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Producción de Bioetanol Por Saccharomyces Cerevisiae

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LA PRODUCCIN DE BIOETANOL POR SACCHAROMYCES CEREVISIAE, PICHIA

Y STIPITIS ZYMOMONAS MOBILIS A PARTIR DE FIBRA DE COCO MADURO


DESLIGNIFICADA Y EXTRACCIN DE LIGNINA DE ACUERDO CON EL
CONCEPTO DE BIORREFINERA
ABSTRACTO
En busca de aumentar la oferta de energa lquida, limpio, renovable y sostenible en la
matriz energtica mundial, el uso de materiales lignocelulsicos (LCM) para la
produccin de bioetanol surge como una alternativa valiosa. El objetivo de este trabajo
fue analizar y comparar el rendimiento de Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis y
Zymomonas mobilis en la produccin de bioetanol a partir de fibra de coco maduro
(CFM), utilizando diferentes estrategias: la sacarificacin y fermentacin simultneas
(SSF) y sacarificacin semisimultaneous y fermentacin ( IUPE). La CFM se trat
previamente por el pretratamiento hidrotrmico catalizada con hidrxido de sodio
(HPCSH). La CFM pretratada se caracteriza por difractometra de rayos X y SEM, y la
lignina recuperada en la fase lquida por FTIR y TGA. Despus de que el tratamiento
previo HPCSH (2,5% (v) de hidrxido v / sodio a 180 C durante 30 min), el contenido
de celulosa era 56,44%, mientras la hemicelulosa y la lignina se redujeron 69,04% y
89,13%, respectivamente. Tras el pretratamiento, la fraccin celulsica obtenida se
someti a la SSF y IUPE. Pichia stipitis permitido para el ms alto rendimiento de
etanol e 90.18% e en IUPE, 91.17% y 91.03% se obtuvieron con Saccharomyces
cerevisiae y Zymomonas mobilis, respectivamente. Se puede concluir que la seleccin
del microorganismo ms eficiente para el obtencin de altos rendimientos de
produccin de bioetanol a partir de celulosa tratada previamente por HPCSH depende
de la estrategia operacional utilizado y este pretratamiento es una alternativa
interesante para el valor agregado de compuestos de fibra de coco maduros (lignina,
compuestos fenlicos) que est en conformidad con el concepto de biorrefinera.
INTRODUCCIN
La necesidad emergente para obtener un limpiado, de bajo costo y las energas
renovables en apoyo de una matriz de energa sostenible, exige para el desarrollo de
procesos biotecnolgicos, como es el caso de la produccin de biocombustibles, que
contribuir a la autosuficiencia energtica en todo el mundo. EE.UU. y Brasil han
alcanzado una situacin cerca del ideal a partir de la produccin de bioetanol "fuente
de alimento", con innumerables ventajas econmicas. Al ser un paso hacia la
sostenibilidad energtica, la matriz se vuelve ms "verde", pero no satisface totalmente
las cuestiones socio-ambientales y la distribucin geogrfica mundial. En este sentido,
una solucin alternativa es la produccin de bioetanol a partir de LCM y otra fuente no
alimentario de los hidratos de carbono, disponible de acuerdo a la ubicacin, haciendo
posible una produccin mundial de este biocombustible. Sin embargo, algunas de las
barreras estn presentes en la produccin de etanol celulsico a escala comercial,
especialmente las etapas de pretratamiento, tratamiento de hidrlisis enzimtica,
fermentacin (hexosa y pentosa) y el uso integral de la materia prima. Tambin hay
una necesidad de seleccionar las materias primas, de acuerdo con las regiones, que
se pueden emplear como sustrato para la produccin de bioetanol. Brasil hace uso de
grandes cantidades de caa de azcar para la produccin de bioetanol y genera como
residuos de paja y bagazo. Sin embargo, en la coyuntura actual del modelo de azcar
y bioetanol produccin brasilea, estos residuos son generalmente destinados para la
produccin de electricidad [1], lo que hace incierto su uso para etanol. Como una
alternativa para mitigar esta posible ausencia de residuos de caa de azcar, Brasil
posee materias primas procedentes de otros cultivos como que el caso del residuo de

coco (conocido como CFM). El cultivo de coco se distribuye en ms de 200 pases y


de la produccin mundial en 2009 fue de unos 55 millones de toneladas [2]. Brasil es
el cuarto mayor productor, con una produccin de alrededor de 3 millones de
toneladas (5%), la regin Nordeste de contabilidad para las 82.28% de la superficie
total cultivada [3]. Gonalves et al. [4] inform de que el contenido estimado de bagazo
(fibra) en el coco en un 50%. Para la produccin de bioetanol de segunda generacin
en el concepto de biorrefinera, una etapa de pretratamiento para el fraccionamiento
del material es necesario, con la finalidad de aumentar la susceptibilidad del material a
ataque enzimtico. Yang y Wyman [5] inform de que la etapa de pretratamiento es el
paso ms costoso en la produccin de bioetanol. El tratamiento previo de LCM se
basan en procesos combinados fsicos, qumicos, biolgicos, fsico-qumicas y son un
factor clave en la eficiencia econmica y uno de los principales retos en la produccin
a gran escala de etanol [6].
De acuerdo con Park et al. [7], el proceso de pre-tratamiento termoqumico es ahora
considerado como el ms eficaz, siendo el pH y la temperatura de los principales
parmetros a tener en cuenta. El pretratamiento alcalino se utiliza con la intencin de
eliminar principalmente lignina. El hidrxido de sodio, hidrxido de calcio y el amonaco
se destacan en este pretratamiento debido al bajo coste y la necesidad de cargas
enzimticas ms pequeas para convertir la celulosa en glucosa [7]. El uso de
hidrxido de sodio como catalizador de pretratamiento de explosin de vapor se llev a
cabo por Park et al. [7] y dio lugar a una deslignificacin elevada y la hidrlisis
enzimtica eficaz en Eucalyptus grandis. Debido a que se produce una reduccin
mnima de la lignina en la fase slida en el LCM pretratada por explosin de vapor [7],
hechos similares se llevan a cabo con el LCM pretratada por autohidrlisis [8]. Por lo
tanto, el uso de hidrxido de sodio en el pretratamiento hidrotrmico consiste en una
alternativa para reducir el contenido de lignina de la LCM, tal como se utiliza por Rawat
et al. [9] en el lamo (Populus deltoides) y Kim y Han [10] en la paja de arroz. Durante
este tratamiento previo, la hemicelulosa se degrada a oligmeros de bajo peso
molecular, los monmeros y los cidos orgnicos que forman un licor negro [11].
Adems, el licor negro contiene una alta concentracin de lignina y compuestos
fenlicos, la recuperacin de lignina a partir del licor que est realizando el
procedimiento de precipitacin con cido y se convierte en gas de sntesis o como se
utiliza como materia prima para varias sustancias aromticas de bajo peso molecular
[11, 12]. Los compuestos fenlicos son fuentes naturales de antioxidantes y se pueden
aplicar como aditivos alimentarios y aplicaciones cosmticas [8,13]. Varias estrategias
para la produccin de etanol de celulosa se pueden aplicar en la etapa de
fermentacin, por ejemplo, la hidrlisis separada y la fermentacin (SHF) y
sacarificacin y fermentacin simultneas (SSF). Atributos de SAI son menos
inhibicin de la enzima y un mayor tiempo de EH en comparacin con la SHF; SHF
posee una mayor velocidad de hidrlisis [14]. Como una alternativa para combinar las
ventajas proporcionadas por SHF y SSF, surge el uso de sacarificacin
semisimultanea y fermentacin (IUPE), que incluye una etapa presacarifcacin antes
SSF [15]. Se espera IUPE tener una mayor productividad y el rendimiento de la SSF y
SHF por su cuenta, si el tiempo de presacarifcacin es apropiado [14,16]. Por lo tanto,
este trabajo tiene como objetivo evaluar una estrategia para la aplicacin de la CFM
como materia prima para la produccin de bioetanol mediante la realizacin de un
paso HPCSH seguido de dos estrategias de fermentacin alternativo e SSF y IUPE
correo utilizando tres microorganismos fermentativos
- Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis y Zymomonas mobilis e y caracterizacin
de lignina obtenido en la fase lquida.

