MANUAL PRCTICO DE MICROBIOLOGA - Tomo II: Microbiologa Ambiental II

Manacorda A. M., Cuadros D. P y lvarez A. S.

Ao 2007

Captulo 3
TCNICA DE FERMENTACIN EN TUBO MLTIPLE (NMP) PARA
MIEMBROS DEL GRUPO DE LOS COLIFORMES: COLIMETRA
Objetivo
Poner en prctica una tcnica microbiolgica de rutina para estimar la calidad
bacteriolgica del agua.
Introduccin
Existen numerosas enfermedades bacterianas de transmisin hdrica como el clera, la fiebre
tifoidea y paratifoidea y la disentera bacilar, entre otras. En general los agentes causales de
estas enfermedades se encuentran en bajas concentraciones en el agua, lo que dificulta su
aislamiento e identificacin.
Se denomina microorganismos indicadores de contaminacin fecal a aquellos que se
encuentran en grandes cantidades en las heces humanas y en las de los dems vertebrados de
sangre caliente, que son de fcil identificacin y deteccin, y permiten evaluar la potencial
presencia de otros microorganismos patgenos que suelen acompaarlos.
El grupo de bacterias generalmente utilizadas como indicadores de contaminacin fecal son las
coliformes. Este grupo pertenece a la familia Enterobacteriaceae e incluye varios gneros:
Escherichia, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella. Estos microorganismos son bacilos aerobios
y anaerobios facultativos, Gram negativos, no formadores de esporas, capaces de utilizar a la
lactosa como fuente de carbono y energa con produccin de gas y cido en 48 horas a 35C.
Existen microorganismos que renen estas caractersticas que viven asociados a vegetales o al
suelo y no necesariamente se asocian a contaminacin fecal. Por esta razn se han desarrollado
diferentes mtodos para la deteccin de coliformes fecales.
Los microorganismos coliformes, algunos de los cuales son saprofitos de vida libre, pueden
multiplicarse en lavaderos de cuero, madera, cuerdas de piscina y empaquetadoras de yute, y
producir a veces cienos en el interior de las tuberas. La diferenciacin de los coliformes tiene
valor en el momento de determinar la fuente de la que procede el aumento de su densidad y que
es consecuencia de la multiplicacin de microorganismos sobre o dentro de materiales
orgnicos. La presencia de un gran nmero de coliformes del mismo tipo en el agua de un pozo
o manantial o en un solo grifo de un sistema de distribucin sugiere que se ha producido la
citada multiplicacin.
Los residuos industriales tambin poseen elevadas concentraciones de elementos nutritivos para
las bacterias y pueden favorecer grandes sobrecrecimientos de coliformes en aguas de efluentes
y afluentes. Estos crecimientos tambin pueden aparecer en los sistemas de distribucin de
aguas tratadas.
Una de las pruebas estndar para el grupo de los coliformes puede realizarse mediante la
Tcnica de Fermentacin en Tubos Mltiples (a travs de las fases presuntiva, confirmatoria y
prueba completa), en la cual los resultados del estudio de los tubos y diluciones replicados se
comunican en trminos de Nmero Mas Probable (NMP) de microorganismos existentes
(nmero equivalente a la densidad media de coliformes en la muestra). La precisin del mtodo
depende del nmero de tubos utilizados, pudiendo ser de tres o cinco series de tubos por
dilucin. La densidad bacteriana puede calcularse mediante una frmula o por medio de la tabla
que utiliza el nmero de tubos positivos en las diluciones mltiples.
Las muestras que pueden utilizarse para la determinacin de coliformes, incluyen: agua dulce
(potable o no), agua salada, lodos, sedimentos, fangos y alimentos (carnes y leche).
La prueba estndar para detectar bacterias coliformes consta bsicamente de dos fases: la
prueba presuntiva y la prueba confirmatoria, aunque suele realizarse una tercera denominada
prueba completa.

