Gayana Bot.

66(1): 1-9, 2009

ISSN 0016-5301

INFLUENCIA DE LOS HONGOS MICORRIZICOS ARBUSCULARES SOBRE EL CRECIMIENTO DE VITRO PLANTULAS DE PIA (ANANAS COMOSUS (L.) MERR.) CON DIFERENTES NIVELES DE FOSFORO INFLUENCE OF ARBUSCULAR MYCORRHIZAL FUNGI ON THE GROWTH OF PINEAPPLE VITRO PLANTLET (ANANAS COMOSUS (L.) MERR.) WITH DIFFERENT PHOSPHORUS LEVELS
Vicente Federico Gutirrez-Oliva1, Miguel Abud-Archila2, Aura Flores-Prez1, Jos David Alvarez-Solis3 & Federico Antonio Gutirrez-Miceli2
Departamento de Ing. Qumica y Bioqumica, Instituto Tecnolgico de Tuxtla-Gutirrez, Tuxtla-Gutirrez, Chiapas, Mxico; 2Maestra en Ciencias en Ing. Bioqumica, Instituto Tecnolgico de Tuxtla-Gutirrez, Tuxtla Gutirrez, Chiapas, Mxico; 3 Departamento de Agroecologa, Divisin de Sistemas de Produccin Alternativos, El Colegio de la Frontera Sur, San Cristbal de Las Casas, Chiapas, Mxico. biotecveg@hotmail.com

RESUMEN El objetivo del trabajo fue evaluar el efecto de dos hongos micorrzicos arbusculares (HMA) a diferentes concentraciones de fsforo sobre la sobrevivencia y el crecimiento de plntulas de pia (Ananas comosus (L.) Merr.) obtenidas por micropropagacin. Las plntulas se multiplicaron masivamente en cultivos in vitro y se aclimataron gradualmente bajo un esquema de estrs por temperatura en tres etapas secuenciales. Los efectos de los HMA y el fsforo no fueron significativos sobre la sobrevivencia y la altura de las plntulas, sin embargo, Glomus claroideum estimul que las plntulas tuvieran mayor nmero de hojas y peso seco. Los resultados sugieren que la altura de las plntulas fue mayor cuando fueron cultivadas con G. claroideum y 0,9 mM de fsforo. PALABRAS CLAVE: Hongos micorrzicos arbusculares, fsforo, pia, optimizacin.

ABSTRACT The objective of this work was to assess the effect of two arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) at different phosphorus concentrations on survival and growth of pineapple (Ananas comosus (L.) Merr.) plantlets obtained for micropropagation. Plantlets were multiplied for in vitro cultures and were acclimatized under three sequential steps. The effects of AMF and phosphorus were not significant on plantlet survival and plantlet height, however Glomus claroideum stimulated that the plantlets were with higher leaves number and dry weight. The results demonstrated that plantlet growth was maximized with G. claroideum and phosphorus 0.9 mM. KEYWORDS: Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF), phosphorus, pineapple, optimization.

INTRODUCCION En la micropropagacin de pia (Ananas comosus (L.) Merr.), la etapa limitante es cuando los cultivos in vitro se pasan al invernadero con la finalidad de aclimatar las plntulas y posteriormente transferirlas

a los productores para su siembra en campo. Cuando la aclimatacin se realiza con estrs nutricional y/o ambiental el porcentaje de sobrevivencia de las plntulas es muy bajo y las plntulas que sobreviven crecen lentamente (Bomfim et al. 2007). Una alternativa utilizada en otros cultivos es el aplicar