2. MATERIALES Y MTODOS
2.1. Materia prima y caracterizacin qumica
CFM se obtuvo de los lugares agroindustrias en el Noreste de Brasil. Caracterizacin
qumica se realiz mediante hidrlisis cida cuantitativa con 5 ml de 72% (w / w) de
cido sulfrico durante 1 h y despus de la hidrlisis cuantitativa con cido sulfrico
4% (aadiendo agua hasta 148.67 g) a 121 C durante 1 h. Antes del anlisis por
HPLC, el residuo slido del proceso posterior a la hidrlisis fue recuperado por
filtracin y considerado como Klason lignina. Azcares monosacridos y cido actico
contenidos en los hidrolizados fueron determinados por HPLC con el fin de estimar el
contenido de muestras de celulosa y hemicelulosa [15]. Composicin de LCM se
determin de acuerdo a los protocolos de laboratorio de la Nacional de Energa
Renovable [17]. Contenido de ceniza residual se estima a partir de 2 g de la muestra
mantuvo a 550 C durante 5 h y se pesa para medir la ceniza residual contenida [18].
La humedad se estim a partir de una muestra de 2 g mantenido a 105 C durante 24 h
y se pes para calcular el residual contenido [17].
2.2. Proceso de pretratamiento
2.2.1. Preparacin de la materia prima antes del tratamiento previo
La CFM se lav para la eliminacin de residuos no lignocelulsico. Despus de cinco
lavados con agua a 70 C, el material se seca en un horno con circulacin de aire a 40
C durante 24 h. Despus de este procedimiento, el CFM se moli en un tamao de
partcula de 48 malla (0,3 mm), con el propsito de normalizar la granulometra del
CFM [15].
2.2.2. Pretratamiento hidrotrmico catalizada con sodio hidrxido de (HPCSH)
La CFM, hidrxido sdico y agua se mezclaron con el fin de obtener una proporcin de
10: 1 lquido / slido, se muestran las condiciones de HPCSH en la Tabla 1. Estos
experimentos se llevaron a cabo en 50 ml de volumen total acero inoxidable Cilindros
reactores. El reactor se cerr y montado verticalmente y luego sumergido en un bao
de aceite abierto Julabo abierto a un termostato de circulacin(Julabo, Alemania) con
control de temperatura PID, previamente calentada a la temperatura de reaccin
deseada (Tabla 1).

En el final del tiempo de reaccin deseado (Tabla 1), el reactor se retirado del bao de
aceite y se enfri por inmersin en un agua helada bao durante 5 min. El slido y
lquido (licor) se separaron a travs de filtracin a vaco, tanto estando caracterizado
como se ha mencionado en el Secciones 2.3 y 2.4. Los experimentos se realizaron por
duplicado.
2.2.3. Diseo experimental y anlisis estadstico
Con el fin de relacionar la variable dependiente de celulosa (celulosa,%) y la
temperatura de las variables independientes (X1, C) tiempo (X2, min) y la
concentracin de hidrxido de sodio (X3,%) en CFM previamente tratado, con la
posible nmero mnimo de experimentos, un material compuesto central 23 diseo
experimental (CCD) para los tres factores que permitieron la construccin de un
polinomio de segundo orden en las variables independientes y la identificacin de
significacin estadstica en la cual se utiliz variables. El modelo matemtico
(Ecuacin (1)) correspondiente al diseo experimental es:

Dnde:

Yi : funcin de respuesta (% de celulosa);


X1, X2, X3: valores de las variables independientes;
b0: coeficiente de relativa a la interceptacin del plano con el eje de la
respuesta;
b1, b2, b3: coeficientes lineales estima por el mtodo de los mnimos
cuadrcula;
b11, b22, b33: coeficiente de las variables de segundo grado;
b12, b13, b23: coeficiente de la interaccin entre las variables
independientes.

La calidad del ajuste de la ecuacin de modelo polinomial se evalu mediante el


coeficiente de determinacin R2 y la significacin estadstica se evalu mediante la
prueba F de Fisher para el anlisis de la varianza (ANOVA) con un nivel de confianza
del 95%. se determin el efecto de cada variable independiente y tambin sus efectos
de interaccin. Los resultados del ANOVA generan los grficos de Pareto de
interacciones y efectos. Paquete de Diseo Experimental Estadstica fue el software
utilizado para el anlisis de datos.
2.3. Caracterizacin de slidos pretratados
2.3.1. Composicin qumica despus del pretratamiento
La composicin qumica se realiz como se describi anteriormente (ver seccin 2.1.).
2.3.1.1. Anlisis de rayos X de difraccin.

