Carhuapoma Ym

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA

UNIDAD DE POST GRADO

Composicin qumica, actividad anti-Helicobacter pylori
y antioxidante del aceite esencial de Satureja brevicalyx
Epling "urqu mua

TESIS
para optar al grado acadmico de Doctor en Farmacia y Bioqumica

AUTOR
Mario Carhuapoma Yance

ASESOR
Pablo Bonilla Rivera

Lima Per
2007

2

Al ADN, una de las misteriosas maravillas
universales. Talvez mutaramos el gen egosta, si
tuviramos la facultad.

A la Va Lctea, por mantenerla en su ceno a
la Tierra y sta a los seres vivos, en especial
a las plantas, inmenso biolaboratorio de
diversos metabolitos biodinmicos, preceptora
de la VIDA.

A mi GRAN PROSAPIA: Teofila, Rmulo,
Sofa, Miriam, Rodrigo, Florisa, Pablo y
Sonia.

3
AGRADECIMIENTO

A travs de una oracin al Ser Divino que vive en nuestro instinto.

Al Dr. Pablo Bonilla R.
Por su valiosa asesora y dedicacin.

Al Dr. Ral Len B. y Dr. Robert H. Gilman, de la Universidad
Peruana Cayetano Heredia.
Por su valiosa colaboracin y dedicacin.

A la Dra. Roser Vila, de la Universidad de Barcelona.
Por su permanente colaboracin y apoyo.

A la Dra. Luz Oyola de Bardales, miembro del Jurado Informante.

A los miembros del Jurado Examinador y
Calificador
Dr. Pedro Cotillo Zegarra
Dra. Elosa Hernndez Fernndez
Dra. Nancy Lozano Reyes
Dr. Pablo Bonilla Rivera
Dra. Luzmila Troncoso Corzo

4
SUMARIO
RESUMEN
SUMMARY
RESUMO
I. INTRODUCCIN 1
II. GENERALIDADES 3
2.1. Antecedentes generales referentes a la especie 3
2.1.1. Taxonoma 3
2.1.2. Descripcin botnica 3
2.1.3. Biodiversidad del gnero Satureja 3
2.1.4. Distribucin geogrfica 4
2.1.5. Antecedentes etnobotnicas y etnofarmacolgicas 4
2.1.6. Investigaciones fitoqumicas 4
2.1.5. Investigaciones farmacolgicas 4
2.2. Helicobacter pylori y radicales libres 5
2.2.1. Helicobacter pylori 5
2.2.2. Radicales libres 6
2.2.3. Helicobacter pylori y dao oxidativo 7
2.2.4. Helicobacter pylori y sntesis de xido ntrico 7
2.3. Aceites esenciales 8
2.3.1. Actividad anti-Helicobacter pylori y antioxidante de aceites esenciales
8
III. PARTE EXPERIMENTAL 13
3.1. Materiales y mtodos 13
3.1.1. Lugar de ejecucin 13
3.1.2. Materiales, equipos y reactivos 13
3.1.3. Mtodos 14
3.1.3.1. Obtencin de la muestra 14
3.1.3.2. Procesamiento de la muestra 14
3.1.3.3. Obtencin del aceite esencial 14
3.1.3.4. Determinacin del rendimiento de aceite esencial 15
3.1.3.5. Determinacin de las constantes fsicas del aceite esencial 15
3.1.3.6. Elucidacin estructural de los componentes qumicos del AE 15
3.1.3.7. Evaluacin de la citotoxicidad en Artemia salina Leach por

5
el mtodo de Anderson, Meyer y Thompson 16
3.1.3.8. Evaluacin de la toxicidad aguda por el mtodo de Dosis Fija 17
3.1.3.9. Evaluacin de la actividad anti-Helicobacter pylori del AE 18
3.1.3.9.1. Aislamiento y activacin de la cepa 18
3.1.3.9.2. Determinacin de la actividad anti-Helicobacter pylori,
mtodo de Bauer-Kirby 18
3.1.3.9.3. Determinacin de la concentracin mnima inhibitoria y
concentracin mnima bactericida 19
3.1.3.10. Actividad antioxidante 20
3.1.3.10.1. Mtodo de la actividad secuestradora del radical 1,1-difenil-2-
picrilhidrazilo 20
3.1.3.10.2. Mtodo de la actividad secuestradora del radical hidroxilo 21
3.1.3.10.3. Actividad inhibidora de la lipoperoxidacin lipdica microsomal 23
3.2. Anlisis estadstico de resultados 24
IV. RESULTADOS 25
V. DISCUSIN 48
VI. CONCLUSIONES 54
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 55
VIII. ANEXOS

6
RESUMEN
El Helicobater pylori, principal agente causal de la gastritis, condiciona el estrs
oxidativo debido a la produccin de radicales libres. La Satureja brevicalyx, es
usada para tratar problemas gastrointestinales, como la gastritis. El objetivo del
presente trabajo fue caracterizar los componentes qumicos, la actividad anti-
Helicobacter pylori y antioxidante del aceite esencial de Satureja brevicalyx.
El aceite esencial report un rendimiento (1.80%v/p), rotacin ptica (-2 a +4),
densidad (0.9047 g/mL) e ndice de refraccin (1.475). Mediante CG-SM y CG-
FID se elucid 35 compuestos al 97.1%: monoterpenos oxigenados (74.8%),
como componentes mayoritarios la pulegona (27.2%), linalol (20.3%), mentona
(11.1%), isomentona (8.3%), cis-isopulegona (2.7%), trans-isopulegona (0.9%),
carvacrol (0.6%), timol (0.6%) y -terpineol (0.5%); hidrocarburos
sesquiterpnicos (16%), destacando biciclogermacreno (8.2%), -cariofileno
(6.5%) y bicicloelemeno (0.5%); hidrocarburos monoterpnicos (4.1%), con el p-
cimeno (2.0%), limoneno (0.7%) y -terpineno (0.6%); y sesquiterpenos
oxigenados (1.5%), con el espatulenol (0.8%). Por el mtodo de Artemia salina
mostr una bioactividad significativa, con una CL
50
de 13.35 g/mL, y por el
mtodo de Dosis Fija, en ratones albinos, presenta una DL
50
de 655.26 mg/kg,
siendo ligeramente txica. Por el mtodo de Difusin de Discos, tiene un efecto
antibacteriano frente al H. pylori, con un halo de inhibicin de 33.33 % en
comparacin con la amoxicilina a una concentracin de 10 g/mL; por el mtodo
de Difusin en Microplacas, la concentracin mnima inhibitoria es de 1.00
g/mL, y la concentracin mnima bactericida de 2.00 g/mL. Se determin en 3
modelos la actividad antioxidante a concentraciones de 10, 50 y 100 g/mL: 1) El
aceite inhibi al radical DPPH en 67.76, 75.33 y 86.84%, frente al trolox que
inhibi en 80.59, 87.17 y 93.09%; 2) secuestr al radical hidroxilo en 28.95,
51.57 y 76.84%; y 3) inhibi de la peroxidacin lipdica en 16.4x10
-8
, 9.8x10
-8

y 8.5x10
-8
moles x cm, comparado con el trolox que lo hizo en 14.9x10
-8
, 8.0x10
-
8
y 7.5 x10
-8
moles x cm, frente a 53.9x10
-8
moles x cm para el control negativo.
Las estructuras qumicas del aceite esencial de la S. brevicalyx justifican su
actividad anti-Helicobacter pylori y antioxidante.

Palabras clave: Satureja brevicalyx, gastritis, radicales libres, anti-
Helicobacter pylori, antioxidante.

7
SUMMARY

The Helicobacter pylori is the main causal agent of gastritis, it conditions the
oxidative stress due to the fact that it produces free radicals. The Satureja
brevicalyx is used to treat gastrointestinal problems as gastritis. The objective of
this work was to characterize the chemical components, the anti-Helicobacter
pylori activity and the antioxidant of the main oil of Satureja brevicalyx. Te main
oil reported a performance (1.80%v/p), optical rotation (- 2 to + 4), density
(0,9047 g/mL) and index of refraction (1.475). By means of CG-SM and CG-FID
elucidated 35 compounds at 97,1%: oxygenated monoterpens (74,8%) as
majority compound the pulegone (27,2%), linalool (20,3%), menthone (11,1%),
isomenthone (8,3%), cis-isopulegone (2,7%), trans-isopulegone (0,9%), carvacrol
(0,6%), thymol (0,6%) and -terpineol (0,5%); sesquiterpenes hydrocarbons
(16%), emphasizing biciclogermacrone (8,2%), -caryophyllene (6,5%) and
bicicloelemene (0,5%); monoterpenic hydrocarbons (4,1%), with the p-cymene
(2,0%), limonene (0,7%) and -terpineno (0,6%); and sesquiterpenes (1,5%), with
espatulenol (0,8%). By the method of Artemia salina it showed a significant
bioactivity, with a CL
50
of 13,35 g/mL, and by the method of Fixed Dose, in
albinae mice shows a DL
50
of 655,26 mg/kg being slightly toxic. By the method of
the Diffusion of Discs, it has an antibacterial effect of the H. pylori, with an halo
of inhibition of 33,33% in comparation with the amoxiciline in a concentration of
10 g/mL; by the method of Diffusion in Microplacas, the minimum inhibitory
concentration is of 1,00 g/mL, and the minimum bactericide concentration is of
2,00 g/mL. The antioxidant activity to concentrations was determined in three
models the concentrations must be of 10, 50 and 100 g/mL: 1) The oil inhibited
the radical DPPH in 67.76, 75,33 and 86,84%, in relation with trolox which
inhibited in 80.59, 87,17 and 93,09%; 2) kidnapped the hidroxile radical in 28.95,
51,57 and 76,84%; and 3) inhibited the lipidic peroxidation in 16.4x10
-8
, 9.8x10
-8

and 8.5x10
-8
moles x cm, in relation with trolox which inhibited in 14.9x10
-8
,
8.0x10
-8
and 7.5 x10
-8
moles x cm, in relation to a 53.9x10
-8
moles x cm for the
negative control. The chemical structures of the main oil of the S. brevicalyx
justify its activity as an anti-Helicobacter pylori and as an antioxidant.

Key words: Satureja brevicalyx, gastritis, free radicals, anti-Helicobacter
pylori, antioxidant.

