INTRODUCCIN

Las clulas son organismos microscpicos, semitransparentes, que presentan diversos organelas como: pared celular, flagelos, membrana celular, cpsulas, etc. Los cuales son ms pequeos que los mismos, es por eso que se necesitan hace coloraciones especiales para poder observar dichos organelas y poder distinguirlos de otros. Dichas coloraciones tien a los organelas debido a que los colorantes son compuestos orgnicos que tienen una afinidad especfica con los ltimos. El siguiente informe muestra nuestros resultados obtenidos en el trabajo de laboratorio por los diversos procedimientos de tincin, se pudieron observar las esporas del bacillus aureus con el mto de Ertz conklin, a los leuconostoc por el mtodo de tincin negativa, los diversos microorganismos presentes en la saliva humana, la membrana celular del Bacillus subtilis por el mtodo de Kanaysi, y el ncleo bacteriano y de levaduras. Cada muestra al ser observada por el microscopio mostr diversos resultados debido al trabajo relacionado con los diferentes mtodos de tincin.

MARCO TERICO

COLORACIN DE ESPORAS: MTODO DE WIRTZ-CONKLIN: Los microorganismos que las forman deben encontrarse en condiciones adversas. Se evidencian en la etapa de vida latente. Caracterizan a los gneros
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Bacillus y Clostridium y su localizacin y forma ayudan en cierto modo a la

identificacin presuntiva especfica. Por la naturaleza y grosor de la membrana y bajo contenido en agua, las esporas son muy difciles de teir; se hace actuar el tinte en caliente en idntico procedimiento al efectuado para 2CIDO-RESISTENTES. La coloracin de contraste para el cuerpo bacteriano se consigue con Safranina. Si el cultivo es joven no hay esporas y los- microorganismos se teirn uniformemente. Es necesario que ste permanezca por 3-4 das a temperatura ambiente, despus de una incubacin ptima de 24 horas o sembrar el cultivo en un medio especfico de esporulacin. De esta manera el material resulta ideal para ensayos de cualquiera de las tcnicas especficas de tincin. Al finalizar el proceso de esporogenesis , la clula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante aos. Algunas de las bacterias productoras de 3endosporas son patgenas para el hombre, por lo que el estudio y observacin son de enorme inters. COLORACIN DE CPSULAS: MTODO DE 4TINCIN NEGATIVA:
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Bacilos: Clulas bacterianas en forma de bastn, compuesto por bacilos gram positivos con una capacidad para producir endosporas. FUENTE: http://www.monografias.com/trabajos/bacilosgram/bacilosgram.shtml 2 cidos resistentes: Procedimiento en ciertos microorganismos que no son teidos por una mezcla de alcohol y cido denominados acido alcohol resistente. FUENTE:MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA-Mara de los ngeles Equihuatl Ramos-Pag.29-34 Endosporas: Son elementos especficos de las bacterias que consisten en clulas deshidratadas con una supervivencia prolongada. FUENTE: Tortora-Fanke-Case MICROBIOLOGIA GENERAL9 ava edicin Buenos Aires Mexico Editorial Panamericana 2007. 4 Tincin negativa: Se llama Tincin negativa porque tie el fondo de la preparacin y no de los microorganismos. FUENTE:http://www.danival.org/600%20microbio/5000micro_dvf/micro_dvf_222b.html

De ordinario la cpsula se compone de material soluble en agua, as como de sustancias no inicas, generalmente polisacridos. Las tcnicas de tincin frecuentemente se basan en una interaccin qumica entre sustancias ionizadas. El mejor modo de visualizar cpsulas consiste en usar el microscopio de fase para observar los organismos en un medio que proporcione un fondo adecuado. En los laboratorios ms modestos, donde no se cuenta con equipo de contraste de fase, es posible duplicar los resultados preparando un montaje hmedo que contenga, junte con las bacterias encapsuladas, algunas partculas de carbn en suspensin. Si se reduce la intensidad lumnica con el iris del diafragma (o bajando el condensador) se puede obtener un efecto como de contraste de fase y as, las cpsulas se observarn como halos o anillos incoloros en derredor de los organismos. Algunas veces es posible emplear con xito tcnicas de tincin en las que el material de la cpsula se deshidrata primero con solucin salina concentrada; pero en los laboratorios estudiantiles esta tcnica rara vez produce resultados. Desde el punto de vista formal no es una tincin propiamente dicha, porque no fija a los microorganismos. Se parece ms a una preparacin de fresco, su realizacin es sencilla, consiste en colocar la muestra hmeda sobre el porta objetos y mesclar con5 tinta china, en los microorganismos se observa el fondo negro. En el microscopio se observa el fondo negro y los microorganismos con capsula sin color.

