GLUCOSA

FUNDAMENTO DEL MTODO La glucosa presente en la muestra origina, segn las reacciones acopladas descritas a continuacin, un complejo coloreado que se cuantifica por espectrofotometra.

Glucosa + O2 + H2O

glucosa oxidasa

Glucnico + H2O2
peroxidasa

2 H2O2 + 4 Aminoantipirina + Fenol

Quinonaimina + 4 H2O

COMPOSICIN A. Reactivo: 10 x 50 mL. Fosfatos 100 mmol/L, fenol 5 mmol/L, glucosa oxidasa > 10 U/mL., peroxidasa > 1 U/mL., 4-aminoantipirina 0,4 mmol/L, pH 7,5 S. Patrn de Glucosa/Urea/Creatinina. Glucosa 100 mg/dL (5,55 mol/L), urea 50 mg/dL, Creatinina 2 mg/dL. Patrn primario acuoso.

CONSERVACIN Conservar a 2-8C. El Reactivo es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, siempre que se conserve bien cerrado y se evite la contaminacin durante su uso. Indicaciones de deterioro: Reactivo: Presencia de partculas, turbidez, absorbancia del blanco superior a 0,150 a 500nm (cubeta de 1 cm). Patrn: Presencia de partculas o turbidez. MUESTRAS Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estndar. El suero o plasma deben separarse de los elementos celulares lo antes posible para evitar la glucolisis. La adicin de fluoruro sdico a la muestra de sangre previene la glucolisis. La glucosa en suero o plasma es estable 5 das a 2-8C. Los anticoagulantes como la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro no interfieren.

MATERIAL Bao mara. Espectrofotmetro. Pipetas automtica 10 100 L. Pipetas automticas 100 1000 L. Puntillas amarillas y azules. Cubetas para espectrofotmetro. Tubos de ensayo. Cronometro.

PROCEDIMIENTO 1. Atemperar el Reactivo a temperatura ambiente. 2. Pipetear en tubos de ensayo (Nota 1):

Blanco. Patrn. Muestra. Patrn (S) 10 L. Muestra 10 L. Reactivo (A) 1 mL. 1 mL. 1 mL. 3. Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente (16-25C) o durante 5 minutos a 37C.

4. Leer la absorbancia (A) del Patrn y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El color es estable durante al menos 2 horas.

CLCULOS La concentracin de glucosa en la muestra se calcula a partir de la siguiente frmula general:

A Muestra A Patrn

x C Patrn = C Muestra

Si se utiliza para calibrar el Patrn de Glucosa suministrado

A Muestra A Patrn

X 100 = mg/dL. Glucosa. X 5.55 = mmol/L. Glucosa.

VALORES DE REFERENCIA Suero y plasma:

Neonato, prematuro Neonato, a termino Nios, adultos.

25-80 mg/dL. = 1.39-4.44 mmol/L. 30-90 mg/dL. = 1.67-5.00 mmol/L. 70-105 mg/dL. = 3.89-5.83 mmol/L.

Estos valores se dan nicamente a ttulo orientativo; es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios intervalos de referencia. Segn el National Diabetes Data Group (US), valores de glucosa plasmtica en ayunas superiores a 140 mg/dL (7,77 mmol/L) obtenidos en ms de una ocasin, permiten el diagnstico de diabetes mellitus.

CONTROL DE CALIDAD Se recomienda el uso de los Sueros Control Bioqumica niveles I (cd. 18005, 18009 y 18042) y II (cd. 18007, 18010 y 18043), para verificar la funcionalidad del procedimiento de medida. Cada laboratorio debe establecer su propio programa de Control de Calidad interno, as como procedimientos de correccin en el caso de que los controles no cumplan con las tolerancias aceptables.

CARACTERSTICAS METROLGICAS Lmite de deteccin: 0,23 mg/dL = 0,0126 mmol/L. Lmite de linealidad: 500 mg/dL = 27,5 mmol/L. Cuando se obtengan valores superiores, diluir la muestra 1/4 con agua destilada y repetir la medicin. Repetibilidad (intraserie):

Concentracin media. 88 mg/dL. =4.84mmol/L. 326 mg/dL. =17.93mmol/L. Reproducibilidad (interserie):

CV 1.2% 0.9%

n 20 20

Concentracin media. 88 mg/dL. =4.84mmol/L. 326 mg/dL. =17.93mmol/L

CV 2.7% 1.9%

n 25 25

Sensibilidad: 4 mAdL/mg = 0,22 mAL/mmol Veracidad: Los resultados obtenidos con estos reactivos no muestran diferencias sistemticas significativas al ser comparados con reactivos de referencia (Nota 2). Los detalles del estudio comparativo estn disponibles bajo solicitud. Interferencias: la hemoglobina (> 3 g/L), la lipemia (triglicridos >1,25 g/L) y la bilirrubina (10 mg/dL) interfieren. Otros medicamentos y sustancias pueden interferir4. Estos datos han sido obtenidos utilizando un analizador. Los resultados pueden variar al cambiar de instrumento o realizar el procedimiento manualmente.

CARACTERSTICAS DIAGNSTICAS La glucosa es la principal fuente de energa del organismo. La insulina, producida en las clulas de los islotes del pncreas, facilita la entrada de glucosa en las clulas de los tejidos. Una deficiencia de insulina o una disminucin de su actividad ocasionan un aumento de la glucosa en sangre. Se encuentran concentraciones elevadas de glucosa en suero o plasma en pacientes con diabetes mellitus (dependiente de insulina o no dependiente de insulina) y con otras condiciones o sndromes. La hipoglucemia puede darse como respuesta al ayuno, o bien puede ser debida a frmacos, venenos, errores congnitos del metabolismo o gastrectoma previa. El diagnstico clnico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un nico ensayo, sino que debe integrar los datos clnicos y de laboratorio. NOTAS 1. Estos reactivos pueden utilizarse en la mayora de analizadores automticos. Solicite informacin a su distribuidor. 2. La calibracin con el patrn acuoso suministrado puede causar sesgos, especialmente en algunos analizadores. En estos casos, se recomienda calibrar usando un patrn de base srica (Calibrador Bioqumica, cd. 18011 y 18044).