8
RESUMO
O Helicobacter pylori, principal agente causador da gastrite, provoca o estresse
oxidativo devido produo de radicais livres. A Satureja brevicalyx, usada
para tratar problemas gastrentestinais, como a gastrite. O objetivo do presente
trabalho caracterizar os componentes qumicos, a atividade anti-Helicobacter
pylori e antioxidante do leo essencial da Satureja brevicalyx. O leo essencial
indicou rendimento (1,80%v/p), rotao ptica (-2 a +4), densidade (0,9047
g/mL) e ndice de refrao (1,475). Mediante CG-SM e CG-FID foram
descobertos 35 compostos em 97,1% os monoterpenos oxigenados (74,8%).
Como componentes maioritrios a pulegona (27,2%), linalol (20,3%), mentona
(11,1%), isomentona (8,3%), cis-isopulegona (2,7%), trans-isopulegona (0,9%),
carvacrol (0,6%), timol (0,6%) e -terpineol (0,5%); hidrocarburos
sesquiterpnicos (16%), destacando biciclogermacreno (8,2%), -cariofileno
(6,5%) e bicicloelemeno (0,5%); hidrocarburos monoterpnicos (4,1%), com p-
cimeno (2,0%), limoneno (0,7%), -terpineno (0,6%); sesquiterpenos oxigenados
(1,5%), e o espatulenol (0,8%). O uso de Artemia salina apresentou uma
bioatividade significativa, com uma CL
50
de 13,35 g/mL, e com o uso de Dose
Fixa em ratos albinos, apresentou uma DL
50
de 655,26 mg/kg, sendo
ligeiramente txica. O mtodo de Difuso de Discos, apresentou um efeito
antibacteriano frente ao H. pylori, com um halo de inibio de 33,33 % em
comparao com a amoxicilina em uma concentrao de 10 g/mL; pelo mtodo
de Difuso em Microplacas, a concentrao mnima inibidora de 1,00 g/mL, e
a concentrao mnima bactericida de 2,00 g/mL. Determinou-se, atravs de 3
modelos, a atividade antioxidante em concentraes de 10, 50 e 100 g/mL: 1) O
leo bloqueou o radical DPPH em 67,76, 75,33 e 86,84%, frente ao trolox que
bloqueou em 80,59, 87,17 e 93,09%; 2) isolou o radical hidroxila em 28,95,
51,57 e 76,84%; e 3) bloqueou a perioxidao lipdica em 16,4x10
-8
, 9,8x10
-8

e 8,5x10
-8
moles x cm, comparado com o trolox que o fez em 14,9x10
-8
, 8,0x10
-
8
e 7.5 x10
-8
moles x cm, frente a 53.9x10
-8
moles x cm para o controle negativo.
As estruturas qumicas do leo essencial da S. brevicalyx justificam sua
atividade anti-Helicobacter pylori e antioxidante.
Palavras-chave: Satureja brevicalyx, gastrite, radicais livres, anti-Helicobacter
pylori, antioxidante.

9
I. INTRODUCCIN
El Helicobacter pylori, es una bacteria que invade la capa mucosa del
estmago, a nivel del antro pilrico, resiste a los efectos del jugo gstrico y del
cido clorhdrico debido a su enzima ureasa y otros mecanismos de defensa.
La presencia y los efectos de H. pylori a nivel del estmago condicionan la
gastritis crnica, conllevando a la produccin de radicales libres, las cuales
inician la lipoperoxidacin de las membranas celulares y afeccin a nivel de
biomolculas como protenas, carbohidratos y cidos nucleicos, generando
mutaciones del ADN y el cncer gstrico.
En los pases en vas de desarrollo existen una alta prevalencia de infeccin por
H. pylori, inicindose desde la niez, por el dficit de agua potable, la higiene y
otros factores correlacionantes. Los esquemas de tratamientos con antibiticos
no son suficientes, muchas de ellas estn generando resistencia antibacteriana,
adems de generar efectos colaterales y secundarios.
Las informaciones etnofarmacolgicas, han propuesto diversas especies
vegetales con propiedades antimicrobianas, antiinflamatorias y antioxidantes,
como la Satureja brevicalyx, que por las serranas del Per son usadas para
tratar problemas de gastritis y otras afecciones gastrointestinales.
La S. brevicalyx es una planta aromtica que contiene, como parte de sus
metabolitos secundarios, aceites esenciales, sustancias que en su mayora estn
compuestos por monoterpenos y sesquiterpenos; conteniendo grupos
funcionales de tipo fenlico, como el timol y carvacrol, que son antimicrobianos
de primer orden; alcoholes, como linalol y -terpineol, antimicrobianos de
segundo orden; y compuestos cetnicos, como pulegona, mentona, isomentona,
cis-isopulegona, trans-isopulegona, etc, antimicrobianos de tercer orden.
Los aceites voltiles, contienen estructuras qumicas de tipo fenlico (timol,
carvacrol, eugenol, vainillina). Son conocidos que los compuestos fenlicos
poseen actividad antioxidante, ya que tienen grupos hidroxi e insaturaciones que
permiten interactuar con los electrones desapariados de los radicales libres,
neutralizndolos de su alta reactividad txica.

10
El presente trabajo pretende validar las propiedades farmacolgicas del aceite
esencial de la Satureja brevicalyx, plantendose el siguiente objetivo:
Caracterizar los componentes qumicos del aceite esencial de la Satureja
brevicalyx, determinar su actividad anti-Helicobacter pylori y antioxidante.

11
II. GENERALIDADES
2.1. ANTECEDENTES GENERALES DE LA ESPECIE
2.1.1. Taxonoma
Segn el sistema de clasificacin de A. Cronquist (1981)
[1,2]
, la especie se ubica
en la siguiente categora taxonmica:
DIVISIN : Magnoliophyta
CLASE : Magnoliopsida
Sub- CLASE : Asteridae
ORDEN : Limiales
FAMILIA : Lamiaceae
GNERO : Satureja
ESPECIE : Satureja brevicalyx Epling

Sinonimia vulgar : urqu mua, wayra mua, sacha mua, mua, "inca
mua", "salqa mua" cjunumua, cjua, konoc y organo de los incas
[3,4]
.

2.1.2. Descripcin botnica
Es de porte arbustiva perennifolio, erguido de 1.0-1.5m de altura, aromtica y
pubescente. Hojas muy pequeas, espatuladas, ssiles, verticiladas y opuestas,
de margen entero. Flores blancas, solitarias, axilares, tetrmeras, bilabiadas;
cliz gamospalo; corola gamoptala; androceo con estambres didnamos;
gineceo con ovario spero, estilo apical y estigma simple. Florece en primavera y
verano
[3,4]
(figura 1 y 2, anexo).

2.1.3. Biodiversidad del gnero Satureja
El gnero Satureja cuenta con unas 200 especies en el mundo, todas estas
especies son de regiones templadas y tropicales de ambos hemisferios de
la Tierra. En el Per se han identificado unas 26 especies, de las cuales 20
son endmicas. La Satureja brevicalyx es una especie endmica de las
regiones altoandinas sureas del Per
[2-5]
.

12
2.1.4. Distribucin geogrfica
La S. brevicalyx crece en la parte sur andina del Per (Ayacucho,
Apurimac, Cuzco y Puno), entre las altitudes de 3300 3800 msnm, es de
predileccin por laderas de suelos areno-arcillosos y pedregosos
[2-5]
.

2.1.5. Antecedentes etnobotnicas y etnofarmacolgicas
Segn informaciones etnobotnicas y etnofarmacolgicas es usada para
resolver problemas gastrointestinales y para la correccin de desordenes
menstruales. Es digestivo, carminativo, contra la gastritis, flatulencia y
antiespasmdica. Tambin es usado como analgsico soasando las hojas
en caso de dolores musculares y tortcolis
[3,4,6]
.

2.1.6. Investigaciones fitoqumicas
El extracto hidroalcohlico evidencia los siguientes metabolitos: resinas,
azcares reductores, catequinas, lactonas sesquiterpnicas, triterpenos,
esteroides, soponinas, taninos, flavonoides y aceite esencial
[4,6]
.

2.1.6. Investigaciones farmacolgicas
Segn Soto (1999)
[6]
, determin la actividad antiinflamatoria y analgsica
del extracto hidroalcohlico de S. brevicalyx en 400 mg/kg de peso,
aproximando tal actividad a la del cido acetilsaliclico y estando por debajo
del ketorolaco.
Diez (2002)
[7]
, determin la actividad antiespasmdica sobre el intestino
aislado de cobayo de una infusin acuosa al 5% de hojas y sumidades
floridas de S. brevicalyx, mostrando una ligera accin antiespasmdica
frente a la N-butilbromuro de hioscina.
Palomino (2005)
[8]
, concluye que el extracto acuoso liofilizado de las hojas
de S. brevicalyx posee capacidad de captacin de radicales libres, en
relacin a la vitamina C. Adems no existe diferencia estadsticamente
significativa en los niveles de lipoperoxidacin, glutatin y protenas
hepticas, utilizados como medida de estrs oxidativo.

13
2.2. HELICOBACTER PYLORI Y RADICALES LIBRES

2.2.1. Helicobacter pylori
H. pylori es un bacilo gram negativo y microaeroflico. Presenta de 4 a 6
flagelos unipolares o bipolares recubiertos por una vaina y ensanchados en
su extremo distal de dimetros entre 0,5 a 1,0 micra y de 2,5 a 4,5 micras
de longitud. Ingresa por la boca del tubo digestivo y mediante los flagelos
puede moverse en un medio de gran viscosidad, hasta ubicarse en la
superficie de la capa de mucus que recubre las clulas epiteliales de la
mucosa gstrica, del fundus y el antro pilrico preferiblemente, a donde se
adhiere por medio de adhesinas. Tambin puede colonizar al hospedero
situndose entre las uniones intercelulares
[9-11]
.
H. pylori no posee capacidad invasiva pues no se observa en forma
intracelular, sin embargo, es capaz de provocar dao epitelial debido
fundamentalmente a su batera enzimtica. La ureasa, una de sus
principales enzimas, es imprescindible en el proceso de colonizacin de la
mucosa gstrica; hidroliza la urea en amonio y CO
2
, esto proporciona un
pH casi neutro a su alrededor, que le permite evadir las propiedades
bactericidas del cido clorhdrico
[11]
. Las altas concentraciones de amonio
alteran la biosntesis del mucus gstrico, y recientemente se ha planteado
que puede proporcionar una energa adicional, la cual favorece la motilidad
de los flagelos por la generacin de un potencial de membrana
[12]
. Unido a
esto, las fosfolipasas hidrolizan las membranas celulares que liberan
lisolecitinas, las cuales constituyen un factor ulcerognico. Por su parte, los
tetrapptidos bacterianos y las enzimas mucinasa, lipasa y fosfolipasa
ejercen un importante efecto quimiotctico sobre eosinfilos y neutrfilos, lo
cual facilita su reclutamiento y proliferacin
[12]
. Estas clulas al activarse
provocan la liberacin de citocinas, que posibilitan el desarrollo de una
respuesta inflamatoria, la cual lesiona an ms la mucosa mediante la
liberacin de mediadores inflamatorios como los metabolitos del cido
araquidnico, los radicales libres del oxgeno y los factores activadores de
plaquetas, que junto con el microorganismo inducen la expresin de otros
receptores para la liberacin de interleucina 1, algunos factores de
crecimiento celular y los radicales libres oxidantes
[13-17]
.
14
El H. pylori induce la produccin de radicales libres, que afectan a las
clulas epiteliales del estmago, ocasionando el estrs oxidativo, atacando
a sus macromolculas como los lpidos, protenas, carbohidratos y cidos
nucleicos, conllevando a una ulcera y carcinognesis
[18-25]
.