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hongos micorrzicos arbusculares (HMA), sin embargo es necesario evaluar si en pia hay efectos y qu especie de HMA es ms adecuada y cul es el comportamiento con diferentes concentraciones de fsforo para incrementar la sobrevivencia y el crecimiento de las plntulas. Los HMA son ubicuos en el suelo y forman asociaciones simbiticas con las races de la mayor parte de las plantas terrestres. Esta asociacin se denomina micorriza arbuscular y se encuentra bien documentado su efecto al incrementar el crecimiento de las plantas. Este efecto se atribuye al incremento en la asimilacin de los nutrientes, especialmente del fsforo, la tolerancia al estrs, patgenos de la raz y ambientes adversos en el suelo, as como a la produccin de sustancias promotoras del crecimiento. Los HMA incrementan el nmero y la actividad de los organismos benficos del suelo como por ejemplo, los fijadores de nitrgeno y los solubilizadores de fosfato y como consecuencia, el crecimiento de las plantas mejora (Karandashov & Bucher 2005). La expansin del micelio externo del hongo en el suelo rizosfrico es la causa principal de este efecto, permitiendo la captacin de los nutrientes ms all de la zona de agotamiento que se crea alrededor de las races (Garca & Mendoza 2007). La asociacin micorrzica permite la asimilacin de microelementos tales como Zn, Cu y Bo, los cuales son absorbidos por las hifas del hongo y transportados hasta el hospedero, cualidad que puede aprovecharse para fitorremediar suelos contaminados con estos elementos (Hildebrandt et al. 2007). El mutualismo supone una relacin beneficiosa para los dos organismos implicados, y tanto el hongo como la planta se ven favorecidos por la asociacin: el hongo coloniza la raz de la planta y le proporciona nutrientes minerales y agua, que extrae del suelo por medio de su red externa de hifas, mientras que la planta suministra al hongo sustratos energticos y carbohidratos que elabora a travs de la fotosntesis (Bolan 1991). Son escasos los reportes que relacionan a los HMA con la sobrevivencia de las plntulas micropropagadas, Padilla et al. (2006) reportaron que los HMA aumentaron el porcentaje de sobrevivencia de lcumo ( Pouteria lucuma (Ruiz et Pav.) Kuntze) en la aclimatacin y el desarrollo de las plntulas. Con respecto al efecto sobre el crecimiento de las plantas, se ha reportado que las plantas de papaya inoculadas con Glomus claroideum Schenck et Smith emend. Walker et Vestberg presentaron mayor cantidad de materia seca y rea foliar en comparacin con los

testigos (Alarcn et al. 2002). Estn bien documentados los procesos metablicos en donde participa el fsforo y se ha demostrado que el peso seco depende de la concentracin de fsforo en el medio nutritivo independientemente de si las plantas son micorrizadas o no (Toussaint et al. 2007). El objetivo del trabajo fue evaluar el efecto de dos hongos micorrzicos arbusculares (HMA), G. claroideum y G. fasciculatum (Thaxter sensu Gerd.) Gerd et Trappe a diferentes concentraciones de fsforo sobre la sobrevivencia y el crecimiento de plntulas de pia (Ananas comosus) obtenidas por micropropagacin.

MATERIALES Y METODOS MICROPROPAGACIN Los explantes se obtuvieron de plantas sanas empleando la corona, la cual fue lavada con una solucin de Tween-20 al 2% durante 15 min y posteriormente enjuagadas tres veces con agua destilada estril. La desinfeccin se realiz mediante inmersin de la corona en una solucin de cloro comercial al 20% durante 10 min y finalmente se enjuagaron tres veces con agua destilada estril. Los explantes (yemas) se desinfectaron con una solucin de cloro comercial al 10% durante 10 min, se enjuagaron tres veces con agua destilada estril y se sumergieron en una solucin antioxidante de cido ctrico al 0,3% durante 10 min. Las yemas se sembraron en el medio de cultivo MS (Murashige & Skoog 1962) suplementado con vitaminas (cido nicotnico 0,5 gL-1, tiamina 0,5 gL-1, piridoxina 0,5 gL-1), sacarosa 30 gL-1, phytagel 2,5 gL-1 y 2,5 mgL-1 de 6Benzil aminopurina (6 BAP), el pH se ajust a 5,7 y la esterilizacin se realiz en autoclave a 121C durante 15 min. La incubacin se realiz a 22C con un fotoperiodo de 16 horas luz y 8 de oscuridad. La multiplicacin se realiz despus de 5 semanas del establecimiento, efectuando 8 subcultivos para obtener el nmero suficiente de plntulas para realizar el estudio en los cultivos ex vitro. El enraizamiento se hizo una vez que las plntulas tuvieron una altura de 3-4 cm, stas se cambiaron a un medio de enraizamiento MS (Murashige & Skoog 1962) suplementado con vitaminas (cido nicotnico 0,5 gL-1, tiamina 0,5 gL-1, piridoxina 0,5 gL-1), sacarosa 30 gL-1, phytagel 2,5 gL-1, carbn activado 1,5 gL-1 y 0,5 mgL-1 de cido naftalen actico (ANA), el pH se ajust a 5,7 y se esteriliz en autoclave a 121C