La celulosa cristalinidad de CFM previamente tratada y no tratada se analizaron


mediante difractometra de rayos X (Bruker D8 Discover, EE.UU.). Determinaciones se
realizaron operando con radiacin de cobre Ka, el voltaje de 40 kV, elctrico
Corriente de 40 mA y la velocidad de 2 por minuto usando ngulo de exploracin
continua 2q de 4 a 70. El ndice de cristalinidad (CI) se defini utilizando la ecuacin
(2) [19].

Dnde,

I002: de mxima intensidad (2q, 22,6 ) de la (002) celosa difraccin;


Iam: intensidad de la difraccin amorfo (2q, 18,7).
2.3.1.2. Microscopio de escaneo de electrones.

La microscopa electrnica de barrido (SEM) de la superficie de CFM previamente


tratada y sin tratar era visualizada mediante un microscopio electrnico de barrido
(Nova NanoSEM 200, Pases Bajos) y se fotografiaron. Las muestras se recubrieron
inicialmente con una capa de oro mediante un procedimiento de pulverizacin catdica
de la tensin de 15 kV y despus se visualiz por SEM.
2.4. Caracterizacin de la fase lquida (licor)
2.4.1. Composicin de licor
Los licores se analizaron por HPLC (ver seccin 2.9.). los siguientes trminos
corresponden al factor estequiomtrico para la conversin de xilano en xilosa o
arabinosa arabinano en (132 /150), xilano en furfural (132/96), los grupos acetilo en
cido actico (43 / 60), celulosa en glucosa (162/180) y celulosa en HMF (162 /126)
[20].
2.4.2. Compuestos fenlicos totales
Contenidos fenlicos totales de las muestras de licor fueron determinados por
espectrofotometra utilizando Folin-Ciocalteu reactivo [21]. 100 ml de licor, 2 ml de
solucin de carbonato de sodio, 500 ml de Folin-Ciocalteu de reactivo y 7,5 ml de agua
destilada se aadieron en un tubo. Los tubos se colocaron en un bao de agua a 50 C
durante 5 min, se enfri a temperatura ambiente y se agit en vrtice. La absorbancia
de la muestras se midi a 700 nm usando cido glico como un estndar. un punto
siete en la curva estndar (0e2000 mg / L) hizo posible cuantificar el contenido de
fenoles totales (por triplicado). 2.4.3. La precipitacin cida de la lignina en el licor
precipitacin de cido se utiliza para recuperar la lignina presente en los licores. Esta
fraccin se precipit junto con hemicelulosas causando impurezas. A tal fin los lquidos
eran se acidific a pH 2 con cido sulfrico a 72% (w / w) y el cido fraccin
insoluble se almacen durante 48 h a decantar, se lav y se sec a 50 C hasta peso
constante (modificado a partir de Eges y col. [11]). lignina solubilizada terico (TSL)
se calcul por la ecuacin (3):

dnde,

SL: LCM% solubilizada;


IL:% de lignina de LCM sin tratar;
YL:% LCM no solubilizada;
PL:% de lignina de LCM pretratada.

2.5. Caracterizacin de la lignina contenida en el licor despus de pretratamiento de


CFM
2.5.1. Transformada de Fourier espectros infrarrojos de lignina
Transformada de Fourier espectros infrarrojos (FTIR) de la lignina de pretratada CFM
se obtuvo en un espectrofotmetro FTIR (serie FTLA 2000,ABB Inc. Bomem, Quebec,
Canad). Las condiciones de anlisis eran como resolucin 4 CM1, Utilizando 20
exploraciones y rango de frecuencia de 500e4000 CM1.
2.5.2. El anlisis termogravimtrico de la lignina
El anlisis termogravimtrico (TGA) se realiz usando un Shimadzu TGA-50 equipo
(Shimadzu Corporation, Japn), con TASYS software trmico. Las muestras se
pesaron (entre 10 y 15 mg) en recipientes de muestra de aluminio. Se llevaron a cabo
los experimentos en atmsfera de N2, a una velocidad de calentamiento de 10 C / min
a travs de un rango de temperatura entre 20 y 600 C.
2.6. Enzima
Las soluciones enzimticas, celulasas, b-glucosidasa y hemicelulasas (Cellic CTec2) y
endoxilanasa (Cellic HTec2) han sido facilitadas amablemente por Novozymes A / S
(Bagsvaerd, Dinamarca). El total de actividad celulosa de Cellic CTec2 se analiz de
acuerdo con la metodologa estndar establecido por Mandel y col. [22]. En un tubo se
aadieron 0,3 ml de la enzima comercial diluido y 1,2 ml de tampn de citrato de sodio
0,5 mM a pH 4,8 y 50 mg de filtro Whatman papel N 1 como sustrato. El medio se
incub en un bao de agua a 50C durante 1 h, la glucosa liberada se midi utilizando
el mtodo del DNS. Para enzima Cellic CTec2, la actividad b-glucosidasa fue tambin
determinada. La actividad b-glucosidasa se mide por la incubacin de la solucin de
enzima con 15 mM de celobiosa y 50 mM de tampn de citrato de sodio (pH 4,8 ) a
50 C durante 30 min. La reaccin se detuvo por inmersin en agua. Entonces, la
concentracin de la glucosa se determin utilizando el mtodo GOD-POD temperatura
ambiente durante 10 min y la cantidad de glucosa medida espectrofotomtricamente a
500 nm. Una unidad de actividad de la enzima (CBU / ml) se define como la liberacin
de 1 mmol de glucosa por minuto. Se determin la actividad de xilanasa para HTec2.
Mezclas de reaccin contenan 0,1 ml de enzima y 0,5% (w / v) de spelts avena
solucin de xilano en tampn de acetato, pH 5,0. La mezcla se incub a 50 C durante
10 min. Despus de un perodo predeterminado, la reduccin de azcares liberada se
cuantificaron por el mtodo DNS medido espectrofotomtricamente a 535 nm [23]. Una
unidad de actividad de xilanasa (UI / ml) se define como la cantidad de enzima que
libera 1 mmol producto por minuto en las condiciones de ensayo. La actividad de la
enzima inicial era 126 FPU / ml de celulasa, 269 CBU / ml de b-glucosidasa para
Cellic kit CTec2 y 1654 UI / ml de endoxilanasa de Cellic kit HTec2.