UREA /BUN COLOR

Fundamento del mtodo: La urea presente en la muestra origina, segn las reacciones descritas a continuacin un indofenol coloreado que se cuantifica espectrofotomtricamente. Urea + H20 ureasa 2NH4 + CO2 NH4 + Salicilato + NaCIO nitropusiato Indofenol Composicin: A1. Reactivo: Salicilato sdico 62mmol/L, nitropusiato sdico 3.4mmol/L, tampn fosfatos 20 mmol/L, pH6.9. A2. Reactivo: ureasa > 500U/mL. A. Reactivo: hipoclorito sdico 7mmol/L, hidrxido sdico 150mmol/L. Irritante (Xi): R36/38: irrita los ojos y la piel, S26: En caso de contacto con los ojos, lvense inmediata y abundantemente con agua y acdase a un mdico, S37/39: sese guantes adecuados y proteccin para los ojos /la cara. s. patrn de Glucosa/Urea/Creatinina: Glucosa 100mg/dL, urea 50mg/dL (8.3mmol/L, BUN 23.3 mg/dL), creatinina 2mg/dL. Patrn primario acuoso. Conservacin: Conservar 2-8C, Los reactivos y el patrn son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, siempre que se conserven bien cerrados y se evite la contaminacin durante su uso. Indicaciones de deterioro: Reactivos: presencia de partculas, turbidez absorbancia del blanco superior a 0.250 a 600nm (cubeta de 1cm). Patrn: presencia de partculas y turbidez.

Preparacin de los reactivos: Reactivo (B) y patrn (S): estn listos para su uso. Reactivo (A): Vaciar el contenido de un vial de reactivo A2 en un frasco de reactivo A1 (nota 1) homogenizar. Si se desea preparar otros volmenes, mezclar en la proporcin: 1mL de reactivo A2 + 24mL reactivo A1. Estable dos meses de 2-8C (nota 2). Equipo adicional: Bao de agua a 37C. Analizador, espectrofotmetro o fotmetro para lecturas a 600 20nm. Muestras: Suero u plasma recogidos mediante procedimientos estndar. Diluir la orina 1/50 con agua destilada antes del ensayo. La urea en suero o plasma es estable 7 das de 2-8C. Se recomienda la heparina como anticoagulante. A urea en orina es estable 3 das a temperatura ambiente si no se produce crecimiento bacteriano. Procedimiento: 1. Atemperar los reactivos a temperatura ambiente. 2. Pipetear en tubos de ensayo: Blanco Patrn Patrn de urea (S) _ 10L Muestra _ _ Reactivo (A) 1.0mL 1.0mL

Muestra _ 10L 1.0mL

3. Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente (16-25C) o durante 5 minutos a 37C. 4. Pipetear:

5. Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente (16-25C) o durante 5 minutos a 37C.

6. Leer la absorbancia (A) del patrn y de la muestra a 600nm frente al blanco. El color es estable durante al menos de 2 horas.

Clculos: La concentracin de urea en la muestra se calcula a partir de la siguiente formula general: Si se utiliza para calibrar el Patrn de Urea suministrado (Nota 3): Suero o plasma orina x 50 = mg/dL urea x 2500 = mg/dL urea x 23.3 =mg/dL BUN x 1165 =mg/dL BUN x 8.3 = mmol/L urea x 415 = mmol/L acido rico Valores de referencia: Suero y plasma: 15-39mg/dL urea = 7-18mg/dL BUN = 2.5-6.5mmol/L urea. En el periodo neonatal las concentraciones son inferiores mientras que en personas mayores de 60 aos se encuentran valores superiores en hombre que mujeres. Orina: 26-43g/24h urea =12-20g/24h BUN = 428-714mmol/24h urea. Estos valores se dan nicamente a ttulo orientativo; es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios intervalos de referencia.

Control de calidad: Se recomienda el uso de los Sueros Control Bioqumica Niveles I (cod. 18005, 18009 y 18042) y II (cod. 18007, 18010 y 18043), para verificar la funcionalidad del procedimiento de medida. Cada laboratorio debe establecer su propio programa de Control de Calidad interno, as como procedimientos de correccin en el caso de los controles no cumplan con las tolerancias aceptables. Caractersticas diagnosticas:

La urea se sintetiza en el hgado como un producto en la desaminacin de los aminocidos. Su eliminacin en la orina representa la principal va de excrecin de nitrgeno. Se encuentran concentraciones elevadas de urea en plasma como consecuencia de una dieta hiperproteica, aumento del catabolismo proteico, despus de una hemorragia gastrointestinal, ligera deshidratacin, shock e insuficiencia cardiaca o tratamiento de glucocorticoides (uremia prerrenal). La uremia postrenal est causada por condiciones que obstruyen el flujo urinario: nefrolitiasis, tumor o hipertrofia prosttica. La utilidad de la urea como indicador de la funcin renal est limitada por la variabilidad de su concentracin plasmtica como consecuencia de factores no renales. El diagnostico clnico debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un nico ensayo, sino que debe integrar los datos clnicos y de laboratorio. Notas: 1. Es conveniente lavar bien el vial de reactivo (A2) con una pequea cantidad de la mezcla preparada, con el fin de arrastrar los restos que mojan las paredes del frasco. 2. El reactivo A liquido es muy sensible a la temperatura, por lo que se recomienda consrvalo estrictamente a 2-8C. La estabilidad indica que se reduce si se mantiene durante periodos prolongados a temperatura ambiente. 3. La calibracin con el patrn acuoso suministrado puede causar sesgos, especialmente en algunos analizadores. En estos casos, se recomienda calibrar usando un patrn de base srica (Calibrador Bioqumica, cod. 18011 y 18044).