2.2.2. Radicales libres
Un radical libre es cualquier especie qumica ya sea atmica o molecular,
capaz de existir independientemente y que contiene uno o ms electrones
desapareados en el orbital ms externo
[26]
.
Estos electrones generan un campo elctrico que no es anulado, lo que
ocasiona que la especie qumica sea paramagntica y por ende altamente
reactiva, capaces de actuar en los sistemas biolgicos dandolos
irreversiblemente
[26]
.
El estrs oxidativo es la exposicin de la materia viva a diversas fuentes
que producen una ruptura del equilibrio que debe existir entre las
sustancias o factores prooxidantes y los mecanismos antioxidantes
encargados de eliminar dichas especies qumicas, ya sea por un dficit de
estas defensas o por un incremento exagerado de la produccin de
especies reactivas del oxgeno
[27]
.
Todo esto trae como consecuencia alteraciones de la relacin estructura-
funcin en cualquier rgano, sistema o grupo celular especializado. El
estrs oxidativo ocasiona el dao oxidativo, sta ltima ocasiona un estado
patolgico y la muerte celular
[27]
.
Las especies reactivas de oxgeno (ERO) y especies reactivas de nitrgeno
(ERN), pueden generar carcinognesis por su capacidad de reaccionar con
el DNA y causar mutaciones. Recientemente se ha sugerido que el xido
ntrico y sus derivados producidos en tejidos inflamados, como la gastritis,
pueden contribuir al proceso de carcinognesis
[24]
.
2.2.3. Helicobacter pylori y dao oxidativo
La alteracin histolgica ms evidente en la mucosa gstrica, inducida por
la presencia del H. pylori, es la respuesta inflamatoria, cuya actividad
depende de la capacidad de respuesta del hospedero y de la actividad
15
bacteriana
[28]
. En los procesos inflamatorios, diferentes fagocitos, tales
como neutrfilos, macrfagos y eosinfilos generan radicales libres en
respuesta a mediadores pro-inflamatorios y productos de la pared celular
bacteriana
[29]
.
Las ERO y ERN, generados en el proceso inflamatorio reaccionan con el
DNA y pueden inducir alteracin de la expresin de proto-oncgenes
[30]
, o
bien como generar productos genotxicos como 8-hidroxinonenal o
malondialdehido, capaces de interactuar con blancos moleculares en el
DNA, o pueden convertir pro-carcingenos en cancergenos
[30]
.
La inestabilidad genmica demostrada por la inestabilidad de microsatlites
(MSI) es observada en 13 44% de los casos de cncer gstrico. La
mayora de los MSI de alto nivel es asociado a defectos del sistema de
reparo
[31]
, que pueden ser inducidos por radicales libres de oxigeno
[32,33]
.
Baik (1996)
[34]
, encontr altos niveles de daos oxidativos en el DNA de
clulas de la mucosa gstrica en la fase precoz de infeccin por el H.
pylori. Este resultado favorece la hiptesis de que la infeccin por H.
pylori sea el denominador comn entre la gastritis crnica y el carcinoma
gstrico.

2.2.4. Helicobacter pylori y sntesis de xido ntrico
Las especies reactivas de oxgeno y nitrgeno pueden tener importante
papel en la carcinognisis gstrica por inducir dao en el DNA directa o
indirectamente. Las especies reactivas de nitrgeno son derivados de la
sntesis de xido ntrico e inducidos por las citocinas liberadas por las
clulas mononucleares de la inflamacin
[35]
. Pacientes infectados por el H.
pylori presentan altos niveles de la enzima xido ntrico sintasa inducible
(iNOS)
[36]
.
El xido ntrico puede favorecer la acumulacin de mutaciones
potencialmente oncognicas por mecanismos como la inhibicin de las
enzimas del sistema de reparo, como hOGG1, que es responsable por ms
de 95% de la actividad de la va de reparo por extirpacin de la base, tal
16
como la extirpacin de 8-hidroxideoxiguanosina, que es el principal
producto de la actuacin de los radicales libres. El xido ntrico lleva a la
inactivacin del proceso de apoptsis por la nitrosilacin de protenas pro-
apoptticas, tales como p53, permitiendo de esta forma la sobrevivencia de
clulas con daos en el DNA
[36]
.

2.3. ACEITES ESENCIALES
Tambin llamada esencia o aceite voltil, que le da un carcter aromtico a
la planta que lo contiene.
Son constituyentes fitoqumicos con predominio voltil y odorfico, de
composicin qumica compleja, se originan a partir de los tejidos
secretores, almacenndose en pelos glandulares, cavidades esquizgenas
o lisignas. Generalmente son lquidos fluidos, ms livianos que el agua,
de olor fuerte y penetrante que recuerda a la planta de origen, incoloras o
amarillentas translucidas, solubles en alcohol, ter, cloroformo e insoluble
en agua, dejan manchas sobre el papel que desaparecen con el tiempo
[37-
39]
.
Qumicamente son sustancias terpnicas (monoterpenos y sesquiterpenos)
y derivados aromticos fenilpropnicos. Pueden ser de tipo alcohol, cetona,
fenol, ter, etc
[39]
.

2.3.1. ACTIVIDAD ANTI-HELICOBACTER PYLORI Y ANTIOXIDANTE DE
ACEITES ESENCIALES
En numerosos estudios los aceites esenciales han mostrado actividad
antibacteriana, anti-Helicobacter pylori y actividad antioxidante.
El aceite esencial de Cymbopogon citratus y Lippia citriodora a una
concentracin de 0.1% (v/v) inhibe el crecimiento de Helicobacter pylori a
0.01% entre un pH 4.0 - 5.0
[40]
.
Ramezani et al. (2004)
[41]
, determinaron la actividad anti-Helicobacter
pylori del aceite esencial de Pistacia vera en 12 tipos de cepas clnicas,
resultando la concentracin mnima inhibitoria (MIC) a 1.55 mg/mL. Los
principales componentes qumicos del aceite esencial son -pineno, -
pineno y -tuyona.
17
Bergonzelli et al. (2003)
[42]
, realiz estudios del aceite esencial de 60
especies aromticas y su actividad anti-Helicobacter pylori. De los cuales
30 especies mostraron un rango de inhibicin del crecimiento entre 0.7 a
6.3 cm de dimetro, adems determinaron que los constituyentes puros de
las diferentes especies que mostraron mayor poder anti-Helicobacter
pylori son carvacrol, isoeugenol, nerol, citral y sabineno.
Mahaboob et al. (2005)
[43]
, aislaron el eugenol (compuesto fenlico) y
cinamaldehido de los aceites esenciales de Eugenia caryophillis y
Cinnamomum verum, respectivamente. Enfrentaron estos 2 compuestos
a 30 cepas clnicas de H. pylori. Los resultados muestran la actividad
antibacteriana a 2 g/mL luego de 9 a 12 horas.
Silva et al. (2001)
[44]
, determinaron el efecto antibacteriano frente a H.
pylori del aceite esencial de Dittrichia viscosa subs. viscosa. A 44.40
g/mL muestra efecto antibacteriano y entre 88.80-133.20 g/mL inhibe
completamente el crecimiento.
Tzakou et al. (2003)
[45]
, encontr en el aceite esencial de Satureja
parnassica subs. parnassica cariofileno, carvacrol, xido de cariofileno,
espatulenol, p-cimeno y linalol. Concluyendo que estos compuestos,
principalmente el carvacrol, son los responsables de la actividad anti-
Helicobacter pylori.
Gllce et al. (2003)
[46]
, correlacionan la actividad antibacteriana y
antioxidante de la Satureja hortensis con las estructuras de timol y
carvacrol, adems del -terpineno y p-cimeno. El IC
50
es de 23.76 0.80
g/mL de la actividad antioxidante, determinado por el mtodo de DPPH.
Lagouri et al. (2005)
[47]
, correlacionan la actividad antioxidante del aceite
esencial de Satureja thymbra a sus constituyentes de grupo fenol, como
el carvacrol y timol.
Bezic et al. (1999)
[48]
, afirman que el timol y carvacrol son los marcadores
qumicos del aceite esencial del gnero Satureja, adems de la pulegona,
ratificando su presencia en Satureja cuneifolia. Afirmando que estos
18
compuestos qumicos son los responsables de la actividad antibacteriana y
antioxidante.
Los aceites esenciales tambin poseen actividades antioxidante y
anticancergeno. Los terpenos fenlicos, cido carnosoico, carnosol,
rosmarindifenol y rosmarinquinona componentes del aceite esencial de
Rosmarinus officinalis y Salvia officinalis muestran actividad
antioxidante
[49,50]
.
El timol, componente principal del aceite esencial de Thymus vulgaris y
del Thymus serpyllum (Lamiaceae), presentan actividad antioxidante, por
la estructura insaturada de la funcin fenol. Lo mismo ocurre con el
carvacrol y el eugenol que son de tipo fenlico, componentes mayoritarios
del aceite esencial de Origanum vulgare (Lamiaceae) y en Syzygium
aromaticum (Myrtaceae), respectivamente
[51,52]
.
Existen monoterpenos antioxidantes de accin anticancergena como el
limoneno y los pinenos, stas inhiben la produccin de colesterol y ayudan
en la proteccin de la actividad de ciertas enzimas
[53]
.
Zygadlo y col. (1995)
[54]
, demostraron el efecto antioxidante de los
aceites esenciales de Thymus vulgaris, Laurus nobilis, Foeniculum
vulgare, Eucalyptus globulus, Tagetes minuta, Satureja parvifolia y
Lippia polystachya en el aceite de soja. Los aceites esenciales de T.
vulgaris y L. nobilis exhibieron una significativa accin antioxidante
seguidos, en orden decreciente, por F. vulgare y E. globulus. Las
esencias de T. minuta, S. parvifolia y L. polystachya no mostraron efecto
antioxidante y su contribucin a la estabilidad oxidativa del aceite de soja
fue despreciable.
Choi et al. (2000)
[55]
, ensay la actividad antioxidante de los aceites
esenciales de 34 plantas del gnero Citrus por el mtodo de 1,1-Diphenyl-
2-picrylhydrazyl (DPPH), todas ellas presentaron dicha actividad en un
rango de 17.7 a 64%, comparado con el trolox.
Rekka et al. (1996)
[56]
, han investigado el efecto del chamazuleno,
metabolito activo del aceite esencial de las flores de Matricaria
19
chamonilla manzanilla, y encontraron que inhibi la lipoperoxidacin en
una manera dependiente del tiempo y la concentracin, presentando un
IC
50
de 18mM despus de 45 minutos de incubacin.
El eugenol y la vainillina, componentes de aceites esenciales de Syzygium
aromaticum clavo de olor, Cinnamomum verum (Lauraceae) canela y
Vanilla planifolia (Orquidaceae) vainilla, se usan como antioxidantes
naturales y tienen amplia aceptacin en la industria de los alimentos
[57]
.
Ricci et al. (2005)
[58]
, realiz un estudio de la composicin qumica,
actividad antimicrobiana y antioxidante del aceite esencial de Teucrium
marum (Lamiaceae), la que mostr una actividad antioxidante en los
ensayos de DPPH, radical superxido y en la formacin del radicales de
lipoperoxidacin. Ellos hipotticamente responsabilizan dicha actividad a
uno de los 30 componentes que identificaron, la dolichodial (9.38%).
Tambin algunos componentes de aceites esenciales reportan actividad
anticancergeno, ya que el cncer es una consecuencia del estrs
oxidativo. Silvestre et al. (2006)
[59]
, realiz un anlisis de los componentes
y la actividad anticancergeno del aceite esencial de Croton flavens
(Euphorbiaceae), la cual mostr citotoxicidad en lneas celulares de tumor
A-549 y DLD-1. Ellos correlacionan que esta actividad, posiblemente, se
debe a los componentes llamados -cadinol, -elemeno y -humeleno.
Carhuapoma (2006)
[60]
, encontr 40 compuestos al 93.6% del aceite
esencial de Luma chequen, y a su vez determin la actividad antioxidante
en 3 modelos. Los resultados sugieren que la actividad antioxidante se
debe al geraniol, -pineno, linalol, -pineno, myrceno, limoneno, p-cimeno,
terpinen-4-ol y -terpineol.

