076-6879(09)63033-0 10.1586/14789450.2014.939635
Ariyarathna HA, Oldach KH, Francki MG Gibbons J (2014) Western blot: Protein
(2016) A comparative gene analysis transfer overview. North Am J Med Sci
with rice identified orthologous group II 6:158–159. doi:10.4103/1947-
HKT genes and their association with 2714.128481
Na+ concentration in bread wheat. BMC Gilda JE, Gomes AV (2013) Stain-free total
Plant Biol 16:21. doi: 10.1186/s12870- protein staining is a superior loading
016-0714-7 control to β-actin for western blots. Anal
Bass JJ, Wilkinson DJ, Rankin D, Phillips BE, Biochem 440:186–188. doi:
Szewczyk NJ, Smith K, Atherton PJ 10.1016/j.ab.2013.05.027
(2017) An overview of technical Goldman A, Harper S, Speicher DW (2016)
considerations for western blotting Detection of proteins on blot
applications to physiological research. membranes. Curr Protoc Protein Sci
Scand J Med Sci Sports 27:4–25. doi: 86:1–11. doi: 10.1002/cpps.15
10.1111/sms.12702 Gorr TA, Vogel J (2015) Western blotting
Chatterjee M, Gupta S, Bhar A, Das S (2012) revisited: Critical perusal of
Optimization of an efficient protein underappreciated technical issues.

181
Optimasi Teknik Western Blot Untuk Deteksi.... Susianti et al.

Proteomics Clin Appl 9:396–405. doi: Mahmood T, Yang P-C (2012) Western blot:
10.1002/prca.201400118 Technique, theory, and trouble
Gulcicek EE, Colangelo CM, McMurray W, shooting. North Am J Med Sci 4:429–
Stone K, Williams K, Wu T, Zhao H, 434. doi: 10.4103/1947-2714.100998
Spratt H, Kurosky A, Wu B (2005) Mishra M, Tiwari S, Gomes AV (2017) Protein
Proteomics and the analysis of purification and analysis: Next
proteomic data: An overview of current generation western blotting techniques.
protein-profiling technologies. Curr Expert Rev Proteomics 14:1037–1053.
Protoc Bioinformatics 13:1–40. doi: doi: 10.1080/14789450.2017.1388167
10.1002/ 0471250953. bi1301s10 Nie X, Li C, Hu S, Xue F, Kang YJ, Zhang W
Huang YT, van der Hoorn D, Ledahawsky LM, (2017) An appropriate loading control
Motyl AAL, Jordan CY, Gillingwater TH, for western blot analysis in animal
Groen EJN (2019) Robust comparison models of myocardial ischemic infarction.
of protein levels across tissues and Biochem Biophys Rep 12:108–113. doi:
throughout development using 10.1016/j.bbrep.2017.09.001
standardized quantitative western Niu L, Yuan H, Gong F, Wu X, Wang W
blotting. J Vis Exp (2018) Protein extraction methods
146:e59438. doi:10.3791/59438 shape much of the extracted
Kurien BT, Scofield RH (2015) Western proteomes. Front Plant Sci 9:802. doi:
blotting: Methods and protocols. Methods 10.3389/fpls.2018.00802
in Molecular Biology Vol 1312. Springer Petras M, Drgova A, Kovalska M, Tatarkova
Science-Business Media, New York Z, Tothova B, Krizanova O, Lehotsky J
Lesmana R, Hanna G (2017) Fisiologi (2017) Effect of hyperhomocysteinemia
molekuler seri prosedur dan protokol on redox balance and redox defence
laboratorium western blot. Fakultas enzymes in ischemia–reperfusion injury
Kedokteran Universitas Padjadjaran, and/or after ischemic preconditioning in
Jatinangor rats. Cell Mol Neurobiol 37:1417–1431.
Li Q, Liu H, Du D, Yu Y, Ma C, Jiao F, Yao H, doi: 10.1007/s10571-017-0473-5
Lu C, Zhang W (2015) Identification of Rodrigues EP, Torres AR, da Silva Batista JS,
novel laminin- and fibronectin-binding Huergo L, Hungria M (2012) A simple,
proteins by far-western blot: Capturing economical and reproducible protein
the adhesins of Streptococcus suis type extraction protocol for proteomics
2. Front Cell Infect Microbiol 5:82. doi: studies of soybean roots. Genet Mol
10.3389/fcimb.2015.00082 Biol 35:348–352. doi: 10.1590/S1415-
Li R, Shen Y (2013) An old method facing a 47572012000200016
new challenge: Re-visiting Schurer JM, Nishimwe A, Hakizimana D, Li H,
housekeeping proteins as internal Huang Y, Musabyimana JP, Tuyishime
reference control for neuroscience E, MacDonald LE (2019) A one health
research. Life Sci 92:747–751. doi: systematic review of diagnostic tools for
10.1016/j.lfs.2013.02.014 Echinococcus multilocularis surveillance:
Li X, Bai H, Wang X, Li L, Cao Y, Wei J, Liu Towards equity in global detection.
Y, Liu L, Gong X, Wu L, Liu S, Liu G Food Waterborne Parasitol 15:1–24.
(2011) Identification and validation of doi:10.1016/j.fawpar.2019.e00048
rice reference proteins for western Taylor SC, Posch A (2014) The design of a
blotting. J Exp Bot 62:4763–4772. doi: quantitative western blot experiment.
10.1093/jxb/err084 BioMed Res Int 2014:361590. doi:
Lin D-G, Wang C-S (2014) Extraction of total 10.1155/2014/361590
proteins from rice plant. Bio-protocol Vavilis T, Delivanoglou N, Aggelidou E,
4:e1277. doi: 10.21769/BioProtoc.1277 Stamoula E, Mellidis K, Kaidoglou A,
Luo H, Rankin GO, Straley S, Chen YC Cheva A, Pourzitaki C, Chatzimeletiou
(2011) Prolonged incubation and K, Lazou A, Albani M, Kritis A (2015)
stacked film exposure improve Oxygen–glucose deprivation (OGD)
sensitivity in western blotting. J modulates the unfolded protein
Pharmacol Toxicol Methods 64:233– response (UPR) and inflicts autophagy
237. doi: 10.1016/j.vascn.2011.06.001 in a PC12 hypoxia cell line model. Cell