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Materiales

- Mechero Bunsen
- Gradillas
- Marcador indeleble
- Tubos con 9 ml de agua de dilucin estril
- Tubos con 10 ml de CMC doble concentracin
- Tubos con 10 ml de CMC simple concentracin
- Tubos con 10 ml de CLVBB y EC
- Pipetas 1 ml y 10 ml estriles
- Pipeta automtica
- Tips estriles
- Ansa
- Estufa de cultivo a 35C
- Estufa de cultivo o bao termostatizado a 44,5 C
Procedimiento
1.- Prueba Presuntiva:
Para su determinacin se utiliza un medio lquido lactosado, pudiendo ser Caldo Lauril Triptosa
(CLT), Caldo Lactosa (CL) o Caldo Mac Conkey1 (CMC). Si el medio se ha refrigerado despus
de su esterilizacin, se debe de incubar de un da a otro a 35C antes de utilizarlo, rechazando
aquellos tubos que muestren crecimiento, burbujas o ambas cosas.
Todos los tubos se preparan con 10 ml del medio elegido (en el caso del presente trabajo se
utiliza el CMC), de la siguiente forma: 3 tubos a doble concentracin del medio y 6 tubos a simple
concentracin del medio. Cada tubo debe llevar una campana Durham (tubo de vidrio invertido).
Se siembra con pipetas estriles:
10 ml de la muestra inicial a tubos de doble concentracin, por triplicado.
1 ml de la muestra inicial a tubos de simple concentracin, por triplicado.
0,1 ml de la muestra inicial a tubos de simple concentracin, por triplicado.
En la figura 1 se indica el procedimiento de la realizacin de las diluciones. Cuando se trabaja
con una muestra de calidad desconocida, se debern sembrar ms series de tubos (ms
diluciones), para asegurarse de tener alguna serie con todos los resultados negativos. En dicho
caso, la metodologa para la realizacin de las diluciones es la misma que la explicada para
bacterias hetertrofas totales (figura 2).
Los tubos sembrados se incuban a 35 0,5 C durante 24 2 horas. El desarrollo de bacterias
que atacan la lactosa con produccin de gas se evidencia por el viraje de color del medio de
cultivo (el viraje de color violeta a amarillo indica la acidez producida en el medio) o por la
acumulacin de gas en la campana de Durham. En caso que sta reaccin no se produzca, se
deben de reincubar aquellos tubos negativos, para luego volver a examinar al final de 48 3
horas. Registrar luego, la presencia o ausencia de gas o cido. La aparicin de dichas
reacciones, constituye una presunta reaccin positiva, por ello, como existen algunas bacterias
grampositivas que son capaces de producir esta reaccin, ste resultado debe confirmarse. En
las pruebas posteriores, a estos tubos se los denominar tubos primarios

Medio preparado color rojo prpura. La bilis de buey presente en este caldo estimula el crecimiento de las
bacterias coliformes mientras que inhibe a gran parte de la flora Gram (+).
2

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Figura 1. Procedimiento para la realizacin de las diluciones de tres series de tubos primarios
para prueba presuntiva

Figura 2. Procedimiento de realizacin de las diluciones para mas de tres series de tubos
primarios para prueba presuntiva
2.- Prueba confirmatoria (Esquema 1 y 2)
En esta fase se confirma la presencia o ausencia de coliformes totales, mediante el cultivo en
Caldo Lactosa Verde Brillante Bilis (CLVBB)2, como as tambin de coliformes fecales, utilizando
Caldo EC3. Ambas preparaciones se colocan en tubos de ensayo, con una Campana Durham
2

El caldo es de color verde.

El caldo es de color mbar. Las sales biliares que componen este medio inhiben el crecimiento
de gran parte de la flora acompaante.
3