COLORACIN DE FLAGELOS: MTODO DE LEIFSON:

Tinta china: La capa de material extracelular que se deforma con facilidad, es incapaz de excluir partculas y no tiene un lmite definido, se denomina capa mucosa o glucoclix. FUENTE:MANUAL DE PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA- Maria de Lourdes Perez Cahbela-Pag,47-50 1era edicin 2004- Mxico

Para teir los 6flagelos se requiere mucha experiencia de laboratorio. La teora de procedimiento es bastante sencilla. El colorante se aplica junto con el 7cido tnico como mordiente, el cual se adhiere a la clula y a los flagelos en capas sucesivas hasta que la bacteria y los flagelos aumentan sus dimensiones. Esto es necesario debido a que los flagelos son demasiado delgados para ser percibidos con el microscopio ptico. Las clulas y los flagelos recubiertos por capas de mordiente nos dan una imagen algo aumentada y distorsionada. La ejecucin de la tincin de flagelos presenta muchos inconvenientes. Una de las cosas que hay que evitar es la presencia de materia orgnica, ajena a las clulas a teir, en la porta. El mordiente por cualquier tipo de, materia orgnica y, por eso cualquier rastro de desecho orgnico presente en el porta. Por lo tanto, antes de empezar debe asegurarse de que el portaobjetos este extremadamente limpio. De preferencia, los portas deben ser nuevos y nunca haber sido tocados con las manos excepto por los bordes. Otro problema con esta tincin es que los flagelos son tan delgados y frgiles que tienden a romperse con facilidad. Debido a esto, en cualquier preparacin donde se hayan teido flagelos se observarn gran cantidad de flagelos libres, despegados de las clulas y desparramados por todo el frotis. Sin embargo, su paciencia y atencin a los detalles lo recompensarn con una preparacin excelente.

COLORACIN DE CORPSCULOS METACROMTICOS: MTODO DE LOEFFLER:

Flagelos: Son estructuras de locomocin demasiado pequeas para ser vitascon microscopio ptico o sin tincin. FUENTE: Tortora-Fanke-Case MICROBIOLOGIA GENERAL9 ava edicin Buenos Aires Mexico Editorial Panamericana 2007. 7 cido tnico: se adhiere en capas sucesivas hasta que los flagelos aumenten su dimensin. FUENTE:http://www.geiic.com/index.php?option=com_fichast&Itemid=83&tasko=viewo&task=view2&id=13

Muchas bacterias acumulan en su protoplasma grandes reservas de fosfato insolubles en agua. Estos son los grnulos 8metacromticos o de velutina que aparecen como grnulos refrctiles, cuando se observan al microscopio sin teir. Con colorante de Azul de Toluidina u otros tintes azules, se tornan de color violceo o ligeramente rojo violceo; de ah el nombre de metacromtico. Los bacilos diftricos y difteroides, poseen numerosos grnulos de este material; los primeros son agentes causantes de la difteria y slo estn presentes en casos agudos. Los segundos, saprofticos, constituyen una material til para las experiencias de coloracin. Se pueden encontrar en muestras de saliva de humanos. Estos grnulos tienen una fuerte afinidad por colorantes bsicos como fucsina bsica o cristal violeta el azul de metileno o verde malaquita. Cuando se tien de azul de metileno los grnulos toman un color azul oscuro, mientras que si se tien con el colorante de Albert que contiene verde malaquita, se observa de un color caf verdoso oscuro.

