Facultad de Ciencias Naturales y Exactas Universidad del Valle

ESTUDIO SISTEMTICO PARA LA DETERMINACIN DE AMINOCIDOS PLASMTICOS

Jaime Restrepo Ana Julia Colmenares Universidad del Valle Universidad del Valle Scrates Herrera Universidad del Valle

Recibido: abril 15, 2011 Aceptado: junio 29, 2011

Pg. 141-151

Resumen Se emple la Cromatografa Lquida de Alta Resolucin, en fase reversa, para la separacin de 17 feniltiocarbamil-derivados de aminocidos plasmticos en 20 minutos. Este mtodo utiliz una columna C18 Waters Pico Tag (300x3,9 mm, 3m) a una temperatura constante de 38 C y un gradiente multietapas simple de dos solventes. El solvente A fue una mezcla 0.150 M de acetato de sodio (pH 6.4)- acetonitrilo (96:6 v/v) y el solvente B fue agua-acetonitrilo (40:60, v/v). En la fase inicial, la programacin del gradiente, la temperatura de la columna, el flujo y la composicin de la fase mvil fueron optimizadas. Al final del estudio, se evalu la influencia de la liofilizacin, en lugar de la aplicacin de alto vaco, en el tratamiento previo de la muestra y de las soluciones estndar, lo cual condujo a una excelente resolucin de los 17 aminocidos. El mtodo fue validado por exactitud (90% de recuperacin), precisin (%RSD < 5%) y linealidad (r=0.996). Los lmites de deteccin y cuantificacin fueron 0.46 y 1.54 M para la cistena (Cys) y 1.42 y 4.57 M para la leucina (Leu), respectivamente. Esta tcnica resulta eficaz para evaluar el verdadero valor nutricional y composicin de aminocidos en materias primas, productos alimenticios procesados y su biodisponibilidad en humanos. Palabras claves: cromatografa lquida de alta resolucin, aminocidos plasmticos, feniltiocarbamil derivados, liofilizacin. Abstract A reversed-phase liquid chromatography (HPLC) method for the separation of 17 phenylthiocarbamyl derivatives of amino acids in human plasma in about 20 min is described. In this method, we used a C18, Waters Pico Tag column (300x3.9 mm, 3 m) thermostated at 38 C, and a simple multistep linear gradient of two solvents. Solvent A was 0.150 M sodium acetate (pH 6.40)-acetonitrile (96:6 v/v) and solvent B was water-acetontrile (40:60, v/v). In the initial phase of development, the composition of the gradient, its timings, column temperature, flow rate, and mobile phase compositions were optimized. At the end of the studio, the influence of the lyophilization instead of High-Vaccum in samples pre-tratment and the standard solutions were studied, and this approach led to an excellent resolution of the 17 aminoacids. The method was validated for accuracy (90% recovery), precision (% RSD < 5%) and linearity (r=0.996); detection and quantification limits were 0.46 and 1.54 M in cystein (Cys), 1.42, and 4.57 M in leucine Volumen 15, diciembre 2011 141

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(Leu), respectively. This technique is effective to evaluate the true nutritional value and composition of amino acids in raw material, food products processed and bioavailability in human being. Keywords: high-performance liquid chromatography, phenylthiocarbamyl derivatives, lyophilization. human plasma amino acids,