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invertida en cada uno. Dichos medios son selectivos, pues inhiben notablemente el crecimiento
de la flora acompaante indeseable.
A la fase de confirmacin se llevan todos los tubos primarios positivos en los que haya aparecido
cualquier cantidad de gas o de crecimiento cido dentro de las 24-48 horas de incubacin, como
as tambin, aquellos tubos que antes de las 24 horas, presentaron positividad (sin esperar que
el tiempo se complete). Si hay otros tubos primarios con crecimiento cido despus de las 48
horas de incubacin, tambin se llevarn a la fase confirmatoria.
Para confirmar la presencia de coliformes totales, a partir de tubos positivos primarios, se inocula
una porcin de cada uno de ellos con un ansa estril en tubos con CLVBB. Se incuban durante
48 3 horas a 35 0,5C. La formacin de cualquier cantidad de gas en la campana Durham
despus del tiempo de incubacin constituye un resultado positivo en la fase confirmatoria, la
produccin de turbidez no indica resultado positivo.
Calcular el valor del NMP a partir de los tubos positivos.
La confirmacin de la presencia de coliformes de origen fecal permite diferenciar entre los
coliformes de origen fecal y los procedentes de otras fuentes. El procedimiento consiste en
inocular (con ansa) una porcin de los tubos primarios positivos en tubos con caldo EC. Los
tubos sembrados se incuban en un bao de agua (ver Fig. 3) incubacin a 44,5 0,2C durante
24 2 horas (prueba a alta temperatura). Depositar todos los tubos en el bao antes de que
transcurran los 30 minutos de la inoculacin y mantenerlos lo suficientemente profundos, como
para que el agua del bao est a un nivel superior al que tiene el medio en los tubos. Se
considera como reaccin positiva la aparicin de gas a las 24 horas o menos de incubacin. La
falta de gas constituye un resultado negativo, que indica que el origen de los microorganismos no
es el aparato digestivo de los animales de sangre caliente. Una vez obtenido los resultados
calcular el valor del NMP a partir de los tubos positivos.
Nota:
Para aplicar la tcnica de fermentacin en tubo mltiple en muestras slidas o semislidas,
stas se deben de preparar de la siguiente manera: se pesa la muestra y diluye en un lquido
de dilucin hasta conseguir una de 10-1. Por ejemplo, se aaden 50 g de muestra en una jarra
mezcladora estril de 450 ml de tampn de fosfato estril o de agua de dilucin con peptona
al 1%, y mezclar durante 1 a 2 minutos a baja velocidad (800 rpm). Preparar las diluciones
decimales correspondientes del homogeneizado resultante lo antes posible para reducir al
mnimo la sedimentacin.

Recuentos
La cuantificacin clsica de las bacterias coliformes se realiza por medio del mtodo estadstico
denominado Nmero ms Probable (NMP). Se basa en el concepto de que una o ms bacterias
inoculadas en un medio de cultivo adecuado, darn origen a una poblacin que se evidenciar
dando un resultado positivo. En el caso de las coliformes este resultado consiste en la aparicin
de turbidez en el medio y/o gas en la campana Durham.
Como las bacterias en el agua no se distribuyen en forma homognea por lo que al sembrar una
serie de tubos con porciones de una misma muestra o dilucin, habr series en las que todos los
tubos darn resultados positivos, otros negativos y otras en las que los resultados sern
positivos y negativos.
Para obtener resultados vlidos, se debern sembrar alcuotas apropiadas de la muestra para
lograr que la primera serie de tubos (inoculados con la menor dilucin), presente resultados
todos positivos, y la ltima (tubos inoculados con la mayor dilucin) todos negativos.
Utilizacin de las Tablas
Las tablas ms comunes estn diseadas para tres series de tubos sembrados con 10, 1 y 0,1
ml de la muestra. Se ingresa a la tabla con el nmero caracterstico, que consiste en los positivos
confirmados de esas series (Tabla 1, ejemplos 1 y 2).
Para cada combinacin posible de resultados positivos de las tres series, corresponde un valor
de NMP. Los valores de NMP expresan cantidad de bacterias por cada 100 ml de muestra.

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Si en lugar de 10, 1 y 0,1 ml de la muestra se sembraron 1, 0,1 y 0,01 ml, el valor de la tabla se
multiplicar por 10; si se sembraron 0,1 , 0,01 y 0,001 ml, el valor de la tabla se multiplicar por
100 (Tabla 1, ej. 5 y 6).
Cuando se sembraron ms de tres diluciones decimales, se ingresa a la tabla con el valor de la
mayor dilucin que dio todos los resultados positivos, seguidos de los dos siguientes (Tabla 1, ej.
5, 6 y 7).
En el ejemplo 4 se eligen las tres primeras diluciones dejando el nico resultado positivo en la
dilucin central.
Las tablas 2 y 3, presentan los ndices de NMP, para distintas combinaciones de resultados
positivos, cuando se utilizan 5 y 3 tubos por dilucin, respectivamente.
Tabla 1. Ejemplos de utilizacin de tablas de NMP con tres rplicas por dilucin.
Ej.
1
2
3
4
5
6
7