DEMOSTRACIN DE PARED CELULAR BACTERIANA: MTODO DE ROBINOW: La pared celular bacteriana se puede tornar visible, a pesar de que sta no se distingue como entidad discreta en las coloraciones ordinarias. La tincin para la pared celular se aprovecha del hecho de que los contenidos citoplsmicos se pueden hidrolizar diferencialmente o fijar dejando la pared celular sin afectar. Despus de teir correctamente, se puede observar la pared celular con citoplasma como "ahuecado". Tambin es posible tornar visible la pared celular de una manera indirecta aprovechndose del hecho de que ciertos colorantes simples (por ejemplo, azul de metileno) no tien la pared celular mientras que otros (violetas cristales) tien tanto la pared celular como el citoplasma. Esta es la razn por la cual las mismas clulas se ven ms pequeas cuando se tien con azul de metileno que cuando se tien con violeta cristal. COLORACIN DE MEMBRANA CELULAR: MTODO DE KNAYS: La membrana citoplasmtica es de naturaleza lipoprotena y da una reaccin acida unindose intensamente con colorantes bsicos y neutros. No obstante esta propiedad, el doble contorno de la membrana se aprecia mejor cuando se
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Meta cromtico: Son ejemplos de inclusiones que constituyen acumulaciones de polifosfato y se conoce como grnulos de volutina. FUENTE:BACTERIOLOGIA GENERAL: PRINCIPIOS Y PRACTICAS- Evelyn Rodriguez Cavallini-Pag. 189

retrae el protoplasma o cuando se trata con algn solvente orgnico que pueda diluir las grasas y deje expuesto el contorno a la accin de los colorantes. TINCIN DE NCLEO BACTERIANO: MTODO DE ROBINOW: Una estructura abundante pero difcil de visualizar dada su complejidad, es el ncleo bacteriano, pues el RNA y el citoplasma se colorean tan intensamente que impiden la visualizacin del DNA. Esto se evita tratando los frotices con ribonucleasa o con cidos para destruir la afinidad del citoplasma por el colorante y aumentar la del ADN. TINCIN DE NCLEO EN LEVADURAS: Ciertos factores citoplsmicos (que normalmente interfieren con el teido del ncleo) deben hidrolizarse antes de aplicar la tincin nuclear (azul de toluidina). En el siguiente experimento tambin se tendr la oportunidad de estudiar la morfologa general de la9 levadura tpica .En el procedimiento se incorpora el
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azul de toluina.

Levadura: Son hongos que carecen de gemacin, en forma de agregados sueltos de clula independientes, que pueden ser globosas, cilndrica, alargadas. FUENTE:http://www.telefonica.net/web2/carlosmartinezanton/pdf/7.%20Hongos%20y%20levaduras.p df
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Azul de toluina: Colorante que tie estructuras basfilas, tales como la cromatina. FUENTE: http://www.e-histologia.unileon.es/1inicio/home/tecnicas.htm

DISCUSIN DISCUSIN 01 (Tincin de corpsculos metacromticos): (V. R. Randazzo, S. R. Costamagna) El objetivo de la presente investigacin fue determinar si la coloracin con azul de metileno, de probada utilidad para demostrar la viabilidad de protoesclices de Echinococcus granulosus, puede evidenciar tambin la viabilidad de larvas libres de Trichinella spiralis. Para ello se utilizaron tres suspensiones de larvas de T. spiralis (M1, M2 y M3), las que fueron expuestas a diferentes condiciones y observadas a distintos tiempos: M1 se expuso a -30 C y se observ a los 70 das; M2 a 80 C durante 5 minutos y se observ inmediatamente, y M3 se mantuvo a 4 C durante todo el experimento, como testigo del 100% de vitalidad. Cada suspensin contena 500 estadios larvarios libres. Se emplearon 100 l de solucin de azul de metileno 1:10 000 en agua destilada, agregados a igual volumen de suspensin de larvas, y las muestras fueron observadas al microscopio ptico para evaluar la motilidad. Los resultados evidenciaron que cuando las larvas de T. spiralis estaban muertas (M1 y M2), el 100% se coloreaban totalmente de azul en su interior, y las estructuras internas, en relacin con la capa quitinosa, aparecan retradas y algunas fragmentadas. En la suspensin testigo M3 las larvas no se coloreaban, y como prueba adicional de viabilidad se pudo observar su tpico movimiento en espiral en el 100% de ellas. En el resumen de las estudiantes de la Universidad del sur San Juan (Argentina), las seoritas estudiantes