CREATININA

FUNDAMENTO DEL METODO La creatinina presente en la muestra reacciona con el picrato en el medio ralcalino originando un complejo coloreado. Se mide la velocidad de formacin de dicho complejo en periodos iniciales cortos, evitndose as la interferencia de otros compuestos. PREPARACION DEL REACTIVO Patrn (S): esta listo para su uso Reactivo de trabajo: mezclar volmenes iguales de reactivo A y de reactivo B. homogenizar. Estable un mes a 2 8 C. MUESTRAS Suero, plasma y orina, recogidos por los mtodos estndar. Diluir la orina fresca 1/50 con agua destilada antes de medir. Los anticoagulantes como la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro no interfieren. La creatinina en las muestras es estable 24 hrs a 2 8C PROCEDIMIENTO Precalentar el reactivo de trabajo e instrumento a 37C Pipetear en una cubeta Reactivo de trabajo Patrn (S) o muestra 1.0ml o.1ml

Mezclar e insertar la cubeta en el fotmetro. Poner el cronometro en marcha.

Leer la absorvancia a 500nm despus de 30 seg. (A1) y de 90 seg (A2).

CALCULOS La concentracin de creatinina en la muestra se calcula a partir de la siguiente formula:

(A2 A1) muestra muestra (A2 A1) patrn

X C patrn X Factor de dilucin muestra = C

Si se utiliza para calibrar el patrn de cratinina suministrado (A2 A1) muestra (A2 A1) patrn Suero y plasma X 2=mg/dl X 177= mmol/L Orina X 100= mg/dl X 8840=mmol/L

VALORES DE REFERENCIA

Suero y plasma Hombres : 0.9 1.3 mg/dl Mujeres: 0.6 1.1 mg/dl ORINA Hombres : 14 26 mg/kg/24 -h Mujeres: 11 20 mg/kg/24 - h

ACIDO URICO.

Fundamento del mtodo: El acido rico presente en la muestra origina, segn las reacciones acopladas descritas a continuacin, un complejo coloreado que se cuantifica por espectrofotometria. Acido rico + O2 + 2H2O uricasa Alatoina + CO2 + H2O2 2H2O2 + 4 Aminoantipirina + DCFS peroxidasa Quinoaimina

Composicin: B. Reactivo: fosfatos 100mmol/L, detergente 1,5g/L, diclorofenolsulfonato 4mmol/L, uricasa >0,12 U/mL, ascorbato oxidasa >5 U/mL, peroxidasa > 1 U/mL, 4Aminoantipirina 0,5mmol/L, pH 7,8. S. patrn de Acido rico: Acido rico 6 mg/dL (357 mol/L). Patrn primario acuoso. Conservacin: Conservar a 2-8C. El reactivo y el patrn son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, siempre que se conserven bien cerrados y se evite la contaminacin durante su uso. Indicaciones de deterioro: Reactivo: Presenta partculas, turbidez, absorbancia del blanco superior a 0,200 a 520nm (cubeta de 1 cm). Patrn: Presencia de partculas o turbidez. Preparacin de los reactivos: Tanto el reactivo como el Patrn estn listos para su uso. Equipo adicional:

 Bao de agua a 37C. Analizador, espectrofotmetro o fotmetro para lecturas a 520 20nm. Muestras: Suero, plasma u orina recogidos mediante procedimientos estndar. Diluir la orina 1/10 con agua destilada antes del ensayo. El acido rico en suero plasma es estable 7 das a 2-8C. Los anticoagulantes como la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro no interfieren. El acido rico en orina es estable 4 das a temperatura ambiente si se ajusta el pH >8 con NaOH. No refrigerar. Procedimiento: 1. Atemperar el Reactivo a temperatura ambiente. 2. Pipetear en tubos de ensayo: (Nota 1) Blanco Patrn Agua Destilada _ 25L Patrn Acido rico _ 25L (S) _ _ Muestra 1,0mL 1,0mL Reactivo (A)

Muestra _ _ 25L 1,0mL

3. Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente (16-25C) o durante 5 minutos a 37C.

Leer la absorbancia (A) del Patrn y de la muestra a 520nm frente al blanco. El color es estable durante 30 minutos.

Clculos:

La concentracin de acid rico en la muestra se calcula a partir de la siguiente formula general:

Si se utiliza para calibrar el Patrn de Acido rico suministrado (Nota 2). Suero o plasma orina x 6 = mg/dL acido x 60 = mg/dL acido rico rico x 357 = mol/L acido x 3570 = mol/L acido rico rico Valores de referencia: Suero y plasma: Hombre: 3.5-7.2mg/dL = 210-420mol/L Mujeres: 2.6-6.0mg/dL = 150-350mol/L Orina: 250-750mg/24 horas = 1.5-4.5mmol/24 horas Estos valores se dan nicamente a ttulo orientativo; es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios intervalos de referencia. Control de calidad: Se recomienda el uso de los Sueros Control Bioqumica niveles l (cod. 18005, 18009 y 18042) y ll (cod. 18007, 18010 y 18043), para verificar la funcionalidad del procedimiento de medida. Cada laboratorio debe establecer su propio programa de Control de Calidad interno, as como procedimientos de correccin en el caso de que lo controles no cumplan con las tolerancias aceptables. Caractersticas diagnosticas: En el hombre el acido rico, es el principal producto de catabolismo de las bases puricas, las cuales se obtienen en la parte de la dieta y en la parte de la sntesis in vivo. Concentraciones elevadas de acido rico en suero u orina pueden ser atribuibles a una sobre produccin de urato (sntesis incrementada de purinas) o una eliminacin defectuosa de urato. La hiperuricemia se asocia generalmente con la gota, disminucin de la funcin renal, deshidratacin, alteraciones mieloproliferativas y otras condiciones en las que no se conoce bien la causa.