10
3/3
3/3
3/3
0/3
3/3
0/3
--

1
2/3
0/3
2/3
1/3
3/3
3/3
--

0,1
0/3
0/3
1/3
0/3
2/3
3/3
3/3

0,01

0,001

0,0001

0/3
0/3
0/3
2/3
3/3

1/3
2/3

0/3

N Carac.
3-2-0
3-0-0
3-2-1
0-1-0
3-2-0
3-2-1
3-2-0

Valor Tabla
93
23
150
3
93
150
93

Bact./ 100 ml
93
23
150
3
93x10
150x100
93x1000

Tabla 2: Indice de NMP y lmites de confianza del 95% para varias combinaciones de resultados
positivos, cuando se utilizan 5 tubos por dilucin (10 ml, 1 ml y 0,1 ml)
Combinacin de
tubos positivos

Indice NMP/
100 ml

0- 0- 0
0- 0- 1
0- 1- 0
0- 2- 0
1- 0- 0
1- 0- 1
1- 1- 0
1- 1- 1
1- 2- 0
2-0-0
2-0-1
2-1-0
2-1-1
2-2-0
2-3-0
3-0-0
3-0-1
3-1-0
3-1-1
3-2-0
3-2-1
4-0-0
4-0-1
4-1-0
4-1-1
4-1-2
4-2-0
4-2-1

<2
2
2
4
2
4
4
6
6
4
7
7
9
9
12
8
11
11
14
14
17
13
17
17
21
26
22
26

Lmites de
Confianza 95%
Superior Inferior
----1.0
10
1.0
10
1.0
13
1.0
11
1.0
15
1.0
15
2.0
18
2.0
18
1.0
17
2.0
20
2.0
21
3.0
24
3.0
25
5.0
29
3.0
24
4.0
29
4.0
29
6.0
35
6.0
35
7.0
40
5.0
38
7.0
45
7.0
46
9.0
55
12
63
9.0
56
12
65

Combinacin de
tubos positivos

Indice NMP/
100 ml

4-3-0
4-3-1
4-4-0
5-0-0
5-0-1
5-0-2
5-1-0
5-1-1
5-1-2
5-2-0
5-2-1
5-2-2
5-3-0
5-3-1
5-3-2
5-3-3
5-4-0
5-4-1
5-4-2
5-4-3
5-4-4
5-5-0
5-5-1
5-5-2
5-5-3
5-5-4
5-5-5

27
33
34
23
30
40
30
50
60
50
70
90
80
110
140
170
130
170
220
280
350
240
300
500
900
1600
> 1600

Inculo: Series A= 10 ml, B= 1 ml y C=0,1 ml de la muestra

Lmites de
Confianza 95%
Superior Inferior
12
67
15
77
16
80
9.0
86
10
110
20
140
10
120
20
150
30
180
20
170
30
210
40
250
30
250
40
300
60
360
80
410
50
390
70
480
100
580
120
690
160
820
100
940
100
1300
200
2000
300
2900
600
5300
-----

Fuente: APHA, 1989

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Tabla 3: Indice de NMP, para distintas combinaciones de resultados positivos, cuando se utilizan
3 tubos por dilucin (10 ml, 1 ml y 0,1 ml)
Combinacin Indice NMP/ Combinacin
Indice NMP/
de tubos
100 ml
de tubos
100 ml
positivos
positivos
A- B- C
A- B- C
0- 0- 1
3
1- 1- 2
15
0- 0- 2
6
1- 1- 3
19
0- 0- 3
9
1- 2- 0
11
0- 1- 0
3
1- 2- 1
15
0- 1- 1
6
1- 2- 2
20
0- 1- 2
9
1- 2- 3
24
0- 1- 3
12
1- 3- 0
16
0- 2- 0
6
1- 3- 1
20
0- 2- 1
9
1- 3- 2
24
0- 2 -2
12
1- 3- 3
29
0- 2- 3
16
2- 0- 0
9
0- 3- 0
9
2- 0- 1
14
0- 3- 1
13
2- 0- 2
20
0- 3- 2
16
2- 0- 3
28
0- 3- 3
19
2- 1- 0
15
1- 0- 0
4
2- 1- 1
20
1- 0- 1
7
2- 1- 2
27
1- 0- 2
11
2- 1- 3
34
1- 0- 3
15
2- 2- 0
21
1- 1- 0
7
2- 2- 1
28
1- 1- 1
11
2- 2- 2
35
Inculo: Series A= 10 ml, B= 1 ml y C=0,1 ml de la muestra