mencionan que las larvas de Trichinella spiralis no se colorean siempre y cuando estn vivas, pero si estas estn muertas la coloracin se dar. Esto nos pone un poco a reflexionar ya que pensbamos que las bacterias se coloreaban sin importar su movilidad y mucho menos sin distinguir entre las diferentes especies. En nuestro trabajo de laboratorio, en el mtodo de coloracin por Loeffler para corpsculos metacromticos, la muestra siempre se sellaba con ayuda del fuego lo que, suponemos, mataba a los microorganismos facilitando su tincin con el azul de metileno.

DISCUSIN 02: Utilidad de tcnicas histolgicas para el diagnstico de infeccin en piezas anatmicas Hospital Militar Central "Dr. Luis Daz Soto" Se realiz un estudio para la introduccin y el montaje de tcnicas histolgicas de coloraciones especiales ms empleadas en los centros especializados, con el objetivo de identificar los distintos tipos de grmenes nosocomiales a nivel celular en muestras de biopsias, citologa y necropsias. Estas tcnicas histolgicas especiales como son verde metilo pironina, Gleen, Gram, plata metenamina, entre otras, adems de realizar modificaciones de algunas de las tcnicas histolgicas especiales que permiten mejor su identificacin. Los resultados del montaje de estas tcnicas posibilitan un diagnstico histolgico especfico del germen causal de la sepsis, lo que permite una rpida aplicacin de conductas preventivas y teraputicas al paciente. En la actualidad la biologa molecular logra identificar cepas de virus, bacterias y parsitos que han revolucionado estudios en hospitales y en el medio ambiente. Los estudios histolgicos con tcnicas histolgicas convencionales y especiales le brindan una informacin bsica al clnico acerca de la naturaleza del proceso infeccioso, etc., lo que permitira su aplicacin y contribucin a elevar la calidad diagnstica en casos de infiltrado inflamatorio agudo, inflamacin aguda, etc. e informar el agente causal de infeccin, por la morfologa, forma de agrupacin y caractersticas clnicas e histologa.

MTODOS Se realiz un montaje de tcnicas histolgicas ms usadas para el diagnstico de grmenes causales de infeccin: tcnica histolgica convencional de hematoxilina/eosina, de origen vegetal, extrada del palo azul de campeche, el azul de azafrn, el ndigo y la orsena. Esta tcnica vino a sustituir al azul de

metileno, siendo un colorante bsico nuclear que colorea al ncleo de azul, y la eosina es un colorante cido que colorea al citoplasma de rojo a rosado. CUADRO 1. Tcnicas histolgicas segn grupo de agentes infecciosos y forma de identificacin Tincin identificacin de

Tcnica histolgica Agente infeccioso Bacterias Brown Brenn grampositivas Bacterias gramnegativas Verde metilo Pironina Glenn PAS Zielh Nielsen Bacterias gramnegativas Grampositivas Gramnegativas Hongos Bacilos Parsitos Algunos hongos Gridley's Mucicarmin Giemsa Levaditis Hongos Hongos Parsitos Espiroquetas

Azul Rojo

Rojo Violeta Rojo Rosado Rojo

Variable Rojo Violeta Negro Carmelita Violeta Variable

Hematoxilina/eosina Hongos Bacterias Parsitos

Inclusiones virales Variable Plata metenamina Waysson Hongos Espiroquetas Negro Azul