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durante 15 min. La incubacin se realiz a 22C con fotoperiodo de 16 horas luz y 8 oscuridad, durante 6 a 8 semanas. La iluminacin se realiz con 2 lmparas de luz de da Phillips Solar de 75 watts con fotoperiodo de 16 h. La aclimatacin se realiz una vez que a las plntulas se les quit el agar y se les sumergi en una solucin de Captan (1 gL-1) durante 5 min. Posteriormente las plntulas fueron colocadas en botellas de plstico con tapa rosca conteniendo peat moss-agrolita (2:1) y las plntulas fueron manipuladas bajo un esquema de incremento gradual de temperatura y de aireacin. En la primera etapa las plntulas se dejaron por 3 das a 20 2C en la botella hermticamente cerrada, al cuarto da la tapa fue removida paulatinamente de tal manera que a los 7 das las botellas estuvieran sin la tapa. Despus, las plntulas fueron colocadas en macetas de unicel conteniendo 30 g de peat moss. Se utilizaron 54 plntulas repartidas en tres partes iguales entre las inoculadas con G. fasciculatum, con G. claroideum y las que no fueron inoculadas con ningn HMA. En los tratamientos correspondientes, las plntulas se inocularon con 1 g de los hongos micorrzicos arbusculares en una ubicacin tal que permitiera el contacto con las races de las plntulas. Los HMA fueron cultivados usando pasto Rhodes como cultivo trampa y arena-suelo (1:1) como sustrato, en donde se tuvo 95% de colonizacin de las races. El inculo contena 200 esporas/g de races y tallos del pasto y micelio del HMA secados y

triturados. Despus de la inoculacin, las plantas se colocaron en un cuarto con condiciones de luz y temperatura (25 14C) por otro periodo de 15 das. Posteriormente, las macetas fueron transferidas a un invernadero con malla reductora de luz del 80%, donde permanecieron por 90 das despus del trasplante (ddt). En esta etapa, las plantas fueron regadas una vez por semana con 20 mL de la solucin nutritiva con las concentraciones de fsforo correspondientes a los tratamientos. La solucin se prepar con el producto comercial Triamin radicular (Arvensis Agro S.A.), diluido con agua de acuerdo a las indicaciones del fabricante, y adicionando KH2PO4 para obtener las concentraciones finales de fsforo de 0,3, 0,6 y 0,9 mM. Para analizar la influencia de la especie de HMA a diferentes concentraciones de fsforo sobre el porcentaje de sobrevivencia y de los parmetros de crecimiento, se utiliz la metodologa de superficie de respuesta. En esta metodologa es necesario codificar los niveles de las variables independientes, por lo que los niveles de cada variable (hongo micorrzico arbuscular y concentracin de fsforo) se designaron como -1, 0 y +1 para los niveles bajo, medio y alto, respectivamente; para el caso de los HMA, el nivel bajo correspondi a los tratamientos sin inocular, el nivel medio a los inoculados con G. fasciculatum y el nivel alto a los inoculados con G. claroideum (Tabla I). En la Tabla II se presentan los diferentes tratamientos usados en el diseo factorial completo.

TABLA I. Rango experimental y niveles de las variables independientes (hongo micorrzico arbuscular y concentracin de fsforo) usados en el diseo factorial 32 para maximizar el crecimiento de las plntulas de pia. TABLE I. Experimental range and levels of the independent variables (arbuscular mycorrhizal fungi and phosphorus concentration) used in the 32 factorial design for maximize the pineapple plantlets growth. Variables -1 HMA Sin inocular Niveles 0 Inoculada con G. fasciculatum 0,6 1 Inoculada con G. claroideum 0,9

Fsforo (mM)

0,3

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TABLA II. Diseo experimental para optimizar el crecimiento de las plntulas de pia. TABLE II. Experimental design to optimize the growth of pineapple plantlets.