Combinacin Indice NMP/

de tubos
100 ml
positivos
A- B- C
2- 2- 3
42
2- 3- 0
29
2- 3- 1
36
2- 3- 2
44
2- 3- 3
53
3- 0- 0
23
3- 0- 1
39
3- 0- 2
64
3- 0- 3
95
3- 1- 0
43
3- 1- 1
75
3- 1- 2
120
3- 1- 3
160
3- 2- 0
93
3- 2- 1
150
3- 2- 2
210
3- 2- 3
290
3- 3- 0
240
3- 3- 1
460
3- 3- 2
1100
3- 3- 3
>1100
Fuente: APHA, 1967

Anlisis de los resultados

Los recuentos de bacterias coliformes se utilizan internacionalmente para establecer criterios de
calidad de aguas para diferentes usos.
Si bien existen otros mtodos para deteccin y determinacin de bacterias coliformes, el NMP es
el ms usado a punto tal que en los informes se omite mencionarlo.
Los entes oficiales de control frecuentemente utilizan la tcnica estndar, sembrando 10, 1 y 0,1
ml de muestra con tres rplicas. Este esquema de trabajo no permite obtener un recuento
preciso cuando la poblacin de bacterias excede 1100 bacterias/100 ml. Sin embargo, como este
nmero supera la mayora de las reglamentaciones, es suficiente para definir el uso de un
recurso hdrico y permite un trabajo de rutina normalizado.
Tabla 4: Valores gua recomendados por diferentes normativas nacionales e internacionales
vigentes.
Indicador
Uso del agua
Valor gua
Referencia
C. totales
Riego
1000/100 ml *
A
C. fecales
Riego
100/100 ml *
C. totales
Recreacin
500/100 ml **
B
C. fecales
Recreacin
200/100 ml *
A
C. totales
Potable
3/100 ml **
C
C. fecales
Potable
0/100 ml **
Tratamientos de Potabilizacin necesarios realizar para los tres casos presentados
a)
b)
c)
C. totales
Agua superficiales
50 - 5000 - 50000
B
C. fecales
Para potabilizar
20 - 2000 - 20000
* Media geomtrica de un mnimo de cinco anlisis en 30 das.
** Frecuencia mnima quincenal.

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a) Filtracin y desinfeccin.
b) Coagulacin, floculacin, filtracin y desinfeccin.
c) Cloracin, coagulacin, floculacin, filtracin por arena, filtracin por carbn activado y
desinfeccin.

A. Canadian Water Quality Guidelines. Canadian Council of Resourse and Environmental

Ministers. Marzo 1987.

B. Ltat de lenvironnement. Premier Rapport. Commission des Comunauts Europennes.

C. Cdigo Alimentario Argentino. Decreto 141/53. Provisin de agua potable. Decreto 352/79.
3.- Prueba completa
A partir de los tubos positivos confirmados, puede realizarse la doble confirmacin en medio
lquido de CLVBB para coliformes totales, y de medio lquido EC, para coliformes fecales. Los
tubos que sean positivos en CLVBB y negativos en medio EC indican la presencia de coliformes
no fecales.
Esta tercera fase consiste en aislar los microorganismos en agar LES Endo o en EMB4 (Eosina
Azul de Metileno), por cada tubo de CLVBB que haya producido gas. Si existen coliformes y se
quiere obtener una elevada proporcin de aislamientos satisfactorios, se deben tomar las
siguientes precauciones: (a) sembrar con ansa estril; (b) abrir e inclinar el tubo primario positivo
evitando la toma con aguja de cualquier membrana o espuma; (c) introducir el ansa a una
profundidad de 0,5 cm; (d) sembrar en la placa, evitando no araar el medio y Flameando el
ansa antes de los cuadrantes segundo y tercero, para mejorar el aislamiento de colonias.
Las placas se deben incubar en forma invertida a 35 0,5C durante 24 2 horas.
Las colonias desarrolladas (Ver tabla de Interpretacin de resultados) pueden ser tpicas (rosas a
rojo oscuras con un brillo metlico superficial), atpicas (rosas, rojas, blancas o incoloras sin
brillo) a las 24 horas de incubacin o negativas (todas las dems). Tmese de cada placa una o
ms colonias tpicas bien definidas o, si no existen, dos o mas dentro de las que se consideran
como probablemente formadas por microorganismos del grupo coliforme y se pasan a un tubo
con medio lactosado con campana Durham invertida (tubo secundario) y a uno con agar en pico
de flauta. Incubar los tubos secundarios a 35 0,5C durante 24 2 horas, si no se produce gas
en ese perodo, se prolonga la incubacin hasta 48 3 horas.
Estudiar microscpicamente colonias obtenidas en los cultivos en agar en pico de flauta, con
Tincin de Gram.
El resultado positivo de la prueba completa requiere la formacin de gas en los tubos
secundarios con el medio lactosado, a las 48 3 horas y la demostracin de bacilos
gramnegativos no esporulados procedentes de los cultivos con agar, demostrando as, la
presencia de un miembro del grupo coliforme. Si en los tubos secundarios no se produce gas en
48 3 horas, se deben de ajustar los resultados originales de NMP calculados a partir de la
prueba confirmatoria.