2.7. Hidrlisis encimtica


La hidrlisis enzimtica (EH) de slido de CFM pretratado deslignificado se realiz
para medir la susceptibilidad de la pretratado material. EH se realiz con 4% (w / v) de
slido de CFM pretratado deslignificado, en un matraz Erlenmeyer con un volumen
de 48 ml a 50C, utilizando el kit de CTEC enzimtica de Cellic 2 y 2 con Cellic HTEC
una carga de la enzima de 30 FPU, 75 y CBU 130 UI por gramo de pretratado slido,
respectivamente, en tampn de citrato sdico 50 mM con 0,02% (w / v) de acida de
sodio para evitar el crecimiento microbiano. La agitacin se mantuvo a 150 rpm
durante 96 h. Las muestras fueron tomadas en Intervalos de 6 h durante las primeras
12 h y 12 h intervalos hasta un tiempo total de 96 h [24,25]. Todas las determinaciones
se realizaron por duplicado. Las concentraciones de azcares se determin por HPLC
(vase la Seccin a hidrlisis enzimtica se calcul utilizando la Ecuacin (4) [24].

dnde:

glucosa = concentracin de glucosa (g / L);


celobiosa =concentracin de celobiosa (g / L);
biomasa= la concentracin inicial de biomasa seca de hidrlisis enzimtica (g /
L);
f = constituye de la fraccin de celulosa de la biomasa seca (g / g);
1.111 = consiste en el factor de conversin de celulosa en glucosa equivalente;
1.053 = consiste en el factor de conversin de celobiosa en glucosa equivalente.

2.8. Proceso fermentativo


2.8.1. Los microorganismos
P. stipitis Y7124, S. cerevisiae PE2 y Z. Mobilis B14023 cepas fueron utilizadas en la
produccin de bioetanol y obtuvieron de la coleccin microbiolgica del Centro de
Ingeniera Biolgica de la Universidad de Minho. Los microorganismos se mantuvieron
en glicerol en tubos Eppendorf a 80 C y se liofiliz posteriormente para su uso como
madre de trabajo.
2.8.2. Preparacin del inculo
S. cerevisiae y P. stipitis se mantuvieron en placas de Petri que contienen PDA (patata
dextrosa agar) medio de cultivo y mobilis Z. se mantuvo en placas de Petri que
contienen PCA (recuento de placa de agar) medio de cultivo a 30 C durante 24 h. Las
cepas para la inoculacin crecieron en matraces de 250 ml Erlenmeyer con 100 ml de
medio de cultivo estril que contiene 50 g / L de glucosa, 1 g / sulfato de amonio L, 0,5
g / L de fosfato de potasio, 0,25 g / l de sulfato de agnesio, 10 g / extracto de levadura
L y 10 g / L de peptona a 30? C y 200 rpm durante S. cerevisiae,250 rpm para P.
stipitis y 150 rpm para Z. mobilis en un agitador orbital durante 12 h y se centrifugaron
[25]. La concentracin celular se inocul a una densidad ptica de 2 de S. cerevisiae,
P. stipitis y Z. mobilis, respectivamente, a 600 nm en un espectrofotmetro UVeVIS
[26]. Posteriormente, las clulas se inocularon en 48 ml de medio de cultivo para iniciar
el proceso SSF y IUPE.

2.8.3. Sacarificacin y fermentacin simultneas (SSF)


Los experimentos se llevaron a cabo utilizando SSF slidos pretratados deslignificados
de CFM de acuerdo con el procedimiento estndar NREL [24]. La SSF se realiz con
4% (w / v) de slidos pretratados deslignificados en 48 ml de tampn de citrato de
sodio 50 mM (pH 5,0), utilizando el kit enzimtico de Cellic ctec 2 y Cellic HTEC 2 con
una carga de la enzima de 30 FPU, 75 CBU y 130 UI por gramo de pretratada slido
[15], complementado con sulfato de 1 g / L de amonio, 0,5 g / L de fosfato de potasio,
0,25 g / l de sulfato de magnesio, 2 g / extracto de levadura L y 1 g / L de peptona [25].
La SSF se inici mediante la adicin de enzimas y las cepas, se incubaron a 30 C en
un agitador orbital a 200 rpm para S. cerevisiae, 250 rpm para P. stipitis y 150 rpm
para Z. mobilis. Las muestras se tomaron a las 0, 6, 12, 24, 36 y 48 h. Las
concentraciones de etanol y azcares se determinaron por medio de HPLC (ver
seccin 2.9). Todas las determinaciones se realizaron por duplicado.
2.8.4. Sacarificacin Semi-y fermentacin simultneas (IUPE)
La sacarificacin semi-y fermentacin simultneas se llev a cabo para 12 h de
presacarificacin 36 h de proceso SSF usando slidos pretratados deslignificados de
CFM como sustrato. El IUPE se realizaron con 4% (w / v) de slidos pretratados
deslignificadas en 48 ml de tampn de citrato de sodio 50 mM (pH 5,0), utilizando el kit
enzimtico de Cellic ctec 2 y Cellic HTEC 2 con una carga enzimtica de 30 FPU, 75
CBU y 130 UI por gramo de slido tratado previamente [15]; en este periodo
presacarificacion, la temperatura del medio se mantuvo a 50 C. Despus de 12 h de
hidrlisis, la temperatura del medio se ajust a 30? C y se suplement con sulfato de 1
g / L de amonio, 0,5 g / L de fosfato de potasio, 0,25 g / l de sulfato de magnesio, 2 g /
extracto de levadura L y 1 g / L peptona. Entonces, el proceso de fermentacin se
inici mediante la adicin de las cepas en un agitador orbital a 200 rpm para S.
cerevisiae, 250 rpm para P. stipitis y 150 rpm para Z. mobilis. Las muestras se tomaron
a las 0, 6, 12, 24, 36 y 48 h. Las concentraciones de etanol y azcares se
determinaron por medio de HPLC (ver seccin 2.9). Todas las determinaciones se
realizaron por duplicado. El rendimiento de etanol (Ecuacin (5)) se calcul
suponiendo que toda la glucosa potencial en los slidos deslignificados pretratados
estaba disponible para la fermentacin y que 1 g de glucosa produjo 0,51 g de etanol y
1 g de celulosa dio 0,9 g de glucosa [24].

dnde:

etanol = concentracin final de etanol (g / L);


glucosa o xilosa inicial = concentracin inicial de glucosa o xilosa (g/L)
0,511 = factor de conversin de glucosa o xilosa a etanol.