Warthin Starry

Espiroquetas

Negro

CUADRO 2. Identificacin de grmenes segn tipo de agente causal y tcnica histolgica empleada Germen Bacterias Cocos grampositivos Streptococcus N. Staphylococcus Neumococo Enterococo Cocos gramnegativos Meningococo Gonococo Bacilos grampositivos Clostridium Actinomyces Bacilos gramnegativos Klepsiella Haemophilus E. coli Piocianico(Pseudomona) Proteus Enterobacter Salmonella X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X Coloraciones H/E Glenn Plata Brown Brenn Gram Pironina PAS Otras

Espirilos

Levaditi

La validacin de estas tcnicas para el diagnstico histolgico de germen causal de infeccin utiliz muestras de tejidos humanos sugestivos de infeccin en rganos como pulmn, hgado, cerebro, vescula biliar, cordn umbilical, piel y otros, obtenidos mediante biopsias y necropsias realizadas en el Departamento de Anatoma Patolgica del Instituto Superior de Medicina Militar "Dr. Luis Daz Soto". RESULTADOS: En las muestras estudiadas sugestivas de infeccin por hematoxilina/eosina se observ la presencia de infiltrado inflamatorio agudo, con presencia de necrosis, exudado purulento, presencia de grmenes en la luz de algunos vasos. Estos rganos fueron pulmn, cerebro, rin, cordn umbilical, vescula biliar, etctera. Se observaron lesiones ampolladas y costrosas en la piel y se procedi a realizar estudio citolgico de estas, en las que se encontraron inclusiones virales. Se realiz puncin bipsica a lesiones tumorales que por las caractersticas del material aspirado se sospech de origen infeccioso y se determin la presencia de bacterias gramnegativas. En ellas se realiz coloraciones especiales y se agruparon, mostrando los rganos con la coloracin. CUADRO 3. Relacin de rganos muestreados con las tcnicas empleadas. RGANOS Pulmn Cerebro Hgado Rin Cordn umbilical Vescula biliar Mama TCNICAS EMPLEADAS Gram, Gleen, Plata, Brown Breen Gram, Gleen y Plata Plata y Gram H/E, PAS y Plata Gram y Gleen Gram y Gleen Gram y Gleen

Piel

H/E y PAS

Cuadro 5. Relacin del diagnstico morfolgico con cultivo positivo DIAGNSTICO MORFOLGICO Cocos grampositivos

CULTIVO POSITIVO Staphilococus epidermitidis Neumococo positivo) Enterococus Estreptococo betahemoltico (ltex

Cocos grampositivos Cocos grampositivos Cocos grampositivos

La hematoxilina/eosina, tcnica histolgica convencional, vino a sustituir al azul de metileno considerado un colorante bsico nuclear que colorea al ncleo de azul, y la eosina, colorante cido que colorea al citoplasma de rojo a rosado. 2, 3 El Zielh Nielsen sirve para identificar bacilo de Koch. El Gram es la tcnica especial ms utilizada para detectar grmenes Gram positivos y Gram negativos adems de permitir diferenciarlos. El uso y difusin de esta tcnica ha sido recomendada por Len como mtodo rpido y fcil en la deteccin de bacteriemia relacionada con el catter en pacientes crticos. Las tcnicas de Giemsa modificada son eficaces para los grampositivos. 3

Al

comparar

nuestras

observaciones

aplicando

coloraciones especiales (azul de metileno, safranina, lugol, tinta china, etc.) las cuales nos permitieron

observar la diferentes estructuras microbianas de los cultivos realizados previamente (24 horas), se puede notar que existen otras coloraciones histolgicas que permiten un mejor reconocimiento de la estructura, fisiologa, funcionamiento, etc. de una bacteria utilizando como

medio el cuerpo humano. Siendo la tcnica Gram las ms utilizada en los laboratorios (tincin diferencial). Los cuadros previos nos muestran que existen tcnicas especiales para la deteccin de infecciones y su

aplicacin correcta nos brinda mayores posibilidades de deteccin anticipada y su posible tratamiento.

