INSTALACIONES El cultivo de tejidos, como tcnica consiste esencialmente en aislar una porcin de la planta (explante), proporcionndole artificialmente las

condiciones fsicas y qumicas apropiadas para que las clulas expresen su potencial intrnseco o inducido. Es necesario adems adoptar procedimientos de asepsia para mantener los cultivos libres de contaminacin. Basados en este concepto, el diseo del laboratorio de cultivo de tejidos, puede presentar variaciones en magnitud y complejidad, dependiendo de los objetivos del laboratorio. rea de Lavado Todo el proceso de lavado y almacenamiento de material de vidrio, material estril y diferentes tipos de aguas (ionizada, destilada, bidestilada y bidestilada estril) necesarios en las actividades cotidianas del laboratorio se realizan en este sitio. Esta rea cuenta con un lavadero grande con tres fuentes de agua: fra, caliente y agua doblemente bidestilada usada para el enjuague final en el lavado de material de vidrio. As mismo se dispone en esta rea de estantera para el almacenamiento del material de vidrio y agua estril bidestilada que va a ser utilizada en los procesos de desinfeccin. rea de Neveras y Autoclave En esta rea se encuentran localizadas las neveras donde se almacenan los reactivos, soluciones stock y los diferentes medios de cultivos utilizados en el laboratorio. La autoclave empleada para la esterilizacin de los medios de cultivo se encuentra ubicada tambin en sta rea e igualmente el destilador de agua y una cmara de incubacin utilizada con fines de investigacin rea de Preparacin de Medios Como su nombre lo indica en esta rea se realiza la preparacin de medios de cultivo, pero tambin provee un espacio para el almacenamiento de material de vidrio y de plstico, reactivos qumicos y agua bidestilada. Esta rea cuenta con mesas de trabajo para la preparacin de medios, balanza analtica, pHmetro, agitadores magnticos, dispensadores de medios entre otros rea de Subcultivo En esta rea se realiza el trabajo de escisin, inoculacin y transferencia de los explantes a los medios de cultivo. Un alto nivel de asepsia debe ser mantenido en sta rea, por lo tanto se cuenta con un filtro electrosttico que se encuentra ubicado en el techo a la salida del aire acondicionado Los filtros electrostticos crean su propia carga de electricidad al unirse una malla de nylon con la malla de aluminio formando un campo magntico, segn el principio de la electrosttica y esto hace que el polvo sea retenido con ms eficiencia. El uso de este filtro no incrementa costos, ya que no necesita de electricidad para hacer su funcin electrosttica, y al hacer esto se favorece el nivel de asepsia, mantiene el rea y los equipos limpios de cualquier impureza. Las operaciones de inoculacin en medios de cultivo son realizadas en cmara de flujo laminar con la presencia de un mechero de alcohol industrial (alcohol metilito) y las herramientas estriles necesaria para esta actividad. Un total de seis cmaras de flujo laminar se encuentran ubicadas en sta rea Se disponen tambin de carros transportadores para la ubicacin de los medios de cultivo, material vegetal, dispensadores de alcohol al 70% y otros implementos requeridos en las

actividades del subcultivo. As mismo se dispone de recipientes para el material vegetal, el material inorgnico y de vidrio que se descarta. Cuarto de Crecimiento Las condiciones de incubacin o crecimiento de material in vitro de yuca son: 0 Temperatura : 26-28 C Iluminacin : 18.5 mol.m-2.s-1 Fotoperodo : 12 horas Calidad de luz : Lmparas fluorescentes, tipo luz da Humedad relativa : 50-70% El cuarto cuenta con un total de 16 estanteras metlicas pintadas de blanco, cada estantera est constituida por 5 pisos y cada piso permite la ubicacin de ocho gradillas y cada gradilla est ocupada por 6 materiales (5 tubos/material) lo que da una capacidad para 3,840 materiales. Cada piso de la estantera contiene una plataforma con perforaciones para facilitar una mejor aireacin y la dimensin es de 124 cm x 39 cm, la altura entre cada piso es de una 39 cm permitiendo una buena iluminacin, cada piso est provisto de una lmpara fluorescente luz da (balastos son instalados en la parte externa del laboratorio. El espacio entre el suelo y el primer piso debe ser entre 10 y 20 cm para facilitar las