Tratamiento

Hongo micorrzico arbuscular

Fsforo mM 0,3 0,6 0,9 0,3 0,6 0,9 0,3 0,6 0,9

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Sin inocular Sin inocular Sin inocular G. fasciculatum G. fasciculatum G. fasciculatum G. claroideum G. claroideum G. claroideum

Los tratamientos fueron ordenados de acuerdo a un diseo de bloques completamente aleatorizado con 6 repeticiones. Las mediciones de sobrevivencia, altura y nmero de hojas se hicieron mensualmente mientras que la medida del peso seco se realiz a los 90 das de que las plntulas estuvieron en cultivo ex vitro, es decir desde cuando fueron trasplantadas. Se emple el paquete estadstico Statgraphics Plus versin 5.1 para realizar el anlisis de varianza (ANOVA) para determinar si existieron diferencias estadsticas significativas (p=0,05) entre los tratamientos evaluados por cada variable determinada y para estimar los coeficientes de las ecuaciones de regresin. El ajuste de los modelos de regresin obtenidos se verific por la determinacin del coeficiente de correlacin ajustado (R2). La significancia estadstica de los modelos se determin por la aplicacin de la prueba F de Fisher. El grfico de Pareto se obtuvo para indicar la significancia estadstica de los efectos estandarizados que se calcularon dividiendo el efecto entre su error estndar para estimar las variaciones experimentales en los diferentes factores analizados (A= HMA; B=concentracin de fsforo), la interaccin entre ellos (AB) y el efecto cuadrtico de los dos factores (AA=efecto cuadrtico de los HMA y BB=efecto cuadrtico de la concentracin del fsforo), considerando una ecuacin de regresin de segundo orden. Se grafic el efecto principal de los factores y la superficie de respuesta para describir los efectos individuales y acumulativos de las variables, as como de las interacciones entre los HMA y la concentracin del fsforo sobre cada variable dependiente.

RESULTADOS En la Figura 1a se presentan los porcentajes de sobrevivencia de las plntulas despus de la tercera etapa de aclimatacin ex vitro. Se observa que no hubo diferencias significativas (P=0,05) entre los tratamientos, por lo tanto se puede concluir que ni el HMA ni la concentracin de fsforo influyeron sobre la sobrevivencia de las plntulas en los cultivos ex vitro. El R2 del modelo matemtico fue de 16,4%, lo cual indica que la sobrevivencia dependi en un 85,6% de otros factores diferentes de la especie de HMA y de la concentracin de fsforo. La altura de las plantas evidenci un comportamiento similar (Fig. 1b), con un coeficiente de correlacin ajustado de 17,0%. El nmero de hojas fue diferente (P=0,05) entre los tratamientos (Fig. 1c), pero no se observ un comportamiento consistente debido a que los valores ms altos se encontraron en las plantas que fueron inoculadas con G. claroideum con 0,6 y 0,9 mM de fsforo, sin embargo no hubo diferencias entre las plantas inoculadas con G. fasciculatum fertilizadas con 0,3 mM de fsforo y con las plantas sin inocular fertilizadas con 0,9 mM de fsforo. En el caso del control sin inocular, se observ un aumento en el nmero de hojas con 0,9 mM de P. En esta variable el coeficiente de correlacin ajustado del modelo fue de 28,7% e indic que la concentracin de fsforo fue el factor que individualmente promovi un efecto positivo (P=0,05) sobre el nmero de hojas (Fig. 2 a).

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FIGURA 1. (a) Porcentaje de sobrevivencia, (b) altura de las plntulas, (c) nmero de hojas, (d) peso seco de las plntulas de pia en cultivos ex vitro para evaluar la influencia de los hongos micorrzicos arbusculares con tres concentraciones de fsforo, bajo (0,3 mM), medio (0,6 mM) y alto (0,9 mM). 0= sin micorrizas; 1 = Glomus fasciculatum; 2 = Glomus claroideum; DMS = Diferencia mnima significativa (P=0,05). Letras iguales denotan que no existe diferencia estadstica significativa entre los tratamientos. FIGURE 1. (a) Survival percentage, (b) plant height, (c) leaves number and (d) dry weight of pineapple plantlets in ex vitro cultures for evaluating the influence of arbuscular mycorrhizal (AM) fungi with three phosphorus concentrations, low (0.3 mM), middle (0.6 mM) and high (0.9 mM). 0= without AM fungi, 1 = Glomus fasciculatum; 2 = Glomus claroideum, LSD = Least Significant Difference (P=0.05). Values with a different letter are significantly different.