1 Introduccin Se ha encontrado que el uso de HPLC para la determinacin cuantitativa de aminocidos en fluidos biolgicos es ms rpido y mejor en los lmites de deteccin que la cromatografa clsica de intercambio inico [1, 2, 3, 4]. Desde hace algunos aos el procedimiento de anlisis de aminocidos basado en la prederivatizacin con fenil isotiocianato (PITC) ha ido ganando popularidad. Una revisin de la literatura existente indica que en los ltimos tiempos se han publicado un poco ms de 100 artculos que utilizaban esta tcnica [5, 6]. El complejo fenil tiocarbamil (PTC)-aminocido que se forma durante este proceso puede detectarse con alta sensibilidad a 254 nm. despus de haber hecho la separacin de los derivados por cromatografa en fase reversa. La formacin de los PTC derivados obtenidos de esta manera constituyen la etapa inicial de la degradacin de Edman [7] y se emplea para la determinacin de secuencia de amino cidos en pptidos y protenas. Sin embargo, a pesar de que esta tcnica fue estudiada desde hace tanto tiempo, su aplicacin en la determinacin cuantitativa de amino cidos libres fue hecha por [8] quienes cuantificaron el contenido de amino cidos libres en carboxipeptidasa y posteriormente los mismos autores estudiaron la metodologa para el anlisis de amino cidos en pptidos y protenas hidrolizados. Sarwar et al. [9], modificaron el mtodo de derivatizacin precolumna con fenilsotiocianato (PITC) obteniendo cromatogramas de HPLC de 17 amino cidos, excepto triptofano en forma precisa y rpida (12 min.) en hidrolizados de alimentos y heces. El mismo Sarwar en 1990 [10] dise un sistema de anlisis rpido para aminocidos libres de importancia nutricional en suero y rganos animales (hgado, cerebro y corazn). El propsito de la presente investigacin fue modificar el mtodo de Sarwar anteriormente descrito para permitir su aplicacin en el anlisis de aminocidos plasmticos libres ms importantes en la nutricin humana. Esta modificacin se realiz utilizando la misma columna (Pico-Tag-Waters de 30 cm.) pero variando la temperatura de la columna, cambiando el mtodo estndar de secado por el de liofizacin, y empleando diferentes condiciones de gradientes. El mtodo de derivatizacin con fenilisotiocianato y el secado de la muestra en un liofilizador reportado en esta investigacin puede ser usado como un mtodo alternativo para la evaluacin rpida de calidad protenica, tanto desde el punto de vista de disponibilidad como de biodisponibilidad, puesto que la metodologa existente actualmente segn Hernndez [11] es lenta y costosa.