Tabla 5. Interpretacin de Resultados Siembra en EMB

Microorganismos
Escherichia coli
Enterobacter, Klebsiella spp.
Proteus, Salmonella, Shigella
Candida spp.
Acinetobacter spp.

Tipo de colonias
Verdosas con brillo metlico y centro negro
azulado
Mucosas, rosadas, confluentes
Incoloras
Incoloras o rosadas, secas, puntiformes
Azul lavanda, pequeas a medianas.

Placas preparadas color prpura anaranjado verdoso

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Figura 3: Bao de Agua

Esquema 1. Esquema de Prueba Confirmatoria y Completa para la deteccin de coliformes

totales y fecales.
Incubar los tubos de fermentacin con medio lquido lactosado inoculados 48 3 horas a 35 0,5C
(1)
Produccin de gas o acidez. Transferir a
CLVBB. Incubar 48 3 horas a 35 0,5C

(a)
Produccin de gas. Transferir*
a LES Endo . Incubar 24 2
horas a 35 0,5C

(2)
Ausencia de gas o acidez. Incubar
durante otras 24 horas ms (total, 48 hs)

(b)
Ausencia de gas.
Resultado negativo**

(1.1)
Colonias de coliformes tpicas o atpicas.
Transferir a pendiente de agar y tubo de
fermentacin con caldo lactosado.
Incubar el primero 18 a 24 horas y el
segundo 48 3 horas a 35 0,5C

(1.2)
Colonias negativas.
Ausencia de grupo
coliforme

(a')
Produccin de gas. Teir con Gram parte
del crecimiento de la pendiente de agar.

(b')
Ausencia de gas.
Resultado negativo**

(1.1.1)
Presencia de bacilos G(-), ausencia de
esporas. Prueba completa: presencia de grupo
coliforme. Presencia de bacilos G(+) y G(-).
Repetir el procedimiento comenzado en 1.1

(1.1.2)
Presencia de esporas o
esporas y bacilos G(-).
Prueba completa: ausencia
de grupo coliforme.

(a)
Produccin de
gas. Continuar
como en B (1)

(c)
Ausencia de gas o
acidez. Resultado
negativo. Ausencia
de grupo coliforme

(b)
Crecimiento
cido. Confirmar
como en B(1)

* Tambin puede emplearse la prueba

EC para coliformes fecales
** Ausencia de grupo coliforme

MANUAL PRCTICO DE MICROBIOLOGA - Tomo II: Microbiologa Ambiental II

Manacorda A. M., Cuadros D. P y lvarez A. S.

Ao 2007

Esquema 2. Esquema de trabajo indicando las siembras, tiempos de incubacin, repiques y

seleccin de resultados positivos, para el recuento de coliformes totales y fecales.
MUESTRA

CMC
35C

Gas 24 hs

Gas +
24 hs

Reincubar
24 hs
Gas +
48 hs

CLVBB
35C

Gas 48 hs

EC
44,5C

Gas +
24 hs

Gas 24 hs

Gas +
24 hs

Reincubar
24 hs
Gas +
48 hs
Presencia de
Coliformes Totales

Presencia de
Coliformes
Fecales

Gas 24 hs
Test
Negativo

Gas 48 hs
Test
Negativo

Bibliografa
American Public Health Association (APHA), American Water Works Association & Water
Pollution Control Federation. 1989. Standard Methods for the examination of Water and
Wastewater. 17th ed. APHA, Washington, D.C.USA. Part 9000.
Madigan, M. T, Martinko, G. M., Parker, J., 2004. Brock, Biologa de los microorganismos.10
ed. Editorial Prentice Hall INC.