III. PARTE EXPERIMENTAL
3.1. MATERIALES Y MTODOS
3.1.1. LUGAR DE EJECUCIN
20
El presente trabajo de investigacin se desarroll entre los meses de mayo del
2006 a mayo del 2007, en el Laboratorio de Qumica Orgnica, del Instituto de
Ciencias Farmacuticas y Recursos Naturales Juan de Dios Guevara, de la
Facultad de Farmacia y Bioqumica y Laboratorio de Bioqumica de Medicina
Humana de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Laboratorio de
Investigacin y Desarrollo de la Universidad Peruana Cayetano Heredia. La
elucidacin de los componentes qumicos del aceite esencial se realiz en el
Laboratorio de Farmacologa y Farmacognosia de la Universidad de Barcelona-
Espaa.
3.1.2. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS
Los principales materiales usados fueron de vidrio y plstico en condiciones
aspticas y grado reactivo: beakers, erlenmeyer, matraces aforados,
micropipetas, microplacas, placas petri, tubo N 0.5 de la escala de Mac Farland,
jarras de anaerobiosis, etc.
Los principales equipos usados: balanza analtica, equipo de destilacin de acero
inoxidable, cromatgrafo de gas-detector de ionizacin de llama (GC-FID)
Hewlett-Packard 6890 computarizado con un procesador de software y
cromatgrafo de gasesespectrmetro de masas (CG-MS) Hewlett-Packard
5890 series II acoplado a un detector selectivo de masa Hewlett-Packard 5971,
con columnas Supelcowax
TM
10 y metilsilicona SE-30 (30m x 0.25 mm i.d., 0.25
m de grosor de pelcula), centrfuga Gelectric, Bao Mara Memmert a 37 C,
Bao Mara hirviente, espectrofotmetro Spectronic 20D+, entre otros.
Los reactivos utilizados ms importantes: Dimetilsulfxido (DMSO) Sigma, 1,1-
difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) Sigma, cido tiobarbitrico Sigma, trolox (cido 6-
hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2-carboxlico 97%) Sigma, acido
etilendiaminotetraactico (EDTA) Sigma, acido ascrbico, sulfato frrico
amnico, acetato de amonio, acetilacetona, fosfato sdico monobsico, fosfato
sdico dibsico, etc. Todos los reactivos usados, fueron grado reactivo.
3.1.3. MTODOS
El presente trabajo de investigacin pertenece a un tipo de estudio analtico,
experimental, prospectivo y longitudinal.
3.1.3.1. OBTENCIN DE LA MUESTRA VEGETAL
21
Las hojas de Satureja brevicalyx urqu mua, se colectaron tomndose en
cuenta slo aquellas plantas que se encontraban a inicios de su floracin, a
partir de una poblacin vegetal con crecimiento en laderas naturales de la
Comunidad de Tranca (3300 m.s.n.m.), distrito de Vinchos, provincia de
Huamanga, departamento de Ayacucho, durante el mes de febrero del 2006.
3.1.3.2. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
Las hojas se desecaron bajo sombra a temperatura ambiente (aproximadamente
21 C), a una presin de 0.72 atmsferas, en los ambientes del Centro de
Investigacin de Plantas Medicinales Aromticas y Medicina Tradicional
CIPLAMT, en la ciudad de Huamanga, durante 07 das, hasta obtener una
muestra seca que fcilmente se tritur al frotar con la mano volatilizando su
aroma, luego fueron conservados en bolsas de papel kraft hasta su utilizacin.
3.1.3.3. OBTENCIN DEL ACEITE ESENCIAL
A partir de 10 Kg de hojas secas de la muestra fueron sometidos a destilacin
por el mtodo de arrastre por vapor de agua en un equipo de destilacin de
acero inoxidable, facilitado por el CIPLAMT. El destilado se separ tomando en
cuenta sus propiedades de inmiscibilidad y diferencia de densidades entre el
agua y el aceite esencial, utilizando una pera de separacin de vidrio, se
deshidrat las impurezas de agua en el aceite esencial con Na
2
SO
4
anhidro, se
filtr, guardndose en un frasco de vidrio color mbar bajo refrigeracin a una
temperatura de 4 C
[37]
.
22
3.1.3.4. DETERMINACIN DEL RENDIMIENTO DE ACEITE ESENCIAL
La determinacin del porcentaje de rendimiento de aceite esencial (%RAE), se
realiz a escala laboratorio por el mtodo de arrastre por vapor de agua en un
equipo de destilacin de vidrio. A partir de 100 g de hojas de S. brevicalyx, se
obtuvo un determinado volumen que fue medido con una probeta florentino. Por
el mtodo gravimetra-volumtrico se determin el %RAE, aplicando la siguiente
frmula
[37]
.
%RAE = V
ol.
AE (mL)/ P
muestra
(g) x 100
Donde:
V
ol.
AE : Volumen del aceite esencial obtenido en mililitros.
P
muestra
: Peso de la muestra a destilar en gramos.
3.1.3.5. DETERMINACIN DE LAS CONSTANTES FSICAS DEL ACEITE
ESENCIAL
Se determin las principales constantes fsicas por mtodos instrumentales:
rotacin ptica, por polarimetra; densidad, por picnometra; e ndice de
refraccin, por refractometra
[37]
.
3.1.3.6. ELUCIDACIN ESTRUCTURAL DE LOS COMPONENTES QUMICOS
DEL ACEITE ESENCIAL
[61]

Se realiz por mtodos cromatogrficos y espectroscpicos. Empleando
cromatgrafo de gas-detector de ionizacin de llama (GC-FID) y el
cromatgrafo de gasesespectrmetro de masas (CG-MS). Con columnas
Supelcowax
TM
10 y metilsilicona SE-30 (30m x 0.25 mm i.d., 0.25 m de
grosor de pelcula). El anlisis por GC-FID fue realizada en un Hewlett-
Packard 6890 computarizado con un procesador de software, en condiciones
de muestra 0.1 mL de aceite esencial en 10 mL de etanol (1%); con columna
a temperatura de inyeccin 250 C, temperatura de horno a 60220 C (10
minutos), gas transportador helio y temperatura detector a 270 C. El espectro
de masa fue obtenido con un sistema computarizado constituido por un
cromatgrafo de gas Hewlett-Packard 5890 series II acoplado a un detector
selectivo de masa Hewlett-Packard 5971, usando las mismas condiciones
23
analticas mencionadas arriba. El espectro de masa fue tomado sobre 35-400
m/z, usando un voltaje de ionizacin de 70 eV.
La identificacin es basada en comparacin de las seales en la mezcla
espectral, con estos datos compilados se acudi a una librera referente y con
la ayuda de un software laboratory-made.
3.1.3.7. EVALUACIN DE LA CITOTOXICIDAD EN ARTEMIA SALINA
LEACH POR EL MTODO DE ANDERSON, MEYER Y THOMPSON
(CYTED, 1995)
[62]

Fundamento: La Artemia salina (camarn salino) es un crustceo cuyas
larvas (nauplios) son sensibles a una gran variedad de sustancias, por lo que
puede medirse fcilmente la bioactividad de extractos vegetales y servir para
dirigir el fraccionamiento bioguiado en forma rpida y simple, es una prueba
til, a pesar de que no es selectiva para ninguna biomolcula. La metodologa
fue originalmente descrito por Michael et al. adaptado por Meyer et al. como
un bioensayo til en la investigacin qumica y biolgica de productos
naturales.
Procedimiento:
Da 1
Se prepar 350 mL de agua de mar (38 g de sal de mar comercial en 1 L de
agua destilada), se filtr para oxigenarlo por 1 hora, despus de este tiempo
se coloc 50 mg de huevos de A. salina, ubicndose en un rea
acondicionado con luz artificial permanente y una bomba de oxgeno con
burbujeo lento.
Da 3
Despus de 48 horas se transfirieron la mayor cantidad de nauplios vivos a
un erlenmeyer con agua fresca, se pes 20 mg de aceite esencial de S.
brevicalyx solubilizndose en 2 mL de disolvente (0.5 mL DMSO + 1.5 mL de
agua de mar). A partir de esta solucin, se preparan diluciones de 1000, 100 y
100 ppm, transfiriendo a cada vial 500, 50 y 5 L respectivamente. Se
emplear 3 viales por cada concentracin (09 en total) ms 3 viales de control
24
con 50 L de DMSO. En cada vial se colocaron 10 nauplios y la dilucin del
aceite esencial requerida, agregando agua de mar hasta 5 mL por vial,
adicionndosele 1 gota de suspensin de levadura como alimento (3 mg de
levadura seca se disuelven en 5 mL de agua de mar).
Da 4
Despus de 24 horas se cont y anot el nmero de sobrevivientes en cada
dilucin. Se estim los valores de la concentracin letal media (CL
50
)
mediante un programa de computadoras para el clculo de los Probits.
3.1.3.8. EVALUACIN DE LA TOXICIDAD AGUDA POR EL MTODO DE
DOSIS FIJA (OECD, 2001)
[63,64]

Se determin la toxicidad aguda del aceite esencial empleando 06 ratones
albinos Suizos, por cada grupo de tratamiento, procedentes de la colonia del
Laboratorio de Control Biolgico del Instituto Nacional de Salud-Chorrillos, con
una masa corporal comprendida entre 18 a 22 g los cuales fueron mantenidos
a una temperatura controlada de 20 2C con un ciclo de luz/oscuridad de 12-
12h. La alimentacin consisti en ratonina peletizada y agua a voluntad. Se
confeccionaron grupos de 06 ratones (3 hembras y 3 machos), identificados
individualmente para su dosificacin exacta mediante un sistema de marcaje
con cido pcrico. Se administr el aceite esencial por va oral mediante
cnula intragstrica, con previa ayuna de 4h; se ensayaron 03 niveles de
dosis: 50 mg/kg (mnima), 200 mg/kg (media) y 2000 mg/kg (mxima), con el
propsito de determinar la dosis letal media (DL
50
). Los animales fueron
observados constantemente durante las primeras 24h, continuando la misma
diariamente durante un perodo de 14 das, registrndose cualquier sntoma
txico. Despus de los 14 das se sacrific por traccin de la nuca y se hizo la
necropsia, efectundose un examen macroscpico de rganos y tejidos,
principalmente corazn, rin, bazo, pulmn e hgado. Del hgado y rin se
realiz un examen histopatolgico microscpico. El peso corporal se control
al inicio y al final del experimento.
El valor de la DL
50
se estim mediante el mtodo estadstico de los Probits.
25
3.1.3.9. EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTI-Helicobacter pylori DEL
ACEITE ESENCIAL
3.1.3.9.1. Aislamiento y activacin de la cepa
Helicobacter pylori se aisl por el mtodo de biopsias gstricas, a parir de
pacientes del Hospital Nacional Cayetano Heredia, los cuales se sembraron
en agar BHI, adicionndole suplemento Skirrow, Isovitalex, Anfoterecin B y
sangre de ovino al 5%; luego fueron incubados en una jarra de anaerobiosis
con 5% CO
2
, 10% O
2
y 85% N
2
a 37 C durante 7 das. Despus de este
tiempo se observ el crecimiento de colonias, a las cuales se les hizo las
pruebas de ureasa, oxidasa y catalasa para verificar si corresponde a H.
pylori, estas colonias fueron sembradas en otra placa que contena agar BHI,
con los mismos requerimientos necesarios para su reproduccin y
crecimiento, obtenindose cepas puras que se incubaron a 37 C por 48 horas
en condiciones de microaerofilia. Despus de este tiempo, nuevamente se
realiz la prueba de ureasa para ver su vialibilad y sembrarlas en Medio EYE
que viene a ser agar columbia, yema de huevo al 5%, Isovitalex, anfoterecin B
y TTC, incubndose en condiciones de microaerofilia a 37 C por 48 horas, a
partir de este crecimiento se realizaron los ensayos.
3.1.3.9.2. Determinacin de la actividad anti-Helicobacter pilory, mtodo
de Bauer-Kirby
[65]