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2 Materiales y mtodos 2.1 Reactivos y equipos (a) Reactivos. Los reactivos y solventes empleados en esta investigacin fueron grado analtico y cromatogrfico respectivamente. El acetonitrilo, metanol, etanol, cido actico glacial y cido fosfrico fueron adquiridos en J.T. Baker Chemical Co. El acetato de sodio (anhidro), el fosfato disdico y el acetato de sodio procedan de Mallinckrodt, Inc. La Trietilamina (TEA) de Aldrich Co., en tanto que el fenilisotiocianato (PITC) y el estndar H de 17 aminocidos se adquirieron en Pierce Co. El estndar de aminocidos contena por cada mL:1.25 moles de cistena (Cys) y 2,5 moles de arginina (Arg), histidina (His), isoleucina (Ileu), leucina (Leu), lisina (Lys), metionina (Met), fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr), treonina (Thr), valina (Val), alanina (Ala), cido asprtico (Asp), cido glutmico (Glu), glicina (Gly), prolina (Pro), serina (Ser) y amonaco, se adicion tambin estndar de triptfano (Trp) en concentracin de 2,5 moles/mL. (b) Equipos. En la preparacin de buffers y dems soluciones se utiliz agua de alta pureza generada por un sistema Milli-Q de Millipore Corp. La derivatizacin con fenilisotiocianato se llev a cabo utilizando tubos de 10x75mm. Las muestras de estndares y de plasma fueron liofilizadas en un liofilizador Labconco. El sistema LC de gradiente consista de 2 bombas Modelo 510 un automuestreador con loop de inyeccin de 1 a 250 microlitros, un mdulo control de temperaturas (TCM ) y un detector de UV Waters 486. Para la determinacin de todos los aminocidos se utiliz una columna C18, fase reversa Pico Tag Waters de 300 x 3,9 mm, I.D. 3 m. El sistema analtico y de clculos se control utilizando el software Milleniun 2010 de Waters. 2.2 Preparacin de las muestras Se utilizaron muestras de plasma humano las cuales fueron desproteinizadas adicionando 50 mg de cido sulfosaliclico (ASS) a 1,0 mL de plasma con posterior mezclado y centrifugacin a 3.000 r.p.m. durante 20 min con el propsito de separar los aminocidos libres de la protena precipitada. Posteriormente se tomaron 50 L del sobrenadante para someterlos al proceso de resecado y derivatizacin. 2.3 Secado y derivatizacin Las muestras de aminocidos plasmticos libres y del estndar H de aminocidos en volumen de 50 microlitros se liofilizaron a sequedad a -40 C durante 30 min, previa congelacin para evitar sublimacin completa. 2.4 Procedimiento Se prepararon estndares de aminocidos a una concentracin de 2.5 mol/mL, los cuales fueron sometidos al proceso de derivatizacin de acuerdo a las siguientes etapas: Etapa 1- Proceso de resecado: en primer lugar, se prepar la solucin de resecado compuesta de EtOH:H2O:TEA en una relacin 2:2:1 respectivamente. Una vez obtenida la solucin de resecado se adicionaron 10 L de la misma a 10 L de la solucin estndar, procediendo posteriormente a liofilizar durante 30 minutos hasta tener eliminacin del solvente a sequedad completa.
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Etapa 2- Preparacin del reactivo derivatizante: dicho reactivo se prepar mezclando EtOH:H20- Q:TEA:PITC en la proporcin 7:1:1:1, respectivamente. Etapa 3- Reaccin de derivatizacin: se adicionaron 20 L de reactivo derivatizante obtenido en la etapa 2 en cada muestra del estndar procesado en la etapa 1. Posteriormente, se liofiliz durante 30 minutos con el propsito de secar completamente el fenilisotiocianato que no reaccion. En esta etapa las muestras de estndar quedan perfectamente derivatizadas y listas para el proceso de cromatografa. El proceso de cromatografa se inicia con la adicin de 600 L de solucin diluente Picotag, la cual se prepar previamente. Despus de agitar vigorosamente en vortex, se transfiri a viales de 1 mL y se inyectaron 50 L de la muestra derivatizada. 2.5 Preparacin de las fases mviles y eluentes Eluente A: se prepar disolviendo 19,0 g de acetato de sodio trihidratado en 1.0 l de agua Milli-Q. A esta solucin se le adicionaron 0,5 mL de TEA y luego la solucin se titul hasta pH de 6,4 con cido actico glacial. La solucin se filtr empleando una membrana 0,45 m, de la solucin resultante se tomaron 940 mL y se le adicionaron 60 mL de acetonitrilo. Eluente B: se prepar mezclando 600 mL de acetonitrilo con 400 mL de agua Milli-Q, se filtr a travs de una membrana de 0,45 m y se desgasific en un bao de ultrasonido durante 20 seg. Diluente de la muestra: se pesaron 710 mg de Na2HPO4 y se diluyeron en 1 litro de agua Milli-Q. Se llev a un pH de 7,4 con H3P04 al 10% se filtr con membrana de 0,45 m y de la solucin resultante se tomaron 95 mL para mezclarlos con 5 mL de acetonitrilo. Gradiente: el flujo de gradiente se program de la manera indicada en la Tabla 1.
Tabla 1 Programacin del flujo de gradiente