El anlisis de varianza mostr diferencias significativas en el peso seco de las plantas inoculadas con G. claroideum en relacin con las que fueron inoculadas con G. fasciculatum, as como en las que no fueron inoculadas (Fig. 1 d). En las plntulas inoculadas con G. claroideum el peso seco aument con el nivel de P aplicado (Fig. 3 a y b). En la Figura 2a se presentan los efectos estandarizados para evaluar la significancia estadstica de los factores y la interaccin entre ellos sobre el nmero de hojas, se observa que solamente

el fsforo tuvo efecto estadstico significativo (P=0,05). En la Figura 2b se presentan los efectos principales de los HMA y del fsforo, se observa que G. claroideum fue el HMA que promovi que las plantas tuvieran ms hojas. Se observa tambin que las plantas generaron ms hojas a medida que se increment la concentracin de fsforo en el sustrato. La grfica de superficie de respuesta (Fig. 2c) muestra claramente que para que las plantas tengan ms hojas es mejor usar G. claroideum y 0,9 mM de fsforo.

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Con respecto al peso seco de las plntulas, el factor que influy significativamente (P=0,05) fue la especie de HMA utilizada (Fig. 3 a). En la Figura 3b se presenta la grfica de efectos principales de los dos factores estudiados sobre el peso seco, es claro que los HMA fueron el factor con mayor influencia y que G. claroideum promovi el mayor efecto. Con respecto al efecto del fsforo fue menos relevante que el de los HMA, observndose un ligero

incremento en el peso seco a medida que se increment la concentracin del fsforo. La ecuacin 1 muestra el modelo matemtico generado a partir de los datos experimentales obtenidos para el peso seco de las plantas de pia, en donde PS es el peso seco (g planta-1), HMA el hongo micorrzico arbuscular y P la concentracin de fsforo. El coeficiente de correlacin ajustado (R2) fue de 85,8%.

PS=0.35 + 0.21*HMA + 0.04*P + 0.27*HMA2 + 0.12*HMA*P + 0.006*P2..................(1)

FIGURA 2. (a) Diagrama de Pareto estandarizado, (b) grfica de los efectos principales, (c) grfica de superficie de respuesta para evaluar la influencia de los HMA a diferentes concentraciones de fsforo sobre el nmero de hojas de las plntulas de pia. FIGURE 2. (a) Standardized Pareto chart, (b) Plots of main effects, (c) Response surface plots to assess the effect of AM fungi, at different phosphorus concentrations on the leaves number of pineapple plantlets.

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En la Figura 3c se presenta la superficie de respuesta del peso seco de las plntulas en funcin de las micorrizas y de la concentracin de fsforo, se observa que las plntulas tuvieron mayor peso seco a medida que se increment la concentracin

del fsforo y cuando fueron inoculadas con G . claroideum. Se encontr que el peso seco de las plntulas puede ser optimizado utilizando G . claroideum y la concentracin ms alta de fsforo (0,9 mM).

FIGURA 3. (a) Diagrama de Pareto, (b) grfica de los efectos principales, (c) grfica de superficie de respuesta para evaluar la influencia de los HMA a diferentes concentraciones de fsforo sobre el peso seco de las plntulas de pia. FIGURE 3. (a) Standardized Pareto chart, (b) Plots of main effects, (c) Response surface plots to assess the effect of AM fungi at different phosphorus concentrations on the dry weight of pineapple plantlets.