2.8.5. Los anlisis estadsticos de SSF y IUPE


La significacin estadstica de la produccin de etanol se evalu para el anlisis de la
varianza (ANOVA) y la prueba t de Student-test F de Fisher, con un nivel de confianza
del 95%. Se realizaron anlisis estadsticos con la ayuda de software estadstico.
2.9. Anlisis de muestras de lquidos por cromatografa de alta resolucin

Todas las muestras se centrifugaron y filtraron a travs de un 0.2 mm membrana


estril de filtrar una analizaron para glucosa, xilosa, etanol, HMF, furfural y cido
actico. Separacin cromatogrfica se realiz utilizando una columna de H Metacarb
87 (300x 7,8 mm, Varian,EE.UU.) en las condiciones siguientes: fase mvil 0,005 mol /
L cido sulfrico, velocidad de flujo 0,7 mL / min y temperatura de la columna 60C
utilizando un cromatgrafo de bomba Jasco 880-PU (Jasco, Tokio, Japn) equipado
con un detector de refraccin-index 830-IR Jasco (Jasco, Tokio, Japn) y un Jasco AS2057 Plus muestreador automtico (Jasco, Tokio, Japn).
3. RESULTADOS Y DISCUSIN
3.1. Caracterizacin de slidos pretratados
3.1.1. Composicin qumica despus del pretratamiento
La composicin qumica del no tratado y pretratado slida CFM se muestra en la Tabla
2. El contenido de humedad de la CFM sin tratar fue del 6,14%. Una reduccin de
entre el 39,48 y el 78,36% en la cantidad de slidos en CFM previamente tratado se
observa y se correlaciona con el aumento de las condiciones operativas de HPCSH
(Tabla 2). Los cambios en la composicin qumica de la CFM en HPCSH se
observaron comparacin con el CFM sin tratar, correspondiente a un aumento de
celulosa de 32.18e59.71%, la reduccin de la hemicelulosa de 27.81e8.61% y la
reduccin de la lignina de 25.02e2.72% (Tabla 2). Estas modificaciones son
estratgicas para el fraccionamiento de CFM. Gonalves et al. [15] llev a cabo un
tratamiento previo autohidrlisis (200 C durante 50 minutos), CFM, que dio lugar a un
rendimiento slido de 76.89%, celulosa aumento de 40,55%, la reduccin de la
hemicelulosa de 50,16% y lignina aumento de 19,10%. Recientemente Kim y Han [10]
llevaron a cabo en HPCSH paja de arroz (5% (w / w)) con hidrxido de sodio a 80 C
durante 1 h, el resultado mostr una composicin de 50,6% de celulosa, 21,7% de
hemicelulosa y lignina 9,5%, con la reduccin de la lignina de 46,88%. Rawat et al. [9]
llevado a cabo en lamo (Populus deltoides) la HPCSH (2.8% (w /w) con hidrxido de
sodio a 94 C durante 1 h) que tiene como resultado un aumento de la celulosa de
26,15% y la hemicelulosa de 14,20%, con una reduccin de la lignina de 12,70%. Se
obtuvieron resultados similares en este funciona para celulosa y lignina, pero una
reduccin de la hemicelulosa era adquirido. Segn Ballesteros et al. [27] el aumento
de la hemicelulosa la degradacin de los residuos agrcolas se produce a altas
temperaturas y elevados tiempos de residencia, por lo tanto, las condiciones de
funcionamiento ms altas proporcionar una mayor reduccin de la hemicelulosa. La
reduccin de lignina aumenta linealmente con un aumento en las condiciones del
pretratamiento, teniendo en cuenta la concentracin de lcali, temperatura y tiempo de
reaccin [10].
3.1.2. Microscopa electrnica de barrido (SEM)
El uso de SEM permite una visualizacin detallada de morfolgica y cambios
estructurales en CFM despus de la termoqumica propuesta pretratamiento. Las
micrografas SEM de CFM sin tratar y despus de HPCSH (2,5% (v) de hidrxido v /
sodio a 180C durante 30 min) se muestran en la Fig. 3a B.
Las imgenes de SEM indicar que no se trata FCM tena intacto epidermis, lumen y
haces vasculares (Fig. 3A). el HPCSH grietas desarrollados que eran heterogneos y
dispersos a lo largo de la biomasa. El desarrollo de estas grietas puede aumentar el
rea de superficie para facilitar la interrupcin de la lignocelulosa, un requisito previo
para EH de la celulosa y la hemicelulosa (Fig. 3B). Similar Los resultados fueron

reportados por Kim y Han [10] y Rawat et al. [9] en paja de arroz y madera de lamo
tratan previamente por HPCSH, respectivamente.
3.1.3. El anlisis de difraccin de rayos X
El anlisis de difraccin de rayos X para la determinacin de ndice de cristalinidad se
llevaron a cabo en CFM sin tratar y tratado previamente con el objetivo

para analizar la estructura cristalina. Si no se trata CFM posee un ndice de


cristalinidad de 34.34%, mientras el CFM pretratada por HPCSH (2.5% (p / v) de
hidrxido de sodio en v 180 C durante 30 min) presenta un valor de 56,38% (Fig. 3C).
Los resultados mostr un aumento en el ndice de cristalinidad de CFM pretratada en
relacin con CFM sin tratar. De acuerdo con Pu et al. [28], este efecto puede
explicarse por la eliminacin de la celulosa amorfa y la hemicelulosa que causa un
aumento en la cristalinidad.
3.1.4. El anlisis estadstico de procesamiento de pretratamiento
El diseo experimental se llev a cabo para determinar las variables que afectan el
tratamiento previo de CFM y la influencia de la celulosa contenido del material
pretratado. Las condiciones utilizadas en el diseo experimental fueron de temperatura
(160, 180 y 200 C), el tiempo (10, 30 y 50 min) y la concentracin de hidrxido de
sodio (1,0, 2,5 y 4,0%). Anlisis de regresin mltiple y el anlisis de la varianza
(ANOVA) Se realizaron los datos experimentales para el modelo matemtico
adecuado. Los modelos en trminos de valores normalizados (tabla 1) expresado en la
ecuacin (6) representa el contenido de celulosa en CFM HPCSH, como funcin de la
temperatura (X1), el tiempo (X2) y la concentracin de hidrxido de sodio (X3)