3 Resultados y discusin Los estndares de concentracin 2,5 mol/mL, que contienen los 18 aminocidos, presentan una buena separacin como se observa en la Figura 1. Con el propsito de estimar la linealidad del mtodo, se tomaron por separado 1.0 L, 2.0 L, 3.0 L, 4.0 L y 5.0 L de la solucin estndar de los aminocidos de concentracin 2.5 mol/mL y se diluyeron a 600 L con la solucin diluente Pico-Tag, obteniendo concentraciones de 4.2 mol/L, 8.3 mol/L, 12.5 mol/L, 16.7 mol/L y 20.8 mol/L respectivamente, para todos los aminocidos, excepto para la cistena que se encontraba en una concentracin de 1.25 mol/mL. Cada inyeccin fue hecha por duplicado.
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Utilizando el programa Milleniun 2010 se determinaron las curvas de calibracin para los 18 aminocidos. En las Figuras 2, 3 y 4 aparecen las curvas de calibracin de 3 de los aminocidos esenciales ms representativos: lisina, metionina y fenilalanina. En la Tabla 2 podemos apreciar los tiempos de retencin promedio de los 18 aminocidos estndar, as como tambin los respectivos coeficientes de correlacin para la curva estndar a 5 concentraciones diferentes. Se observa cmo los coeficientes de correlacin presentan valores que van desde 0.9909 para isoleucina hasta 0.9994 para arginina. Teniendo en cuenta que para la cistena el coeficiente de correlacin fue de 0.9835, el ms bajo de todos, tal vez por la baja concentracin en la que se encuentra en los estndares. Es destacable aqu la excelente respuesta en cuanto se refiere a la linealidad como sistema analtico para caracterizar el mtodo de HPLC empleado. Con el propsito de evaluar la exactitud y aplicabilidad del mtodo se trat 1.0 mL de la muestra de plasma con 10 mg de cido sulfosaliclico (ASS) seguido de agitacin con vortex y posterior centrifugacin a 3000 r.p.m. durante 30 min. Se obtuvieron los aminocidos libres en el sobrenadante, el cual se separ y filtr a travs de una membrana de 0,45 m. Las muestras as tratadas se procesaron en igual forma que los estndares tanto en el proceso de derivatizacin como en el anlisis cromatogrfico. El cromatograma obtenido se puede observar en la Figura 5 correspondiente a los aminocidos libres del plasma; en dicha figura podemos apreciar la excelente resolucin para la mayora de los aminocidos y la estrecha similitud en cuanto a los tiempos de retencin, los cuales aparecen comparados en la Tabla 3. Para la muestra de amino cidos libres de plasma humano no hay buena resolucin para los picos de arginina y treonina debido posiblemente a efectos de columna ya que sta tena cierto tiempo de uso. Sin embargo, para propsitos de investigacin podemos considerar como de excelente resolucin. Estos resultados muestran una mejor resolucin de picos de todos los aminocidos en contraposicin a los obtenidos por Lavi et al. [12] quienes reportaron alguna dificultad en la determinacin de lisina, histidina, treonina, cistena en fluidos biolgicos por derivatizacin pre columna con PITC y separacin de los aminocidos derivatizados por cromatografa en fase reversa.

Figura 1 Cromatograma tpico de un estndar de aminocidos libres

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Figura 2 Curva de calibracin de lisina (Lys)

Figura 3 Curva de calibracin de metionina (Met)

Figura 4 Curva de calibracin de fenilalanina (Phe)

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Por otra parte, a pesar de que algunos autores [13] sostienen que el uso de metanol y ASS como agentes desproteinizantes causan considerables prdidas y reducen el rendimiento de muchos PTC-amino cidos, al realizar ensayos de porcentaje de recuperacin en la Tabla 4 se puede observar que se obtuvieron muy buenos resultados, con porcentajes superiores al 90% para la mayora de los aminocidos, excepto la glicina, demostrando de esta manera una buena exactitud de el mtodo de extraccin de los aminocidos libres del plasma humano utilizando como agente desproteinizante el ASS, esto puede deberse tambin al empleo del sistema de liofilizacin que por las condiciones de bajas tempera turas (- 40C) y bajas presiones (10 - 5 mbares) evitan en gran parte la prdida de PTC-aminocidos por reacciones colaterales y, simultneamente, mantienen la estructura molecular intacta lo cual puede no estar sucediendo cuando se utilizan los otros sistemas de secado en la pre-derivatizacin. En la Figura 6 se muestra una grfica comparativa de los porcentajes de recuperacin para muestra de aminocidos libres plasmticos de hombres y mujeres por separado, los cuales fueron obtenidos utilizando la tcnica descrita.
Tabla 2 Tiempos de retencin y coeficientes de correlacin (R) en estndares de aminocidos
aMiNoCiDo Asp Glu Ser Gly His Arg/Thr Ala Pro Tyr Val Met Cys Ile Leu Phe Trp Lys tret.(min.) 3.633 0.125 3.967 0.250 6.888 0.130 7.250 0.150 7.600 0.400 10.733 1.240 11.450 1.410 11.967 1.315 14.833 1.150 15.417 0.240 15.917 0.320 16.683 1.400 17.033 0.120 17.200 6.150 17.967 0.180 18.200 0.200 18.853 0.300 r 0.9994 0.9991 0.9988 0.9987 0.9993 0.9996 0.9992 0.9983 0.9995 0.9990 0.9996 0.9917 0.9994 0.9982 0.9992 0.9983 0.9992