El diagnostico clnico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un nico ensayo, sino que debe integrar los datos clnicos y de laboratorio. Notas: 1. Estos reactivos pueden utilizarse en la mayora de analizadores automticos. Solicite informacin a su distribuidor. 2. La calibracin con el patrn acuoso suministrado pude causar sesgos, especialmente en algunos analizadores. En estos casos, se recomienda calibrar usando un patrn de base srica (Calibrador Bioqumica cod. 18011 y 18044).

COLESTEROL

FUNDAMENTO DEL METODO. Tanto el colesterol libre como el esterificado presente en la muestra originan, segn las reacciones acopladas descritas a continuacin, un complejo coloreado que se cuantifica por espectrofotometra. Conservacin: Conservar a 2-8C. El Reactivo y el Patrn son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, siempre que se conserven bien cerrados y se evite la contaminacin durante su uso. Indicaciones de deterioro: Reactivo: Presencia de partculas, turbidez, absorbencia del blanco superior a 0,200 a 500 nm. Patrn: Presencia de partculas o turbidez. PREPARACION DE LOS REACTIVOS. Tanto el Reactivo como el Patrn estn listos para su uso.

EQUIPO ADICIONAL.

Bao de agua a 37C. Analizador, espectrofotmetro o fotmetro para lecturas a 500 20 nm. MUESTRAS. Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estndar. El colesterol en suero o plasma es estable 7 das a 2-8C. Pueden utilizarse como anticoagulantes la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro. PROCEDIMIENTO. 1. Atemperar el Reactivo a temperatura ambiente. 2. Pipetear en tubos de ensayo: (Nota 1).

BLANCO Patrn Colesterol(S) Muestra Reactivo (A) ___ ___ 1,0 ml

PATRN 10 l ___ 1,0 ml

MUESTRA ___ 10 l 1,0 ml

3. Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente (16-25C) o durante 5 minutos a 37C. 4. Leer la absorbancia (A) del Patrn y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El color es estable durante al menos 2 horas.

CALCULOS. La concentracin de colesterol en la muestra se calcula a partir de la siguiente frmula general:

Si se utiliza para calibrar el Patrn de Colesterol suministrado (Nota 2).

X 200 = mg/dl colesterol X 5,18 = mmol/l colesterol.

VALORES DE REFERENCIA. Los siguientes valores discriminantes universales han sido establecidos por la US National Cholesterol Education

Program y tambin aceptados en otros pases para la evaluacin del riesgo de enfermedad de las arterias coronarias.

Hasta 200 mg/dl = 5,2 mmol/l Optimo 200-239 mg/dl = 5,2-6,21 mmol/l Moderado >240 mg/dl = >6,24 mmol/l Elevado CARACTERISTICAS DIAGNOSTICAS. El colesterol es un esteroide de alto peso molecular que contiene una estructura ciclopentanofenantreno. El colesterol se transporta en el plasma en las lipoprotenas, Se excreta a la bilis como tal o tras su transformacin en cidos biliares. Las concentraciones elevadas de colesterol se asocian con un riesgo progresivamente creciente de ateroesclerosis y enfermedad de las arterias coronarias. El diagnostico clnico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un nico ensayo, sino que debe integrar los datos clnicos y de laboratorio. NOTAS. 1. Este reactivo puede utilizarse en la mayora de analizadores automticos. 2. La calibracin con el Patrn acuoso suministrado puede causar sesgos, especialmente en algunos analizadores. En estos casos, se recomienda calibrar usando un patrn de base srica.

TRIGLICERIDOS

FUNDAMENTO DEL METODO:

Los triglicridos presentes en la muestra original, segn las reacciones acopladas descritas a continuacin, un complejo coloreado que se cuantifica por espectrofotometra. Triglicridos + H2o---lipasa-------- Glicerol + cidos grasos Glicerol + ATP --------glicerol quinasa--- Glicerol -3-P + ADP Glicerol -3-P + O2 --G-3-P-oxidasa--- Dihidroxiacetona P + H2O2
2H2O2 + 4-Aminoantipirina + 4-Clorofenol----peroxidasa-- Quinoaimina + 4 H2O

COMPOSICION DEL REACTIVO:

A. Reactivo: Pipes 45 mmol/l, 4-clorofenol 6 mmol/l, cloruro magnsico 5 mmol/l, lipasa > 100U/ml, glicerol quinasa > 1,5 U/ml, glicerol-3-fosfato oxidasa >4 U/ml, peroxidasa > 0,8 U/ml, 4-aminoantipirina 0,7 mmol/l, ATP 0,9 mmol/l, pH 7,0. S. Patrn de triglicridos: Glicerol equivalente a trioleina 200 mg/dl (2,26 mmol/l). Patrn primario acuoso.

MUESTAS:
Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estndar. Los triglicridos en suero o plasma son estables 5 das a 2-8 C. Los anticoagulantes como la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro no interfieren.

MATERIAL:
Bao mara Espectrofotmetro Pipetas automtica 10 100 l Pipetas automticas 100 1000 l Puntillas Cubetas para espectrofotmetro Tubos de ensayo Cronometro.

PROCEDIMIENTO:

1.- Atemperar el reactivo a temperatura ambiente. 2.- Pipetear en tubos de ensayo: Blanco Patrn Muestra Patrn triglicridos (S) ---10 l ---Muestra ------10 l Reactivo (A) 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 3.- Agitar bien e incubar los tubos durante 15 minutos a temperatura ambiente (16-25C) o durante 5 minutos a 37C. 4.- Leer la absorbancia (A) del patrn y de la muestra a 500 nm frente al blanco. El color es estable durante al menos 2 horas.

