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IV. MATERIALES Y MTODOS

4.1. Materia Prima

El morfotipo de chile Bell verde ( Capsicum annuum L.) utilizado para el estudio de extracci n de carotenoides por medio de diferentes sistemas de solventes, fue proveniente de la regin de Zamora, Hermosillo, Sonora, Mxico ( latitud 29 05, longitud 110 57, altura 282m) y proporcionado por la empresa Distfrut S.A. de C.V. Los distintos morfot ipos de chile (rojo, amarillo, verde, naranja) Bell ( Capsicum annuum L.) utilizados para el estudio de la

caracterizacin de los carotenoides y su relacin con la actividad antioxidante, fueron cosechados en los alrededores de Len,

Guanajuato, Mxico (latitud, 19 55' 08" - 21 52' 09", longitud, 99 41' 06" - 102 09' 07 y una altitud de 2400 m) y proporcionados por la empresa Frogs S.A. de C.V. 4.2. Preparacin de la Muestra Las muestras de chiles fueron lavadas con agua destilada, se cortaron por la mitad para retirar las semillas y se realizaron cortes del pericarpio en rajas de 5 cm de largo y 0.5 cm de ancho. Parte de las muestras fueron liofilizadas (Modelo 5, Labconco Corporation, Kansas City, MO) a una temperatura de 50C (Vinson et al ., 1998). Las muestras frescas y liofizadas se almacenaron en bolsas hermticas (Ziploc) a una temperatura de 20C. Para la deshidratacin de las muestras de chile fresco, se colocaron aproximadamente 40 g en un liofilizador (Labconco nm. 5) a una temperatura de -50 C durante 10-12 horas. Posteriormente, se

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colocaron las muestras deshidratadas en un desecador (BOEKEL, Philadelphia, Pa) para eliminar la h umedad restante, despus de 2 horas en completa oscuridad se pesar on (Sartorius Mechatronics) y almacenaron a -20C hasta su utilizacin. 4.3. Extraccin de los Carotenoides por D iferentes Sistemas de Solventes El primer objetivo de este trabajo fue evaluar una serie de sistemas de solventes para conocer la mejor eficiencia de extraccin de carotenoides, seleccion ndose seis sistemas en base a la

literatura cientfica (Santamaria et al. , 2000; Rao et al. , 2006; ElSayed et al. , 2007).Por otro lado, tambin se probaron muestras frescas y liofilizadas, para conocer cual estado de la muestra (hidratada y deshidratada) es el ms adecuado para la extraccin de los carotenoides. Para la extraccin de los carotenoides se tomaron 5 g de muestra de chile Bell verde fresco o 0.5 g de muestra de chile Bell verde liofilizado y se le adicion 10 mL de cada uno de los sistemas de solvente: 1) acetona, 2) etanol 96%, 3) etanol 80 %, 4) cloroformometanol 1:1 (v: v), 5) cloroformo-metanol 2:1 (v: v), y 6) cloroformometanol 1:2 (v: v). Posteriormente, la mezcla fue agitada en un Ultra Turrax T 25 basic S1 (IKA W orks Inc, W ilmingt on, NC, USA) y el homogenizado fue sometido a movimientos ultrasnicos

(BRANSONIC, 1510R- DTH, Danbury) por 30 min y centrifugado (17,900 g) a 1 C por 15 min. El sobrenadante se separ mediante filtracin utilizando papel filtro ma rca W hatman no. 2. El proceso se repiti dos veces para asegurar la mxima extracc in de los

compuestos (Figura 11 ).

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5 gramos de muestra f resca

0.5 gramos de muestra liofilizada

10 mL del sistema de so lventes

Homogenizar

Sonicar 30 min

Centrifugar 17900 g a 1C por 15 min

Precipitado + 10mL del sistema de s olvente s

Juntar drenante y reflujar con N 2

Anlisis HPLC

Figura.11. Diagrama de flujo de la extraccin de carotenoides.