labores de limpieza. La regulacin de la temperatura se realiza a travs de un sistema de refrigeracin el cual est conectado a sensores de temperatura que permiten detectar alteraciones de la misma. Explante Varios factores deben ser tenidos en cuenta en la eleccin del explante apropiado para el establecimiento de los cultivos in vitro, entre ellos: Objetivo del cultivo Posibilidad de contaminacin con microorganismos: De ser posible, se deben cultivar explantes de plantas donantes que crecen en condiciones de invernadero, con ello se reduce sustancialmente las tasas de contaminacin. Por otra parte, es recomendable evitar el uso de explantes sucios (races, rizomas) que provienen de plantas crecidas en macetas o en el campo, dado que en la mayora de los casos no es posible conseguir una buena desinfeccin de los mismos. Edad fisiolgica: Este es un aspecto de gran influencia en la morfognesis. Como regla general se puede decir que cuando ms joven e indiferenciado se encuentre el explante a cultivar, mejor ser su respuesta in vitro. Es por ello que los meristemas apicales y axilares son ampliamente usados en numerosas especies. En el caso de la micropropagacin de plantas leosas, la edad del explante es un factor crtico. Si los tejidos son jvenes, la Micropropagacin tiene mayores posibilidades de ser exitosa que con tejidos maduros. Este hecho genera la necesidad de realizar tratamientos de rejuvenecimiento de las plantas donantes de explantes. Tamao: En general, cuanto ms grande sea el explante mayores sern las posibilidades de inducir la proliferacin de callos o la regeneracin directa de rganos. Sin embargo, a mayor tamao de explante tambin son mayores las probabilidades de que los cultivos se contaminen con microorganismos. Tambin es necesario tener en cuenta que existe un tamao mnimo del explante, que depende de la especie y del material vegetal, por debajo del cual no es fcil lograr el establecimiento de los cultivos. Los explantes muy pequeos suelen requerir del empleo de medios ms complejos o de los denominados medios acondicionados. Epoca del ao: Es un factor que suelen tener mucha importancia en la micropropagacin y que generalmente est asociado al grado de dormicin que

presentan ciertos explantes (yemas, por ejemplo) y tambin con la posibilidad de mayor o menor proliferacin de microorganismos.

Asepsia De los principales problemas que se presentan cuando se tratan de establecer los cultivos es el de la contaminacin de los mismos con diversos tipos de microorganismos (hongos, levaduras, bacterias, fitoplasmas, virus). El ambiente generado por explante-medio de cultivo-condiciones fsicas de incubacin es altamente propicio para la proliferacin de muchos de estos microorganismos que pueden provocar la destruccin de los cultivos. Es difcil cuantificar el impacto de estas prdidas, pero en promedio, en laboratorios dedicados a la micropropagacin se lo puede estimar en alrededor del 10%. En el mejor de los casos, estos microorganismos no destruyen los cultivos pero compiten con el explante por los nutrientes del medio de cultivo o bien lo modifican. Es muy difcil conseguir cultivos estrictamente aspticos dado que en la mayora de los casos es altamente probable que los mismos contengan virus y fitoplasmas, por lo que en la prctica, cuando se refiere a cultivos aspticos, en general se quiere significar que son cultivos donde no se produce la proliferacin de hongos y bacterias.Dos son las fuentes de contaminaciones: a) microorganismos presentes en el interior o en la superficie de los explantes y b) fallas en los procedimientos de cultivo en el laboratorio. La correcta deteccin de estas fuentes y del tipo de microorganismo son aspectos importantes para el xito de los cultivos, pues por un lado ayuda a determinar la fuente de contaminacin y por otro lado, ayuda a la planificacin de los procedimientos para controlarlos. Varios gneros de bacterias (Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia, Enterobacter, Agrobacterium, Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, Mycobacterium, Corynebacterium) y de hongos filamentosos (Aspergillus, Penicilium, Fusarium, Alternaria, Cladosporium y Neurospora) estn frecuentemente en los cultivos. Es conveniente inspeccionar visualmente 1. Conocer el material vegetal con que se trabaja y los posibles contaminantes especficos. 