Fundamento:
Llamada tambin mtodo de difusin de discos. El crecimiento exponencial
de bacterias (H. pilory) en el medio de cultivo adecuado es inhibido por las
molculas bioactivas del aceite esencial que difunden del disco de papel de
filtro hacia el agar. Este procedimiento se basa en el descrito por Bauer-Kirby
y es usado para evaluar la actividad antibacteriana vegetal.
26
Procedimiento:
Se prepar el medio EYE (agar Columbia y yema de huevo al 15%),
adicionndosele suplementos al 1% de IsoVitalex (BBLTM-Becton Dickinson
and Co), anfoterecin B y TTC, homogenizndose. A continuacin se plaque
en placas petri (15mm x 15cm), se enfri y solidific. Paralelamente se
prepar el inculo de H. pylori (TIF 209 Ca) en 10 mL de solucin salina al
0.9%, con una turbidez equivalente al tubo N 0.5 de la escala de Mac Farland
(1.5x10
8
UFC/mL), se incorpor 500 L de este inculo al medio preparado,
expandindose con sembrador de vidrio por toda la superficie, seguidamente
se colocaron discos estriles de papel de filtro (6 mm de dimetro y 0.6 mm
de grosor), a los que se embebi 50 L de dilucin en dimetilsulfxido
(DMSO) de las concentraciones de 10, 20, 30 y 50 g/mL de aceite esencial
de S. brevicalyx, cada concentracin se realiz por triplicado. Todos los
procesos antes mencionados se ejecut en campana de flujo laminar. Las
placas invertidas se colocaron en jarras de anaerobiosis con 5% CO
2
, 10% O
2
y 85% N
2
(condiciones de microaerofilia) y 30% de humedad, incubndose a
37 C por 72 horas. Luego de ese tiempo, se realizaron las mediciones de los
halos de inhibicin. El control negativo fue con DMSO y el control positivo con
amoxicilina
[66,67]
.
3.1.3.9.3. Determinacin de la Concentracin Mnima Inhibitoria (MIC) y
Concentracin Mnima Bactericida (CMB).
Se determin por el mtodo de dilucin en microplacas, para lo cual se
emple una microplaca de 96 pocillos (8 filas x 12 columnas). En 10 tubos de
pruebas graduadas se prepar, por separado, suplemento de Isovitalex 10 L,
Anfoterecin B 2 L, TTC 4 L y yema de huevo 100 L, a cada tubo se agreg
aceite esencial a las concentraciones de 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 g/mL, y
luego se enras a 1 mL con agar Columbia. En otros 2 tubos, se prepar la
misma solucin, uno para el control negativo (sin aceite esencial, ni cepa) y el
otro como control positivo (con cepa). A partir de cada uno de los 12 tubos,
respectivamente, se colocaron 200 L a cada uno de los 12 pocillos de la
microplaca, por 4 repeticiones, dejando solidificar. Paralelamente, el inculo
fue preparado en un tubo de prueba con 10 mL de solucin salina al 0.9% y
se aadieron colonias de H. pylori (TIF 209 Ca), hasta alcanzar una turbidez
27
equivalente al tubo N 0.5 de la escala de Mac. Farland (aprox. 1.5 X10
8
UFC/mL), luego se coloc 5 L de inculo sobre la superficie del medio de
cada pocillo, posteriormente fueron incubadas en condiciones de
microaerofilia con 5% CO
2
, 10% O
2
y 85% N
2
a 37 C por 48 horas; luego de
este tiempo se hizo las lecturas correspondientes, corroborando con la prueba
de la ureasa, para determinar CMI. Dejando un da ms en las mismas
condiciones de microaerofilia, a las 72 horas se volvi a realizar la lectura y
prueba de ureasa, con la cual se determin la CMB
[66,67]
.
3.1.3.10. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
3.1.3.10.1. MTODO DE LA ACTIVIDAD SECUESTRADORA DEL RADICAL
1,1-DIFENIL-2-PICRILHIDRAZILO
[68]

Fundamento:
El radical libre y estable 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH), es un indicador
para medir la capacidad de secuestro de cualquier compuesto con actividad
antioxidante. Su mecanismo de reaccin consiste en la sustraccin de un
tomo de hidrgeno proveniente de un donador (ej. Compuesto fenlico) para
generar el compuesto difenilpicrilhidrazina y una especie radical (ej. Radical
fenoxil). La reaccin de ensayo qumico in vitro, desarrolla un cambio de color
violeta a amarillo a medida que disminuye la absorbancia a 515 nm. La
reduccin del DPPH sigue la siguiente reaccin:
DPPH
+ AH DPPH + A

DPPH
+ R
DPPH-R
Procedimiento:
Se prepararon las siguientes soluciones stock: solucin metanlica de DPPH
de 20 g/L; solucin metanlica de aceite esencial de 300 g/L (sol. A); un
blanco con metanol: agua (2:1) para ajustar el espectrofotmetro a cero; un
blanco de muestra con 0,75 mL de muestra (sol. A) y 1,5 mL de metanol; un
patrn de referencia (estndar) con 1,5 mL de DPPH y 0,75 mL de agua
destilada. La muestra con 0,75 mL de solucin A y 1,5 mL de DPPH
obtenindose una concentracin final de 100 g/L, dejando a temperatura
28
ambiente por 5 minutos y leyendo a 515 nm en un espectrofotmetro. Diluir la
solucin A con metanol en una proporcin de 1:2 (sol. B) para obtener una
concentracin final de 50 g/L y luego en una proporcin de 1:10 (sol. C) para
obtener una concentracin final de 10 g/L. Con las soluciones B y C se
procede igual que en el caso anterior. El trolox fue usado como patrn de
comparacin.
La actividad secuestradora de radicales libres es expresada como una
concentracin efectiva 50% (CE 50; la concentracin de sustancia de prueba
requerida para reducir la absorbancia de la solucin blanco de DPPH en
50%).
Para calcular la capacidad de secuestro de radicales DPPH
(capacidad de
decoloracin) por el aceite esencial y patrn de referencia, se emple la
siguiente expresin.
% Capacidad antioxidante = 1 - (A
2
A
3
) / A
1
x 100
Donde:
A
1
: Absorbancia del patrn de referencia.
A
2
: Absorbancia del compuesto en experimentacin.
A
3
: Absorbancia del blanco de la muestra.
3.1.3.10.2. MTODO DE LA ACTIVIDAD SECUESTRADORA DEL RADICAL
HIDROXILO
[62,69]

Fundamento:
Este mtodo que genera radicales hidroxilos, se basa en la reaccin del hierro
con el perxido de hidrgeno, llamada reaccin de Fenton:
Fe
2+
- EDTA + H
2
O
2
Fe
3+
- EDTA + OH
+ OH

Dicha reaccin est favorecida en presencia de agentes reductores como el
cido ascrbico, los cuales regeneran el hierro a su estado reducido.
Preparacin de la muestra:
Las muestras se prepararon en Buffer fosfato 50 mM, pH 7.4.
29
Diseo experimental:
La mezcla de incubacin consta de EDTA (0.1 mM), complejo Fe3+ - EDTA
(1:2) (167 M), DMSO (33 mM), cido ascrbico (2 mM) y aceite esencial de
S. brevicalyx a 100, 50 y 10 g/mL se disuelven en metanol y buffer fosfato
50 mM (pH 7.4) hasta un volumen final de 3 mL. La reaccin se inicia con la
adicin del cido ascrbico. Despus de 30 minutos de incubacin a 37 C la
reaccin se detiene con 1 mL de cido tricloroactico al 17.5%(p/v). Se
detecta el formaldehdo producido por el color amarillo, debido al producto
formado, llamado 3,5-diacetil-1,4-dihidrolutidina (DDL), cuya longitud de onda
de mxima absorbancia es de 412 nm. El DDL se forma como consecuencia
de la reaccin de acetato amnico, acetilacetona y formaldehdo.
El revelador del formaldehdo producido, es una mezcla reactiva de acetato
amnico y acetil acetona en tampn fosfato 50 mM, pH 7.4, a una
concentracin final de 1M y 0.01 M, respectivamente. El revelado de los
distintos ensayos se realiz aadiendo sobre alcuotas de 1,5 mL, 2 mL del
revelador, incubando en bao de agua de 58 C por 5 minutos, luego
inmediatamente se sumergi en hielo para detener la reaccin. La lectura
espectrofotomtrica se realiz a 412 nm.
Para la estimacin de la actividad captadora de radical hidroxilo de la
sustancia problema, los resultados se expresan como porcentaje de inhibicin
de la produccin de formaldehdo respecto de la reaccin control (ausencia
del producto a ensayar).
% Inhibicin = C P/ C x 100
Donde:
C = Reaccin control
P = Reaccin con la muestra problema
Los resultados son evaluados estadsticamente mediante un anlisis de
varianza mltiple utilizando como factores de comparacin muestra y
concentracin, con un nivel de confianza de 95%.
3.1.3.10.3. ACTIVIDAD INHIBIDORA DE LA LIPOPEROXIDACIN LIPDICA
MICROSOMAL
[70]

Se emple el modelo de la inhibicin de la peroxidacin lipdica producida por
un prooxidante como el perxido de hidrgeno. Este mtodo indirecto permite
detectar los productos de la degradacin de los lpidos (aldehdos y
30
malondialdehido) basado en que 2 molculas de cido tiobarbitrico (TBA)
reaccionan con 1 molcula de malondialdehdo (MDA) para generar un
complejo (cromforo) que se lee a 535 nm. La inhibicin se evidencia por una
disminucin en la produccin del complejo MDA-TBA, producto de la
peroxidacin lpidica.

Muestras
Se utiliz aceite esencial de S. brevicalyx a las concentraciones de 10, 50 y
100 g/mL y como control positivo el trolox a las mismas concentraciones.

Procedimiento:
Reactivos Blanco Control Muestra
Microsoma heptico (2 mg/mL) 0.5 0.5 0.5
Buffer fosfato 100 mM pH 7.4 1.5 1.4 1.3
H
2
O
2
- 0.1 0.1
Aceite esencial y trolox - - 0.1

Se mezcl e incub a 37C por 10 minutos. Se detuvo la reaccin con 1,0 mL de
cido tricloractico en cada tubo. Luego llevando a bao mara hirviente por 10
minutos. Se enfri y aadi 1,5 mL de cido tiobarbitrico, llevar nuevamente a
bao mara hirviente durante 30 minutos. Se retir y enfri en bao de agua
helada. Se centrifug a 6000 rpm por 10 minutos. Se extrajo el sobrenadante y
se realiz la lectura en un espectrofotmetro a 535 nm, a esta longitud se mide el
complejo Malondialdehdo - cido tiobarbitrico (MDA TBA) formado.
Para los clculos se utiliz el coeficiente de extincin molar 1,56 x 10
5
mM
-1

cm
-1
, mediante la siguiente frmula:
A= x l x C (1)
C = A/ I x .... (2)
Donde:
A: Absorbancia C: concentracin
I = 1cm = 1.56 x 10
5
mM
-1
cm
-1

3.2. ANLISIS ESTADSTICO DE LOS RESULTADOS
[71]

31
Los resultados son presentados en tablas y grficos y sometidas a un Anlisis
de Varianza y a la Prueba de Tukey para comprobar las diferencias entre las
medias, a un 95% de confianza.