Figura 5. Perfil de aminocidos plasmticos libres

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Tabla 3 Comparacin entre los tiempos de retencin de estndares de aminocidos y los aminocidos plasmticos

Tabla 4 Porcentajes de recuperacin de aminocidos para la muestra de mujeres

A.A.
Asp Glu Ser Gly His Arg/Thr Ala Pro Tyr Val Met Cys Ile Leu Phe Trp Lys
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Concentracin determinada en la muestra (a.a. lib.20 M)

0.292 2.094 4.881 12.099 9.031 5.355 32.079 16.069 3.252 10.469 1.565 3.018 3.535 4.931 2.669 2.394 6.216

Concentracin Std 12.5 M agregada (std 12M)

13.432 13.487 13.004 13.282 13.536 13.534 14.245 15.622 13.223 14.554 13.565 8.572 12.816 11.891 13.399 16.080 13.567

Concentracin determinada en la muestra + std

(a.a. lib + std 12.5) 12.464 14.802 15.797 10.194 22.186 18.454 45.590 31.917 15.890 23.756 15.062 10.021 16.329 16.706 15.008 17.651 18.848

Recuperacin 90.819 94.998 88.327 40.163 98.310 97.698 98.415 100.716 96.449 94.935 99.549 86.459 99.869 99.310 93.408 95.546 95.273

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Figura 6 Comparacin del porcentaje de recuperacin de aminocidos libres en muestras de plasma de hombres y mujeres

En conclusin, el mtodo de cromatografa lquida reportado en el presente estudio puede ser usado para la determinacin con una muy buena linealidad de los aminocidos ms importantes desde el punto de vista nutricional, especialmente los aminocidos esenciales (Lys., Val., Phe., Leu., Met., Thr.,Trp., e Ile.). Respecto al triptofano, de acuerdo con cromatogramas publicados por Sarwar [14] y Haniharan [15] de aminocidos plasmticos utilizando las mismas tcnicas de pre-derivatizacin con PITC y tcnicas cromatogrficas similares, se puede realizar su caracterizacin ubicndolo entre fenilalanina y lisina con un tiempo de retencin promedio de 18.367 min; esto es importante, debido a que el triptofano es un aminocido esencial fcilmente degradable como se ha observado en los estudios in vitro de hidrolizados proteicos, por lo cual es necesario disear una tcnica especial. En nuestro caso, por no haber realizado hidrlisis cida, los niveles plasmticos de triptofano pueden ser empleados como ndice de su biodisponibilidad. Estudios similares en rumen animal han sido realizados por Or-Rashid [1], y por Frank [16] con OPA y deteccin de fluorescencia. Un mtodo similar al aqu reportado ha sido de mucha utilidad para la determinacin de aminocidos libres en msculo de salmn [17], y composicin de aminocidos libres en mejillones provenientes de diferentes sitios de Espaa [18]. Referencias bibliogrficas [1] Or- Rashid, Mamun M., Onodera, Ryoji; Wadud Shaila and Mohammed Nazimuddin (2000). Convenient method of threonine, methionine and their related amino compounds by high-performance liquid chromatography and its application to rumen fluid. Journal of Chromatography B. 741 (2): 279-287 [2] Fekkes, Durk; Voskuilen- Kooyman Ans; Jankie, Robin and Huijmans (2000). Precise analysis of primary amino acids in urine by an automated high-performance liquid chromatography method: comparison with ion-exchange chromatography. Journal of Chromatography B. 744 (1): 183-188
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