Superficies de respuesta se dibujan como grficos tridimensionales de los modelos


polinomiales de segundo orden (ecuacin (6)) como una funcin de la dos variables
ms fuertemente que influyen. el rendimiento de celulosa se traz como una funcin
de la temperatura, el tiempo y el hidrxido de sodio (Fig. 1) se demostr que el
aumento en el rendimiento de celulosa se correlaciona con el aumento de
temperatura, tiempo y concentracin de sodio hidrxido durante el HPCSH. Los
resultados de ANOVA enumerados en la ecuacin (6) revelaron que la modelos
polinomiales de segundo orden representan adecuadamente las respuestas de
rendimiento de celulosa con coeficientes de determinacin R2, lo que indica que
95,66% de la variabilidad de la respuesta puede ser explicada por el modelo. Estos
valores estn de acuerdo con la coeficiente ajustado de determinacin R2 adj =
0,8916. De acuerdo con los resultados del ANOVA para el rendimiento de celulosa en
CFM pretratados por HPCSH (Tabla 4), el X1 lineal, X2 y X3 y X1X3 trminos de
interaccin tienen un efecto significativo en el rendimiento de celulosa con respuestas
p-value debajo de un nivel de significacin de un 0,05. Estos efectos pueden ser
visualizada en los diagramas de Pareto estandarizados (Fig. 2A). Se observa que las
variables de temperatura, tiempo, concentracin de sodio hidrxido y la temperatura
de la concentracin de hidrxido de sodio la interaccin son importantes en un nivel de
confianza del 95% de la celulosa el rendimiento y el efecto de la temperatura, tiempo y
concentracin de hidrxido de sodio son positivos, cuando el aumento de menor a los
valores ms altos (Fig. 1). Adems, los valores predichos frente los valores
observados por la aplicacin del modelo de mltiples de regresin se muestra en la
Fig. 2B y la evidencia de la buena calidad del ajuste.
3.2. Caracterizacin del licor
3.2.1. Composicin de licor
El licor separado por filtracin de la fase slida de la solucin de la HPCSH tratada
CFM, de acuerdo con las condiciones se muestra en la Tabla 1, posee las variaciones
del pH durante HPCSH entre 9,3 y 13,6 (Tabla 3). Este aumento en el valor de pH se
correlaciona con aumentar en las condiciones de funcionamiento del pretratamiento
(temperatura, tiempo y la concentracin de hidrxido de sodio). Se observa una
correlacin lineal entre el aumento en el pH

y el aumento de las concentraciones de celulosa, hemicelulosa, HMF, compuestos


fenlicos totales en furfural y los licores. Adems, el tratamiento previo de CFM por
PhCH permiti la obtencin de concentraciones de glucosa, hemicelulosa, y HMF
furfural en los licores de hasta 4,09, 23,09, 0,21 y 0,88 g / L, respectivamente (Tabla
3). Monosacridos, oligosacridos, actico cidos, compuestos fenlicos totales y
lignina presentes en los licores puede ser utilizados en procesos biotecnolgicos y
tecnolgicos y en una concepto de biorrefinera.
3.2.2. Compuestos fenlicos totales en la fraccin lquida
Los licores de CFM pretratadas por HPCSH mostraron entre 7,49 y 17,52 g / L de
compuestos fenlicos totales (compuestos fenlicos totales entre 74,9 y 175,2 mg / g
de LCM seco) (Tabla 3). Faustino et al. [29] analizaron el licor negro de E. globulus en
kraft el tratamiento previo y la concentracin de compuestos fenlicos obtenidos fue de

entre 91,6 y 293,5 mg / g de peso seco LCM, valores que estn dentro del rango de
los resultados presentados en este trabajo.

2.3. La precipitacin cida de la lignina

presente en los licores

es
el
comn para
lignina
del
este
obtuvieron a
tratamiento
precipitaron

Precipitacin cida
mtodo
ms
la recuperacin de
licor negro [12]. En
contexto,
licores
partir
del
previo de CFM se
mediante la adicin

de cido, lo
que resulta en
valores de entre 8,54 y 19,32 g / L de la lignina, con un rendimiento de recuperacin
de lignina de 91,1% (en relacin con la lignina total presente en el licor). En
comparacin, Eges et al. ? [11] llev a cabo la recuperacin de la lignina de los
residuos de maz (contiene 17,18% de Klason lignina) pretratados por HPCSH (160? C
y 75 min, relacin slido / lquido de 1:20 y deber la solubilizacin del mcm de
39.75%) que resulta en 2,5 g / l de lignina. Estos resultados demuestran la eficacia del
mtodo para recuperacin de lignina utilizada en este trabajo.
3.2.4. FTIR de la lignina obtenida por precipitacin
Los anlisis se llevaron a cabo por espectroscopia infrarroja con el propsito de
obtener informacin de los grupos qumicos presentes en la lignina [30]. Los espectros
de FTIR en la regin entre 500 y 4000 cm-1 de lignina estndar y se recupera la
lignina de licor de CFM pretratada por HPCSH (2,5% (v) de hidrxido v / sodio a 180 C
por 30 min) se muestran en la Fig. 4. Los espectros estn dominadas por una amplia
banda en 3396e3381 CM1 debido a grupos OH fenlicos y alifticos, seguido de
bandas para CH estiramiento en grupos metilo y metileno (CM1 2962e2874), las
bandas a 1604, 1516 y 1495 cm-1 asignados a esqueltico aromtico vibraciones,