32
IV. RESULTADOS

Las principales constantes fsicas del aceite esencial de la S. brevicalyx (tabla
1), determinadas a una temperatura de 21 C y a 1 atmsfera de presin,
aproximadamente, presentan un buen rendimiento en seco, el aceite es menos
denso que el agua e inmiscible, de olor fuerte y persistente, color amarillento y
translcido.
Se elucid 35 compuestos qumicos al 97.1% del total de la muestra de aceite
esencial (tabla 2 y figura 1). Como componentes mayoritarios destacan los
monoterpenos oxigenados (74.8%), dentro de ellas la pulegona (27.3%), linalol
(20.3%), mentona (11.1%), isomentona (8.3%) y cis-isopulegona (2.7%); el resto
de los componentes de este grupo se hallan en porcentajes por debajo de 1.0
%. Seguidamente predomina el grupo de hidrocarburos sesquiterpnicos
(16.0%), entre los cuales estn el biciclogermacreno (8.2%), -cariofileno (6.5%)
y bicicloelemeno (0.5%). El grupo de hidrocarburos monoterpnicos (4.1%),
contiene como componentes mayoritarios al p-cimeno (2.0%), limoneno (0.7%) y
-terpineno (0.6%). Los sesquiterpenos oxigenados representan slo el 1.5%,
destacando el espatulenol (0.8%) e isoespatulenol (0.3%). Los compuestos no
terpnicos (0.7%) representativos son 3-octanol (0.3%) y 1-octen-3-ol (0.3%).
La citotoxicidad del aceite esencial de S. brevicalyx, presenta una concentracin
letal media (CL
50
) de 13.354 g/mL, analizado estadsticamente por el programa
Probit, con un intervalo de confianza al 95% entre 2.517 g/mL y 70.832 g/mL
(tabla 03).
El ensayo de toxicidad oral de la S. brevicalyx (tabla 4) reporta una dosis letal
media (DL
50
) de 655.263 mg/kg, estadsticamente fue analizado por el programa
Probit, con un intervalo de confianza al 95% entre 256.308 y 1675.209 mg/kg. En
la figura 2, se observa el resultado antomo patolgico, con parnquimas
hepticos y renales sin alteraciones significativas. La muerte de una parte de la
poblacin de ratones en experimentacin, podra deberse a que los rganos ms
afectados sean los pulmones debido a su mayor exposicin a los componentes
voltiles del aceite esencial.
El aceite esencial de S. brevicalyx exhibe actividad anti-Helicobacter pylori
(anti-Hp), en comparacin con la amoxicilina, antibitico betalactmico de amplio
espectro derivado de la penicilina (amino penicilina). En las cuatro
33
concentraciones presenta actividad antibacteriana (figuras 3, 4 y 5). A 10 g/mL
de concentracin, el aceite esencial tiene un halo de inhibicin de 11mm de
dimetro, frente a 33mm de la amoxicilina; esto representa, para el aceite, un
tercio de la actividad del antibitico ms usado en los esquemas de
tratamientos infecciosos producidas por esta bacteria.
Presenta una relacin directa las concentraciones y la actividad antibacteriana. A
medida que se incrementa la concentracin, muestra mayor actividad anti-HP. A
10 g/mL el porcentaje es de 33.33% y a 50 g/mL es de 45.45% (figura 5).
La concentracin mnima inhibitoria (CMI) y la concentracin mnima bactericida
(CMB), se observa que es 1.00 g/mL y 2.00 g/mL, respectivamente, frente a
0.02 g/mL de la amoxicilina (tabla 5).
En la figura 6 se observa el color rojo caracterstico en algunas microplacas, que
indica crecimiento de H. pylori, mientras que en las que no crece presenta un
color amarillento claro. En la parte inferior de las microplacas se presenta las
pruebas de ureasa, para corroborar la presencia de H. pylori. A partir de la
tercera columna la presencia de H. pylori es negativo, confirmando su accin
bactericida del aceite esencial.
El aceite esencial de S. brevicalyx presenta actividad antioxidante, segn el
modelo del radical DPPH (1,1-diphenyl -2-picryl hydrazyl) comparado con el
trolox. En la figura 7, realizando el anlisis de varianza (ANVA), existen
diferencias entre las tres concentraciones de aceite esencial por su efecto de
captacin del radical DPPH. La prueba de Tukey determina que la concentracin
de 100 g/mL tiene mayor efecto de captacin radicalaria, seguida de las
concentraciones de 50 g/mL y 10 g/mL, por ello que se correlacionan en el
orden de (a), (b) y (c).
En la figura 8, se realiza un tratamiento comparativo por la prueba de Tukey,
entre el aceite esencial de S. brevicalyx y el trolox de tres concentraciones: 10,
50 y 100 g/mL. Observndose que existen diferencias en sus capacidades de
captacin del radical DPPH, el trolox posee mayor capacidad anti-radicalaria en
las tres concentraciones frente al aceite esencial de S. brevicalyx. Sin embargo,
a medida que incrementa la concentracin tambin potencia su actividad
antioxidante para ambos compuestos.
En la figura 9, de acuerdo al anlisis de regresin por correlacin, entre la
concentracin y el efecto de captacin del radical DPPH, se corrobora que a
34
mayor concentracin mayor es el efecto antioxidante del aceite esencial de S.
brevicalyx y la relacin de esta magnitud es de 0.997, lo que quiere decir que la
variacin del efecto de captacin est explicada en un 99.97% por la variacin de
la concentracin, siendo un valor elevado (segn la teora el valor de R
2
va
desde 0 a 1), por lo que 0.997 es muy cercano a 1.
En las figuras 10 y 11, se presentan las concentraciones de inhibicin media
(IC
50
) para ambos compuestos. El aceite esencial de S. brevicalyx presenta
28.84 g/mL, y el trolox 16.75 g/mL, estos valores confirman el efecto
antioxidante de la S. brevicalyx cercano al del trolox.
En la figura 12, se estima la actividad captadora del radical hidroxilo, expresado
como porcentaje de inhibicin de la produccin de formaldehdo respecto de la
reaccin del control, presentando diferencias en los porcentajes de inhibicin.
Segn el anlisis de varianza, estadsticamente hay diferencias en su capacidad
de captacin del radical hidroxilo en las tres concentraciones. El de las
concentraciones de 50 y 100 g/mL, estn por encima del 50% de inhibicin de
la produccin de formaldehdo. Mientras que el de 10 g/mL se encuentra por
debajo del 50%. La prueba de Tukey determina que la concentracin de 100
g/mL tiene mayor efecto de inhibicin, seguida de 50 g/mL y 10 g/mL.
En la figura 13, se hace el anlisis de regresin por correlacin, entre la
concentracin y el efecto de inhibicin, dicha recta indica que a mayor
concentracin mayor es el efecto de inhibicin. La magnitud de la relacin de
ambas variables, concentracin e inhibicin, es de 0.99, lo que quiere decir que
la variacin del efecto de inhibicin est explicada en un 99.99% por la variacin
de la concentracin, este resulta es un valor elevado.
Este modelo, tambin, confirma que cuanto mayor es la concentracin del aceite
esencial, mayor es su capacidad antioxidante del aceite esencial de S.
brevicalyx.
En la figura 14, se compara los efectos antioxidantes de 3 concentraciones de
aceite esencial y trolox a 100, 50 y 10 g/mL. Estadsticamente hay diferencias
en la capacidad de inhibicin del complejo malondialdehido-cido tiobarbitrico
(MDA-TBA) frente al trolox, este ltimo exhibe mayor capacidad de inhibicin en
cada concentracin.
En la figura 15, la inhibicin del complejo MDA-TBA, resulta que hay diferencias
de inhibicin entre el aceite esencial y el control negativo que no posee ningn
agente antioxidante, este ltimo se dispara en la concentracin del complejo
35
MDA-TBA llegando hasta 53.9 x 10
-8
moles x cm. Segn el ANVA existe
diferencias entre las tres concentraciones por su efecto en la concentracin de
del complejo MDA-TBA, la prueba de Tukey determina que la concentracin de
100 g/mL presenta menor concentracin de MDA-TBA, seguida de 50 y 10
g/mL.
En la figura 16, se observa la tendencia de la concentracin del complejo MDA-
TBA, entre la concentracin y el efecto de inhibicin, dicha recta indica que a
mayor concentracin de aceite esencial de S brevicalyx existe una menor
concentracin de MDA-TBA. La magnitud de la relacin de ambas variables,
concentracin e inhibicin, es de 0.8235, lo que quiere decir que la variacin del
efecto de inhibicin est explicada en un 82.35%.
En este modelo, que emplea microsoma heptico de rata, el aceite esencial
estara protegiendo de la peroxidacin lipdica, por ello se observa la
disminucin de concentracin del complejo MDA-TBA en los tratamientos que
tienen agente antioxidante.

36

Tabla 1. Principales constantes fsicas del aceite esencial de Satureja
brevicalyx.

CONSTANTES FSICAS

VALORES

Rendimiento en seco

1.80 %v/p

Rotacin ptica (21C)

-2 a +4

Densidad (21C)

0.9047 g/mL

ndice de refraccin (21C)

1.475

37

Tabla 2. Composicin qumica del aceite esencial de Satureja brevicalyx.

CONSTITUYENTES
% IR1 IR2 IR3 IR4
-pineno 0.3 1035 - 938 217
-pineno 0.2 1123 148 978 238
Sabineno 0.2 1133 156 972 235
-mirceno 0.1 1169 182 - -
Limoneno 0.7 1211 209 1027 263
1,8-cineol 0.6 1222 215 1027 263
-terpineno 0.6 1258 234 1054 275
p-cimeno 2.0 1285 248 1017 258
amil isovalerato 0.1 - - 1094 294
3-octanol 0.3 1388 298 983 242
1-octen-3-ol 0.3 1469 340 966 232
Mentona 11.1 1480 347 1142 320
Bicicloelemeno 0.5 1487 351 1499 493
Isomentona 8.3 1506 360 1151 326
Linalol 20.3 1545 377 1090 293
Trans-isopulegona 0.9 1590 396 1158 329
cis-isopulegona 2.7 1602 400 1157 329
-cariofileno 6.5 1622 410 1428 464
Pulegona 27.2 1676 439 1226 365
-humuleno 0.3 1689 447 1460 478

38

CONSTITUYENTES
% IR1 IR2 IR3 IR4
-terpineol 0.5 1701 454 1178 341
Piperitona 0.2 1728 467 1234 368
Biciclogermacreno 8.2 1762 479 1500 497
Acetato de geranil 0.2 1773 484 1359 428
Acetato de timil 0.8 1863 527 1339 417
Acetato de carvacril 0.4 1886 539 1346 421
Piperitenona 0.4 1956 571 1316 406
Oxido de cariofileno 0.3 2021 600 1582 540
E-nerolidol 0.1 2072 625 1549 522
Espatulenol 0.8 2149 662 1575 536
Carvacrol 0.6 2190 680 1278 388
Timol 0.6 2224 700 1267 383
Isoespatulenol 0.3 2248 706 1603 563
Aromadendreno 0.2 - - 1467 481
Germacreno B 0.3 - - 1480 488
IDENTIFICACIN TOTAL 97.1

Leyenda:
IR1 : ndice de retencin en Supelcowax Kovats
IR2 : ndice de retencin en Supelcowax metil ester
IR3 : ndice de retencin en metilsilicona Kovats
IR4 : ndice de retencin en metilsilicona metil ester

39

4.1
74.8
16
1.5
0.7
2.9
0
10
20
30
40
50
60
70
80
P
R
O
P
O
R
C
I
N

(
%
)
HM MO HS SO OTROS NID
GRUPOS DE CONSTITUYENTES

HM : Hidrocarburo monoterpnico MO : Monoterpeno oxigenado
HS : Hidrocarburo sesquiterpnico SO : Sesquiterpeno Oxigenado
OTROS: Otros grupos NID : No identificados

Figura 1. Grupos de constituyentes fitoqumicos elucidados del aceite esencial
de Satureja brevicalyx.

40

Tabla 3. Citotoxicidad del aceite esencial de Satureja brevicalyx segn mtodo
de Artemia salina Leach.

CONCENTRACIN
(g/mL)

CONCENTRACIN LETAL MEDIA
CL
50
(g/mL)

1000
100
10

13.3534

41

Tabla 4. Toxicidad oral del aceite esencial de Satureja brevicalyx en ratones
albinos.

CONCENTRACIN
(mg/kg)

SNTOMAS

DOSIS LETAL
MEDIA
DL
50
(mg/kg)

2000
200
50

Depresin profunda,
incoordinacin motora,
respiracin acelerada,
piloereccin, arrastra el tren
posterior, sedacin,
reestablecimiento y muerte de un
nmero parcial.