2. Realizar una adecuada preparacin de la planta dadora de explantes, cultivndola preferentemente en invernaderos tratadas con productos qumicos que eliminen patgenos y eventuales microorganismos endfitos. 3. Proceder a la desinfeccin superficial de los explantes mediante el uso de compuestos qumicos con el objeto de eliminar los microorganismos con el menor dao posible para el explante. Si bien no es posible recomendar un procedimiento general, se puede sealar que el procedimiento ms popularizado consiste en una doble desinfeccin mediante la inmersin de los explantes en etanol (70%v/v) durante 20-60 segundos seguido de hipoclorito de sodio 1 -3%, contenido en el agua de lavandina comercial, durante 3 a 30 minutos, dependiendo de la naturaleza del explante. Algunos procedimientos se basan en el empleo de nicamente etanol o de hipoclorito de sodio. Finalmente, es necesario eliminar los restos de estos productos mediante varios lavados con agua destilada estril. En este ltimo punto hay que aconsejar que se utilice agua destilada estril de reciente preparacin, dado que est demostrado que el almacenaje prolongado del agua estril puede ser la causa de contaminaciones con bacterias. Es aconsejable realizar estas operaciones de desinfeccin superficial en una cmara de transferencia con aire estril. En lugar del hipoclorito de sodio se puede utilizar hipoclorito de calcio (6 -12 %) o el cloruro de mercurio (0,1%- 1,5%). Es preciso recomendar extrema cautela con el empleo de este ltimo compuesto, dado que es altamente txico y adems no es removido con facilidad del explante.

En los casos en que no se utilice etanol, la adicin de agentes tensoactivos junto con el desinfectante es una prctica recomendada. Entre los ms usados figuran Tween-20 (0,01 0.1%) o unas gotas de Triton. El lavado previo de los explantes con agua corriente y detergentes, ayuda a una mejor desinfeccin. La inmersin de los explantes en soluciones conteniendo sustancias antibiticas y /o antimicticas (gentamicina, sulfato de estreptomicina, ampicilina, tetraciclina, carbenicilina, sulfato de gentamicina, pentacloronitrobenceno, rifampicina, anfotericina B, benomil, carbendazim) puede ser de utilidad, pero deben ser utilizados en casos excepcionales. Estos productos tienen el inconveniente de que alteran la composicin de los medios de cultivo y adems pueden ser metabolizados por los explantes. ltimamente han aparecido soluciones biocidas que matan bacterias y hongos, previenen la germinacin de esporas y a altas concentraciones pueden eliminar contaminaciones de microorganismos endfitos. Uno de estos compuestos es el PPM (Plant Preaservative Mixture). Otro ejemplo es el denominado G-1, un compuesto derivado de los furfurales de la caa de azcar. Este compuesto, qumicamente: 1-(5-bromofur-2-il)-2- bromo-2-nitroeteno fue desarrollado en la Universidad Central de las Villas (Cuba) y tiene efecto bactericida y fungicida de amplio espectro. En los casos en que se utilicen plntulas crecidas in vitro como plantas donantes de explantes, es necesario desinfectar las semillas para su cultivo y germinacin y luego es aconsejable desinfectar tambin las plntulas resultantes. En algunos materiales vegetales se utiliza la preincubacin de los explantes mediante lo cual stos son desinfectados suavemente y precultivados durante 24 horas en un medio conteniendo sacarosa, y finalmente son desinfectados nuevamente y cultivados. 4. Emplear medios e instrumentos de cultivo esterilizados, es decir, liberados completamente de cualquier microorganismo vivo o esporas. Para la esterilizacin, en la mayora de los casos se hace uso del calor en sus diversas formas: llama directa, calor hmedo (en forma de vapor abierto o bajo presin), calor seco (aire caliente). Se pueden usar hornos a microondas. El agua caliente tambin puede ser usada. En el caso de sustancias termolbiles, la esterilizacin se puede hacer mediante filtracin a travs de filtros bacteriolgicos. No es posible recomendar ningn sistema de esterilizacin dado que la exitosa destruccin de los microorganismos depende de mltiples factores entre los que interesan el tamao del recipiente, el tiempo de esterilizacin y la naturaleza de la sustancia a esterilizar. Sin embargo, se