1454 cm1 asignados a deformaciones y CH aromtico vibraciones de anillo, 1440 cm1 asignados a las vibraciones del esqueleto aromticos, 1331 CM-1 asignados a
siringil anillo de la respiracin con CO estiramiento, 1284 CM-1 asignados a guayacil
anillo de la respiracin con CO estiramiento y 1039 cm-1 asignados a tipo CH guayacil
aromtico y CH deformacin de alcohol primario. Adems de estos, hay bandas
observados en 1201, 1070, 753, 667 y 570 cm-1. La ausencia de un pico a 1739 cm-1
se asigna a CO estiramiento de no conjugada cetona, carbonilo y grupos ster, lo que
indica la presencia de hidroxicinamatos, tales como p-cumarato y ferulato [31]. No se
observaron los picos en la longitud de onda de 1170e1164 CM-1 en los espectros de
ligninas. De acuerdo con Tan et al. [32], la ausencia de este pico indica la ausencia de
azufre en la lignina y se convierte una caracterstica importante, porque el azufre en la
lignina es un contaminante e interfiere con su uso.
3.2.5. El anlisis termogravimtrico (TGA) de la lignina obtenida por precipitacin
La estabilidad trmica de la lignina recuperada de licor de CFM pretratada por PhCH
(2.5% (p / v) de hidrxido de sodio v en 180C durante 30 min) fue investigado por TGA
y se muestra en la Fig. 4B. La lignina perfiles de degradacin de la muestra de la
lignina estndar y el muestra de la lignina recuperada de licor de CFM pretratada por
PhCH fueron similares. El peso residual a 600C de la lignina recuperada era 55,68%,
mientras que la de la lignina estndar fue 56,71%. En general, el comportamiento de
descomposicin trmica de las muestras de lignina puede ser dividido en tres etapas.
La primera etapa (25e150? C) implica la deshidratacin de la lignina por el agua
absorbida en lignina. La lignina muestra contena una cierta cantidad de agua unida
cuya evaporacin producido a temperaturas superiores a 100? C, lo que indica la
fuerte interaccin entre las molculas de agua y el hidroxilo grupos en muestras de
lignina. La siguiente etapa, se produjo hasta 350C, implica la fragmentacin de los
vnculos internos entre la lignina unidades. Los principales productos en esta etapa
fueron coque, cido orgnico y compuestos fenlicos junto con productos de gas [33].
En el ltimo etapa (ms de 350 C), la degradacin de la lignina piroltica, la
descomposicin y la condensacin de los anillos aromticos se produjo [34].
3.3. La susceptibilidad a la hidrlisis enzimtica
Las conversiones de CFM pretratadas por HPCSH (2,5% (v / v) de sodio hidrxido a
180? C durante 30 min) en glucosa fue 90,72% a las 96 h de EH, siendo 88,90% a las
72 horas y 85,35% a las 48 h de EH (Fig. 5A). Estos resultados demuestran la
accesibilidad de CFM a la ataque enzimtico. En comparacin, para el CFM pretratada
por autohidrlisis (200 C durante 50 min) la conversin de la glucosa por EH en 96 h
fue de 84.10% [15]. La conversin menor del CFM previamente tratada por
autohidrlisis de la glucosa puede haber sido influenciado por la mayor contenido de
lignina en el CFM (29,80% de la lignina), en comparacin con el CFM pretratada por
HPCSH (11,72% de la lignina) [15]. La EH de madera de lamo tratado por HPCSH
(2,8% (w / w) hidrxido de sodio a 94 C durante 1 h) dio lugar a una conversin en
glucosa a las 48 h del 41,5% [9]. La conversin en glucosa durante la EH de
Eucalyptus grandis pretratada por explosin de vapor catalizada por hidrxido de sodio
(7% (W / w) de hidrxido de sodio a 210? C durante 9 min) fue 65,55% en 72 h [7]. La
EH de paja de arroz despus de HPCSH (5% (w / w) hidrxido de sodio a 80 C
durante 1 h) dio lugar a una conversin en glucosa de 78,7% en 72 h [10].
En cuanto a la tasa mxima de hidrlisis inicial (de la productividad glucosa) (dG / dt),
que se produce en las primeras 12 h (la pendiente de la glucosa concentracin frente
al tiempo) se muestra en la Fig. 5B, la velocidad de hidrlisis inicial de CFM era 1,27

g / (L h) (Fig. 5B). Gonalves et al. [15] inform de la velocidad de hidrlisis inicial de


autohidrlisis tratada previamente CFM como 0,82 g / (L h) utilizando 30 FPU / g de
LCM. En comparacin, Ruiz et al. [35] inform la velocidad de hidrlisis inicial de la
paja de trigo pretratada por autohidrlisis como 0,47 g / (L h) utilizando 30 FPU / g de
celulosa. Rawat et al. [9] estudi la velocidad de hidrlisis inicial de madera de lamo y
utilizando HPCSH obtenido 1,67 g / (L h) durante 15 FPU / g de celulosa. Estos
resultados demuestran la susceptibilidad de CFM pretratada por PhCH al ataque
enzimtico.
3.4. Proceso fermentativo para la produccin de bioetanol
Estrategias IUPE SSF y se llevaron a cabo utilizando S. cerevisiae PE2, P. stipitis
Y7124, Z. mobilis B14023 en CFM pretratada por HPCSH (Hidrxido de 2,5% (v / v) de
sodio a 180? C durante 30 min) como materia prima. Segn Shen y Agblevor [14], el
rendimiento de estrategias de fermentacin pueden ser evaluados por dos indicadores:
el rendimiento y productividad volumtrica de etanol.
3.4.1. Sacarificacin y fermentacin simultneas (SSF) y semi-sacarificacin y
fermentacin simultnea (IUPE) Los resultados de la produccin de bioetanol SSF por
S. cerevisiae, P. stipitis y Z. mobilis se muestran en la Fig. 6AeC, respectivamente. Los
resultados de este estudio indican que la glucosa de EH podra ser fermentada a

etanol
por
S.
mobilis, los perfiles
un patrn similar para
consumo rpido de
produccin
de S. cerevisiae y
10,96 g / L, siendo
complet despus
Tabla
5).
El
corresponde a una
mientras
para
S.
85.31% y 84,56%,
productividad
Los
tres
fermentacin
en la estrategia SSF.