655.2632

Figura 2. Parnquimas heptico y renal de ratones albinos sin alteraciones
significativas del efecto de toxicidad del aceite esencial de Satureja brevicalyx.
42
6
33
6
11
13
14
15
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 10 20 30 50
CONCENTRACIN (g/mL)
H
A
L
O

D
E

I
N
H
I
B
I
C
I
N

(
m
m
)
Amoxicilina
S. brevicalyx

Figura 3. Actividad anti-Helicobacter pylori del aceite esencial de Satureja
brevicalyx en comparacin con la amoxicilina.
b
a
c
d
e

a: 0; b: 10; c: 20; d: 30; e: 50 g/mL
Figura 4. Actividad anti-Helicobacter pylori del aceite esencial de Satureja
brevicalyx segn el mtodo Difusin de Discos.

43

33.33
36.36
42.42
45.45
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
E
F
E
C
T
O

A
N
T
I

-

H
.

P
Y
L
O
R
I

(
%
)
10 20 30 50
CONCENTRACIN S. brevicalyx (g/mL)

Figura 5. Porcentaje de actividad anti-Helicobacter pylori del aceite esencial de
Satureja brevicalyx usando como estndar la amoxicilina.

44
Tabla 5. Concentracin mnima inhibitoria y concentracin mnima bactericida del
aceite esencial de Satureja brevicalyx en comparacin con la amoxicilina.

COMPUESTOS

CONCENTRACIN
MNIMA INHIBITORIA

CONCENTRACIN
MNIMA BACTERICIDA
S. brevicalyx 1.00 g/mL 2.00 g/mL
Amoxicilina 0.02 g/mL ----------------

0.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 - +
1
2
3
4
5
6
7
8

Concentraciones: 0.5; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9g/mL
(-) : control sin cepa (+) : Control con cepa
Figura 6. Concentracin mnima inhibitoria y concentracin mnima bactericida
del aceite esencial de Satureja brevicalyx segn mtodo de Dilucin en
Microplacas.

45

67.76
c
75.33
b
86.84
a
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
C
A
P
T
A
C
I
N

R
A
D
I
C
A
L

D
P
P
H

(
%
)
100 50 10

Figura 7. Valores promedios y prueba de Tukey para la captacin de radical
DPPH de tres concentraciones del aceite esencial de Satureja brevicalyx.

46
67.76
80.59
75.33
87.17
86.84
93.09
0
20
40
60
80
100
C
A
P
T
A
C
I
N

D
E

R
A
D
I
C
A
L

D
P
P
H

(
%
)
S.
brevicalyx
Trolox S.
brevicalyx
Trolox S.
brevicalyx
Trolox
10 50 100

10g/mL tc = 31.804; gl = 4; P = 0.00; SIGNIFICATIVO
100g/mL tc = 29; gl = 4; P = 0.00; SIGNIFICATIVO

Figura 8. Valores promedios y prueba Tukey para la captacin de radical DPPH
de tres concentraciones del aceite esencial de S. brevicalyx en comparacin
con el Trolox.

CONCENTRACIN (g/mL)
47
y = 0.2127x + 65.297
R
2
= 0.997
60
65
70
75
80
85
90
0 20 40 60 80 100 120
C
A
P
T
A
C
I
N

R
A
D
I
C
A
L

D
P
P
H

(
%
)

Figura 9. Tendencia de la captacin del radical DPPH de tres concentraciones
del aceite esencial de Satureja brevicalyx.

48
y = -0.0019x + 0.2068
R
2
= 0.5438
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0 20 40 60 80 100 120
A
B
S
O
R
B
A
N
C
I
A

(
n
m
)
IC50 = 28.84

Figura 10. Concentracin de inhibicin media del aceite esencial de Satureja
brevicalyx frente al DPPH.

49

y = -0.002x + 0.1855
R
2
= 0.4583
-0.03
0.02
0.07
0.12
0.17
0.22
0.27
0.32
0 20 40 60 80 100 120
CONCENTRACIN TROLOX (g/mL)
A
B
S
O
R
B
A
N
C
I
A

(
n
m
)

IC
50
=16.75

Figura 11. Concentracin de inhibicin media del Trolox frente al DPPH.

50
28.95
c
51.57
b
76.84
a
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
I
N
H
I
B
I
C
I
N

D
E

R
A
D
I
C
A
L

.
O
H

(
%
)
10 50 100

Figura 12. Valores promedios y prueba de Tukey para la inhibicin de radical
hidroxilo (
OH) de tres concentraciones del aceite esencial de S. brevicalyx.

51
y = 0.531x + 24.132
R
2
= 0.999
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 20 40 60 80 100 120
I
N
H
I
B
I
C
I
N

D
E

R
A
D
I
C
A
L

.
O
H

(
%
)

Figura 13. Tendencia para la inhibicin de radical hidroxilo (
OH) de tres
concentraciones del aceite esencial de S. brevicalyx.

52
53.9 53.9
16.4
14.9
9.8
8
8.5
7.5
-5
5
15
25
35
45
55
65
I
N
H
I
B
I
C
I
N

M
D
A
-
T
B
A

(
m
o
l
e
s

x

c
m

x

1
0
-
8
)
S
.
b
r
e
v
i
c
a
l
y
x

T
r
o
l
o
x
S
.
b
r
e
v
i
c
a
l
y
x

T
r
o
l
o
x
S
.
b
r
e
v
i
c
a
l
y
x

T
r
o
l
o
x
S
.
b
r
e
v
i
c
a
l
y
x

T
r
o
l
o
x
0 10 50 100


Figura 14. Inhibicin del complejo malondialdehido-cido tiobarbitrico por el
aceite esencial de Satureja brevicalyx y trolox.

CONCENTRACIN (g/mL)
53

53.9
16.4
c
9.8
b
8.5
a
0
10
20
30
40
50
60
I
N
H
I
B
I
C
I
N

M
D
A
-
T
B
A

(
m
o
l
e
s

x

c
m

x

1
0
-
8
)
100 50 10 0

Figura 15. Valores promedios y prueba de Tukey de la inhibicin del complejo
malondialdehido-cido tiobarbitrico del aceite esencial de Satureja brevicalyx
frente al control negativo.

54

y = -0.0852x + 16.113
R
2
= 0.8235
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 20 40 60 80 100 120
C
O
N
C
E
N
T
R
A
C
I
N

M
D
A
-
T
B
A

(
m
o
l
e
s

x

c
m

x

1
0
-
8
)

Figura 16. Tendencia de la concentracin del complejo malondialdehido-cido
tiobarbitrico a tres concentraciones del aceite esencial de Satureja brevicalyx.

V. DISCUSIN

55
Las constantes fsicas del aceite esencial de S. brevicalyx caracterizan los
grupos de componentes qumicos presentes, y adems son parmetros de
calidad aromtica que permiten tomar decisiones en futuros proyectos de
rentabilidad comercial. Segn Bandoni (2000)
[37]
, los valores de rendimiento
1.0% de aceite esencial, las categorizan a las especies aromticas en
excepcionalmente interesantes y promisorias. Para el caso de la S. brevicalyx
resulta ser un valor significativamente alto (tabla 1), llegando a 1.80% v/p. Los
resultados de la rotacin ptica, densidad e ndice de refraccin, permitirn en lo
posterior caracterizar y analizar los parmetros de control de calidad, siendo
novedosos para el caso de la especie en estudio.
El aceite esencial de S. brevicalyx al contener unos 35 componentes qumicos,
estara dotndole de una alta bioactividad farmacolgica al extracto vegetal en
conjunto, actuando en sinergismo, ya que el uso frecuente se da en base al
extracto de las hojas. Cabe destacar, que el carvacrol (0.6%) y timol (0.6%) son
los marcadores qumicos del gnero Satureja, adems de la pulegona, y que
corresponden a monoterpenos oxigenados
[72]
.
La pulegona posee grupo funcional cetnico, es un potente antisptico y biocida,
favorece el parto y la expulsin de la placenta
[73]
. El linalol, posee grupo funcional
alcohol, es un antimicrobiano moderado, estomacal y carminativo
[74]
; adems, es
muy empleada en las industrias farmacutica y perfumero cosmtica
[75]
. La
mentona, posee grupo funcional cetnico, se le relaciona con las propiedades
antiespasmdica, carminativa y estomacal
[74]
. El resto de los metabolitos
elucidados, estaran actuando en sinergismo con los componentes mayoritarios,
stos reforzaran la actividad biolgica del aceite esencial de S. brevicalyx;
amerita hacer hincapi, que el timol y carvacrol, son los metabolitos ms
potentes desde el punto de vista antimicrobiano y antioxidante que se han
estudiado hasta el momento con respecto a los aceites esenciales, y son de tipo
fenlico
[46,48,74]
.
Al realizar un estudio de los metabolitos bioactivos de una planta, debe
identificarse preliminarmente el grado de actividad biolgica, para ello el mtodo
de Artemia salina es un mtodo de bioensayo verstil y estandarizado que
permite monitorear la presencia de compuestos citotxicos y antitumorales de
utilidad potencial
[62]
. Moreno y col. (2006)
[76]
y Eugenia y col. (2007)
[77]