CALCULOS: La concentracin de triglicridos en la muestra se calcula a partir de la siguiente formula general: A Muestra A Patrn x C Patrn = C Muestra
A Muestra X 200 = mg/dl triglicridos.

A Patrn

VALORES DE REFERENCIA: Los siguientes valores discriminantes universales han sido establecidos por el US National Institutes of Health y tambin aceptados en otros pases para la evaluacin del riesgo. Hasta 150 mg/dl = 1,7 mmol/l Bajo 150 199 mg/dl = 1,70 2,25 mmol/l Dudoso 200 499 mg/dl = 2,26 5,64 mmol/l Alto > 500 mg/dl = > 5,65 mmol/l Muy alto

FOSFATASA ALCALINA

FUNDAMENTO DEL METODO:

La fosfatasa alcalina (FAL) cataliza en medio alcalino la transferencia del grupo fosfato del 4-nitrofenilfosfato al 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP), liberando 4nitrofenol. La concentracin cataltica se determina a partir de la velocidad de formacin del 4-nitrofenol, medido a 405 nm.

4Nitrofenil fosfato + AMP ----FAL--- AMP fosfato + 4-Nitrofenol

COMPOSICION DEL REACTIVO:

A. Reactivo: 2-Amino-2-metil-1-propanol 0,4 mol/l, sulfato de zinc 1,2 mmol/l, acido Nhidroxietil-etilenodiaminotriacetico 2,5 mmol/l, acetato de magnesio 2,5 mmol/l, pH10,4 B. Reactivo: 4-Nitrofenifosfato 60 mmol/l.

PREPARACION DE LOS REACTIVOS: Reactivo de trabajo

Cod. 11592 y 11593: Vaciar el contenido del frasco B en el frasco A. Agitar suavemente. Si se desea preparar otros volmenes, mezclar en la proporcin: 4ml de reactivo A + 1ml de reactivo B. Estable 2 meses a 2-8C. Cod. 11598: Vaciar 25ml del frasco B en el frasco A. Agitar suavemente. Si se desea preparar otros volmenes, mezclar en la proporcin: 4ml de reactivo A + 1ml de reactivo B. Estable 2 meses a 2-8C.

MUESTRAS:
Suero o plasma regido mediante procedimientos estndar. La fosfatasa alcalina en suero o plasma es estable 7 das a 2-8C. Puede utilizarse heparina como anticoagulante.

MATERIAL:
Bao mara

Espectrofotmetro Pipetas automtica 10 100 l Pipetas automticas 100 1000 l Puntillas Cubetas para espectrofotmetro Tubos de ensayo Cronometro.

PROCEDIMIENTO: 1.- Precalentar el reactivo de trabajo y el instrumento a la temperatura de reaccin. 2.- Pipetear en una cubeta: Reactivo de trabajo 1,0 ml Muestra 20 l 3.- Mezclar e insertar la cubeta en el fotmetro. Poner el cronometro en marcha. 4.- Anotar la absorbancia inicial y efectuar nuevas lecturas cada minuto durante 3 minutos.

5.- Calcular el incremento de absorbancia por minuto promedio (A/min).

CALCULOS: La concentracin de FAL en la muestra se calcula a partir de la siguiente formula general:

A/min x Vt x 106 = U/L X I x VS

A/min

X 2764 = U/L X 46,08 = Kat/L

VALORES DE REFERENCIA
Temperatura de reaccin

Hombres
75 U/L = 1,25 Kat/L 87 U/L = 1,45 Kat/L 115 U/L = 1,92 Kat /L

Mujeres
68 U/L = 1,13 Kat /L 80 U/L = 1,33 Kat /L 105 U/L = 1,75 Kat /L

25C, hasta 30C, hasta2 37C, hasta2

FOSFATASA ACIDA TOTAL Y FRACCION PROSTATICA (CINETICA)

RESUMEN Y PRINCIPIO. Grandes elevaciones de Fosfatasa cida se encuentran en casos de cncer prosttico con metstasis. Ya que la fosfatasa tambin se produce en otros tejidos, la isoenzima prosttica se debe distinguir de la no prosttica para un diagnostico seguro. Los niveles elevados de la fosfatasa cida no-prosttica se han observado en pacientes con enfermedad de Paget, hiperparatiroidismo con complicaciones esquelticas y en cnceres en los cuales se encuentra invadido el hueso. PREPARACION DEL REACTIVO. Reactivo de Fosfatasa cida Total Reconstruir con el volumen de agua destilada que se indica en la etiqueta. Agitar levemente para disolver el contenido. Reactivo de L-tartrato Reconstruir con 5 ml de agua destilada o desionizada. Llevar el reactivo a temperatura ambiente para ayudar a su disolucin, si es necesario. MATERIAL REQUERIDO PERO NO INCLUIDO. Espectrofotmetro capaz de dar lecturas de absorbancia a 405 nm, Pipetas, Cronometro, Bloque de calor o bao a (37C) cubetas para espectrofotmetro de temperatura controlada, agua destilada desionizada, Tubos de prueba. RECOLECCION DE LA MUESTRA Y PREPARACION. Se recomienda como muestra sueros no hemolizados, claros, separados del coagulo antes de 2 horas despus de la toma. NO UTILICE PLASMA. Algunos anticoagulantes inhiben la actividad de la fosfatasa cida y/o causan turbidez.