cerevisiae, P. stipitis y Z.
cinticos que tiene
la glucosa, con un
glucosa durante las primeras 24 h. La
correspondiente de etanol en SSF
Z. mobilis eran 10,91 g / L y
el proceso de SSF
de 48 h (Fig. 6 y
rendimiento de etanol para P. stipitis era 87.44%, lo que
productividad volumtrica de etanol de 0,23 g / (L h) en 48 h,
cerevisiae y Z. Mobilis el rendimiento de etanol fueron
respectivamente. Los mobilis S. cerevisiae y Z. presentan
volumtrica de etanol de 0,30 g / (L h) a las 36 h (Tabla 5).
microorganismos han demostrado ser adecuado para la
azcares a etanol
En
un
trabajo

reciente, Chaudhary et al. [36] produce bioetanol a travs de un alcalino


secuencial y el pretratamiento cido usando Kans biomasa Grass como sustrato y P.
stipitis como microorganismo, reportando una productividad de 0,22 g / (L h).
Vaithanomsat et al. [37] Estudiado la eficiencia en la produccin de bioetanol a partir
de proceso SSF con S. cerevisiae y cscara de coco pretratados con sodio

hidrxido
como materia prima e inform de un rendimiento de etanol de 85%.
Gonalves et
al.
[15]
inform de la
produccin de etanol S.
cerevisiae, P. stipitis
y Z. mobilis en SSF utilizando
CFM
autohdralizada,
produccin
de etanol con una concentracin de
7,44 g / L,
8,47 g / L y 7,30 g / L y el rendimiento de
etanol
de
86,90%,
84,19%
y
85,26%,
respectivamente. Estos resultados estn de
acuerdo con los
reportados en este trabajo.
La
estrategia
de glucosa durante
(Fig. 6AeC). El
cerevisiae, P. stipitis
mobilis eran 11,65 g / L,
g / L y 11,64 g / L,

IUPE tena un patrn similar para la concentracin


la 12 h inicial y una disminucin gradual con el tiempo
correspondiente produccin de etanol en IUPE por S.
y
Z.
11,29
siendo
el

proceso IUPE complet despus de 48 h, respectivamente (Fig. 6 y la Tabla 5). El


rendimiento de etanol para P. stipitis era 90,18%, corresponde a una productividad
volumtrica de etanol de 0,24 g / (L h), en 48 h, mientras que para S. cerevisiae y Z.
mobilis la obtenida valores fueron 91,17%, 91,03% y 0,32 g / (L h), 0,32 g / (L h) para
el etanol el rendimiento y la productividad volumtrica, en 36 h, respectivamente (Tabla
5). Los tres microorganismos han demostrado ser adecuado para la fermentacin
azcares a etanol en la estrategia IUPE. En un trabajo reciente, Franco et al. [38] llev
a cabo el proceso de IUPE (24 h de presacarificacion y

24 h de SAI) utilizando deslignificada Pinus radiata y S. cerevisiae, lo que resulta en la


produccin de 15.5 g / L de etanol con un rendimiento de 90,0%. Por otra parte,
Gonalves et al. [15] inform de la produccin de etanol y valores de rendimiento de
etanol por S. cerevisiae, P. stipitis y Z. mobilis en IUPE usando CFM previamente
tratada por autohidrlisis de 7,71, 8,78 y 7,63 g / L, 90,09%, 87,25% y 89,16%,
respectivamente. Estos resultados corroboran los resultados presentados en este

trabajo para IUPE. La produccin de etanol por S. cerevisiae, P. stipitis y Z. Mobilis el


uso de estrategias fermentativa IUPE y SSF fue evaluado estadsticamente mediante
ANOVA y la prueba t (nivel de confianza del 95%). El etanol la produccin por los
microorganismos utilizando SSF no mostr significativa diferencias, cuando sean
evaluados por el ANOVA. Un resultado similar fue tambin obtenido a partir de los
microorganismos utilizando IUPE. La comparacin entre los resultados obtenidos por
el uso de S. cerevisiae y SSF S. cerevisiae utilizando IUPE mostr una diferencia
significativa, cuando evaluadas por la prueba t. Un resultado similar tambin fue
mostrado por Z. mobilis.
Los resultados obtenidos para la produccin de etanol, el rendimiento de etanol y
productividad volumtrica con la estrategia IUPE son ligeramente superiores en
comparacin con el SSF (ver Tabla 5). La mayor eficiencia fermentativa para IUPE
puede explicarse por la aplicacin de la corta presacarificacion perodo que puede
mejorar la conversin de la celulosa a la glucosa y, en secuencia a etanol, por lo tanto,
resulta en una disminucin en la inhibicin enzimtica. Por otra parte, el corto proceso
de presacarificacion aumenta la solubilidad del sustrato, dando lugar a la mejora de la
transferencia de masa de nutrientes para los microorganismos. Otra cuestin
importante relacionada con la produccin de etanol es la necesidad para aumentar la
concentracin de etanol celulsico para reducir los costos en el proceso de destilacin.
El uso de una etapa de procesamiento, tal como se sugiere en IUPE, que permite una
alta carga de slidos, como resultado de la reduccin de la viscosidad medio de
fermentacin puede tener un positivo impacto en el proceso general [26,39].
En este sentido, las estrategias fermentativos SHF, SSF y eran IUPE evaluadas por
algunos autores. Por ejemplo, Santos et al. [25] llev a cabo la fermentacin con S.
cerevisiae en SHF (72 h), SSF (24 h), que IUPE (16 h de presacarificacion y 24 h de
SSF) y IUPE II (16 h de presacarificacion y 24 h de SSF) con la caa de azcar
pretratada bagazo de explosin de vapor y deslignificada con hidrxido de sodio.
Los mejores resultados para las productividades volumtricas de etanol eran obtenido
en IUPE I y IUPE II, 0,29 g / (L h) y 0,30 g / (L h), respectivamente. Mesa et al. [16]
inform de que a partir de 1 tonelada de caa bagazo es posible obtener 192 L, 172 L
y 198 L de etanol a partir de SHF, SSF y IUPE, respectivamente. Llegaron a la
conclusin de que es el mejor IUPE estrategia de proceso basado en el rendimiento de
etanol y el volumen de producido etanol. Estos resultados demuestran la importancia
de realizar la etapa de presacarificacion antes de que el proceso fermentativo y
corroborar con los resultados obtenidos en este trabajo.
4. Conclusin
El CFM previamente tratada por HPCSH mostr resultados prometedores para
aplicacin como sustrato en la produccin de bioetanol con un alto conversiones de
CFM en glucosa durante la EH y etanol por las estrategias fermentativas de SAI y
IUPE. Adems, los licores de CFM previamente tratada por HPCSH contenan un alto
contenido de lignina (alto calidad) y compuestos fenlicos que pueden ser recuperados
por precipitacin para an ms la utilizacin de acuerdo con el concepto de
biorrefinera. Tambin es muestra que el microorganismo ms eficiente para ser
utilizado en el produccin de bioetanol depende de la estrategia operacional que se
emplee.

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