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La fase oleosa fue separada en un embudo de separaci n y reflujada con N 2 hasta sequedad. En el momento del anlisis

cromatogrfico fueron resuspendidos en 1 mL de acetona (Chitindingu et al ., 2006). Por otro lado, otras fases oleosas no fueron llevadas a sequedad, sino que fueron filtradas utilizando filtr os Nylon de jeringa (17MM 0.2 UM) y sometidas al anlisis cromatogrfico (HPLC). Esto con el fin de comparar el efect o del secado bajo reflujo con ni trgeno, sobre los carotenoides. Los extractos slidos y los lquidos no llevados a sequedad fueron congela dos a 20C. 4.4. Cuantificacin de los Carotenoides por HPLC La identificacin y cuantificacin de los carotenoides se realiz a 450 nm, utilizando un cromatgrafo de lquidos, equipado con una bomba ternaria (Varian, modelo ProStar 230), un detecto r UV-VIS (Varian, modelo 9050), una columna Supelcosil C18 (30cm4.6mm 5 m tamao de partcula, Supelco, Bellefonte, PA, USA) y un rizo (loop) de 20 L. La fase mvil utilizada fue acetona -agua con una rampa de elucin (Tabla 14) a un flujo de 1.5 mL/min (M nguezMosquera et al. , 2008). Los carotenoides fueron identificados por la comparacin de los tiempos de retencin y cuantificados por las curvas de calibracin de los estndares de -caroteno, lutena, clorofila-a y clorofila-b (Sigma Aldrich Co., St Louis, MO, USA). 4.5. Evaluacin de la Capacidad Antioxidante Los mtodos ms utilizados para medir la actividad antioxidante de extractos vegetales, son el ABTS (2,2-azino -bis(3-etilbenzo -

tiazolina -6-sulfnico)) y el DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidra -cilo). Ambos presentan una excelente estabilidad en ciertas condiciones (escasa luminosidad y temperatura ambiente) aunque tambin muestran

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Tabla 14. Rampa de elusin para la identificacin de carotenoides. Tiempo(min) 5 5 7 5 5 % Acetona 75 95 95 100 75 % Agua 25 5 5 0 25

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diferencias entre ellos (precisin y estabilidad ante las especies reactivas de oxgeno) (Kuskosi et al ., 2005). El DPPH es un radical libre que puede obtenerse directamente sin una preparacin previa, mientras que el ABTS+ tiene que ser generado tras una reaccin que puede ser qumica (dixido de manganeso, persulfato potasio). Con el ABTS+ se puede medir la actividad de compuestos de naturaleza hidrof lica y lipoflica, mientras que el DPPH solo puede disolverse en medio orgnico (Kuskosi et al ., 2005; Gorinstein et al ., 2009). 4.6. Capacidad Antioxidante Equivalente a T rolox (TEAC) Este mtodo evala la capacidad antioxidante equivalente de trolox (TEAC, trolox equivalent antioxidant capaci ty) y se basa en la reduccin de la coloracin verde/azul producida por la reaccin del radical 2,2 -azino -bis (3-etilbenzotiazolina -6- sulfnico) (ABTS+) con el antioxidante presente en la muestra. Para generar el radical catin ABTS+ se pesaron 19.2 mg d e ABTS+ y se disolvieron en 5 mL de agua destilada. Posteriormente , se agregaron 88 mL de una solucin de persulfato de potasio (0.0378 mg/mL). La solucin se homogeniz y se incub en oscuridad a temperatura ambiente (25 +1C) durante 16 h. Una vez formad o el radical ABTS+, ste se diluy con etanol hasta obtener un valor de absorbancia alrededor de 0,70 +0,1 a 754 nm (espectrofotmetro UV -VIS Varian, modelo Cary 100). Los

extractos filtrados (0.1 mL de extracto) se colocaron cada uno en una celda y se mezclaron con 3.9 mL del radical recin generado. Se ley la absorbancia al inicio (Absi) y a cada minuto hasta los 7 minut os de reaccin (Absf) (Figura 12 ). El diferencial de absorbancia (absi absf) se transform a porcentaje de inhibicin y se calcul la a ctividad antioxidante en milimoles equivalentes t rolox (mmoles ET)/gramo peso fresco (g pf), mediante una curva de calibracin (concentracin

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Figura 12. Diagrama de flujo de la determinacin de la actividad antioxidante por el radic al ABTS .