ESTABILIDAD DE LA MUESTRA. La estabilidad de la fosfatasa cida es extremadamente lbil a temperatura ambiente. La estabilizacin de la enzima solo se puede obtener por acidificacin con el regulador de acetatos proporcionados en el equipo. ANALIZADOR AUTOMATICO. PARAMETROS Longitud de onda:405 nm Tipo de reaccin:Cintica Temperatura de reaccin:37C Direccin de reaccin:Increme nto Relacin muestra/reactivo:1: 10 Tiempo de equilibrio:30 seg Tiempo de lectura:120 seg Tiempo Lag:300 seg Limite blanco de absorbancia:0.40 0A Absorbancia alta:1.20 0A FactorFosfatasa cida total853 Fosfatasa cida no prosttica860

Valor normal bajo: 0.0 U/L Valor normal alto:9.0 U/L Linearidad: 60 U/L Absorbancia inicial:<0.40 0 PH:5. 31 Dichos parmetros deben ser empleados en la programacin de los analizadores automatizados para fosfatasa cida total y no prosttica. PROCEDIMIENTO MANUAL. A. FOSFATASA ACIDA TOTAL NOTA: Utilizar la muestra de suero, previamente estabilizada por el regulador de acetatos, tal y como se recomienda en la parte de Estabilidad de la muestra. 1. Para cada muestra, dispense 1 ml de reactivo reconstruido dentro de cada tubo de prueba y caliente a 37C. 2. Adicionar 0.1 ml (100 l) de suero dentro del respectivo tubo, agitar levemente. Incube por 5 minutos a 37C. 3. Lleve a cero el espectrofotmetro a 405 nm con agua destilada. 4. Despus de la incubacin, lea y registre los incrementos de absorbancia a intervalos de 60 segundos durante 5 minutos para determinar el A/min. Los valores tendrn que ser constantes. 5. Los valores en U/L se obtienen multiplicando el A/min por el factor 853. B. FOSFATASA ACIDA NO PROSTATICA. 1. Para cada muestra adicione 1.0 ml de reactivo reconstituido dentro de cada tubo de prueba y caliente a 37C. 2. Adicionar 0.01 (10 l) de reactivo de L-tartrato y mezcle. 3. Adicionar 0.1 ml (100 l) de suero en el respectivo y mezclar suavemente. Incube por 5 minutos a 37C. 4. Llevar a cero el espectrofotmetro a 405 nm con agua destilada.

5. Despus de la incubacin, lea y registre los incrementos de absorbancia a intervalos de 60 segundos durante 5 minutos para determinar el A/min. 6. Los valores en U/L se obtienen multiplicando el A/min por 860.

C. FOSFATASA ACIDA PROSTATICA. = Fosfatasa cida Total (A) Fosfatasa cida no prosttica (B) NOTA: Los volmenes de todos los reactivos se pueden duplicar si el instrumento requiere un volumen mayor a 1.0 ml. RESULTADOS. Una Unidad Internacional se define como la cantidad de enzima que cataliza la transformacin de un micromol se sustrato por minuto bajo las condiciones definidas.

A. FOSFATASA ACIDA TOTAL.

B. FOSFATASA ACIDA NO PROSTATICA.

VALORES ESPERADOS. Fosfatasa cida Total 0 9 U/L Fosfatasa cida Fraccin Prosttica 0 3 U/L

TGP/ALT

PRINCIPIO Y RESUMEN La enzima alanina aminotransferaza (ALT), es reportada en una gran variedad de tejidos. La mayor de ALT es de origen heptico y su determinacin de ALT se ha aplicado para el estudio de enfermedades hepticas. Niveles elevados se hallan en hepatitis, cirrosis e ictericia obstructiva. Los niveles de ALT estn solo ligeramente elevados en pacientes que han sufrido un infarto de miocardio. Los mtodos UV para la determinacin de ALT fueron primeramente desarrollados por Wroblewski y LaDue en 1956. El mtodo se basa en la oxidacin del NADH del lactato deshidrogenasa (LDH). En 1980 la federacin internacional de qumica clnica, recomend un procedimiento de Wroblewski y LaDue. Los reactivos de ALT se basan en una formulacin modificada por la IFCC y por los mtodos de Bergmeyer L-alanina +2-Oxo-glutarato Piruvato + NADH + H ALT LDH Piruvato + L Glutamato L-lactato + NAD + H2O

La alanina aminotransferaza (ALT), cataliza la transferencia del grupo amino de la alanina al 2- oxoglutarato para producir piruvato y glutarato. El piruvato formado es reducido a lactato en presencia de

LDH, con la oxidacin simultanea de la nicotinamida a 340nm es directamente proporcional a la actividad de ALT. REACTIVOS ALT BUFFER (R1) Cat. No. 2931 Composicin: L- alanina LDH musculo de conejo Tris buffer, pH 7.5 500 mmol/L 1200 U/L 100 mmol/L

ENZIMA ALT (R2), Cat No 2932 Composicion: 2- Oxoglutarato NADH (sal disodica ) 15 mmol/L 0.18 mmol/L

PREPARACION DEL REACTIVO El buffer y los reactivos enzimticos estn listos para su uso. Prepare reactivo de trabajo en porcin de 5 partes de buffer (R1) y 1 parte de enzima (R2) (por ejemplo 50 ml de buffer y 10 mL de enzima)

PROCEDIMEINTO MANUAL 1. Prepare reactivo de trabajo ALT de acuerdo a las instrucciones 2. Lleve a cero el espectrofotmetro a 340 nm con agua destilada 3. Por cada muestra y control, agregar 1.0 ml de reactivo del reactivo de trabajo a la cubeta o tubo de prueba y llevar a 37 C por 3 min. 4. Adicionar 100l de suero a cada tubo respectivamente y agitar levemente 5. Leer y anotar la absorvancia al 1 min. Continue incubando a 37 C, y anotar el cambio de absorvancia a los 2 y 3 min. El cambio debe ser constante

6. Determine el cambio de absorvancia por min y multiplicar por el factor 1746 para obtener los resultados en U/L

RESULTADOS Los valores se derivan en base al coeficiente de estencion de absorvancia micromolar de NADH a 340 nm. Unidad por litro (U/L) de actividad de GPT/ALT, es la cantidad de enzima que oxida un mol/L de NADH por min.