182
 J Bioteknol Biosains Indones – Vol 6 No 2 Thn 2019

Mol Neurobiol 36:701–712. doi: Sci 31:2032–2039. doi:

10.1007/s10571-015-0250-2 10.1002/jssc.200800087
Vilhena MB, Franco MR, Schmidt D, Carvalho Wu J, Lee DY, Wang Y, Kim ST, Baek S-B,
G, Azevedo RA (2015) Evaluation of Kim SG, Kang KY (2014) Protein
protein extraction methods for profiles secreted from phylloplane of
enhanced proteomic analysis of tomato rice leaves free from cytosolic proteins:
leaves and roots. An Acad Bras Cienc Application to study rice-Magnaporthe
87:1853–1863. doi: 10.1590/0001- Oryzae interactions. Physiol Mol Plant
3765201520150116 Pathol 88:28–35. doi:
Villafanez F, Gottifredi V, Soria G (2019) 10.1016/j.pmpp.2014. 08.003
Development and optimization of a Zhang C, Li H, Wang J, Zhang B, Wang W,
miniaturized western blot-based Lin H, Luan S, Gao J, Lan W (2017a)
screening platform to identify regulators The rice high-affinity K+ transporter
of post-translational modifications. High OsHKT2;4 mediates Mg2+ homeostasis
Throughput under high-Mg2+ conditions in
8:E15. doi:10.3390/ht8020015 transgenic Arabidopsis. Front Plant Sci
Walentowicz-Sadlecka M, Dziobek K, 8:1823. doi: 10.3389/fpls.2017.01823
Grabiec M, Sadlecki P, Walentowicz P, Zhang Y, Tang L, Liu X, Liu L, Cao W, Zhu Y
Mak P, Szymankiewicz M, Kwinta P, (2017b) Modeling the leaf angle
Dutsch-Wicherek M (2018) The dynamics in rice plant. PLoS One
analysis of human leukocyte antigen-G 12:e0171890. doi:
level in patients with endometrial cancer 10.1371/journal.pone.0171890
by western blot technique. Am J Reprod Zhao L, Liu C, Sun Y, Ban L (2012) A rapid
Immunol 81:1–10. doi:10.1111/aji.13070 and simplified method for protein silver
Wang W, Tai F, Chen S (2008) Optimizing staining in polyacrylamide gels.
protein extraction from plant tissues for Electrophoresis 33:2143–2144. doi:
enhanced proteomics analysis. J Sep 10.1002/elps.201200107

183

View publication stats