pueden dar algunas sugerencias: La esterilizacin en estufas mediante calor seco (aire caliente) es recomendable para esterilizarrecipientes de vidrios secos (pipetas, cpsulas de Petri, tubos). En estos casos, 2-4 horas en estufas a 180-200 C brindan excelentes resultados. La esterilizacin con calor hmedo con vapor bajo presin (en autoclave o en una olla a presin). Es el procedimiento ms empleado para la esterilizacin de los medios de cultivo (salvo, como se indic ms arriba, para aquellos que posean componentes termolbiles). En este caso, lo ms comn es usar una presin de 1.46 kg.cm-2 durante 20 minutos, con lo que prcticamente se destruyen todas las formas de vida. Es importante que en todos los puntos del autoclave se alcance dicha temperatura, para lo cual hay disponibles cintas detectoras colorimtricas. 5. Cultivar los explantes en una cmara de transferencia con aire estril (gabinete de flujo laminar), localizada en un ambiente limpio y no expuesta a corrientes de aire. De no disponer este equipamiento, se pueden sustituir con cuartos esterilizados previamente con luz ultravioleta (nunca exponerse a la luz UV en forma directa). La mesada de

trabajo y las paredes del gabinete deben ser desinfectadas previamente con etanol al 70%. De la misma manera deben ser desinfectados exteriormente todos los recipientes (conteniendo medios de cultivo, agua, etc.) que ingresen en el rea del aire estril. Los operarios constituyen frecuentemente una importante fuente primaria de contaminacin, porque es recomendable que, antes de comenzar a trabajar laven sus manos y antebrazos con abundante agua y jabn y se desinfecten con etanol al 70 %. La utilizacin de guardapolvos, guantes y mscaras protectoras de la boca y de la nariz, as como los gorros protectores de los cabellos, ayudan a reducir sensiblemente los niveles de contaminacin. Los instrumentos de trabajo (pinzas, pipetas, tijeras, agujas, cpsulas de Petri) deben ser esterilizados antes de su uso. Muchos de estos instrumentos pueden ser colocados en etanol al 95% y, antes de ser usados, se deben flamear cuidadosamente en la llama de un mechero. Tambin es necesario flamear la boca de los recipientes que contienen los medios de cultivo antes y despus de cultivar el explante. 6. Incubar los cultivos en cmaras o cuartos de cultivo, cerrados, libres de corrientes de aire y bien higienizados. En lo posible se debe restringir la circulacin de personas, y los recipientes con cultivos contaminados deben ser rpidamente eliminados de este sector. Es conveniente que antes del lavado, estos cultivos sean esterilizados. Medios de cultivo Un medio de cultivo puede ser definido como una formulacin de sales inorgnicas y compuestos orgnicos requeridos para la nutricin y manipulacin de los cultivos. Existen numerosas formulaciones, cada una de las cuales comprende entre 6 y 40 compuestos. Para dar una idea de la cantidad de formulaciones disponibles, George y col., luego de revisar ms de 3.000 trabajos cientficos describen en dos tomos (casi 1.000 pginas en total) ms de 2.000 medios de cultivo. Tambin dos empresas multinacionales ofrecen para la venta ms de 60 medios cada una, listos para su utilizacin especialmente en la Micropropagacin comercial de plantas. En la Tabla 1 se presentan tres medios que son muy usados en la actualidad. Bsicamente, los medios de cultivo se componen de compuestos que suministran: Una fuente de carbono Nutrientes minerales Sustancias vitamnicas Sustancias reguladoras del crecimiento Agente gelificante (en el caso de medios semislidos) Otros compuestos: Fuente de carbono: Prcticamente todos los cultivos son hetertrofos (comparativamente unos pocos son auttrofos) y por ende necesitan del suministro de una fuente de carbono. La sacarosa, en concentraciones de 2 al 5%, es el azcar ms utilizado. En algunos medios se la reemplaza por glucosa. En casos particulares se cita el empleo de maltosa o galactosa. Tambin myo-inositol (100 mg/L) suele ser incorporado a los medios resultando un mejor crecimiento de los cultivos. Nutrientes minerales: Los medios de cultivo deben suministrar los mismos macro y micronutrientes que son esenciales para el crecimiento de las plantas enteras. En general se destacan las concentraciones relativamente altas de nitrgeno y potasio.