U/L= A/min Obsortividad

volumen total volumen de muestra

U/L= A/min 0.0063

1.10 0.10

U/L= A/min

1746

Valores de referencia: Rango normal 3 35 U/L (37 C)

. Bilirrubina Total y Directa Para la determinacin cuantitativa colorimtrica de bilirrubina directa y total en suero o plasma humano

Resumen y Principio La mayora de los procedimientos clnicos de rutina para la determinacin de bilirrubina srica, estn basados en la clsica reaccin Diazo de Ehrlich (1), la cual se aplic primero a la estimacin de estos pigmentos biliares en suero en 1913 por Van den Berg y Snapper.(2) Winkelman y colaboradores (3) proporcionaron una revisin excelente de muchas metodologas de bilirrubina. Cuando una solucin de cido sulfanlico en cido clorhdrico diluido es combinada con nitrito de sodio, se forma cido nitroso. Este cido inestable, el cual debe ser preparado en el momento del ensayo, reacciona para formar cido sulfanlico diazotizado. Este ltimo (tambin llamado p-bencendiazonio sulfonato) se acopla con la bilirrubina para producir azobilirrubina, la intensidad de color de este es proporcional a la concentracin de bilirrubina. Ya que los estndares de bilirrubina sufren una gran degradacin por su inestabilidad, el mtodo presentado utiliza una solucin acuosa de N-1-naftiletilendiamina dihidroclorhdrico como calibrador, de acuerdo con Bilissis y Speer (4). Esta amina aromtica estable pura se acopla con el cido sulfanlico diazotizado bajo las condiciones de prueba para dar un colorante azo con cualidades espectrales similares a la azobilirrubina. El calibrador proporcionado ha sido preparado para obtener, por la tcnica descrita, un color equivalente al nivel de bilirrubina a 540 nm.

Reactivos. Reactivo de Bilirrubina Total. Acido sulfanlico, 32 mmol/ L en cido clorhdrico diluido. Adicionado de un acelerador y estabilizador. Reactivo de Bilirrubina Directa. Acido sulfanlico, 32 mmol/ L en cido clorhdrico diluido. Adicionado de un estabilizador. Oxidante de Bilirrubina. Nitrito de sodio 20 mmol/L, acuoso. Adicionado de un estabilizador. Estndar de Bilirrubina (10 mg/dL). N-1-naftiletilendiamina diclorhdrico, 0.346 mmol/L. Adicionado de estabilizadores. Equivalente a 10 mg/dL de bilirrubina en el mtodo descrito. Precauciones: Para uso diagnstico in-vitro. Los reactivos son custicos: No pipetee con la boca.

Preparacin del Reactivo de Trabajo: Aada una gota (50 L) de Bilirrubina Oxidante a cada mL. de reactivo de Bilirrubina Total y Directa. Invierta suavemente de 3-4 veces. El calibrador est listo para su uso.

Estabilidad y almacenamiento del Reactivo. El reactivo de Bilirrubina Total y Bilirrubina Directa, el reactivo Oxidante y el estndar son estables cuando se almacenan a temperatura ambiente, hasta la fecha de caducidad indicada en su respectiva etiqueta. Descartar el Oxidante si presenta una coloracin amarillo obscuro. El reactivo de trabajo es estable por 7 das de 275-281 K (2-8C) o por 24 horas a temperatura ambiente.

Materiales requeridos pero no provistos. Espectrofotmetro capaz de leer absorbancias a 540 nm, pipetas automticas, cubetas, agitador, cronmetro.

Recoleccin y Preparacin de la muestra (3),(5). 1. Suero o Plasma colectado con cualquier anticoagulante comn, libre de hemlisis y tomado en ayunas para evitar muestras lipmicas. 2. Las muestras deben protegerse de la luz del sol as como de la luz blanca artificial, ya que la bilirrubina es altamente fotosensible. Se ha reportado que aproximadamente el 50% de la bilirrubina puede perderse cuando se expone a la luz solar por 1 hora. Estabilidad de la muestra. La bilirrubina es estable en suero o plasma de 4-7 das de 275-281 K (2-8C) y por 3 meses cuando se congela a 253 K (-20C).

Sustancias Interferentes. La hemlisis puede causar resultados elevados falsos de bilirrubina, debido a la inhibicin de la reaccin diazo por efecto de la oxihemoglobina3, 6. Yung et al7, ha reportado una extensa lista de drogas y otros agentes que interfieren con la metodologa diazo bilirrubina. Muestras turbias o lipmicas puede causar tambin elevaciones falsas de la bilirrubina, si esto ocurre deber manejarse un blanco de suero con cada prueba de paciente.

Parmetros de prueba Total. Longitud de onda Tipo de reaccin Direccin de la reaccin Temperatura de la reaccin Relacin de la muestra/reactivo Tiempo de Equilibrio Tiempo de lectura Tiempo lag Absorbancia lmite blanco Mxima absorbancia Calibradores Valor normal bajo Valor normal alto Linearidad pH Absorbancia inicial pH del Reactivo de Trabajo de Bilirrubina Total. pH del Reactivo de Trabajo de Bilirrubina Directa. pH Oxidante de Bilirrubina pH Calibrador de Bilirrubina Absorbancia Inicial del Reactivo de Trabajo de Bilirrubina Total. Absorbancia Inicial del Reactivo de Trabajo de Bilirrubina Directa. 540 nm Punto Final Incremento 310 K (37C) 1:20 3 seg 4 seg 210 seg 0.100 A 2.000 A 10 mg/dL 0.0 mg/dL 1.2 mg/dL 20 mg/dL 1.9 1.0 < 0.100 1.9 1.0 Directa. 540 nm Punto Final Incremento 310 K (37C) 1:10 3 seg 4 seg 180 seg 0.100 A 2.000 A 10 mg/dL 0.0 mg/dL 0.5 mg/dL 10.0 mg/dL 1.8 1.0 < 0.100 1.8 1.0 6.3 1.0 7.0 1.0 < 0.030 6.3 1.0 7.0 1.0 < 0.030

Los parmetros antes mencionados deben ser empleados en la programacin de los analizadores automatizados para Bilirrubina. Consulte su manual del usuario para programar las instrucciones.