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DISCUSION Los resultados del presente trabajo demostraron que la inoculacin con los HMA, G. fasciculatum y G. claroideum, a diferentes niveles de fsforo no ejercieron efecto significativo en la sobrevivencia de las plntulas de pia en la etapa ex vitro. Los factores ms importantes que pudieron haber influido para que las plantas sobrevivieran son los ambientales, por ejemplo el procedimiento de aclimatacin gradual a la temperatura y a la concentracin de CO 2 para que las plantas adquirieran una actividad fotosinttica adecuada a las condiciones ex vitro. De acuerdo a Pospilov et al . (1999), la aclimatacin gradual es un procedimiento que permite que una planta micropropagada tenga altos porcentajes de sobrevivencia en la etapa ex vitro, en donde se corrigen anormalidades que tienen las plantas micropropagadas, tales como produccin insuficiente de cera cuticular, presencia de estomas daados, una pobre actividad fotosinttica, pobre conexin vascular, deshidratacin e infeccin por patgenos. El fsforo fue el factor que influy significativamente sobre el nmero de hojas, este resultado se puede explicar porque el sustrato utilizado para cultivar las plntulas en el proceso de aclimatacin es deficiente en macronutrientes y especialmente en fsforo y est bien documentado que el fsforo es un macronutriente esencial para todos los organismos (Vance 2003). Las plntulas se regaron con la solucin de Triamin que contiene aminocidos y oligopptidos ms nitrgeno, fsforo y potasio y esto hizo que las plntulas pudieran satisfacer sus necesidades nutricionales, sin embargo en el caso del fsforo y para las plntulas micropropagadas de pia, los resultados indican que es necesario adicionarle una mayor cantidad. En plantas cultivadas en suelo, un factor que complica la asimilacin del fsforo por las plantas es la movilidad ya que se ha demostrado que se generan zonas sin fsforo alrededor de las races (Hinsinger et al. 2005). En este caso, la solucin de riego se aplic en la proximidad de la raz de las plntulas, por lo que no se considera que la movilidad haya sido un problema y de esta manera las plantas pudieron asimilar el fsforo directamente va races aunque no se descarta que los HMA le proporcionaron una ruta adicional para la asimilacin de este nutriente (Zhu et al. 2001). La asimilacin puede ser ms

compleja debido a que se llevan a cabo mecanismos de transporte de alta y de baja afinidad. Para algunas especies vegetales, se ha sugerido la presencia de ms de siete cinticas de transporte. Los aspectos moleculares y bioqumicos de los sistemas correspondientes al transporte de fsforo se han estudiado extensivamente (Bucher 2007, Raghothama & Karthikeyan 2005), sin embargo en el caso de pia no se tiene documentado cul es el mecanismo de transporte del fsforo. Para el peso seco los HMA fueron los que tuvieron mayor relevancia respecto del fsforo. G. claroideum promovi que las plantas tuvieran mayor crecimiento en comparacin con las plantas inoculadas con G. fasciculatum y con las plantas control. Esta respuesta diferencial se ha reportado con anterioridad en plantas de Pueraria phaseoloides (Roxb.) Benth., donde el rea foliar, el peso fresco de la parte area y de las races fueron significativamente mayores en las plantas micorrizadas con Acaulospora tuberculata Janos et Trappe y Glomus manihotis Howeler, Sieverding et Schenck. que con otras micorrizas ensayadas (Boddington & Dodd 1998). La explicacin probablemente est relacionada con la proporcin de propgulos infectivos en el inculo de los HMA o con el patrn de crecimiento de las hifas de los HMA dentro de las races de la planta. Schnepf et al. (2007) estudiaron el crecimiento de tres HMA (Scutellospora calospora Nicol. et Gerd, Glomus sp. y Acaulospora laevis Gerd. et Trappe, encontrando que los tres crecieron con distintos patrones de ramificacin de las hifas. Previamente este grupo de trabajo demostr que los mecanismos de asimilacin de fsforo son diferentes entre distintos HMA y que estn relacionados con el crecimiento de las hifas (Schnepf & Roose 2006). En conclusin, los resultados demostraron que las respuestas de las plntulas fue diferente en funcin de la especie de HMA inoculado y que si se combina con una concentracin adecuada de fsforo puede promoverse un mayor crecimiento de las plantas micropropagadas de pia.

AGRADECIMIENTOS La investigacin fue financiada por la Direccin General de Educacin Superior Tecnolgica proyecto: Co-inoculacin de micorrizas con organismos promotores del crecimiento vegetal para

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incrementar el crecimiento y nutricin de plantas micropropagadas, y el Fondo Mixto CONACYT Gobierno del Estado de Chiapas.

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Recibido: 16.12.08 Aceptado: 23.01.09