56
ensayaron en nauplios de A. salina la citotoxicidad del aceite esencial de Simsia
pubescens y Croton malambo, determinando su CL
50
, respectivamente para
ambos, en 0.12 g/mL y 15.32 g/mL. Estos valores comparados con el de
13.45 g/mL para el sulfato de vinblastina, confirman que los aceites de S.
pubescens y S. brevicalyx (CL
50
= 13.354 g/mL), son posibles agentes
citotxicos y antitumorales. Un aceite esencial o uno de sus metabolitos, es
considerado potencialmente til como citotxico y antitumoral cuando su CL
50
es
30 g/mL
[76]
. Por lo tanto, para el aceite esencial de la S. brevicalyx resulta
interesante continuar sus estudios de citotxicidad y otras actividades biolgicas,
y stas se justifican por la diversidad de metabolitos caracterizados que suman
un total de 35 compuestos. El sulfato de vinblastina, utilizado como punto de
comparacin, es un derivado semisinttico de la vinblastina, el cual se obtiene
de la planta de Catharanthus roseus, la cual es usada en el tratamiento de
leucemia infantil y en la quimioterapia de diversos cnceres. La viblastina
previene la produccin de microtubulos, los cuales son vitales en la separacin
fsica de clulas durante la divisin celular. Sin microtubulos la divisin celular no
puede ocurrir, por tanto la clula muere; adems interfiere con la capacidad de la
clula para sintetizar ADN y ARN
[76]
.
De acuerdo a la dosis letal media de la S. brevicalyx (DL
50
= 655.263 mg/kg), se
categoriza como ligeramente txica, extrapoladas en la tabla de Williams
[76]
.
Suarez et al. (2003)
[78]
, determinaron para la Satureja viminea una DL
50
de
556.80 mg/kg, ambas especies corresponden al gnero Satureja, por ello que los
valores son muy prximos. Existen muchas evidencias sobre la toxicidad de la
pulegona, que es el principal componente del gnero Satureja
[46,48,78]
. Nassiff y
col. (2004)
[73]
, sealan que la pulegona por encima de 0.065g/250mL es muy
txico en mujeres embarazadas, ocasionando el aborto. La pulegona pueda
permitir la formacin de epxido de pulegona, este grupo qumico es muy
inestable, tiene mucha tensin angular y puede abrirse con facilidad frente a
protenas y cidos nucleicos del organismo humano, con la posibilidad de
generar mutaciones
[80]
. Razn por la cual, el Comit de Expertos de la
Organizacin Internacional Flavour Industry, recomiendan que la presencia de
pulegona en productos alimenticios acabados, se limita a un mximo de 250 ppm
en golosinas y de 20 ppm en comidas y bebidas
[79]
.
57
Carhuapoma (2006)
[60]
, determin la DL
50
para el aceite esencial de Luma
chequen, resultando 906.114 mg/kg, este valor confirma una toxicidad menor
que del aceite esencial de S. brevicalyx; esta diferencia, podra deberse que los
componentes del aceite de este ltimo sean mucho ms bioactivos por la
variedad de componentes qumicos que presenta, como la pulegona, linalol,
mentona, isomentona, timol, carvacrol, entre otras.
El aceite esencial inhibe el crecimiento del H. pylori a una concentracin de 1.00
g/mL, mientras que la amoxicilina lo hace en 0.02 g/mL; esto expresa que el
antibitico es 50 veces ms potente que el aceite. Sin embargo, comparando
dicha actividad con la ampicilina, antibitico betalactmico que pertenece a la
familia de la amoxicilina, el aceite esencial muestra relativamente mayor
actividad. Li et al. (2005)
[66, 81]
, determinaron la CMI de la ampicilina en 2.00
g/mL.
La CMB resultante para el H. pylori es de 2.00 g/mL; es decir, que dicha
concentracin posee efecto bactericida, segn el modelo ensayado.
El efecto bacteriosttico y bactericida de los aceites esenciales se debe a sus
componentes fitoqumicos, como los de grupo fenol, alcohol y cetnico
[42, 45, 74]
. El
aceite esencial de S. brevicalyx, presenta principalmente compuestos como el
timol, carvacrol, linalol, -terpineol, pulegona, mentona, isomentona, cis-
isopulegona y trans-isopulegona; y estos compuestos son de tipo fenol, alcohol y
cetnico.
Ramezani et al. (2004)
[41]
, determin la CMI para H. pylori del aceite esencial de
Pistacia vera en 1.55 mg/mL, correlacionan dicha actividad con el -pineno, -
pineno y -tuyona. La actividad del aceite de S. brevicalyx, es superior que el
aceite de P. vera, y tambin contiene -pineno y -pineno.
Mahaboob et al. (2005)
[43]
, determinaron la actividad anti-Helicobacter pylori
(anti-HP) en 2.00 g/mL para el eugenol y cinamaldehido, componentes de los
aceites esenciales de Eugenia caryophillis y Cinnamomum verum. El aceite
de S. brevicalyx, posee una actividad similar, estos resultados muy cercanos se
deben a que el eugenol es un compuesto fenlico, como el timol y carvacrol;
metabolitos bactericidas de primer orden.
58
Bergonzelli et al. (2003)
[42]
, demostraron la actividad anti-Hp de los aceites
esenciales de 30 especies, mostrando un rango de inhibicin del crecimiento
entre 0.7 - 6.3 cm de dimetro; atribuyendo que los constituyentes puros
responsables son: carvacrol, isoeugenol, nerol, citral y sabineno. El aceite voltil
de S. brevicalyx posee como parte de sus componentes el carvacrol.
Tzakou et al. (2003)
[45]
, encontr en el aceite esencial de Satureja parnassica
subs. parnassica cariofileno, carvacrol, xido de cariofileno, espatulenol, p-
cimeno y linalol. Concluyendo que estos compuestos, principalmente el
carvacrol, son los responsables de la actividad anti-Helicobacter pylori.
Silva et al. (2001)
[44]
, determinaron el efecto antibacteriano frente a H. pylori del
aceite esencial de Dittrichia viscosa subs. viscosa. La CMI es 44.40 g/mL y
la CMB es entre 88.80-133.20 g/mL. Los valores del aceite de la S. brevicalyx
son muy superiores frente a este resultado.
Con mayor certeza, se puede afirmar que los responsables primarios de la
actividad anti-Helicobacter pylori del aceite esencial de S. brevicalyx, son:
timol, carvacrol, linalol, -terpineol, pulegona, mentona, isomentona, cis-
isopulegona y trans-isopulegona.
El aceite esencial de S. brevicalyx, posee actividad antioxidante, y que est en
funcin de sus componentes qumicos y sus estructuras. Choi et al. (2000)
[55]
,
determinaron la actividad antioxidante para el geraniol en un 87.7% de capacidad
de captacin del radical DPPH, seguido por terpinoleno en 87.4% y -terpineno
en 84.7%, usando como patrn de comparacin al trolox. El aceite esencial de S.
brevicalyx posee -terpineno, que posiblemente sea uno de los componentes
fitoqumicos que est dotndole de actividad antioxidante.
Gllce et al. (2003)
[46]
, correlacionan la actividad antibacteriana y antioxidante
de la Satureja hortensis con las estructuras de timol y carvacrol, adems del -
terpineno y p-cimeno. El IC
50
de su accin antioxidante es de 23.76 0.80 g/mL,
determinado por el mtodo de DPPH. El aceite esencial de S. brevicalyx
contiene timol y carvacrol.
59
El aceite esencial de S. brevicalyx, en los tres modelos ensayados, muestra
capacidad antioxidante comparado con el trolox, dicha actividad se debe a las
estructuras moleculares de sus constituyentes qumicos, siendo 35 (tabla 2).
Choi et al. (2000)
[55]
, reportan que el linalol y el -pineno tienen capacidad de
captacin del radical DPPH entre 18.7 - 22.4%, y estas dos molculas estn
presentes en el aceite esencial de S. brevicalyx, el primero representa (20.3%)
y el -pineno (0.3%). Pero adems el -terpineol, -mirceno, -pineno, limoneno
y p-cimeno, tambin estn presentes en el aceite esencial ensayado mostrando
una actividad anti-radicalaria frente al DPPH entre 8.8 16.5% de captacin.
Ruberto et al. (2000)
[50]
, ensayaron 100 compuestos puros de aceites esenciales
en dos modelos de actividad antioxidante, usando como referente al -tocoferol.
Los compuestos puros que muestran accin antioxidante, tambin presentes en
el aceite esencial de S. brevicalyx, son: pulegona, 1.8-cineol, -pineno, -
pineno, -terpineol y -mirceno; que muestran una actividad antioxidante entre
3.2 - 34.9%, en orden ascendente.
Sylvestre et al. (2006)
[59]
, analizaron el aceite esencial y su actividad
anticancergeno del Croton flavens, mostrando citotoxicidad en lneas
celulares de tumor A-549 (de pulmn) y DLD-1 (de colon). Ellos correlacionan
que esta actividad, posiblemente, se debe a los componentes llamados -cadinol
(3.97%), -elemeno (1.53%) y -humeleno (1.06%). Se puede observar que el
aceite esencial de S. brevicalyx tiene -humeleno (0.3%), adems los radicales
libres constituyen uno de los factores condicionantes de la carcinogenesis,
posiblemente esta molcula sea un potencial anticancergeno del aceite esencial
de urqu mua.
Lagouri et al. (2005)
[47]
, correlaciona la actividad antioxidante del aceite esencial
de Satureja thymbra a sus constituyentes de grupo fenol, como el carvacrol y
timol.
Bezic et al. (1999)
[48]
, afirma que el timol y carvacrol son los marcadores
qumicos del aceite esencial del gnero Satureja, ratificando su presencia en
Satureja cuneifolia. Afirmando que estos compuestos qumicos son los
responsables de la actividad antibacteriana y antioxidante.
Dicho estudio justifica y valida la actividad anti-Helicobacter pylori y
antioxidante del aceite esencial de S. brevicalyx. En los modelos ensayados de
60
actividad biolgica, todas las molculas del aceite esencial actan en sinergismo,
potenciando su capacidad antibacteriana y antioxidante, dicha actividad se debe
a los 35 componentes, destacando los principales componentes con mayor
actividad.
El Per es poseedora de muchas especies aromticas nativas y endmicas,
deben continuarse las investigaciones que validen su uso popular, como el caso
de la S. brevicalyx urqu mua u organo de los incas.

61
VI. CONCLUSIONES
1. Se elucid 35 compuestos del aceite esencial de Satureja brevicalyx,
siendo los mayoritarios 74.8% de monoterpenos oxigenados (pulegona
27.2%, linalol 20.3%, mentona 11.1%, isomentona 8.3%, cis-isopulegona
2.7%, trans-isopulegona 0.9%, carvacrol 0.6%, timol 0.6% y -terpineol
0.5%); 16% de hidrocarburos sesquiterpnicos (biciclogermacreno 8.2%,
-cariofileno 6.5% y bicicloelemeno 0.5%); 4.1% de hidrocarburos
monoterpnicos (p-cimeno 2.0%, limoneno 0.7% y -terpineno 0.6%); y
1.5% de sesquiterpenos oxigenados (espatulenol 0.8% e isoespatulenol
0.3%).
2. Se determin que la citotoxicidad del aceite esencial confirma su alta
bioactividad, siendo su concentracin letal media (CL
50
) de 13.35 g/mL;
y su dosis letal media (DL
50
) de 655.26 mg/kg, considerndose
ligeramente txica.
3. Se determin que el aceite esencial de Satureja brevicalyx posee un
efecto anti-Helicobacter pylori, con una concentracin mnima inhibitoria
de 1.00 g/mL y con una concentracin mnima bactericida de 2.00
g/mL.
4. Se determin que el aceite esencial de Satureja brevicalyx muestra un
significativo efecto antioxidante, comparado con el trolox.

62
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFIAS

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69

70
VIII. ANEXOS

Figura 1. Planta de Satureja brevicalyx Epling urqu mua.

Figura 2. Crecimiento en abundancia en laderas naturales de Satureja
brevicalyx Epling urqu mua.

71

Figura 3. Ensayos de actividad anti-Helicobacter pylori del aceite
esencial de S. brevicalyx.

72

CH
3
C H
3
CH
3
-terpineno
CH
2
OH
C H
3
C H
3
CH
3
linalol
CH
3
O
C H
3
CH
3
pulegona
CH
3
C H
3
CH
3
OH
-terpineol
CH
3
OH
C H
3 CH
3
timol
CH
3
OH
C H
3
CH
3
carvacrol
CH
3
CH
3
C H
3
p-cimeno
CH
2
C H
3
CH
3
sabineno

OH
CH
3
C H
3
CH
3
carvacrol
CH
3
C H
3
C H
3
CH
3
C H
3
C H
2
-pineno
-pineno
CH
3
C H
3
CH
3
O
1,8-cineol
CH
3
C H
3
CH
2
Limoneno
O
C H
3
C H
3
CH
3
mentona
CH
2
CH
2
C H
3
CH
3
mirceno

Figura 4. Estructuras qumicas de los principales componentes del
aceite esencial de S. brevicalyx.

73

min 0 10 20 30 40 50 60
pA
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
FID1 A, (FLORIAN\TEST07.D)

Figura 5. Cromatograma GC-FID del aceite esencial de S. brevicalyx en
Supelcowax
TM
10 column.

min 0 10 20 30 40 50
pA
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
FID1 A, (FLORIAN\TEST12.D)

Figura 6. Cromatograma GC-FID del aceite esencial de S. brevicalyx en
columna de metilsilicona.

74

30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210220230
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
m/ z-->
Abundance
Scan 2839 (20.944 min): SATUCW.D
81
152
67
109
41
137
95
53
123
161 204 189 228

Figura 7. Espectro de pulegona del aceite esencial de S. brevicalyx.

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
m/ z-->
Abundance
71
93
43
55
121
136
107 82
154 194 229 244 268

Figura 8. Espectro de linalol del aceite esencial de S. brevicalyx.

75
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
1000000
m/ z-->
Abundance
112
69
41
55
139
154
97
83
125
272 169 207 287 255

Figura 9. Espectro de mentona del aceite esencial de S. brevicalyx.

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FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA

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