Procedimiento manual (Bilirrubina Total). 1. Pipetear en cubetas o tubos de ensaye marcados como RB (Blanco de Reactivo), C (Calibrador), MB (blanco de muestra) y M (muestra) los volmenes (mL.), excepto el Oxidante, el cual es de una gota, mezclando bien despus de cada adicin.

MATERIAL. Bao mara Espectrofotmetro Pipetas automtica 10 100 l Pipetas automticas 100 1000 l Puntillas amarillas y azules. Cubetas para espectrofotmetro Tubos de ensayo Cronometro. RB 1 mL. 1 50 L. Total. C BM 1 mL. 1 mL. 1 50 L. 50 L. M 1 mL. 1 50 L.

Reactivo de Bilirrubina Total. Oxidante (Gotas) Agua. Calibrador. Muestra.

2. Permitir que las cubetas se incuben a temperatura ambiente por lo menos 3 minutos. 3. Ajuste a cero el espectrofotmetro a 540 nm con el reactivo.

4. Lea C y M-BM vs. RB a 540 nm en el transcurso de 30 minutos.

Procedimiento Manual (Bilirrubina Directa). 1. Pipetear en cubetas o tubos de ensaye marcados como RB (Blanco de Reactivo), C (Calibrador), MB (Blanco de muestra) y M (Muestra) los volmenes (mL.), excepto el Oxidante, el cual es 1 gota, mezclando bien despus de cada adicin.

Reactivo de Bilirrubina Directa. Oxidante (Gotas) Agua. Calibrador. Muestra.

RB 1 mL. 1 100 L.

Directa. C BM 1 mL. 1 mL. 1 100 L. 100 L.

M 1 mL. 1 100 L.

2. Permitir que las cubetas se incuben a temperatura ambiente por lo menos 3 minutos. 3. Ajuste a cero el espectrofotmetro a 540 nm con el reactivo. 4. Lea C y M-BM vs. RB a 540 nm en el transcurso de 30 minutos.

Notas: 1. El tiempo de 3 minutos para las muestras de Bilirrubina Directa despus de la adicin del suero es crtico, ya que las lecturas de absorbancias se incrementan lentamente debido a la presencia de la fraccin Indirecta. El tiempo del calibrador no es crtico, ya que la reaccin se completa en 3 minutos. 2. Para los recin nacidos, usualmente solo se requiere la Bilirrubina Total. Sin embargo, la presencia de la forma conjugada (directa) ocurre con suficiente frecuencia en los recin nacidos, por lo que la prueba de la bilirrubina directa puede ser utilizada. Control de Calidad Sueros control analizados por este mtodo se deben incluir en cada corrida de muestras de pacientes.

Resultados Los valores se derivan de los siguientes clculos: Bilirrubina directa o total mg/dL = AM-ABM X10 AC

Donde AM, ABM y AC son los valores de absorbancias de la muestra, blanco de muestra y calibrador respectivamente y 10 es la concentracin del calibrador.

Valores esperados (3),(5) Lmites (mg/dL) Bilirrubina Total. Bilirrubina Directa. Adultos 1.2 Recin nacidos 12.0 Adultos e infantes (mayores de 1 mes) 0.5

Caractersticas de Funcionamiento8 Precisin: En el estudio intra-ensayo, se analizaron muestras en 20 ocasiones y en el estudio inter-ensayo se analizaron las mismas muestras durante 10 das consecutivos. Los coeficientes de variacin intraensayo fueron de 3.3% (con un promedio de 0.49 mg/dL) y de 2.3% (con un promedio de 10.2 mg/dL) y los de inter-ensayo fueron de 3.5 % (con un promedio de 0.51 mg/dL) y de 2.4% (media = 10.2 mg/dL) para bilirrubina total. Para bilirrubina directa los coeficientes de variacin del intra-ensayo fueron los siguientes: 1.82% (media = 3.70 mg/dL) 2.76 % (media = 3.62 mg/dL). Correlacin: La determinacin de bilirrubina por el procedimiento descrito (y) y por la tcnica modificada de Jendrasski-Groff (x) en 25 muestras de suero mostraron un coeficiente de correlacin (r) de 0.9995 para la bilirrubina total y 0.9970 para la bilirrubina directa. La ecuacin de regresin para la bilirrubina total es y= 1.06 x - 0.100. Sensibilidad: Tanto el procedimiento de Bilirrubina Total como Directa mostraron una sensibilidad de 0.018 mg/dL por 0.001 unidades de absorbancia. Linearidad: Los procedimientos de la bilirrubina total y directa han sido establecidos de 20 mg/dL y 10 mg/dL, respectivamente.

Referencias:

1. Ehrlich P. Charite Ann 8:140, 1883 2. Van den Bergh AAH, Snaper J. Deut Arch Kiln Med. 110:540, 1913. 3. Winkelman JW et al. In clinical Chemistry Chemistry-Principles and Techniques. RJ Henry et al., Eds. Harper & Row, Hagerstown, MD. 1974, pp.1042-1061. 4. BilissisPK, Speer RJ. Clin Chem 9:552, 1963. 5. Routh JI. In Fundamentals of Clinical Chemistry. Nw Tietz, Ed Saunders, Philadelphia, 1976, pp. 1035-1043. 6. Shull DC. Clin. Chem 26:22, 1980. 7. Young DS et al. Clin Chem 21:22, 1980. 8. Stanbio Laboratory data. 9. Jendrassik L., Groff, P. Biochem Z 297-81, 1938.