SEPARACIN DE PROTENAS POR CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR INTRODUCCION La cromatografa es una tcnica que permite la separacin de molculas diferentes

presentes en una misma muestra. El mtodo est basado en la circulacin de una fase mvil (que arrastra a la mezcla de compuestos a separar), a travs de una fase estacionaria. Dependiendo de la afinidad relativa que por ambas fases tengan los distintos compuestos presentes en la mezcla resultar su separacin. La cromatografa de exclusin molecular (a menudo tambin llamada filtracin en gel o de tamiz molecular) es una de las tcnicas ms sencillas de las empleadas en la separacin de protenas y cidos nucleicos. Este tipo de cromatografa se realiza en columnas cilndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican con este fn y que pueden ser de varios tipos: dextranos con enlaces cruzados (sephadex), agarosa (sepharose, Bio-gel A), poliacrilamida (Bio-gel B), etc. Todos estos geles (fase estacionaria) se hallan constituidos por grnulos (particulas) de un material esponjoso hidratado, que contiene poros con un tamao de dimetro determinado.

Hypothetical partial structure of sephacryl Cuando se hace pasar una mezcla de molculas de distinto tamao, a travs de una columna de filtracin en gel; aquellas molculas con un tamao mayor que el dimetro de los poros de las particulas, slo podran moverse en su camino, a travs de la fase estacionaria, en el espacio que queda entre las partculas; y por lo tanto, no se vern retrasadas en su descenso. En cambio aquellas molculas capaces de penetrar en las partculas se vern retrasadas por la fase estacionaria; en mayor medida, cuanto menor sea su tamao. Por lo tanto, las molculas eluyen en este tipo de cromatografa por orden decreciente de tamao molecular.

Mecanismo de la cromatografa de exclusin

Las mallas del gel permiten la entrada selectiva de las particulas de menor masa molecular. De ah que las particulas de mayor peso molecular salgan primero. Diferentes compartimentos dentro de la columna

Diagrammatic representation of Vt and V0. Note that Vt V0 will include the volume of the actual fibres forming the matrix of each bead. APLICACIONES A) Cambios de buffers. Despus de cromatografas de intercambio inico, afinidad o de interaccin hidrofbica. B) Desalado. Protenas, polisacridos, polipptidos etc. Pueden ser desalados antes de ser concentrados o liofilizados. C) Eliminacin de fenol de las preparaciones de cidos nuclicos. D) Eliminacin de compuestos de bajo peso molecular marcados. I125, FITC de las soluciones de marcaje de protenas. E) Para reacciones entre macromolculas y reactivos de bajo peso molecular. F) Eliminacin de productos, cofactores, inhibidores, etc. De las enzimas. G) Purificacin de macromolculas. H) Determinacin del peso molecular de las protenas.

OBJETIVO Realizar la calibracin de una columna de gel filtracin de sephacryl S-200 y determinacin del peso molecular de una protena problema. MATERIAL 1-Tampn fosfato 25 mM y ClK 100 mM pH 7. 2-Columna de cromatografa de 30 cm de altura y 1cm de dimetro 3-20 ml de Sephacryl S-200 equilibrados en tampn fosfato 4-Patrones de alto y bajo peso molecular. A cada grupo se le suministran 3 marcadores de peso molecular, azul de dextrano y una alcuota de riboflavina 100 mM. 5- Muestra problema.

Cromatograma

Calibration kits for gel filtration. An example showing their use with Sephadex G-200 superfine. Peaks: 1. catalase; 2. aldolase; 3. bovine serum albumin; 4. ovoalbumin; 5 chymotrypsinogen A; 6 ribonuclease A.

METODO -Empaquetar el gel dentro de la columna: con la columna cerrada aadir 5 ml de tampn fosfato, a continuacin comenzar a aadir los 20 ml de gel debidamente hidratado en el mismo tampn, lentamente y evitando hacer burbujas de aire dentro de la columna. En este momento; colocar un recipiente debajo de la columna para recoger el lquido que va a fluir, abrir la columna para ealizar el proceso de empaquetado. -Lavar bien la columna (aprox. 40 ml). -Marcar 50 tubos -Elucin de la columna: El proceso descrito a continuacin se debe realizar para cada uno de los marcadores de peso molecular y colorantes por separado, ms otra vez para la muestra problema. 1-Aplicacin de la muestra. Dejar que la columna gotee hasta que se elimine todo el tampn de la parte superior del gel. A continuacin aplicar 20 l de la muestra. 2-Dejar gotear hasta que toda la muestra entre en el gel 3-Colocar el tubo n 1 debajo de la columna y aadir a la columna una alcuota de 400 l de la solucin tampn. Recoger en el tubo el eludo hasta que se elimine de la parte superior todo el volumen aplicado. 4-Repetir el paso 3 con cada uno de los tubos numerados RESULTADOS 1-Determinar el volumen de elucin de cada uno de los marcadores de peso molecular, volumen de exclusin y volumen total.

A. Simple size negligible compared with bed volume. B. Sample size not negligible compared with bed volume. C. Sample giving plateau elution curve.

La identificacin de las fracciones que contienen los dos colorantes se hace mediante estimacin visual; mientras que para saber que fracciones que contienen los marcadores de peso molecular y la muestra problema se aade 1ml del reactivo de Bradford. 2-Cromatograma: para cada compuesto hacer una grfica representando en el eje de abcisas el volumen aadido a la columna y en ordenadas la intensidad relativa del color del compuesto (por estimacin visual). 3-coeficiente de reparto de cada uno de los marcadores empleados y de la muestra problema.

Relationship between several expressions used for normalizing elution behaviour. 4-realizar la recta de calibracin y determinar el peso molecular de la protena problema.

Calibration curve using the low molecular weight gel filtration calibration kit on sephadex G-75 superfine