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de 0-0.25 mg/mL) de trolox (anlogo de la vitamina E soluble en agua) (Kuskoski et al ., 2005). 4.7. Capacidad Antioxidante por el M todo DPPH + Los antioxidantes (DPPH*), reducen el radical un libre 2,2 -difenil-1de color de

picrilhidracilo

manifestndose

cambio

morado a amarillo en la solucin, presentando una absorbancia mxima a 515 nm. La solucin del radical se prepar disolviendo 2.5 mg DPPH* en 100mL etanol. Para el ensayo fot omtrico (Figura 1 3) se mezclaron 3.9 mL del radical DPP H (0.025 mg/mL metanol) con 0.1 mL de cada uno de las diluciones de los extractos metanlicos (concentracin 0.25 g/mL). La reaccin se llev a cabo por 30 min y posteriormente se ley a 515 nm en un espectrofotmetro UV -VIS (Varian, modelo Cary 100). La absorbancia de las muestras se midi en funcin del tiempo hasta que las diferencias fueron menores a 0.003. Los cambios en la absorbancia al inicio y final de la reaccin fueron transformados a porcentaje de inhibicin (Materska y Perucka, 2005). A partir de las cinticas de disminucin de DPPH*. Se utilizaron los valores asintticos de absorbancia y se graficaron en funcin de las concentraciones para cada extracto. De estas ltimas curvas se calcul la concentracin media efectiva (EC 5 0 ) que es el conten ido de antioxidante requerido para reducir la concentracin inicial de DPPH* a la mitad, para poder comparar la capacidad antioxidante de los diferentes extractos. Los resultados finales se expresaron como mg de fruto/mg de DPPH* (Molyneux, 2004).

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Figura 13. Diagrama flujo de la determinacin de la actividad antioxidante por el radical DPPH * .

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4.8. Cuantificacin de Carotenoides Totales La identificacin y cuantificacin de los C arotenoides Totales se realiz haciendo una lectura a los extractos de -caroteno entre un

rango de 800 a 200 nm, Para obtener una longitud de onda en la cual se d el mayor rango de extraccin UV-VIS Varian, modelo Cary 100 ). Despus de concluir cual es la longitu d de onda donde se dio una mayor identificacin, se realiza una curva calibracin de los extractos de -caroteno con concentraciones que Varian entre 0.064 a 0.032 mg/mL para despus compararlos con los extractos de Chile bell ( Capsicum annuum L .) a contenido de carotenoides 430 nm, y as obtener el valor de en cada variedad (Umiel y utilizando un Espectrofotmetro

totales

Gabelman, 1971). 4.9. Determinacin de cido Ascrbico Para la determinacin de vitamina C se utiliz un gramo de muestra a la cual se le agregaron 20 mL de cido metafosfrico: acido actico glacial: agua (30:80:890 w/w/v), se homogeniz en un ultraturrax T 25 basic S1 (IKa -W orks Inc. W ilmington, NC, USA) y el sobrenadante fue colocado en tubos eppendorf para centrifugarse a 14000 rpm, durante 15 min, a 2C. El sobr enadante se filtr en una membrana miliporo. Las muestras se analizaron por cromatografa de lquidos, inyectando 10 L a un cromatgrafo Varian 9012 (CA, USA) equipado con un detector UV Varian 9050 (CA, U.S.A) y una columna (3.9 x 300 mm, 10 mm). La fase mvil fue acetonitrilo: 0.05M KH2PO4 (75:25 V/V) con un flujo de 1.5 mL/min y una longitud de onda de 268 nm (Donner y Hicks, 1981). La concentracin de vitamina C fue calculada usando acido ascrbico como estndar externo y es expresado como miligramos d e acido ascrbico por 100 gramos de fruta fresca.

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4.10. Rendimiento de los Diferentes Tipos de Solventes en el Proceso de Extraccin de los Carotenoides

La eficiencia de cada uno de los solventes se obtuvo mediante un balance de materia expresado en porcentajes y utilizando la siguiente ecuacin: M 1 =M 2 +M 3 Donde: M 1 = Peso de muestra fresca o liofilizada que e ntra. M 2 = Peso de muestra fresca o liofilizada extrada por el solvente. M 3 = Peso de muestra fre sca o liofilizada sobrante (no e xtrada). 4.11. Anlisis Estadstico Los datos fueron analizados por un anlisis de varianza y comparacin de med ias por la prueba de Tukey (P< 0,05) utilizando el programa estadstico Sigmasta t 3.5 (Point Richmond, CA, USA). Tambin se us este mismo programa para correlacionar (correlacin de Pearson) los niveles del -caroteno con la capacidad antioxidante por el catin radical ABTS y por el radical DPPH de cada uno de los cultivares de chile Bell ( Capsicum annuum L.) rojo, amarillo, anaranjado y verde . Todas las extraccione s y anlisis se realizaron por duplicado.