El nitrgeno es suministrado en forma de amonio y/o nitrato. Tambin se pueden utilizar urea, glutamina y casena hidrolizada. Es fundamental que el hierro sea incorporado juntamente con un agente quelante (Na2EDTA), lo que lo hace disponible es un amplio rango de pH. Sustancias vitamnicas: De todas las que comnmente se incorporan a los medios, pareciera que la tiamina es la nica realmente imprescindible para el buen crecimiento de los cultivos. Sustancias reguladoras del crecimiento: En la mayora de los casos los medios utilizados para el establecimiento de los cultivos contienen auxinas (ANA, 2,4-D, AIA, AIB, NOA, Dicamba, Picloram) y/o citocininas (BA, KIN, ZEA, 2iP, Thidiazurn). Las giberelinas (especialmente GA3) son requeridas en algunas ocasiones para el cultivo de meristemas o para la elongacin de brotes. El ABA, es usado en algunos casos. Agente gelificante (en el caso de medios semislidos): El agar (entre 0,6 y 1%) es el compuesto ms utilizado. Tambin pueden emplearse Agargel (0,40-0,60%), Transfergel (2,0-2,60%), Phytagel (0,25- 0,40%), agarosa (0,80-0.90%) y Gelrite (0,100,20%). Otros compuestos: Muchas sustancias, de variada composicin qumica, suelen ser adicionadas a los medios bsicos. Adems de la glicina, otros aminocidos se pueden agregar a los medios. Es el caso de L-tirosina, asparagina y cistena, aunque hay que tener presente que en dosis altas pueden inhibir el crecimiento de los cultivos. El carbn activado (0,1 a 5%) suele ser incorporado al medio, dado que es probable que absorba metabolitos txicos para los cultivos. En algunos medios se incorporan cidos orgnicos como el mlico, el ctrico, el pirvico y el succnico y es frecuente el empleo de L-glutamina y de casena hidrolizada. An hoy se siguen utilizando ciertos componentes de composicin qumica no bien definida como el agua de coco (5 a 15%), jugo de tomate y pur de banana. Tambin en ocasiones es necesaria la incorporacin de agentes antioxidantes (L-cistena, cido ascrbico, polivinilpirrolidona) para prevenir el ennegrecimiento tisular causado por la oxidacin de polifenoles presentes en los explantes. Este ennegrecimiento puede causar la muerte de los mismos. La preparacin de los medios de cultivo puede llevarse a cabo de diferentes maneras, en lecturas recomendadas se citan manuales de laboratorio donde se describen detalladamente este punto. Condiciones ambientales para la incubacin. La incubacin de los cultivos se debe llevar a cabo en condiciones controladas. Por lo menos en lo que se refiere a temperatura, calidad e intensidad de luz, fotoperodo, humedad atmosfrica e higiene. Estas condiciones se logran con el empleo de cmaras climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (fro-calor) y una buena y uniforme

circulacin de aire en el interior y dotados de un buen sistema de alarma para cortar la iluminacin en caso de no funcionar el aire acondicionado. En general, los cultivos son incubados a temperatura constante de 25-28 C, con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz es generalmente provista por lmparas fluorescentes del tipo luz da con una irradiancia de entre 50 y 200mol m-2s-1. La humedad atmosfrica debe ser elevada (80- 90%).