DISCUSIN 03 (Tincin de esporas): Seguido de la explicacin por parte del auxiliar de laboratorio se procedi a colocar con la punta del asa bacteriolgica una gota de solucin salina, luego se esterilizo el asa en el mechero, se enfri y se tomo la muestra de un cultivo bacteriolgico utilizado con muestra y se realizo el frotis. La placa se flameo hasta que se evaporara toda el agua y se coloreo con verde de malaquita. Se flameo durante 5 minutos, adicionando colorante cada vez que se secaba la muestra. Se lavo con agua hasta retirar el exceso de colorante y se realizo la tincin con safranina durante un minuto. Posteriormente se lav con agua y se sec con papel absorbente. La muestra se rotul y observ al microscopio ptico con el objetivo de inmersin. Finalmente se esquematizaron y anotaron los resultados obtenidos. RESULTADOS: La bacteria es una estructura muy pequea, sin embargo, por medio de esta tincin pudimos observar la estructura interna de la clula bacteriana, particularmente las endosporas, en este experimento se utiliza una tincin simple debido a que la misma permite que se coloree toda la clula excepto la espora que se observa de un tamao bien aceptable. En el prrafo mencionado anteriormente se menciona que cada vez que se secaba el verde de malaquita con el flameado se le agregaba mas, este procedimiento no fue realizado por nosotros debido a que no estaba en la gua, pero cabe mencionar que al comparar nuestros resultados

por esta tincin fueron iguales ya que las endosporas quedaron coloreadas de color verde. El texto no menciona si se le agrega safranina para colorear el resto del cuerpo bacteriano, pero en nuestro caso la safranina agregada solo tio parcialmente el cuerpo (solo bordes) de las bacterias y sirvi para distinguirlo de las esporas. DISCUSIN 04 (Tincin negativa): Algunas bacterias presentan una capa externa a la pared denominada cpsula, la cual est compuesta de azcares y protenas. No es una estructura vital para la bacteria, de modo que es posible que bajo determinadas condiciones ambientales o del propio desarrollo genere cpsula y bajo otras no lo haga. Se ha comprobado que la presencia de cpsula dificulta de algn modo la fagocitosis de las bacterias, es decir las cpsulas constituyen un factor de virulencia de los microorganismos. La tincin de cpsula se denomina tincin negativa porque tie el fondo de la preparacin y no el microorganismo. Desde el punto de vista formal no es una tincin propiamente dicha, porque no fija los microorganismos. Su realizacin es sencillsima, porque consiste en colocar la muestra hmeda sobre la porta objetos y mezclarla con tinta china. La cual la tinta cubre toda la preparacin a excepcin de las cpsulas. En el microscopio se observa el fondo negro y los microorganismos con cpsula sin color.

CONCLUSIONES El azul de metileno colorea, en su mayora, a los

microorganismos muertos, esto se pudo rescatar del paper Coloracin de azul de metileno como alternativa para determinar viabilidad de larvas libres de Trichinella spiralis debido a que en ese documento indica que dicha larva solo es coloreada si est muerta. Conforme avance la ciencia y tecnologa nos brinda mtodos y tcnicas que contribuyen en el desarrollo de vacunas, anticuerpos, etc. que se pueden aplicar para disminuir la tasa de mortandad y mejorar la calidad de vida de las personas. Las caractersticas tintoriales nos ayudan a deducir el tipo de agente causal, es decir si es una bacteria Gram positivo (bicapa recubierta de peptidoglicanos) o Gram negativo (tiene 2 capas de fosfolpidos y una capa de proteoglicano en su pared celular); esto nos permite emitir un diagnostico de infeccin. Es importante introducir y aplicar estas tcnicas

histolgicas con una nueva visin de calidad diagnstica, lo que suple la falta de recursos de costosas tcnicas como es la reaccin en cadena a la polimerasa (PCR). Se debe sealar que existe limitacin en el diagnstico histolgico, pues si bien se puede conocer al agente causal, no es posible llegar a determinar la cepa ni la resistencia a los antibiticos, esto solo a travs del diagnstico microbiolgico. El verde de malaquita es un indicador de estructura trifenilmetano que se caracteriza por presentar tonalidades fuertes y brillantes a distintos pH.